淫羊藿苷的新用途.pdf

本发明提供了淫羊藿苷的新用途，所述淫羊藿苷作用于脐带间充质干细胞一周后能够增强多能性基因Oct-4mRNA表达，提高脐带间充质干细胞多能性，能够提高其向神经细胞，心肌细胞，胰岛细胞的分化的能力，降低多能性调控基因Oct-4甲基化水平和促进组蛋白H3K9乙酰化水平。

1.  淫羊藿苷在增强干细胞多能性中的用途。

2.  根据权利要求1所述的淫羊藿苷的用途，其特征在于：通过淫羊藿苷处理干细胞，提高干细胞多能性，再移植干细胞给动物。

3.  根据权利要求1所述的淫羊藿苷的用途，其特征在于：应用于诱导培养用于治疗急性肝损伤或脑缺血损伤时的待移植细胞的培养液。

4.  根据权利要求3所述的淫羊藿苷的用途，其特征在于：所述诱导培养细胞的方法为：脐带间充质干细胞于含有100μM淫羊藿苷的完全培养基培养7天，每3天换液一次，培养条件为37℃、5％CO₂，得到多能性增强的干细胞，所述完全培养基为DMEM-F12培养基+20％FBS+1％LG+1％PS+10ng/mlEGF+10ng/mlbFGF。

淫羊藿苷的新用途
技术领域
本发明涉及淫羊藿苷的新用途。
背景技术
干细胞具有多向分化潜能和自我更新的能力，在细胞替代治疗、基因治疗、组织工程等方面具有良好的应用前景。近年来关于干细胞基础与临床的研究突飞猛进、日新月异，使人们对干细胞有了更深刻的理解。从全能性胚胎干细胞(ES细胞)的研究，到成体干细胞的发现，再到人们通过体细胞重新编程而得到的诱导全能干细胞(iPS)，无不体现了科研工作者对干细胞研究的智慧和倾注的心血。人们对于干细胞的大规模、常规临床应用报以了极大的热情和希望，但是由于胚胎干细胞的免疫排斥反应、致瘤性、伦理道德问题等因素的制约，极大的限制了其临床应用。
通过体细胞重新编程而得到iPS是近年干细胞研究的热点，人们采用体细胞核移植(SNCT)，利用逆转录病毒将特定基因(Oct-4、Nanog等)、小分子非病毒载体导入体细胞等方法均成功获得了iPS。Oct-4和Nanog是两种维持干细胞多能性和自我更新的最为重要的转录因子。它们通常只在多能干细胞中表达，在分化细胞中不表达。目前多采用成纤维细胞、表皮细胞作为供体细胞进行逆分化而获得多能性细胞，这些研究工作证明了细胞的逆分化性。但成纤维细胞、表皮细胞均为终末分化细胞，其逆分化能力差、重编程为多能性细胞所需要的时间比较长、效率低。最新研究表明，应用具有一定干细胞特性的成体干细胞可以更加容易的得到iPS，如Kim等报道：神经干细胞可以简化重编程步骤得到iPS；同时研究表明，体外应用小分子化合物可以增加体细胞逆分化比例,提高逆分化效率。
然而，现阶段所用成体细胞移植治疗某些疾病，但成体细胞多能性差，影响治疗效果，现在传统诱导细胞多能性的方案是病毒或基因改造，这样处理的细胞不利于移植给人或者动物。
人脐带间充质干细胞(hUMSCs)是近年人们从胎儿脐带华尔通氏胶(Whartonps Jelly)部位分离得到的基质细胞。hUCMSCs具有一定干细胞特性，其多向分化潜能和可塑性已得到证实。特定条件下，hUCMSCs可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、胰岛细胞、神经细胞、心肌细胞以及生殖细胞等。鉴于脐带间充质具有一定的分化多能性、可塑性强、排异反应低、无伦理道德争议等优点，hUMSCs将有望成为自体与同种异体移植及细胞替代治疗的理想细胞来源。虽然hUCMSCs具有一定干细胞特性，但其分化能力仍具有一定局限性。若能利用药物干预诱导hUCMSCs，使其获得像ES一样的多能性，则可以避免应用胚胎干细胞所产生的免疫排斥、伦理问题及应用逆转录病毒诱导iPS所致的操作复杂性、致瘤性等缺点。
中医学“肾藏精”理论认为肾精的盛衰决定着人体的生长、发育与生殖，其内涵及功能与干细胞具有多向分化及自我增殖的能力密切相关，而且许多补肾益精中药具有促进干细胞分化及增殖的功能。鉴于此，本发明以Oct-4多能性调控基因为切入点，通过观察常用补肾中药有效成分对hUMSCs多能性调控基因Oct-4表达的影响，筛选出影响hUMSCs多能性的补肾中药活性成分；通过考察所筛选出的活性成分对hUMSCs向内、中、外三胚层细胞分化的影响，确证补肾中药活性成分诱导hUMSCs多能性的作用及应用价值。
在诸多补肾中药有效成分中，淫羊藿苷为小檗科植物淫羊藿(Epimedium grandiflorum Morr.)的地上部分，分子式为C₃₃H₄₀O₁₅，分子量676.65，为淡黄色针状结晶，熔点231-232℃。溶于乙醇、乙酸乙酯、不溶于醚、苯、氯仿。淫羊藿苷具有促进造血 功能、免疫功能及骨代谢等功效，现代药理实验研究表明：淫羊藿能增加心脑血管血流量、促进造血功能、免疫功能及骨代谢,具有抗衰老、抗肿瘤等功效，被用于本申请诱导hUMSCs多能性的研究中。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供淫羊藿苷的新用途。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
淫羊藿苷在增强干细胞多能性中的用途。
优选的，上述淫羊藿苷的用途，通过淫羊藿苷处理干细胞，提高干细胞多能性，再移植干细胞给动物。
优选的，上述淫羊藿苷的用途，应用于诱导培养用于治疗急性肝损伤或脑缺血损伤时的待移植细胞的培养液。
优选的，上述淫羊藿苷的用途，所述诱导培养细胞的方法为：脐带间充质干细胞于含有100μM淫羊藿苷的完全培养基培养7天，每3天换液一次，培养条件为37℃、5％CO₂，得到多能性增强的干细胞，所述完全培养基为DMEM-F12培养基+20％FBS(胎牛血清)+1％LG(谷氨酰胺)+1％PS(青霉素链霉素)+10ng/mlEGF(表皮生长因子)+10ng/mlbFGF(碱性成纤维生长因子)。
本发明的有益效果是：
淫羊藿苷作用脐带间充质干细胞一周能够增强其多能性，促进其向神经细胞，心肌细胞，胰岛细胞的分化，明确了hUMSCs(人脐带间充质干细胞)体外具有向三胚层细胞分化的能力，体内实验建立代表三个胚层不同器官的损伤模型，移植ICA干预后的hUMSCs，通过评价模型动物各项机能指标和移植细胞分化能力情况，进一步验证了补肾中药活性成分对hUMSCs分化多能性的影响。同时通过研究淫羊藿苷对脐带间充质干细胞在基因组整体水平的变化，表明淫羊藿苷作用脐带间充质干细胞一周后，能够降低多能性调控基因Oct-4甲基化水平和促进组蛋白H3K9乙酰化水平。
通过实验验证，最终结果表明淫羊藿苷作用于脐带间充质干细胞后能够增强其多能性，揭示出淫羊藿苷作用于脐带间充质干细胞的分子生物学机制，为脐带间充质干细胞广泛应用于再生医学提供理论和实验依据。
附图说明
图1是hUCMSCs的原代及传代培养形态学变化图(倒置显微镜，×100)，a：原代培养5天，b：原代培养一周，c：原代培养两周，d：传代培养P1；
图2是免疫荧光细胞化学染色结果图，
a:CD29(×400),b:CD44(×400),c:CD90(×200)；d:C45(×200),e:CD31(×200),f:CD34(×200)；
图3是流式细胞术检测人脐带间充质干细胞表型图；
图4是淫羊藿苷上调人脐带间充质干细胞多能性基因Oct-4表达图，
*P<0.05.**P<0.01；
图5是向神经样细胞诱导形态变化图，
a:对照组(×100)；b:诱导4h(×100)；c:诱导6h(×200)；
图6是免疫荧光鉴定结果图，
a：对照组，b：nestin，c：GFAP，d：Map-2(×200)；
图7是向心肌细胞诱导形态变化图，
a:对照组(×200)；b:诱导4周组(×200)；
图8是RT-PCR检测cTNI mRNA表达结果图，
a:内参基因GAPDH；b:目的基因cTNI；1：未诱导组；2：诱导组；
图9是向胰岛细胞诱导形态变化图，
a未诱导组(×100)，b诱导12天组(×100)；
图10是双硫腙染色结果图，
a：未诱导组(×200)，b：诱导12天组(×200)；
图11是细胞移植3天对小鼠血肌酐和尿素氮的影响图；
图12是细胞移植7天对小鼠血肌酐和尿素氮的影响图；
图13是活体成像系统对肾组织体外拍照结果图——细胞移植3d和7d肾组织荧光信号强度，备注：肾组织依次的顺序为对照组、模型组、MSC组、MSC+I组；
图14是细胞移植3天和7天肾组织荧光信号强度图；
图15是细胞移植3d对肾组织形态学的影响(×100)图；
图16是细胞移植7d对肾组织形态学的影响(×100)图；
图17是细胞移植3d hUCMSCs向肾小管上皮细胞分化情况(×200)图，其中，红色荧光为DIR标记hUCMSCs、绿色荧光为肾小管上皮细胞标记物Cadherin、蓝色荧光为DAPI；
图18是细胞移植7d hUCMSCs向肾小管上皮细胞分化情况(×200)图，其中，红色荧光为DIR标记hUCMSCs、绿色荧光为肾小管上皮细胞标记物Cadherin、蓝色荧光为DAPI；
图19是四氯化碳造模24小时对小鼠ALT和AST的影响图；
图20是细胞移植3天对小鼠谷丙转氨酶和谷草转氨酶的影响图；
图21是细胞移植7天对小鼠谷丙转氨酶和谷草转氨酶的影响图；
图22是移植细胞3天和7天对肝脏系数的影响图；
图23是细胞移植3d和7d肝组织荧光信号强度图，备注：肝组织依次的顺序为对照组、模型组、MSC组、MSC+I组；
图24是细胞移植3天和7天肝组织荧光信号强度图；
图25是细胞移植3d对肝组织形态学的影响(×100)图；
图26是细胞移植7d对肝组织形态学的影响(×100)图；
图27是细胞移植3d hUCMSCs向肝细胞分化情况(×200)图，备注：红色荧光为DIR标记hUCMSCs、绿色荧光为肝细胞标记物AFP、蓝色荧光为DAPI；
图28是细胞移植7d hUCMSCs向肝细胞分化情况(×200)图，备注：红色荧光为DIR标记hUCMSCs、绿色荧光为肝细胞标记物AFP、蓝色荧光为DAPI；
图29是移植细胞对2-VO模型大鼠海马区Nestin表达的影响图；
图30是移植细胞对2-VO模型大鼠海马区Map-2表达的影响图；
图31是ICA干预后Nanog\Oct-4基因启动子区域DNA甲基化的变化图；
图32是Nanog、Oct-4基因启动子区域DNA甲基化的变化点状图，图中黑点示甲基化的CpG二核苷酸，白点为去甲基化的CpG二核苷酸；
图33是Oct-4基因启动子区域组蛋白乙酰化数据。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。其中，实施例中所用到的：
淫羊藿苷购自天津药品检验所。
完全培养基：DMEM-F12培养基+20％FBS(胎牛血清)+1％LG(谷氨酰胺)+1％PS(青霉素链霉素)+10ng/mlEGF(表皮生长因子)+10ng/mlbFGF(碱性成纤维生长因子)
实施例1
1、hUMSCs的分离培养与鉴定
分离脐带间充质干细胞：在无菌条件下将脐带用2％双抗的D-hank’s反复冲洗2-3遍，尽量除去残留血液，并剔除动静脉血管。将清洗后的脐带置于玻璃皿中，剪成1mm³ 大小，加入胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅱ(终浓度为0.05％)，置于37℃恒温摇床中，消化30min。粗筛过滤，滤液为A，剩余组织加入0.25％胰酶继续消化30min；消化束后加入FBS终止消化，消化产物经粗筛网过滤，滤液B。将A，B液混合，再经200目筛网过滤，收集滤液，1000rpm，15min，加入全培(DF12+20％FBS+1％L-G+1％PS+10ng/mlEGF+10ng/mlbFGF)，置于37℃饱和湿度、5％CO₂培养箱培养。一周换液两次，当细胞融合到80-90％左右，进行传代。实验用稳定生长的第四代hUCMSCs。
鉴定脐带间充质干细胞：实验取第4代hUCMSCs，利用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化，按2×10⁴/孔的密度接种于提前包被盖玻片的12孔板，5％CO₂，37℃培养箱内培养，贴壁24h后用4％多聚甲醛固定10min，PBS洗3次，正常羊血清封闭30min，加入一抗(CD29、CD44、CD90、CD31、CD34、CD45)比例1:50(抗体稀释液配)，同时不加一抗做阴性对照，4℃过夜，隔天用PBS洗3次后，加入二抗孵育1h，弃去PBS洗3次后，加入DAPI染核，荧光显微镜下观察并拍照。
实验取第4代hUCMSCs，分别选用抗人CD29、CD44、CD90、CD31、CD34、CD45抗体，应用流式细胞技术对分离细胞进行鉴定。
2、实验结果
分离培养hUCMSCs：原代培养五天后可见几个长梭形成纤维状细胞贴壁生长，一周后可见细胞逐渐增多，两周后细胞融合到90％以上，典型的长梭形，并成漩涡状生长，即可以传代，传代后细胞均匀贴壁生长，见图1。
原代鉴定hUCMSCs：免疫荧光细胞化学染色和流式细胞术结果显示，hUCMSCs表达间充质干表面抗原CD29，CD44，CD90阳性，见图2.a、b、c)，而不表达CD31，CD34，CD45，见图2.d、e、f。流式细胞术检测测结果见图3。
实验结果表明本实验所用分离方法可得到hUCMSCs，细胞纯度较高，培养方法可靠，生长状况良好，能进行稳定传代培养，可用于后续实验。
实施例2
补肾中药活性成分对hUCMSCs多能性的影响
1、不同补肾中药活性成分对hUCMSCs多能性基因Oct-4表达的影响
选用常用补肾中药活性成分：淫羊藿苷、淫羊藿总黄酮、菟丝子总黄酮、巴戟天多糖、柚皮甙、马钱苷和莫诺苷，其中，巴戟天多糖、淫羊藿总黄酮和菟丝子总黄酮为自提获得，其余均是购买所得标品。其中，
巴戟天多糖提取方法为：精密称取巴戟天药材，粉碎，加入10倍体积水超声提取，回收水提液蒸干，加入75％乙醇超声混合，静置过夜，去除乙醇，回收沉淀，乙酸乙酯萃取除去脂溶性杂质，回收水层，Sevage法除蛋白，回收至干，活性炭脱色，滤液回收至10-20ml，80％乙醇超声后静置，除去乙醇，得到巴戟天多糖；
淫羊藿总黄酮提取方法为：精密称取淫羊藿药材，粉碎，95％乙醇超声40min，提取液过滤悬干回收，产物用水分散，3倍体积的石油醚脱脂，得到水层用正丁醇(1:1)萃取，得到粗提物浸膏，取大孔树脂柱，湿法上样，在水洗5个体积之后，分别用20％和60％乙醇洗脱，回收得到淫羊藿总黄酮；
菟丝子总黄酮提取方法为：精密称取菟丝子药材，粉碎，95％乙醇超声40min，提取液过滤悬干回收，产物用水分散，3倍体积的石油醚脱脂，得到水层用正丁醇(1:1)萃取，得到粗提物浸膏，取大孔树脂柱，湿法上样，在水洗5个体积之后，分别用10％和30％乙醇洗脱，回收得到淫菟丝子总黄酮。
将上述活性成分分为高、中、低剂量组，具体剂量如下：淫羊藿苷、柚皮甙、马钱苷、莫诺苷高、中、低剂量分别为100uM、10uM和1uM，淫羊藿总黄酮、菟丝子总黄酮、巴戟天多糖高、中、低剂量分别为50ug/ml、5ug/ml和0.5ug/ml，同时设置空白 对照组。实验取第四代生长良好的hUCMSCs，用0.25％的胰蛋白酶和0.02％EDTA混合液消化，将hUCMSCs消化分散成单细胞，调整细胞密度为5×10⁴mL^-1接种于六孔板中，每孔2mL，待细胞贴壁后，加入上述药物分别作用72h后，收集细胞，提取总RNA，采用RT-PCR方法，检测药物对多能性调控基因Oct-4 mRNA表达水平的影响。筛选出影响hUCMSCs多能性的活性成分之有效剂量及时间。
2、淫羊藿苷对hUCMSCs多能性基因Oct-4表达的影响
实验取第四代生长良好的hUCMSCs，用0.25％的胰蛋白酶和0.02％EDTA混合液消化，将hUCMSCs消化分散成单细胞，调整细胞密度为5×10⁴mL^-1接种于六孔板中，每孔2mL，待细胞贴壁后，加入淫羊藿苷100uM分别作用72h和1w后，收集细胞，提取总RNA，采用RT-PCR方法，检测淫羊藿苷100uM对多能性调控基因Oct-4 mRNA表达水平的影响。
3、Q-PCR验证淫羊藿苷对hUCMSCs多能性基因Oct-4表达的影响
实验取第四代生长良好的hUCMSCs，用0.25％的胰蛋白酶和0.02％EDTA混合液消化，将hUCMSCs消化分散成单细胞，调整细胞密度为5×10⁴mL^-1接种于六孔板中，每孔2mL，待细胞贴壁后，加入淫羊藿苷100uM10uM和1uM分别作用72h和1w后，收集细胞，提取总RNA，采用Q-PCR方法，检测淫羊藿苷100uM对多能性调控基因Oct-4mRNA表达水平的影响。
4、实验结果
首先采用RT-PCR的方法考察了7味补肾中药有效成分对多能性基因oct-4表达的影响。在作用了72小时之后，淫羊藿苷、淫羊藿总黄酮、巴戟天多糖等成分均可提高Oct-4基因表达，其中淫羊藿苷表达水平高于其他组分，见图4-A。将药物作用时间提高到1周，采用RT-PCR方法考察淫羊藿苷对多能性基因oct4表达的影响，实验结果得出，淫羊藿苷100μM作用于72h和1W后对多能性基因oct4表达均具有显著性差异(p<0.05)，见图4-B。对于淫羊藿苷组，进一步采用Q-PCR方法进行验证，结果得出淫羊藿苷100μM在72和1周两个时间点均可以显著提高多能性基因oct4表达，且在1周时具有极显著性差异，见图4-C，故后续试验采用淫羊藿苷100μM作为给药条件。
实施例3
补肾中药活性成分对脐带间充质干细胞向三胚层组织细胞分化能力的影响
Ⅰ体外研究——hUMSCs向三胚层组织细胞分化能力的影响
1、体外诱导hUCMSCs向神经细胞分化：实验取第4代hUCMSCs，利用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化，细胞爬片，待细胞生长至50％-60％汇合时，先用含1 mmol/Lβ-巯基乙醇的低糖DMEM(10％FBS)预诱导24 h后，吸去预诱导液，PBS洗涤3次，再以2％二甲基亚砜和终浓度为200μmol/L丁羟基茴香醚BHA的无血清低糖DMEM/F12进行诱导孵育，4-6h后倒置显微镜下观察细胞形态变化。
2、免疫荧光细胞化学检测神经样细胞表面标志物：取诱导后的细胞，4％多聚甲醛固定10min，PBS洗3次，正常羊血清封闭30min，加入一抗GFAP(1:100)、MAP-2(1:100)、Nestin(1:50)，同时不加一抗做阴性对照，4℃过夜，隔天用PBS洗3次后，加入二抗孵育1h，弃去PBS洗3次后，加入DAPI染核，荧光显微镜下观察并拍照。
3、体外诱导hUCMSCs向心肌细胞分化：实验取第4代hUCMSCs，利用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化，按照5×10⁴/孔的密度接种于6孔板中，5％CO₂，37℃培养箱内培养，待细贴壁培养2天后，诱导组加入10μM 5-氮胞苷+DMEM/F12培养基培养24h后，换为正常完全培养基培养4周，对照组始终是完全培养基培养。
4、RT-PCR检测心肌肌钙蛋白CTNI mRNA表达：细胞诱导4周后，PBS洗三遍，加入RTIZol裂解细胞，按照RNA simple Total RNA kit说明书提取总RNA，RT-PCR步骤按照Quantscript RT Kit进行。
5、体外诱导hUCMSCs向胰岛细胞分化：实验取第4代hUCMSCs，利用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化，按照2×104/孔的密度接种于12孔板中，5％CO₂，37℃培养箱内培养，待细胞融合到80％左右后，诱导组加入第一阶段诱导剂：含0.55μmol/Lβ-巯基乙醇+高糖DMEM培养基培养2天后，换为第二阶段诱导剂：100ng/mlEGF+10ng/mlbFGF+2％B27+高糖DMEM培养基培养6天后，换为第三阶段诱导剂：20mmol/L尼克酰胺+高糖DMEM培养基培养4天，对照组始终是完全培养基培养。
6、双硫腙染色：将诱导12天的细胞以及未诱导的细胞用PBS洗3遍后，每孔加1 mL1％双硫腙(PBS配)，置37℃孵箱中孵育20 min，用倒置显微镜观察细胞着色情况。
主要观察指标：①脐带间充质干细胞原代分离培养的形态。②脐带间充质干细胞表面标记的荧光细胞化学染色结果。③诱导分化为心肌细胞的形态变化及RT-PCR检测cTNI mRNA表达情况。④诱导分化为胰岛细胞的形态变化及双硫腙染色结果。
7、实验结果：
7.1向神经样细胞诱导形态变化：细胞加入预诱导液24 h后，部分细胞开始悬浮死亡，剩余细胞形态回缩变得不规则，正式诱导4h后部分细胞胞质向核回缩，胞体变周边折光性强，见图5 b(图5 a为对照组)。诱导6 h后细胞质以细胞核为中心收缩，细胞变短，体积变小，细胞形成双极或多极的细胞体突起，出现类似神经细胞形态，见图5 c。
7.2免疫荧光细胞化学检测神经样细胞表面标志物：结果表明诱导6h后的细胞表达GFAP和MAP-2，但不表达Nestin，对照组都不表达，如图6所示。
7.3向心肌细胞诱导形态变化：细胞诱导24h后，小部分细胞死亡，大部分细胞继续贴壁生长，诱导7d后，细胞生长缓慢，形态扩大，诱导4周后出现肌丝状结构，如图7所示。
7.4RT-PCR检测cTNI mRNA表达结果：未诱导的细胞低表达cTNI基因，诱导组12天后强表达cTNI基因，如图8所示。
7.5向胰岛细胞诱导形态变化：经第一阶段诱导后，部分细胞死亡，剩余细胞贴壁生长，经第二阶段诱导后，细胞形态变为立体的细长型，经第三阶段诱导后，细胞回缩，渐渐变为球形并聚集成团，如图9所示。
7.6双硫腙染色结果：诱导组倒置显微镜下观察几乎所有细胞呈棕红色，未诱导的细胞不着色，如图10所示。
可见，人脐带间充质干细胞向神经细胞方向，诱导前人脐带间充质干细胞呈典型的长梭形，并成漩涡状生长；经BHA等联合诱导后，细胞形态改变趋向神经元样，免疫荧光检测其表达微管相关蛋白MAP2和胶质纤维酸性蛋白GFAP；向心肌样细胞方向，经5-氮胞苷诱导后一二周后，细胞体积变大，生长缓慢，诱导4周后RT-PCR检测其心肌细胞表面标志肌钙蛋白cTnI表达情况，诱导组cTnI mRNA表达水平较未诱导组明显增加；向胰岛样细胞方向，经β-巯基乙醇等联合诱导12天后，诱导组细胞逐渐变圆，并聚集成团，双硫腙染色结果显示诱导组细胞90％以上诱导成功。综上所述，人脐带间充质干细胞具有多向分化潜能，体外可诱导分化为神经样细胞、心肌样细胞和胰岛样细胞。
Ⅱ体内研究——考察补肾中药活性成分对hUMSCs向三胚层组织细胞分化能力的影响
①补肾中药活性成分干预脐带间充质干细胞移植对急性肾损伤的影响
1、细胞加药及标记
将传代后的hUCMSCs接种于T75的培养瓶，密度为4×10⁴/ml，共15ml，次日加入含有100μM的淫羊藿苷完全培养基，培养7天，中间3天换液一次，待细胞长至80％～90％融合时，0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA消化细胞。DIR标记诱导后的脐带间充质干细胞。
2、急性肾损伤(AKI)模型
顺铂注射液用生理盐水稀释成1mg/ml，以11.5mg/kg剂量腹腔注射，建立AKI模型。
3、小鼠顺铂急性肾损伤模型建立后细胞移植
利用顺铂造模24h后，对照组及模型组经尾静脉输注生理盐水0.4ml；MSC组：经尾静脉输注DIR标记的正常MSC细胞悬液4×10⁶/0.4ml；MSC+I组：经尾静脉输注DIR标记的并经淫羊藿苷干预的MSC细胞悬液4×10⁶/0.4ml。
检测指标：
分别于移植MSC后第3和7天随机各组小鼠5只，眼眦取血，置于水浴箱中，37℃水浴半小时，3000rpm离心15min后分离血清，-20℃低温保存，备用，当样本集齐后，复温半自动生化分析仪测定血清肌酐和尿素氮。
切取双侧肾脏，小动物活体成像系统迅速拍照后，切开其被膜，纵行剖开，左侧肾组织以10％的福尔马林固定并编号，石蜡包被，6μm厚连续切片，常规做HE染色，光镜下观察。对每张切片在光镜下观察非重叠的10个视野观察，肾小管损伤定义为：肾小管坏死或刷状缘脱落、管型形成、管腔扩张。
右侧肾组织恒冷冰冻切片机切片，荧光观察片厚约10μm，进行荧光免疫组织化学染色观察检测hUCMSCs向肾小管上皮细胞分化情况等。
细胞移植到小鼠体内后，分别于时间点为3天和7天时，每组随机取出三只小鼠肾脏，用小动物活体成像仪体外检测移植细胞在肾脏的分布情况。
4、实验结果
4.1细胞移植对AKI小鼠血肌酐和尿素氮的影响
由表1和图11可知，细胞移植3天后，与正常对照组比较，模型组实验小鼠血肌酐和尿素氮水平(BUN和CRE)均显著升高(P＜0.01)，造模成功；
与模型组比较，静脉移植MSC及淫羊藿苷干预MSC后BUN水平有所降低，MSC+I组下降趋势明显，但未见显著性差异，细胞移植后CRE水平明显降低，且MSC+I组更为显著且有明显差异(P＜0.05)。
由表2和图12可知，细胞移植7天后，与正常对照组比较，模型组实验小鼠BUN和CRE水平均显著升高(P＜0.01)，MSC组和MSC+I组BUN和CRE未见明显差异，；
与模型组比较，MSC组和MSC+I组均有能降低BUN和CRE水平的趋势，并且MSC组和MSC+I组能降低CRE水平(P＜0.05)，与MSC组相比，MSC+I组BUN和CRE水平有所降低，但未见明显差异。
表1 细胞移植3天对小鼠血肌酐和尿素氮的影响(n＝5，)

*与正常组比较P＜0.05；**与正常组比较P＜0.01；
#与模型组比较P＜0.05；##与模型组比较P＜0.01；
△与MSC组比较P＜0.05；△△与MSC组比较P＜0.01；
表2 细胞移植7天对小鼠血肌酐和尿素氮的影响(n＝3，)

*与正常组比较P＜0.05；**与正常组比较P＜0.01；
#与模型组比较P＜0.05；##与模型组比较P＜0.01；
△与MSC组比较P＜0.05；△△与MSC组比较P＜0.01；
4.2淫羊藿苷干预对hUMSCs静脉移植迁移的影响
小动物活体成像系统拍照结果如图13、14和表3所示，细胞移植3和7天后，处死动物迅速取出肾脏，MSC组和MSC+I组均有红色荧光信号，并且MSC+I组比MSC组荧光强度有增强的趋势。
表3 细胞移植3天和7天肾组织荧光信号强度(n＝3，)

*与MSC组比较P＜0.05；**与MSC组比较P＜0.01；
4.3细胞移植对小鼠肾组织形态的影响
镜下观察模型组和细胞移植后第3天MSC组和MSC+I组肾脏组织学的变化。AKI模型组可见肾小管扩张、轮廓结构不清晰、细胞排列杂乱，部分小管上皮细胞空泡变性及肿胀，管型的形成，间质炎性细胞浸润及充血。细胞移植组上皮细胞排列整齐也有少量空泡变形，但管形形成较少，以MSC+I效果更好，见图15；
移植后第7天，小鼠AKI模型组肾小管仍然扩张，上皮细胞脱落，炎性细胞浸润。MSC组肾小管扩张减轻，趋于正常，以MSC+I效果更好，见图16。
4.4免疫荧光化学法检测hUCMSCs向肾小管上皮细胞分化情况
免疫荧光化学法结果如图17、18所示：MSC组和MSC+I组均有少量DIR红色荧光标记的hUCMSCs同时表达肾小管上皮细胞表面标记物Cadherin(绿色荧光标记)，多为几个细胞聚集在临近的区域，说明移植的hUCMSCs可以向肾小管上皮细胞分化，但MSC组和MSC+I组之间未见明显差异。
②补肾中药活性成分干预脐带间充质干细胞移植对急性肝损伤的影响
1、细胞加药及标记：
将传代后的hUCMSCs接种于T75的培养瓶，密度为4×10⁴/ml，共15ml，次日加入含有100μM的淫羊藿苷完全培养基，培养7天，中间3天换液一次，待细胞长至80％～90％融合时，0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA消化细胞。DIR标记诱导后的脐带间充质干 细胞。
2、造急性肝损伤(ALI)模型：
0.2％CCl₄，以10 ml/kg剂量腹腔注射，建立ALI模型，正常对照组给等量的橄榄油。
3、小鼠四氯化碳急性肝损伤模型建立后MSC的移植：
利用四氯化碳造模24h后，对照组及模型组经尾静脉输注生理盐水0.4ml；脐带间充质干细胞(MSC组)：经尾静脉输注DIR标记的正常MSC细胞悬液4×10⁶/0.4ml；淫羊藿苷干预脐带间充质干细胞(MSC+I)组：经尾静脉输注PKH26标记的加药MSC细胞悬液4×10⁶/0.4 ml。
4、检测指标：
分别于移植MSC后第3天和7天随机各组小鼠5只，眼眦取血，置于水浴箱中，37℃水浴半小时，3000rpm离心15min后吸出血清，-20℃低温保存，备用，当样本集齐后，复温半自动生化分析仪测定血清ALT和AST。
抽取血液完毕后，迅速切取肝脏，称重，用生理盐水冲洗，滤纸吸干，称重,计算肝脏系数。脏器系数(％)＝脏器重量(g)/体重(g)×100％；
肝左叶组织以10％的福尔马林固定并编号，切片，厚约6μm，HE染色，对每张切片在光镜下观察非重叠的10个视野观察，肝脏组织病理学检查评估肝脏损伤情况考查组织学变化。
肝右叶组织恒冷冰冻切片机切片，荧光观察片厚约10μm，进行荧光免疫组织化学染色及荧光显微镜观察检测hUCMSCs向肝细胞分化情况等。
细胞移植到小鼠体内后，分别于时间点为3天和7天时，每组随机取出三只小鼠肝脏，用小动物活体成像仪体外检测移植细胞在肝脏的分布情况。
5、实验结果
5.1模型确立
利用四氯化碳造模24h后，随机分别取3只正常小鼠模型小鼠，眼眦取血，分离血清，半自动生化仪检测ALT和AST，由表7可知，与正常组小鼠相比，模型组ALT和AST水平显著升高(P＜0.01)，证明模型建立成功，结果见表4和图19。
表4 四氯化碳造模24小时对小鼠ALT和AST的影响(n＝3，)

*与正常组比较P＜0.05；**与正常组比较P＜0.01；
5.2细胞移植对小鼠谷丙转氨酶和谷草转氨酶的影响
由表5-6和图20-21可知，移植细胞后3天和7天对ALI小鼠谷丙转氨酶和谷草转氨酶的水平没有影响。
表5 细胞移植3天对小鼠谷丙转氨酶和谷草转氨酶的影响(n＝5，)


*与正常组比较P＜0.05；**与正常组比较P＜0.01；
#与模型组比较P＜0.05；##与模型组比较P＜0.01；
△与MSC组比较P＜0.05；△△与MSC组比较P＜0.01；
表6 细胞移植7天对小鼠谷丙转氨酶和谷草转氨酶的影响(n＝5，)

*与正常组比较P＜0.05；**与正常组比较P＜0.01；
#与模型组比较P＜0.05；##与模型组比较P＜0.01；
△与MSC组比较P＜0.05；△△与MSC组比较P＜0.01
5.3细胞移植对小鼠肝脏系数的影响
由表7可知：与对照组相比，细胞移植3天，模型组和MSC组肝脏系数有显著性升高(P＜0.01)，MSC+I组也有升高(P＜0.05)；与模型组相比，MSC组及MSC+I组有降低肝脏系数的趋势；细胞移植7天后，MSC组及MSC+I组，肝脏系数与模型组及正常组无显著性差异。
表7 移植细胞3天和7天对肝脏系数的影响(n＝5，)

*与正常组比较P＜0.05；**与正常组比较P＜0.01；
#与模型组比较P＜0.05；##与模型组比较P＜0.01；
△与MSC组比较P＜0.05；△△与MSC组比较P＜0.01
5.4淫羊藿苷干预对hUMSCs静脉移植迁移的影响
细胞移植后3和7天，处死动物迅速取出肝脏，应用小动物活体成像系统检测移植细胞到达病灶部位情况。小动物活体成像系统对肝组织体外拍照结果如表8及图23-24所示：移植后MSC组和MSC+I组均检测到红色荧光信号，与MSC组相比，细胞移植3天，MSC+I组的荧光信号更强(P＜0.05)；细胞移植7天，MSC+I组的荧光信号明显强于MSC组(P＜0.01)
表8 细胞移植3天和7天肝组织荧光信号强度(n＝4，)

*与MSC组比较P＜0.05；**与MSC组比较P＜0.01；
5.5细胞移植对ALI小鼠肝脏组织形态的影响
如图25所示，正常对照组小鼠肝脏颜色为红褐色，质软，表面光滑，有光泽；常规HE染色可见肝小叶结构完整，围绕中心静脉呈放射状排列。细胞移植3d，模型组小鼠肝脏的HE染色中央静脉周围出现肝细胞气球样变或脂肪变性，可见炎性细胞浸润，MSC组及MSC+I组上述变化并不明显；
如图26所示，随着时间的延长到第7d，模型组仍然存在以上组织变化，但均有减轻，MSC组及MSC+I组肝脏结构基本完全恢复正常。
5.6免疫荧光化学法检测hUCMSCs向肝细胞分化情况
免疫荧光化学法检测移植hUCMSCs向肝细胞分化情况结果如图27-28所示：MSC组和MSC+I组均有少量DIR红色荧光标记的hUCMSCs同时表达肝细胞表面标记物AFP(绿色荧光标记)，多为几个细胞聚集在临近的区域，说明移植的hUCMSCs可以向肝细胞分化，但MSC组和MSC+I组之间未见明显差异。
③补肾中药活性成分干预脐带间充质干细胞移植对脑缺血损伤的影响
1、细胞加药及标记：
将传代后的hUCMSCs接种于T75的培养瓶，密度为4×10⁴/ml，共15ml，次日加入含有100μM的淫羊藿苷完全培养基，培养7天，中间3天换液一次，待细胞长至80％-90％融合时，0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA消化细胞。DIR标记诱导后的脐带间充质干细胞。
2、大鼠大脑2-VO模型的制备：
复制大鼠双侧颈总动脉永久结扎(2-VO)模型，具体操作如下：大鼠术前12小时禁食不进水，10％水合氯醛麻醉后，颈部备皮，作正中切口约1公分，钝性分离皮肤下组织和肌肉，分离双侧颈总动脉，1号手术线双重结扎，避免损伤颈部交感神经和迷走神经。实验过程中，保持自主呼吸、肛温37±0.5℃，假手术组动物手术过程同模型制备组，但不结扎颈总动脉。
3、大鼠大脑2-VO模型建立后MSC的移植：
大鼠大脑2-VO模型建立后48h，对照组经尾静脉移植淫羊藿苷干预脐带间充质干细胞(CI-1M)；脐带间充质干细胞(48C-1M组)：经尾静脉输注DIR标记的正常MSC细胞悬液4×10⁶/0.4ml；淫羊藿苷干预脐带间充质干细胞(48I-1M)组：经尾静脉输注PKH26标记的加药MSC细胞悬液4×10⁶/0.4 ml。依据大鼠脑立体定位图谱，海马定位坐标为：ML:-1.62mm,AP:-2.59mm,DV:-3.11mm，标记移植点，用微型电动钻在颅骨移 植点处钻一个直径为0.5mm小孔。注射时将微量注射器固定在立体定位仪定向支架上，注射剂量为每只大鼠5μl，注射时间为3min，留针3min，逐步拔出注射器，历时3min。缝合皮肤后，腹腔注射庆大霉素，每只0.2mL。
4、检测指标：
移植细胞对2-VO模型大鼠海马区Nestin、Map2表达的影响
移植后第28天收集各组大鼠脑组织，分离海马，通过Q-PCR考察海马区MAP-2、NESTIN表达的变化，引物序列见表9。分离海马后提取总RNA,紫外分光光度计测定总RNA浓度与纯度，于-80℃保存备用。用反转录所得cDNA进行PCR扩增。RT-PCR参照SYBR Green说明书设定:预变性95℃15min，变性94℃30 s，55℃30s，40个循环；反应结束后仪器自动生成Ct值以及熔解曲线图。
相对定量计算策略简述：
本实验采用的是ΔΔCT法来进行相对定量，计算方法如下：
(1)根据实验所测得的每个基因各重复管CT值来计算该基因平均CT值。
(2)然后用待测基因平均CT值减去内参照基因(在本实验中为GAPDH)的平均CT值，得到校正后的CT值，即ΔCT。
(3)用实验样品各待测基因的校正CT值减去基准样品的相应基因的校正CT值,得到比较结果，即ΔΔCT。
(4)在假设各比较基因的PCR扩增效率一致且等与1时，可用2-ΔΔCT来表示实验样品中该基因的表达量与基准样品中表达量的倍数关系。
表9 Q-PCR引物

5、实验结果：
如图29-30所示，Q-PCR结果显示，与对照组比较，hUCMSCs静脉移植28d后，MSC组和MSC+I组均可以显著提高海马区Nestin、MAP-2基因表达，但组间无显著性差异。
可见，对于小鼠AKI模型，hUCMSCs静脉移植3d和7d后，MSC组和MSC+I组血BUN和CRE较模型组均有所降低，且MSC+I组CRE较模型组有显著性降低；小动物活体成像结果显示，MSC组和MSC+I组肾组织均检测到标记的MSC信号，且MSC+I组红色荧光信号明显强于MSC组；移植3d和7d，HE结果显示，与模型组相比，MSC组和MSC+I组均可改善肾损伤，且MSC+I组效果更好；免疫荧光结果显示MSC组和MSC+I组均有移植MSC向肾小管上皮细胞分化。
对于小鼠ALI模型，hUCMSCs静脉移植3d和7d后，MSC组和MSC+I组与模型组及正常组相比，血ALT和AST水平无明显差异；细胞移植3d，与模型组相比，MSC组和MSC+I组均可降低肝脏系数，但MSC组和MSC+I组之间未见明显差异；小动物活体成像结果显示，MSC组和MSC+I组肝组织均检测到标记的MSC信号，且MSC+I组红色荧光信号明显强于MSC组；移植3d和7d，HE结果显示，与模型组相比，MSC 组和MSC+I组均可改善肝损伤；免疫荧光结果显示，MSC组和MSC+I组均有移植MSC向肝细胞分化。
对于2-VO模型大鼠，hUCMSCs静脉移植28d后，MSC组和MSC+I组均可以显著提高海马区Nestin、MAP-2基因表达，但组间无显著性差异。结果显示，MSC组和MSC+I组均可以提高模型动物向神经细胞分化。
实施例4
基于表观遗传学修饰机制考察补肾中药活性成分作用的分子生物学机理DNA甲基化检测：
脐带间充质干细胞传代至第4代，淫羊藿苷100umol/L体外诱导一周，提取DNA，用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶(C)被转化为尿嘧啶(U)而甲基化的胞嘧啶则不变。基因组DNA经亚硫酸盐处理后，设计BSP引物扩增目的片段，此时尿嘧啶(U)全部转化为胸腺嘧啶(T)，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化。进行BSP基因甲基化检测。
如图31-32所示，实验结果表明，采用100umol/L浓度的ICA作脐带间充质干细胞1周，亚硫酸氢钠测序结果显示，ICA作用后，多能性调控基因Nanog去甲基化变化无显著性差异；多能性调控基因Oct-4去甲基化变化具有显著性差异，提示ICA调控期待间充质干细胞多能性可能与Oct-4启动子区域甲基化有关。
实施例5
组蛋白乙酰化检测：
脐带间充质干细胞传代至第4代，淫羊藿苷100umol/L体外诱导细胞，同时设置空白对照组，作用一周后收集细胞。采用染色质免疫共沉淀法，检测两基因启动子区域组蛋白修饰的变化
如图33所示，Oct-4检测结果表明，相对于空白对照组，采用100umol/L浓度的ICA作脐带间充质干细胞1周后，组蛋白H3乙酰化抗体结合的Oct-4 DNA量明显增加(P<0.05),结果提示ICA可以显著提高脐带间充质干细胞Oct-4基因启动子组蛋白H3乙酰化水平，进而提高Oct-4基因表达。
可见，补肾中药淫羊藿苷干预脐带间充质干细胞后增强脐带间充质干细胞多能性调控基因Oct-4的表达，并通过体内和体外实验表明淫羊藿苷100umol/L作用脐带间充质干细胞一周后能够增强其向三胚层组织细胞分化能力，进一步明确补肾中药淫羊藿苷能够增强干细胞多能性的能力。通过表观遗传学修饰机制的研究，明确了淫羊藿苷对脐带间充质干细胞多能性影响的分子生物学机理。
综上所述，本发明通过实施例中所述实验，首先研究补肾中药活性成分对脐带间充质干细胞向三胚层组织细胞分化能力的影响，体外考察所筛选出的活性成分对hUMSCs向三胚层组织细胞分化的能力，实验分诱导分化组、淫羊藿苷(ICA)组、诱导剂+ICA组，和空白对照组。分别向心肌细胞、神经细胞和胰岛细胞方向分化，明确了hUMSCs体外具有向三胚层细胞分化的能力。进一步的，在体外实验的基础上实施体内实验，通过建立急性肝损伤、肾损伤、脑缺血模型，体内移植ICA干预后hUMSCs，考察了补肾中药活性成分ICA诱导后hUMSCs移植对急性肝、肾衰竭和脑缺血模型各项机能指标的影响及对体内移植细胞分化能力的影响，证明了通过体外淫羊藿苷干预hUMSCs，其多能性提高后，有助于hUMSCs在体内向三胚层组织细胞的分化，进一步确证了补肾中药活性成分淫羊藿苷对hUMSCs分化多能性的影响。
上述参照具体实施方式对该淫羊藿苷的新用途进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。