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1、10申请公布号CN104204216A43申请公布日20141210CN104204216A21申请号201380016801022申请日2013031261/616,99020120328USC12P19/14200601C13K7/0020060171申请人丹尼斯科美国公司地址美国加利福尼亚州72发明人T克雷恩豪特BC库普斯FK库伊SH李JK舍蒂BA斯托姆74专利代理机构北京市中咨律师事务所11247代理人陈迎春黄革生54发明名称高麦芽糖糖浆制备方法57摘要本教导提供了一种直接转化法，用于将颗粒淀粉转化为可溶性糖类组合物，该组合物具有高、很高和/或超高的麦芽糖含量。该方法涉及使颗粒淀粉的含。
2、水浆料与包含适当比率淀粉酶和产麦芽糖酶的酶组合物接触，生产可溶性淀粉底物，该底物在酶的作用下可转换为含较高麦芽糖的糖类组合物。该过程可能需在多个温度以达到相同结果。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014092686PCT国际申请的申请数据PCT/US2013/0303842013031287PCT国际申请的公布数据WO2013/148152EN2013100351INTCL权利要求书3页说明书37页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书3页说明书37页附图2页10申请公布号CN104204216ACN104204216A1/3页21一种制备含有至少5。
3、0DP2的高DP2糖浆的方法，包括使用外源淀粉酶在处于或低于初始糊化温度下溶解颗粒淀粉底物以形成包含糊精的混合物；使用产麦芽糖酶水解所述糊精以形成所述高DP2糖浆，其中以AAU/GDS表示的淀粉酶剂量与以DP表示的产麦芽糖酶剂量的比率小于8。2一种制备含有至少70DP2的很高DP2糖浆的方法，包括使颗粒淀粉底物与外源淀粉酶和产麦芽糖酶在处于或低于初始糊化温度下接触，其中以AAU/GDS表示的淀粉酶剂量与以DP表示的产麦芽糖酶剂量的比率为0002794。3一种制备含有至少80DP2的超高DP2糖浆的方法，包括使颗粒淀粉底物与支链淀粉酶、外源淀粉酶和产麦芽糖酶在处于或低于初始糊化温度下接触，其中以。
4、AAU/GDS表示的淀粉酶剂量与以DP表示的产麦芽糖酶剂量的比率为000242。4根据权利要求12中任一项所述的方法，还包括脱支酶。5根据权利要求14中任一项所述的方法，其中所述淀粉为精制颗粒淀粉。6根据权利要求15中任一项所述的方法，其中所述淀粉为全磨谷物。7根据权利要求5或6所述的方法，其中所述淀粉来自玉米、小麦、大麦、黑麦、小黑麦、水稻、燕麦、豆子、香蕉、马铃薯、甘薯、高粱、豆类、木薯、小米、马铃薯或木薯淀粉。8根据权利要求17中任一项所述的方法，其中所述产麦芽糖酶为内源地存在的。9根据权利要求17中任一项所述的方法，其中所述产麦芽糖酶为外源地添加的。10根据权利要求19中任一项所述的方。
5、法，其中所述DP2为至少80、至少81、至少82、至少83、至少84或至少85。11根据权利要求110中任一项所述的方法，其中所述DS为介于5和40之间。12根据权利要求111中任一项所述的方法，其中所述产麦芽糖酶为淀粉酶。13根据权利要求112中任一项所述的方法，其中所述产麦芽糖酶为大麦淀粉酶、小麦淀粉酶或大豆淀粉酶。14根据权利要求13所述的方法，其中所述大麦淀粉酶为BBA或BETALASE1500。15根据权利要求13所述的方法，其中所述大豆淀粉酶为淀粉酶1500S。16根据权利要求112中任一项所述的方法，其中所述产麦芽糖酶为一种真菌淀粉酶。17根据权利要求16中任一项所述的方法，其中。
6、所述真菌淀粉酶为L。18根据权利要求112中任一项所述的方法，其中所述产麦芽糖酶为产麦芽糖淀粉酶。19根据权利要求18所述的方法，其中所述产麦芽糖淀粉酶为MAXLIFETMP100或MALTOGENASEL。20根据权利要求112中任一项所述的方法，其中所述产麦芽糖酶为FUNGAMYL800L、权利要求书CN104204216A2/3页3NOVAMYL芽孢杆菌属物种BACILLUSSP、GC626AKAA、XTENDER、来自植物材料豌豆、甘薯、黑麦、燕麦、水稻、高粱的淀粉酶、微生物的淀粉酶多粘芽孢杆菌PAENIBACILLUSPOLYMYXA、热产硫磺热厌氧杆菌THERMOANAEROBAC。
7、TERIUMTHERMOSULFURIGENES、法夫酵母XANTHOPHYLLOMYCESDENDRORHOUS、蜡样芽胞杆菌BACILLUSCEREUS、巨大芽胞杆菌BACILLUSMEGATERIUM、拟南芥ARABIDOPSISTHALIANA、来自曲霉属ASPERGILLUS例如黑曲霉ANIGER、白曲霉AKAWACHI以及米曲霉AORYZAE、木霉属物种TRICHODERMASP例如里氏木霉TRICHODERMAREESEI淀粉酶、根霉属物种RHISOPUSSP、毛霉属物种MUCORSP以及青霉属物种PENICILLIUMSP的真菌淀粉酶，或来自芽孢杆菌属物种、枯草芽孢杆菌BACI。
8、LLUSSUBTILIS、嗜热脂肪芽孢杆菌GEOBACILLUSSTEAROTHERMOPHILUS、加氏乳杆菌LACTOBACILLUSGASSERI以及栖热杆菌属物种THERMUSSP的产麦芽糖淀粉酶。21根据权利要求112中任一项所述的方法，其中所述淀粉酶为XTRA、FRED、LT300、480L、SUPRA、SCDS、MAXLIFETMP100、MALTOGENASEL、L。22根据权利要求112中任一项所述的方法，其中所述淀粉酶为SC、SC、LF、VERETASE、SC4X、SUPRA28、SUPRA2、X、120L、ALPHA、CL、AA、OPTITHERMTM、TAKATHERM。
9、TM、KEISTASETM、一种来自芽孢杆菌属物种BACILLUSSPECIES的淀粉酶所述芽孢杆菌属物种包括枯草芽孢杆菌BSUBTILIS、嗜热脂肪芽孢杆菌BSTEAROTHERMOPHILUS、迟缓芽孢杆菌BLENTUS、地衣芽孢杆菌BLICHENIFORMIS、凝结芽孢杆菌BCOAGULANS和解淀粉芽孢杆菌BAMYLOLIQUEFACIENS、来自曲霉属例如黑曲霉、白曲霉和米曲霉、木霉属物种例如里氏木霉淀粉酶、根霉属物种、毛霉属物种以及青霉属物种真菌淀粉酶，或来自芽孢杆菌属物种、枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、加氏乳杆菌以及栖热杆菌属物种的产麦芽糖淀粉酶。23根据权利要求122中任一项。
10、所述的方法，其中如果存在，所述脱支酶为L1000、D2，或来自于假单胞菌属物种PSEUDOMONASSP例如MEGAZYME的ISOAMYLASE。24根据权利要求123中任一项所述的方法，其中所述脱支酶为PROMOZYMED6诺维信、由芽孢杆菌属物种例如脱支芽孢杆菌BACILLUSDERAMICANS、嗜酸普鲁兰芽孢杆菌BACILLUSACIDOPULLULYTICUS和长野芽胞杆菌BACILLUSNAGANOENSIS分泌的支链淀粉酶、来自硫磺矿硫化叶菌SULFOLOBUSSOLFATARICUS、假单胞菌属物种PSEUDOMONASSP的支链淀粉酶以及来自多节闪烁杆菌FERVIDOBAC。
11、TERIUMNODOSUM的热稳定支链淀粉酶。25一种包含淀粉酶和产麦芽糖酶的组合物，其中以AAU/GDS表示的淀粉酶剂权利要求书CN104204216A3/3页4量与以DP表示的产麦芽糖酶剂量的比率为0002794。26根据权利要求25所述的组合物，其中以AAU/GDS表示的淀粉酶剂量与以DP表示的产麦芽糖酶剂量的比率为0002042。27根据权利要求2526中任一项所述的组合物，还包括支链淀粉酶。28根据权利要求2527中任一项所述的组合物，还包括颗粒淀粉。29根据权利要求27所述的组合物，其中所述颗粒淀粉为精制颗粒淀粉。30根据权利要求27所述的组合物，其中所述颗粒淀粉为全磨谷物。31根。
12、据权利要求2530中任一项所述的组合物，还包含权利要求1220所述的任一产麦芽糖酶、权利要求2122所述的任一淀粉酶和/或权利要求2324所述的任一支链淀粉酶。32一种制备含有至少50DP2的高DP2糖浆的方法，包括使用外源淀粉酶和外源淀粉酶在低于初始糊化温度下溶解颗粒淀粉底物；并且在比第一温度更高的温度下水解所得的混合物以形成高DP2糖浆，其中两个温度都低于所述初始糊化温度。33根据权利要求32所述的方法，其中所述第一温度被保持1至3小时。34根据权利要求32所述的方法，其中所述第一温度为约50。35根据权利要求32所述的方法，其中所述第二温度为约55至约60。36根据权利要求35所述的方法。
13、，其中所述第二温度为约55。37根据权利要求35所述的方法，其中所述第二温度为约60。38根据权利要求32所述的方法，其中所述高DP2糖浆包含至少75DP2。39根据权利要求32中所述的方法，其中所述高DP2糖浆包含至少80DP2。40根据权利要求3239所述的方法，其中相比于仅在更高温度下实施的工艺，粘度峰值被降低至少约10。41根据权利要求3240所述的方法，其中相比于仅在更高温度下实施的工艺，过滤速度被提高至少约15倍。42根据权利要求3240所述的方法，其中相比于仅在更高温度下实施的工艺，过滤速度被提高至少约2倍。43根据权利要求3240所述的方法，其中相比于仅在更高温度下实施的工艺，。
14、胶类物质被降低至少约10。权利要求书CN104204216A1/37页5高麦芽糖糖浆制备方法0001相关申请的交叉引用0002本专利申请要求于2012年3月28日提交的美国临时专利申请NO61/616,990的优先权，该文献全文引入本文以供参考。技术领域0003本发明涉及利用酶从淀粉底物制备高麦芽糖糖浆的组合物和方法。0004发明背景0005麦芽糖是一种二糖，由通过1，4糖苷键相连的两个D吡喃葡萄糖组成，它在食品/冷冻食品、烘焙、酿造和饮料行业具有较高的商业应用价值。麦芽糖也作为底物，用于生产无热量的糖类甜味剂，即麦芽糖醇。高纯度麦芽糖或纯麦芽糖是糖尿病病人所用静脉注射液的一种活性成分。根据具。
15、体应用，已经确立了含有不同麦芽糖含量的糖浆的商业化生产工艺，如，50麦芽糖高转化麦芽糖糖浆或低麦芽糖糖浆、5055麦芽糖高麦芽糖糖浆、7075麦芽糖很高麦芽糖糖浆和80麦芽糖超高麦芽糖糖浆。此类工艺的共同点在于它们都采用了双酶法，涉及两个不同的步骤，即液化和糖化。0006双酶法过去用于水解淀粉，从而制备葡萄糖或麦芽糖糖浆。第一步是在高温95下的液化步骤，然后第二步是糖化步骤。麦芽糖生产过程中的第二步被称为麦芽糖化，其通常在60或更低温度下进行。在液化步骤中，不溶解的淀粉颗粒在水中浆化，经热处理后变成糊状，并在来源于芽孢杆菌属物种的热稳定淀粉酶EC3211，1，4D葡聚糖葡聚糖水解酶的作用下发生。
16、水解，期间通常需要添加钙。源自细菌地衣芽孢杆菌BACILLUSLICHENIFORMIS如，由杜邦杰能科生产的FRED或由诺维信生产的L120、嗜热脂肪芽孢杆菌BACILLUSSTEAROTHERMOPHILUS如，由杜邦杰能科生产的XTRA和由诺维信生产的SC及SUPRA或地衣芽孢杆菌BACILLUSLICHENIFORMIS和嗜热脂肪芽孢杆菌BACILLUSSTEAROTHERMOPHILUS的混合物如，由杜邦杰能科生产的CLEARFLOWTMAA或由诺维信生产的SUPRA的热稳定淀粉酶首先用于将淀粉在95高温和PH值5265时液化成低DE葡萄糖当量的可溶淀粉水解产物。在麦芽糖化步骤，产麦。
17、芽糖酶MALTOGENICENZYME例如真菌淀粉酶如，由杜邦杰能科生产的L或由诺维信生产的800L和植物淀粉酶如，由杜邦杰能科生产的BBA或由SENSON生产的BETALASE1500L一般在温度低的多的情况下使用，从而进一步水解可溶淀粉水解产物。对于麦芽糖含量超过60的麦芽糖糖浆，在液化淀粉的麦芽糖化过程中加入脱支酶，比如支链淀粉酶如，由杜邦杰能科生产的L1000，由诺维信生产的D2或D6。0007以前通过液化和麦芽糖化生产麦芽糖糖浆时需要高能耗，目的是将淀粉浆加热至说明书CN104204216A2/37页695以上从而实现液化，并使其冷却至60进而进行麦芽糖化。这些方法比较复杂，涉及多个。
18、步骤、多种PH值和多种工作温度。高温的另一个缺点是，它会引起美拉德反应产物的形成，从而导致不需要的颜色形成。精制淀粉通常包含0205的蛋白质。高温度和高PH值会促进蛋白质氨基与糖类活性还原基的缩合，生成活性缩合物，即美拉德反应产物，其进一步聚合成高分子聚合物并产生不需要的颜色。这种不需要的颜色需要通过使用活性炭处理的精制工艺才能消除。为制备超高麦芽糖糖浆，需要使液化中使用的淀粉酶失活，这一过程被称为消除步骤。通常的做法是，使液化淀粉通过温度很高的二次喷射式蒸煮锅。这一步骤会消耗大量能源，而且会造成额外美拉德反应产物的形成。0008在液化过程中，淀粉酶水解淀粉。通过每个酶水解作用，淀粉分子中的一。
19、个1，4糖苷键断裂，形成两个较小的葡萄糖聚合物，从而导致一个额外的还原端和一个额外的非还原端的形成。0009在麦芽糖化过程中，淀粉酶从液化期间所形成的葡萄糖聚合物的非还原端释放连续的麦芽糖分子。淀粉酶在液化期间的作用为淀粉酶作用于水解淀粉提供了大量的反应区域。淀粉酶无法水解1，6糖苷键，且会在分支点或接近分支点时停止发挥作用。脱支酶如，支链淀粉酶会水解1，6糖苷键，从而促进液化淀粉在淀粉酶的作用下实现更完整水解，这一效果在业内已得到公认。当脱支酶水解1，6糖苷键，它只形成了一个额外的还原端，而不是非还原端。0010液化过程中形成的直链葡萄糖聚合物和麦芽糖化过程中在支链淀粉酶作用下形成的直链葡萄。
20、糖聚合物可以包含偶数或奇数个葡萄糖分子。在淀粉酶作用下，当具有偶数个葡萄糖分子的直链葡萄糖聚合物发生完全水解时，只会生成麦芽糖。当具有奇数个葡萄糖分子的葡萄糖聚合物在淀粉酶作用下发生水解时，麦芽三糖也剩下了，原因是它不能在淀粉酶作用下发生水解。0011已知比较重要的一点是，当生成高麦芽糖和超高麦芽糖水解产物时，应限制麦芽三糖的形成。例如，US4917916、US3708396和US3804715介绍了低DE液化产物在高纯度麦芽糖糖浆制备过程中的应用。通过采用包含大量长链葡萄糖聚合物和短链葡萄糖聚合物的低DE液化产物，生成奇数个聚合物的风险降低，从而导致较高的麦芽糖含量。超高麦芽糖糖浆制备过程中。
21、的DE值可低至05。可惜的是，由于低DE液化产物的粘度较高且很可能发生回生，因此很难对其加以利用。回生淀粉可以抵抗因传统麦芽糖化酶导致的水解，从而形成碘阳性麦芽糖糖浆一般被称为“蓝囊”。由于存在与加工有关的过滤问题且会影响最终产品的质量，碘阳性麦芽糖糖浆在商业领域还未被广泛接受。0012为了在一定程度上克服这些问题，US4917916、US3708396和US3804715也介绍了低干固体DS含量的利用。然而，低干固体含量也有其自身的局限性，如需要的大糖化体积和蒸发期间的高能耗。从理论上讲，利用DE值接近于零的液化产物会在麦芽糖化过程中形成最高的麦芽糖含量。这是因为，低DE尽可能限制了具有奇数。
22、个葡萄糖残基的葡萄糖聚合物的数量，从而实现最高麦芽糖含量。然而实际上，利用包括液化步骤在内的传统工艺无法达到如此低的DE。0013用于制备超高麦芽糖糖浆的其它方法涉及常规的两步水解反应，之后需进行一定形式的纯化，如活性炭处理US4294623、色谱法分离US4487198和结晶US4846139。这种额外的纯化步骤既复杂又昂贵。说明书CN104204216A3/37页70014对于涉及常规两步水解反应的其它超高麦芽糖糖浆制备方法，除淀粉酶、淀粉酶和脱支酶之外，还要求利用第四种酶，即麦芽糖淀粉酶。这样的方法在US6346400、US5141859和CA1052717中有描述。0015其描述了利用。
23、生淀粉水解生成麦芽糖糖浆的低温工艺，目的是在一定程度上克服液化糖化工艺的上述限制。美国专利5188956公开了一种低聚麦芽糖糖浆制备方法，这种糖浆主要包含麦芽糖、麦芽三糖和葡萄糖，其利用生淀粉作为底物和来自嗜热脂肪芽孢杆菌BACILLUSSTEAROTHERMOPHILUS的淀粉酶。所得的糖浆的麦芽糖含量约为5055，并且麦芽三糖的含量也较高30365。但这一工艺不适用于制备高麦芽糖糖浆或超高麦芽糖糖浆。美国专利6,361,809也描述了90以上麦芽糖的制备工艺，其在温度低于淀粉糊化温度的条件下利用生玉米淀粉作为底物和EC321133类淀粉酶。在这一过程中，反应介质通过超滤UF膜组件得到不断的。
24、循环利用，从而移除较小的寡糖，包括麦芽糖和葡萄糖。利用UF膜组件制备的糖浆滤液的最终产率只有最初淀粉重量的28，干固体含量只有11。这一工艺的缺点在于DS含量低、产率有限且需要连续回收利用UF膜组件，从而限制了大规模工业应用。GB1470325描述了颗粒淀粉通过1、2或3个步骤在酶的作用下水解成包含水解产物的葡萄糖和麦芽糖。在这些工艺中没有麦芽糖含量超过80的水解产物的描述，迄今为止也没有认识到低淀粉酶含量的重要性。0016因此，从加工和经济性两者的角度来看，高麦芽糖糖浆和超高麦芽糖糖浆的现有生产技术还存在很多不足，需要进一步的改进。发明内容0017本教导涉及一种高DP2糖浆包含至少50DP2。
25、制备方法，其包括在初始糊化温度或更低温度下使用外源淀粉酶使颗粒淀粉底物溶解从而生成包含糊精的混合物，并利用产麦芽糖酶水解糊精从而形成高DP2糖浆，其中淀粉酶单位为AAU/GDS与产麦芽糖酶单位为DP的剂量比率小于8。0018此外，还提供了附加的方法和组合物。附图说明0019图1展示了根据本教导编制的多个实验的示例性资料。0020图2展示了根据本教导编制的多个实验的示例性资料。0021图3展示了根据本教导编制的多个实验的示例性资料。具体实施方式0022我们在此描述了一个意外发现，即，在存在高活性剂量的产麦芽糖酶的情况下，通过利用低活性剂量淀粉酶处理颗粒淀粉用作底物可模拟超低DE淀粉水解产物。这一。
26、处理过程可通过单一步骤完成。脱支酶可进一步有利于较高的麦芽糖含量。0023在不受机制限制的情况下，我们认为低含量的淀粉酶会使颗粒淀粉逐渐溶解，释放的葡萄糖聚合物随即会在脱支酶和产麦芽糖酶作用下发生水解。此外还发现，在测定所得糖浆的麦芽糖含量时，淀粉酶与淀粉酶的比率起着重要作用，且在适当条件下，麦芽糖的含量可达到90，甚至更高。说明书CN104204216A4/37页80024这一工艺的优势在于，它涉及单步骤工艺，且可在单一PH值、单一温度和只添加一种酶的条件下完成。这显著简化了超高麦芽糖糖浆的生产工艺。另外，也不要求实施消除工序也就是说，不需要通过耗时耗能的加热工序使淀粉酶失活。在本教导的工艺。
27、中，可通过淀粉酶与淀粉酶的适当比率在糖化期间维持较低的DP3含量。0025本教导描述了一个意外观察结果，即，当利用颗粒淀粉或部分糊化淀粉制备麦芽糖时，减小淀粉酶的剂量会导致麦芽糖含量的增加，DP3和DP3含量的减少，这样增溶作用增强。这在图1中有所描述。图1结合了多个实验数据，以表示在反应时间为48小时的条件下，淀粉酶剂量与反应介质糖类组合物之间的关系。图1结合了60条件下的实验数据，小麦淀粉的初始DS为32，XTRA的剂量为0120AAU/GDS。淀粉酶BBA的剂量始终为063DP/GDS，支链淀粉酶L1000的剂量为0530ASPU/GDS。图1显示，淀粉酶的剂量与DP2、DP3和DP3之。
28、间存在明显的相关性。就增溶而言，淀粉酶的剂量越大，增溶作用越小。糖类组合物与淀粉酶剂量之间的相关性不受支链淀粉酶剂量0530的影响。0026根据这些数据，我们可以得出一个结论较低的淀粉酶含量会使淀粉缓慢溶解，淀粉在淀粉酶和支链淀粉酶的作用下会立刻转化为麦芽糖。反应期间出现的情况是，生成低浓度溶解淀粉且其暴露在大剂量淀粉酶中。在不受理论限制的条件下，据信这是为什么产生低DP3含量和可以得到高麦芽糖含量的原因。相关数据进一步表明，淀粉酶与淀粉酶的比率非常重要。可以增加淀粉酶来促进增溶，只要淀粉酶剂量也同样增大。只要淀粉酶与淀粉酶的比率保持不变，最终水解产物中麦芽糖的含量将十分相似。这从图2中可以看。
29、出，图中显示了48小时后水解产物中麦芽糖含量与淀粉酶活性和淀粉酶活性之间比率的关系曲线。图2结合了实验数据，其中实验PH值始终为50，干固体含量为1040，综合实验的温度为5060，XTRA剂量为00120AAU/GDS，BBA剂量为0191008DP/GDS，L1000剂量为0550ASPU/GDS。0027因此，在一些实施方式中，本教导涉及一种高DP2糖浆包含至少50DP2制备方法，其包括在初始糊化温度或更低温度下利用外源淀粉酶使颗粒淀粉底物溶解从而生成包含糊精的混合物，并利用相对外源淀粉酶化学计量过量的产麦芽糖酶水解糊精来形成高DP2糖浆。0028在一些实施方式中，本教导涉及一种很高DP。
30、2糖浆包含至少70DP2的制备方法，包括在初始糊化温度或更低温度下使颗粒淀粉底物与外源淀粉酶和产麦芽糖酶接触，其中淀粉酶单位为AAU/GDS与产麦芽糖酶单位为DP/GDS的剂量比率为0002794。在一些实施方式中，该比率为00057、0024或0012。0029在一些实施方式中，本教导涉及一种超高DP2糖浆包含至少80DP2制备方法，包括在初始糊化温度或更低温度下使颗粒淀粉底物与支链淀粉酶一种外源淀粉酶和产麦芽糖酶接触，其中淀粉酶单位为AAU/GDS与产麦芽糖酶单位为DP/GDS的剂量比率为0002042。在一些实施方式中，该比率为000503、00202或00201。0030在本教导的一些。
31、实施方式中，该反应可以在温度高于所用淀粉初始糊化温度时进说明书CN104204216A5/37页9行。例如，在一些实施方式中，反应温度比初始糊化温度高1、2、3、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20度。在一些实施方式中，该反应可在温度比初始糊化温度高15、110、510、115、515或120度时进行。0031在本教导的一些实施方式中，该反应可以在温度低于所用淀粉初始糊化温度时进行。例如，在一些实施方式中，反应温度比初始糊化温度低1、2、3、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20度。在。
32、一些实施方式中，该反应可在温度比初始糊化温度低15、110、510、115、515或120度时进行。0032在一些实施方式中，本教导提供一种组合物，其包含淀粉酶和产麦芽糖酶，其中淀粉酶单位为AAU/GDS与产麦芽糖酶单位为DP/GDS的比率为0002794。在一些实施方式中，该比率为0002042、00057、0024或0012。0033在一些实施方式中，在按照本教导利用酶进行处理之后，可以将未溶解的剩余淀粉用作发酵原料。例如，可对未溶解的淀粉进行传统液化，从而形成能够通过微生物发酵的液化产物，进而形成各种生化药剂，例如乙醇、乳酸、琥珀酸、柠檬酸、谷氨酸钠、13丙二醇等类似物质。在一些实施方式。
33、中，可以利用初次低温处理时所采用的酶对未溶解的淀粉进行再次处理，从而形成糖浆和/或发酵底物。0034通用技术0035除非另外指明，否则所用的所有技术和科学术语在相关科学领域有其普遍含义。SINGLETON，ETAL，DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY，2DED，JOHNWILEYANDSONS，NEWYORK1994SINGLETON等人，微生物学和分子生物学词典，第2版，约翰威立父子出版公司，纽约，1994年HALEMARKHAM，HARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY，HARPERPERENNIAL，NY1991。
34、HALE和MARKHAM，哈珀柯林斯生物学词典，哈珀永久出版社，纽约州，1991年提供了描述本发明的多个术语的普遍含义。0036除非另外指明，否则对本发明的实施将采用分子生物学包括重组技术、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学领域的常规技术，这些技术均为本领域的现有技术。这些技术在以下文献中有完整解释“MOLECULARCLONINGALABORATORYMANUAL”，SECONDEDITIONSAMBROOKETAL，1989分子克隆实验指南，第二版SAMBROOK等人，1989年；“OLIGONUCLEOTIDESYNTHESIS”MJGAIT，ED，1984寡核苷酸合成MJGAIT编。
35、辑，1984年；“ANIMALCELLCULTURE”RIFRESHNEY，ED，1987动物细胞培养RIFRESHNEY编辑，1987年；“METHODSINENZYMOLOGY”ACADEMICPRESS，INC酶学方法美国学术出版社；“CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY”FMAUSUBELETAL，EDS，1987，ANDPERIODICUPDATES现代分子生物学实验技术FMAUSUBEL等人编辑，1987年，以及定期更新版本；“PCRTHEPOLYMERASECHAINREACTION”，MULLISETAL，EDS，1994PCR聚合酶链反应，MU。
36、LLIS等人编辑，1994年。SINGLETONETAL，“DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY”2NDED，JWILEYSONSNEWYORK，NY1994SINGLETON等人，微生物学和分子生物学词典，第二版，约翰威立父子出版公司，纽约，1994年和BALTZETAL，“MANUALOFINDUSTRIALMICROBIOLOGYANDBIOTECHNOLOGY”3RDED，WASHINGTON，DCASMPRESS，2010BALTZ等人，工业微生物与生物技术手册，第3版，华盛顿特区美国微生物学会出版社，2010，为本领域技术人员提供了。
37、本专利申请使用的多个术语的一般指导。说明书CN104204216A6/37页1000371运用高压液相色谱HPLC法分析碳水化合物组合物。寡糖反应产物的组合物，由使用如下所示A或B任一种方法描述的高压液相色谱HPLC测得。对于给定的样品使用方法A或方法B得到类似的结果。浆料样品的制备包括在转速13000转/分钟下离心5分钟，稀释糖浆为10的溶液，以及煮沸10分钟使酶变性。在进行HPLC分析之前，使样品冷却，然后用022M的盘式过滤器TITANSYRINGE过滤器特氟龙，045M30MM进行过滤。基于这两种方法，所采用的HPLC色谱柱可按照分子量分离糖类。例如，标识DP1为单糖，例如葡萄糖；标识。
38、DP2为二糖，例如麦芽糖；标识DP3为三糖，例如麦芽三糖，以及标识“DP3”是聚合度DP为4或更高的寡糖。不同糖类DP3，DP3，DP2，DP1的色谱图面积百分比是由每种糖的面积除以所有糖化物的总面积计算得到。0038A采用了配有HPLC色谱柱REZEXRCM单糖的HPLC系统金32克拉型贝克曼系统，富勒顿，美国加利福尼亚州，使其温度维持在80，并安装有一个折光率RI检测仪。用流速为每分钟06ML的去离子水作为流动相。将二十微升的30糖浆注射至色谱柱中。0039BHPLC系统岛津公司快速模块化HPLC；日本京都PROMINENCEMODULARHPLC配备有HPLC柱REZEXRHM单糖H8相。
39、，购自菲罗门公司；托兰斯，美国加利福尼亚州保持在85条件下使用。用流速为每分钟06ML的超纯软化水MILLIQ作为流动相。对于每个样品，将5微升10糖浆溶液注射到色谱柱中。00402一个AAU的细菌淀粉酶活性为在60和用30MM乙酸钠缓冲的PH60下，每分钟从包含312MM氯化钙的干固体可溶性里氏淀粉的5溶液水解10MG淀粉所需的酶量。00413以糖化力度DP为单位测定淀粉酶的活性。该分析基于在温度为20、PH46时淀粉底物的30分钟水解。通过利用碱性铁氰化物的滴定程序测定水解期间生成的还原糖基团。一个淀粉酶活性单位用DP表示定义为用于生成足够多还原糖所需淀粉酶的量该淀粉酶来自01ML5样品酶。
40、溶液，当在20下用100ML底物对样品进行1小时温育时，所生成的还原糖应足以还原5ML斐林溶液。00424颗粒淀粉的增溶百分比。使用25ML微量离心管从搅拌浆料中取样，从而进行增溶试验。以13,000RPM的转速使离心管旋转约4分钟，在30条件下测定上清液的折光率RISUP。总干物质测定取152ML淀粉浆到25ML离心管中，用一次性微量移液管加入一滴FRED，然后在沸水中煮10分钟。以13,000RPM的转速使离心管旋转约4分钟，在30条件下测定上清液的折光率RITOT。利用适当的DE表测定上清液的总干物质基于RISUP和整个样品的总干物质基于RITOT。将RISUP转换为DS的表为42DE，。
41、即来自玉米加工协会的关键数据表的表E。将RITOT转换为DS，可以使用不止一种表格，并在表32DE来自玉米加工协会的关键数据表的表D和4DE之间进行内插。首先，用上清液的DS值除以初始DS105，从而对增溶百分比进行估算。估算的增溶百分比用于在根据表42DE和32DE获得的DS之间进行内插。增溶百分比的计算方法为用上清液干物质含量除以总干物质含量，再乘以100。然后，对该值进行校正，以弥补剩余颗粒淀粉如，占据空间并干扰计算的未溶解淀粉，包括反应介质中的未溶解淀粉的影响。00435一个耐酸支链淀粉酶单位ASPU为在PH45和温度60下，每分钟从支链淀粉释放一当量以葡萄糖计的还原力的酶量。说明书C。
42、N104204216A107/37页1100446产麦芽糖淀粉酶的单位MAA。该方法属于UV吸收法，其将麦芽三糖用作可溶底物。产麦芽糖淀粉酶将麦芽三糖转化为麦芽糖和葡萄糖。在GLUCDH葡萄糖脱氢酶的催化作用下，葡萄糖会将NAD烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原为NADH。可以通过UV检测是否形成了NADH一种葡萄糖当量测定方法。将被本领域的普通技术人员所认可，以MAA单位表示的产麦芽糖淀粉酶剂量可易于在AAU分析中测试以测定相关的AAU单位，以及在分析中测试以测定相关的DP单位。00457真菌淀粉酶SKB的单位。该方法可用于测定真菌淀粉酶的活性。此分析使用非还原端糖化学封闭的对硝基苯麦芽庚糖苷底物。葡。
43、萄糖苷酶和葡糖淀粉酶被用作偶联酶。封闭的端糖阻止葡糖淀粉酶的进攻。对硝基苯基的释放率与真菌淀粉酶的活性成比例，并于410NM处进行监测。将被本领域的普通技术人员所认可，以SKB单位表示的真菌淀粉酶的剂量可易于在AAU分析中测试以测定相关的AAU单位，以及在分析中测试以测定相关的DP单位。0046定义0047术语“颗粒淀粉”指未蒸煮的生的淀粉，其未进行糊化。0048术语“淀粉糊化”指淀粉分子增溶形成粘性混悬液。0049术语“初始糊化温度”指淀粉底物发生糊化时的最低温度。本领域技术人员可易于测定确切的温度，它取决于具体的淀粉底物，进一步可取决于淀粉来源的特定植物品种和生长条件。根据本教导，特定淀粉。
44、的初始糊化温度是指利用GORINSTEINSANDLIICL，STARCH/STARK，VOL4412PP4614661992GORINSTEINS和LIICL，淀粉，第4412卷，第461466页，1992年所述的方法使5淀粉颗粒失去双折射功能所需要的温度。对于许多颗粒淀粉而言，初始淀粉糊化温度差异较大，可根据此处工艺进行选择，其包括大麦5259、小麦5864、黑麦5770、玉米6272、高直链淀粉玉米6780、水稻6877、高粱6877、马铃薯5868、木薯5969和甘薯5872SWINKELS，PG3238INSTARCHCONVERSIONTECHNOLOGY，EDSVANBEYNUM。
45、ETAL，1985MARCELDEKKERINCNEWYORKSWINKELS，第3238页，淀粉转化技术，VANBEYNUM等人编辑，1985年，马塞尔德克尔公司，纽约和THEALCOHOLTEXTBOOK3SUPRDEDAREFERENCEFORTHEBEVERAGE，FUELANDINDUSTRIALALCOHOLINDUSTRIES，EDSJACQUESETAL，1999NOTTINGHAMUNIVERSITYPRESS，UK醇教科书饮料、燃料和工业酒精行业参考，第3版增补，JACQUES等人编辑，1999年，诺丁汉大学出版社，英国。糊化涉及结晶区的熔化、分子的水合以及颗粒的不可逆溶胀。
46、。对于给定的颗粒，糊化温度发生在一定范围内，因为结晶区的大小和/或分子有序性或晶格完整程度不同。STARCHHYDROLYSISPRODUCTSWORLDWIDETECHNOLOGY，PRODUCTION，ANDAPPLICATIONSEDS/SHENCKANDHEBEDA，VCHPUBLISHERS，INC，NEWYORK，1992ATP26淀粉水解产物世界范围的技术、生产和应用SHENCK和HEBEDA编辑，VCH出版公司，纽约，1992年，第26页。0050术语“DE”或“葡萄糖当量”是用于衡量总还原糖浓度的一种行业标准，基于干重将其计算为D葡萄糖的量。非水解的颗粒淀粉的DE几乎为0，而。
47、D葡萄糖的DE为100。0051术语“淀粉底物”是指颗粒淀粉或液化淀粉，该淀粉可以是精制淀粉、全磨谷物或分离的谷物。淀粉底物可来自多种不同的植物，包括玉米、小麦、大麦、黑麦、小黑麦、说明书CN104204216A118/37页12水稻、燕麦、豆子、香蕉、马铃薯、甘薯、高粱、豆类、木薯CASSAVA、小米、马铃薯或木薯TAPIOCA。0052术语“浆料”是指包含未溶解淀粉颗粒的含水混合物。0053术语“液化淀粉”是指通过传统淀粉液化工艺溶解的淀粉。0054术语“麦芽糖糖浆”是指包含固态麦芽糖的含水组合物。可以定义不同级别的麦芽糖糖浆，例如，低麦芽糖糖浆麦芽糖含量50、高麦芽糖糖浆麦芽糖含量为50。
48、55、很高麦芽糖糖浆麦芽糖含量为7075和超高麦芽糖糖浆麦芽糖含量80。0055术语“干固体含量DS”是指基于干重的浆料中的总固体包括溶解和未溶解的固体含量用表示。“初始DS”指零时间点时浆料的干固体含量。随着水解反应的进行，溶解干固体的含量可用“糖浆DS”和“上清液DS”表示。0056“淀粉酶”EC3211指能够对1，4D糖苷键水解起催化作用的酶。也可以将此类酶定义为能够影响多醣包含1，4D葡萄糖单元1，4D糖苷键外型或内型水解的酶。用于描述这些酶的另一术语是糖原酶。典型的酶包括1，4葡聚糖4葡聚糖水化酶葡聚糖水解酶。在本发明所涉及的一些实施方式中，淀粉酶具有EC编号EC3211。在一些实施。
49、方式中，淀粉酶为热稳定细菌性淀粉酶。合适的淀粉酶可能是天然生成的、重组的和突变的淀粉酶。在优选的实施方式中，淀粉酶源自芽孢杆菌属物种BACILLUSSPECIES。优选的芽孢杆菌属物种BACILLUSSPECIES包括枯草芽孢杆菌BSUBTILIS、嗜热脂肪芽孢杆菌BSTEAROTHERMOPHILUS、迟缓芽孢杆菌BLENTUS、地衣芽孢杆菌BLICHENIFORMIS、凝结芽孢杆菌BCOAGULANS和解淀粉芽孢杆菌BAMYLOLIQUEFACIENSUSP5,763,385、USP5,824,532、USP5,958,739、USP6,008,026和USP6,361,809。需要特别注意的是，优选的淀粉酶源自芽孢菌株BACILLUSSTRAINS、嗜热脂肪芽孢杆菌BSTEAROTHERMOPHILUS、解淀粉芽孢杆菌BAMYLOLIQUE。