说明书一种提高多倍体杨树配子育性的方法
技术领域
本发明涉及一种利用现有多倍体植物资源的方法，特别涉及一种提高多倍体植 物配子育性的方法，属于植物遗传育种领域。
背景技术
利用多倍体材料作为亲本是植物染色体工程育种、创育多倍体新种质最直接的 手段。然而，由于多倍体植物减数分裂过程同源染色体联会及分离的不规律性，联 会多价体在中期Ⅰ时排列取向不规则，后期Ⅰ染色体不均等分离，产生大量染色体 数非整倍的配子，当配子中缺少某条具功能染色体，或者虽然没有缺失具功能染色 体，而基因间的协调性受到影响时，必然会造成配子败育，导致形成正常可育配子 的概率极低，不利于有性杂交产生后代。
现有获得多倍体植物的重要途径是利用理化方式处理使得染色体加倍，诱导植 物未减数(2n)配子进行杂交而成。在杨树倍性育种研究中，张志毅、康向阳等均 通过秋水仙碱和高温处理等方式获得过高达80％以上的2n花粉得率(张志毅,李凤 兰.白杨染色体加倍技术研究及三倍体育种(I)——花粉染色体加倍技术.北京林业 大学学报,1992,14(增3):52-58；Zhang ZY,Li FL,Zhu ZT,Kang XY.Doubling technology of pollen chromosome of Populus tomentosa and its hybrid.J.Beijing For. Univ.(English Ed.),1997,6(2):9-20；康向阳,朱之悌,林惠斌.杨树花粉染色体加倍 有效处理时期的研究.林业科学,1999,35(4):21-24)，并利用加倍后花粉进行杂交获 得过杨树三倍体后代。
然而，与对应树种的正常花粉相比，加倍后的未减数花粉普遍存在萌发进程迟 缓等问题，由于存在正常单倍性花粉的竞争，致使参与受精的竞争力低下(康向阳, 朱之悌.白杨2n花粉生命力测定方法及萌发特征的研究.云南植物研究,1997,19(4): 402-406)，直接导致了授粉杂交后的三倍体得率(不足0.1％)远远低于用于授粉的 混合花粉中的2n花粉比率。这种加倍花粉生活力低下的原因被认为可能与加倍花粉 自身遗传上的不平衡和在花粉中残余的秋水仙药液的影响等因素有关。类似未减数 花粉萌发率低、萌发迟缓的现象在杜鹃红山茶、杜仲等材料中均有所报道(王有兵, 徐斌,张方秋,等.杜鹃红山茶2n花粉自然发生及其诱导初步研究.广东林业科技, 2011,27(6):9-15；毛彦科.高温诱导杜仲配子染色体加倍技术研究.北京林业大学 硕士学位论文,2012)，表明加倍处理尽管能获得较高的2n花粉得率，但是与对应树 种的正常花粉相比，其生活力却可能显著下降。正因如此，近年来，在杨树等树种 的多倍体诱导研究中，已较少采用理化处理诱导花粉染色体加倍，并利用加倍花粉 进行杂交的方式来获取多倍体，而普遍选用三倍体诱导率较高的雌配子染色体加倍 途径(康向阳,张平冬,高鹏,等.秋水仙碱诱导白杨三倍体新途径的发现.北京林 业大学学报,2004,26(1):1-4；Wang J,Li DL,Kang XY.Induction of unreduced megaspores with high temperature during megasporogenesis in Populus.Annals of Forest Science,2012,69(1):59-67；Xi XJ,Guo LQ,Xu WT,et al.Megasporogenesis, megagametogenesis,and induction of 2n eggs with colchicine in poplar section Aigeiros. Scandinavian Journal of Forest Research,2014,29(6):527-536.)。
众所周知，植物产生花粉的数量巨大，一次收获花粉可以满足大量的杂交需求， 如能开发一种新的技术手段，获得较高比例加倍花粉的同时，提高加倍花粉的生活 力，必将对植物多倍体的大规模创制做出巨大贡献。康向阳等曾提出利用不同倍性 花粉对γ射线的辐射耐受性差异，提高加倍花粉的萌发竞争力的方法(康向阳,朱 之悌,林惠斌.白杨不同倍性花粉的辐射敏感性及其应用.遗传学报,2000,27(1): 78-82.)，并在育种中加以利用，将该途径的三倍体得率提高到了12.9％(康向阳,朱 之悌,张志毅.银腺杨与毛新杨正反交三倍体选育.北京林业大学学报,2000,22(6): 8-11)。然而，该技术操作繁琐，且存在辐射危害性，不同树种的辐射剂量存在差异， 在实际生产中难以推广。因此，有必要创新技术手段，推动理化处理诱导植物花粉 染色体加倍选育多倍体技术进步，提高加倍后的花粉的生活力的同时，确保操作的 便捷性、安全性和实用性，从而消除对花粉染色体加倍途径选育植物多倍体的技术 偏见。
将多倍体植株用作育种亲本，一条可行的途径是诱导形成高度异源四倍体植株， 由于异源四倍体植株在减数分裂过程中，几乎不存在同源染色体配对紊乱的问题， 因此可正常完成减数分裂过程，形成可育的染色体减数配子。然而，异源四倍体的 诱导需要利用来源不同的2n雌雄配子融合，或者对远缘杂种实施体细胞染色体加 倍，诱导难度大，而且，即便获得异源四倍体，还需要等待其开花才能有性利用， 周期长。因此，开发一种即时、有效、可靠的提高多倍体杨树配子育性的方法，对 于充分利用现有多倍体品种资源，通过多倍体有性杂交途径提高多倍体新种质创育 效率，创制大量多倍体种质资源，推动杨树多倍体育种研究进展具有重要价值和实 践意义，同时对于其他类似植物的多倍体植株配子育性提高技术具有重要的借鉴意 义。
发明内容
本发明的目的是针对现有多倍体植物配子育性低，配子败育率高，不利于有性 杂交产生后代的技术问题，提供一种显著提高现有多倍体植物配子育性的方法，实 现现有多倍体植物尤其是多倍体杨树品种的有性利用，为多倍体新种质创育服务， 而且本发明方法在提高多倍体杨树配子育性方面具有较强的即时性、有效性、可靠 性。
为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种提高多倍体植物配子育性的方法， 包括对处于减数分裂时期的孢母细胞进行诱变处理，其中所述诱变处理是对花芽注 射化学药剂。
其中，所述化学药剂为秋水仙碱溶液。
特别是，所述秋水仙碱溶液的重量百分比浓度为0.1-0.5％，优选为0.5％。
其中，在所述诱变处理过程中，向花芽内注射4-6次的秋水仙碱溶液；相邻两 次注射的时间间隔为3-5h；诱变处理时环境温度为5-10℃。
特别是，在所述诱变处理过程中，向花芽内注射5次的秋水仙碱溶液；相邻两 次注射的时间间隔为4h。
其中，所述多倍体植物为多倍体杨树。
特别是，所述多倍体杨树选择三倍体杨树杂种或者同源四倍体杨树。
尤其是，所述三倍体杨树杂种选择三倍体‘银中杨’(Populus alba×P. berolinensis‘Yinzhong’)、三倍体白杨杂种、三倍体青杨杂种、三倍体黑杨杂种；所 述四倍体杨树选择四倍体白杨杂种或四倍体青杨杂种。
其中，所述孢母细胞处于减数分裂的粗线期或终变期。
特别是，按照如下步骤确定所述处于减数分裂时期的孢母细胞：首先采集雄花 芽，用Farmer氏固定液于4℃进行固定30分钟；接着将花药从花芽上取下并置于 载玻片上；然后用2％醋酸洋红染色液染色并夹碎花药，于明场显微镜下观察，确 定孢母细胞的发育时期。
尤其是，所述Farmer氏固定液由体积之比为3：1的95％乙醇和乙酸组成。
特别是，还包括将诱变处理后的雄花芽在温度为15-25℃的条件下培养至雄花 序发育成熟。
本发明提高多倍体植物配子育性的方法具有如下优点：
1、本发明方法处理后的多倍体杨树的配子育性显著提高，花粉萌发率显著提 高，经过本发明方法处理的花粉的萌发率是为正常多倍体杨树花粉萌发率的9.9倍 以上，甚至达到18.7倍。
2、采用本发明方法处理的多倍体杨树的花粉的直径差异显著，花粉中存较高 比例的大花粉，并且花粉直径两极分化明显，直径频率分布呈双峰分布；本发明方 法处理使得‘银中杨’部分花粉直径增加，产生较高比例染色体数未减数的大花粉， 大花粉比例达到44.7％。
3、本发明方法为多倍体杨树的各条染色体人为地提供同源染色体，帮助其完 成配对，克服多倍体材料减数分裂过程染色体配对、分离紊乱的问题，显著提高配 子育性，从而实现多倍体杨树品种的有性利用，提高杨树新种质创育效率。
4、本发明方法抑制多倍体杨树减数第一次分裂过程纺锤丝形成，阻止多倍体 材料减数分裂过程染色体不平衡分离保证减数第二次分裂过程姊妹染色单体的平衡 分离，从而确保形成整倍性且染色体数量平衡的配子，显著提高配子育性，实现多 倍体杨树品种的有性利用，提高杨树新种质创育效率。
5、本发明方法实现了对现有多倍体植物尤其是多倍体杨树品种的有性利用， 而且本发明方法在提高多倍体杨树配子育性方面具有较强的即时性、有效性、可靠 性。
6、本发明方法具有操作简单、周期短、使用的仪器易得，耗资较少，易于操 作，结果可靠，有助于对多倍体植物有性杂交繁殖。
7、本发明提高多倍体杨树配子育性的方法，对于充分利用现有多倍体品种资 源，通过多倍体有性杂交途径提高多倍体新种质创育效率，创制大量多倍体种质资 源，推动杨树多倍体育种研究进展具有重要价值和实践意义，同时对于其他类似植 物的多倍体植株配子育性提高技术具有重要的借鉴意义。
附图说明
图1为本发明实施例1中三倍体‘银中杨’的正常对照花粉与诱变处理花粉直 径及直径频率分布对比图；其中：图1A为对照花粉醋酸洋红染色观察图；图1B为 对照花粉的直径频率分布图；图1C为诱变处理花粉醋酸洋红染色观察图；图1D为 诱变处理花粉的直径频率分布图。
图2为本发明实施例1中三倍体‘银中杨’的正常对照花粉与诱变处理花粉萌 发情况对照图；其中：图2A为对照花粉的萌发情况图；图2B为诱变处理花粉的萌 发情况图。
图3为正常多倍体植物减数分裂的模式图。
图4为本发明提高多倍体植物减数分裂的模式图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述 而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本 领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方 案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明的实验材料选择我国东北地区广泛栽培的三倍体雄株杨树品种‘银中 杨’，采集雄花枝水培于温室内。
多倍体植物减数分裂过程，同源染色体联会异常且分离不平衡，引起配子体内 染色体非整倍或剂量不平衡，具有高败育率的特点。三倍体‘银中杨’染色体数为 2n＝3x＝57，即每条染色体有3条同源染色体，在减数第一次分裂过程中，3条同源 染色体必然不可能平均分离到两极，导致其花粉的染色体数目处于非整倍和不平衡 状态，花粉生活力低下。
实施例1
1、花枝水培处理
将三倍体‘银中杨’雄花枝水培于温室内，温室的温度保持为15-25℃；水培 过程每3天换一次清水，并在自来水管下冲洗掉培养过程中的代谢物。自花枝水培 开始，每隔2-3小时采集雄花芽，用Farmer氏固定液(95％乙醇：乙酸＝3:1)于4 ℃进行固定，固定30分钟后，用小镊子将花药从花芽上取下，置于载玻片上，用 2％醋酸洋红染色液染色并夹碎花药，使花粉母细胞释放出来，去除大块杂质，盖上 盖玻片，于明场显微镜下观察。
2、花粉诱变处理
当观察到‘银中杨’花粉母细胞减数分裂进行到粗线期(染色体明显缩短变粗， 并且染色较深)时，立即将水培花枝转移到5-10℃环境中，以免其发育过快，同时 采用微量注射器向花芽内施加0.5％秋水仙碱溶液，进行诱变处理，注射次数为5次， 相邻两次注射的时间间隔为4小时。诱变处理后，将花枝移回温室，继续水培至雄 花序发育成熟，收集诱变处理花粉。
以未进行秋水仙碱溶液诱变处理的正常发育的花粉(对照花粉)作为对照。
在本发明的相对低温的诱变处理温度(5-10℃)下，细胞发育速度降低，提高 诱变效果，防止由于温度高而导致细胞发育快，诱变不彻底，降低配子育性，降低 诱变效率。
3、结果
1)花粉直径
将诱变处理的花粉和对照花粉分别置于载玻片上，滴加1滴醋酸洋红染液染 色，观察，估测加倍的效果，并利用目镜测微尺随机测量至少1000粒饱满球形花粉 的直径，观察结果如图1所示。
其中：图1A为对照花粉醋酸洋红染色观察图，显示正常花粉直径较为均匀； 图1B为对照花粉的直径频率分布图，呈近似高斯分布；图1C为诱变处理花粉醋酸 洋红染色观察图，显示花粉中存较高比例的大花粉；图1D为诱变处理花粉的直径 频率分布图，呈双峰分布，表明处理使得花粉直径发生了分化。
从上述结果可知：经秋水仙碱溶液诱变处理的花粉，花粉直径的频率分布与对 照正常花粉相比存在较大差异。其中，对照花粉直径较为均一(如图1A)，直径频 率分布呈近似高斯分布(如图1B)，而诱变处理后的花粉直径差异显著，两极分化 明显(如图1C)，直径频率分布呈双峰分布(如图1D)，表明经秋水仙碱溶液诱变 处理使得‘银中杨’部分花粉直径有所增加，产生了较高比例染色体数未减数的大 花粉(染色体数为2n＝3x＝57)，大花粉比例达到44.7％。
2)花粉萌发
用干净毛笔将新鲜收集的诱变处理花粉和对照花粉分别均匀撒播在固体培养 基上，于恒温恒湿培养箱内进行萌发培养，其中固体培养基为：1.5％琼脂+120g/L 蔗糖+60mg/L硼酸+80mg/L氯化钙；萌发培养温度为25±1℃，培养时间为18h，利 用明场显微镜观察，统计其萌发率，以评价其生活力水平。观察结果如图2所示。
图2A为对照花粉的萌发情况，由于三倍体‘银中杨’减数分裂紊乱，导致花 粉高度败育，正常萌发的花粉极少，萌发率极低；图2B为诱变处理花粉的萌发情 况，观察到较多萌发产生的花粉管，而且萌发的绝大部分是大花粉，表明适当的理 化处理使得花粉的生活力显著提高。
花粉萌发测试结果如表1所示，从表1的试验结果发现，对照花粉是三倍体‘银 中杨’花粉，存在减数分裂紊乱等问题，花粉的萌发率非常低(图2A)，仅为1.77％； 诱变处理花粉萌发率则显著提高(图2B)，达到了33.06％，而且萌发的绝大部分为 大花粉。
实施例2
1、花枝水培处理
与实施例1相同。
2、花粉诱导
当观察到‘银中杨’花粉母细胞减数分裂进行到终变期(二价体高度浓缩并分 散到核的边缘，核仁变小乃至消失)时，立即将水培花枝转移到5-10℃环境中，以 免其发育过快，同时采用微量注射器向花芽内施加0.5％秋水仙碱溶液，进行诱变处 理，注射次数为5次，相邻两次注射的时间间隔为4小时。诱变处理后，将花枝移 回温室，继续水培至雄花序发育成熟，收集诱变处理花粉。
以未进行秋水仙碱溶液诱变处理的正常发育的花粉(对照花粉)作为对照。
3、结果
将诱发处理的花粉和对照花粉分别置于载玻片上，滴加1滴醋酸洋红染液染 色，观察，估测加倍的效果，并利用目镜测微尺随机测量至少1000粒饱满球形花粉 的直径；同时用干净毛笔将诱变处理花粉和对照花粉分别均匀撒播在固体培养基上， 于恒温恒湿培养箱内进行萌发培养，其中固体培养基为：1.5％琼脂+120g/L蔗糖 +60mg/L硼酸+80mg/L氯化钙；萌发培养温度为25±1℃，培养时间为18h，统计其 萌发率，以评价其生活力水平。
观察结果如下：诱变处理花粉中直径显著大于对照花粉的大花粉比例达到 27.3％，诱变处理花粉直径的频率分布同样呈现双峰分布；诱变处理花粉生活力达 到17.5％，与对照花粉相比有显著提高，如表1所示。
表1‘银中杨’正常对照花粉和诱变处理花粉的萌发率对比结果
样本 萌发率
对照花粉 1.77％
实施例1 33.06％
实施例2 17.5％
从图1、2和表1的结果可以看出，在三倍体杨树‘银中杨’的减数分裂过程 对花芽注射秋水仙碱溶液，施加理化诱变处理，可以抑制减数第一次分裂发生，这 样在减数第二次分裂过程中，姊妹染色单体发生正常分离，可防止减数分裂染色体 不平衡分离现象的产生，保证减数分裂过程的有序性，从而显著提高多倍体植物的 配子育性，本发明的配子育性模式图如图4所示。本发明方法提高了多倍体植物的 配子育性，尤其是三倍体杨树的配子育性，为利用现有多倍体植物资源进行杂交创 育多倍体新种质奠定技术基础。同时证明，利用理化处理诱导植物配子染色体加倍 的技术可以提高多倍体植物的配子生活力，重新诠释了该技术在植物多倍体诱导中 的实用性，克服了近年来对该技术的偏见。
三倍体‘银中杨’植物正常减少分裂如图3所示，每个细胞中个体大的染色体 为一组同源染色体，个体小的染色体为一组同源染色体，在三倍体植物正常减数分 裂过程中，3条同源染色体联会，产生联会不紧密现象，在减数第一次分裂过程中， 3条同源染色体不均等的分向两极，致使每一极含有的同源染色体数目不平衡，而 在减数第二次分裂过程中，每条染色体的姊妹染色单体呈均等分离，因此在产生的 配子中形成非整倍染色体和不同染色体间剂量不平衡的结果，导致高度败育。
本发明提高多倍体杨树配子育性的方法，对减数分裂时期的花芽注射秋水仙碱 溶液，进行诱变处理，抑制减数第一次分裂纺锤丝的形成，使得本来应该不均等分 向两极的同源染色体只能共同停留于细胞赤道区而不发生分离，这样在减数第二次 分裂过程中，姊妹染色单体分离后，形成含有完整染色体数并且剂量平衡的未减数 配子，这些配子具有育性(如图4)。