一种高效筛选T细胞抗原表位肽，制备 MHC-肽多聚体(MHC tetramer)的体系 技术领域：
本发明涉及一种高效筛选T细胞抗原表位肽的方法，属于生物制药领域。
背景技术：
T细胞是机体免疫系统最重要的细胞之一，是免疫反应的核心。T细胞参与免疫的识别、活化及反应阶段。除了可以调节其它细胞，如B细胞的反应以外，还直接参与机体抗传染、抗肿瘤的免疫过程。T细胞也可以直接攻击自身组织或同种移植物，产生自身免疫性疾病或移植排斥反应。因而，T细胞的识别、活化及清除可用于疾病的预防、检测及治疗。与B细胞不同，T细胞不能直接识别游离的，诱导免疫反应的物质，抗原。抗原必需经过抗原提呈细胞(APC)如：巨噬细胞，处理后，以小肽或其它小分子的形式组装到其MHCI类或II类的分子上，并且共表达在APC的膜表面。如此形成的MHC-肽复合物才能被T细胞的抗原受体(TCR)结合，从而产生识别和活化。
与抗原肽结合的MHC分子是高度多态性的，可以结合各种不同序列的肽序列。T细胞与MHC-肽复合物的结合是受MHC限制的，即只有T细胞的MHC表型与APC的MHC表型相一致时，识别和活化才是最有效的。
T细胞地TcR与MHC-肽的结合是非常短暂的，天然情况下，还需要APC及T细胞上的辅助粘附分子来加强这种结合。因此，过去直接用抗原或抗原肽，甚至MHC-肽复合物单体都无法检测抗原特异性的T细胞，阻碍了T细胞的研究和应用。
近年，国外发明了一种MHC-肽四聚体技术(usp5,635,363)，可用于抗原特异性的T细胞检测、分选、活化及扩增，从而可用于T细胞识别表位的筛选及特异性T细胞的检测。这一发明是将MHC的α和β链膜外段基因重组、并表达在大肠杆菌中，将表达的α和β链与抗原肽共同复性，经分离获得MHC-肽单聚体，在单聚体的重链C末端导入一个生物素化位点，并标记上生物素，通过荧光标记的抗生素上的四价生物素结合位点，结合生物素形成MHC-肽四聚体。MHC-肽四聚体可以牢固地结合在抗原表位特异性T细胞的TCR上。从而可以精确地检测、分选、活化和扩增抗原表位特异性地T细胞。在疫苗研究、疾病诊断、检测及新药筛选上具有重要的应用价值。我们在这一基础上进一步发明了一种新的MHC-肽四聚体的制备工艺及新的MHC-肽多聚体制备方法。不但保持了MHC-肽多聚体识别抗原表位T细胞的特性，而且使制备效率大为提高，商业价值提高(中国专利申请号：02153465.9)。然而，MHC-肽四聚体/多聚体的应用价值的核心是结合在其中的抗原肽或称T细胞表位。筛选制备这类表位肽已成为MHC-肽四聚体/多聚体的主要热点。T细胞抗原肽表位的筛选制备主要有以下几种方法：
1、在抗原氨基酸序列的基础上，顺序合成的小分子肽段
2、通过抗原构象分析，合成可模拟相似结构的小分子肽段。
3、通过分离与APC内结合在抗原肽转运分子(TAP)上或结合在APC表面MHC分子上的抗原小肽，测序后再合成的小分子肽段。由这些技术筛选T细胞表位肽的过程是极为费时、费工及高成本的。因此发明一种能够更经济、有效、快速筛选目标T细胞表位肽的方法是具有极大的商业价值的。
近年来，噬菌体展示系统技术发展很快，这一技术的基本特征是将代表各种肽段氨基酸残基序列的DNA(库)插入到噬菌体基因中，然后这些肽段可以表达在噬菌体表面，并与相应的受体、抗体、配体结合。通过结合-淋洗过程分选的噬菌体，可以通过再感染宿主细菌而得以扩增，从而可以获得充足的重组噬菌体载体DNA，进一步确定表达和结合肽段的序列。再通过合成这些肽段，就可以制备出具有各种应用价值的肽分子。同理，这些肽段也可用于MHC-肽四聚体或多聚体的制备，用于各种情况下的T细胞识别、活化及扩增，产生商业价值。
本发明就是利用噬菌体展示系统这一特点及T2样细胞上MHC分子结合抗原肽的特点，建立一种高效筛选T细胞抗原表位的方法。在这一方法中，噬菌体展示系统可以同时展示大量的可筛选的小分子肽，通过这些肽与T2样细胞上的MHC分子结合的特点，将含T细胞表位肽的噬菌体。分选出来。通过结合-淋洗的方法进一步挑出亲和力高，从而应用价值大的多肽-噬菌体；再根据噬菌体的重组表达载体上的克隆基因序列推算出特异性T细胞表位肽的序列。由于建立了iRNA敲除技术，制备了表达各种MHC等位基因分子的T2样细胞。这一系统还可以一次筛选各种MHC限制的特异性T细胞抗原表位肽，使T细胞抗原表位肽的筛选效率极大地提高、筛选的T细胞抗原表位肽可用于各种情况下T细胞的识别、分选、活化及扩增具有极大的应用价值。
发明内容：
现有的筛选抗原肽的实验步骤繁复，而且要合成大量的肽段，成本很高。本发明的目的是提供一种能高效筛选T细胞抗原表位肽的体系。
本发明的另一个目的是提供用此体系筛选的肽制备MHC-肽多聚体的应用。本发明的主要内容是利用T2样细胞不能递呈内源性抗原表位肽，但其表面的MHC分子却能结合外源性抗原表位的特点，利用噬菌体展示系统可在噬菌体表面展示各种抗原肽，并与T2样细胞上的MHC分子结合的特点，建立一种快速筛选T细胞抗原表位肽的方法，所筛选的抗原表位肽可用于制备MHC四聚体或多聚体，后者可用于各种情况下抗原特异性T细胞的检测、分选、活化及扩增，其步骤如下：
1、采用RNAi技术使细胞中TAP沉默，从而制备一系列具有不同MHC I II类抗原位点的T2样细胞；
2、制备各种来源的表达9-15肽的cDNA；
3、将这些cDNA克隆到噬菌体展示系统中噬菌体表达载体中，cDNA/基因III聚合蛋白可提呈噬菌体颗粒表面，并且与MHC分子结合；
4、将噬菌体与T2样细胞孵育，表面具有MHC分子结合能力的噬菌体结合到T2细胞表面；
5、通过不同强度的缓冲液洗涤，未结合的噬菌体被洗去，表达具有MHC分子结合活性的噬菌体留在T2样细胞表面；
6、加入噬菌体敏感宿主大肠杆菌使T2样细胞上的噬菌体感染大肠杆菌，并得以扩增；
7、由大肠杆菌中进一步分离噬菌体质粒，并对其中的cDNA克隆测序、筛选出与MHC分子结合的肽段序列；
8、合成所筛选的肽段，结合至T2样细胞用该细胞刺激T细胞反应，确认肽段T细胞表位活性。
具体实施方式：
实施例1：制备内源性抗体肽表达缺陷的T2细胞系
制备T2细胞的TAP基因，使用Benitec公司的RNAi试剂盒，根据产品实验说明的步骤，制备出TAP基因缺陷的T2样细胞。
把上述T2样细胞破碎，根据《分子克隆》的方法提取T2样细胞的基因，再用PCR技术用TAP启动子和终止子进行扩增，再进行凝胶电泳，没有发现有TAP基因带。
实施例2：制备HCV肽链基因库
用专利02117666.3的方法制备大量的HCV病毒，再用常规方法分离RNA，并用试剂盒把RNA逆转录成cDNA(Indianapolis，Ind)。第一步制备出来的cDNA再用PCR方法扩增。
把XhoI 2μ和SpeI 2μ加入到上述制备的DNA中，在37℃度水浴下，同时进行酶切24h，并把基因库加入到噬菌体展示系统里(Dyax公司生产)。得到含有各种HCV肽段的噬菌体系统。
实施例3：制备HIV肽链基因库
用常规的方法制备HIV病毒粒子，用常规方法分离RNA，并用试剂盒把RNA逆转录成cDNA(Indianapolis，Ind)。第一步制备出来的cDNA再用PCR方法扩增。
把XhoI 2μ和SpeI 2μ加入到上述制备的DNA中，在37℃度水浴下，同时进行酶切24h，得到9-15基因的肽链DNA。
并把以下已知的HIV肽链制备成DNA库：
p24(133-147HIBB10)sequencePIVQNIQGQMVHQAIWahren er al.(1989)
p24(133-154 SF2)Sequence PIVQNIQGQMVHQAISPRTLNA Tosenberg etal.(1997)
p24(143-157)Sequeace VHQAISPRTLNAWVKC Bedford et al.(1997)
p24(153-167)Sequence NAWVKVVEEKAFSPEC Bedford et al.(1997)
p24(163-177)Sequence AFSPEVIPMFSALSEC Bedford et al.(1997)
p24(163-184 SF2)Sequence AFSPEVIPMFSALSEGATPQDL Rosenberg etal.(1997)
并把上述基因库加入到噬菌体展示系统里(Dyax公司生产)。得到含有各种HCV肽段的噬菌体系统。
实施例4：制备鼻烟癌肽链基因库
用常规的方法制备鼻烟癌病毒，再用常规方法分离RNA，并用试剂盒把RNA逆转录成cDNA(Indianapolis，Ind)。第一步制备出来的cDNA再用PCR方法扩增。
把XhoI 2μ和SpeI 2μ加入到上述制备的DNA中，在37℃度水浴下，同时进行酶切24h，并把基因库加入到噬菌体展示系统里(Dyax公司生产)。得到含有各种HCV肽段的噬菌体系统。
实施例5；筛选亲和性高的HIV肽
把T2样细胞固定到细胞板上，用PBS洗涤细胞，把没有结合的噬菌体洗去，再增加洗涤液的离子强度，继续洗涤，把结合不紧密的噬菌体洗去，不断增加洗涤液的离子强度，不断进行洗涤去除结合不紧密的噬菌体，最后筛选出和T2样细胞亲和力高的噬菌体。
实施例6：扩增亲和力高的噬菌体
在实施例5中筛选出的和T2样细胞亲和力高的噬菌体和细胞的混合液中加入噬菌体敏感宿主大肠杆菌使T2样细胞上的噬菌体感染大肠杆菌，然后把混合液放到LB培养基中，37℃培养24-48小时，收集大肠杆菌，由大肠杆菌中进一步分离噬菌体质粒，并对其中的cDNA克隆测序、筛选出与MHC分子结合的肽段序列(如PIVQNIQGQMVHQAI、PIVQNIQGQMVHQAISPRTLNA、VHQAISPRTLNAWVKC、NAWVKVVEEKAFSPEC、AFSPEVIPMFSALSEC、AFSPEVIPMFSALSEGATPQDL)。
实施例7：检测筛选出来的肽段PIVQNIQGQMVHQAI的表位活性
把肽段PIVQNIQGQMVHQAI于T2样细胞结合，并刺激T细胞反应，用细胞计数器检测T细胞的数量，明显增加，表明此肽段有表位活性。
实施例8：检测筛选出来的肽段PIVQNIQGQMVHQAISPRTLNA的表位活性
把肽段PIVQNIQ6QMVHQAISPRTLNA于T2样细胞结合，并刺激T细胞反应，用细胞计数器检测T细胞的数量，明显增加，表明此肽段有表位活性。
实施例9：用HCV肽段合成MHC-肽抗体多聚体
水浴或冰冻孵箱预冷1L折叠缓冲液(装于有搅拌子的1L的烧杯中)，在折叠缓冲液加入还原型谷胱酐肽至5mM，氧化型谷胱酐肽至0.5mM，PMSF至0.2mM。计算加入1uM重链、2uM轻链和30mg/L肽的必需量，将重链和轻链加入5ml注射缓冲液中，于室温抽入5ml注射器中。并根据人组织相容性抗原多肽的氨基酸序列(疏水性)于500ul双蒸水或DMSO中稀释人组织相容性抗原多肽。将1L重悬缓冲液放于搅拌器上高速搅拌(避免反应液起泡)，用移液器逐滴加人组织相容性抗原多肽于搅拌的反应液中。用26号针头在尽可能接近搅拌子的位置猛烈将重链和轻链注射于搅拌的反应液中。加入轻链后，折叠缓冲液应变得轻微不透明。存放于10℃，过夜。
将复性反应物超滤浓缩至7ml。用Superdex75凝胶过滤纯化MHC-HCV抗原肽单聚体。用SDS-PAGE检测，并用ELISA法鉴定其构象。
将MHC-I单聚体与制备的荧光标记的卵黄抗体按比例混合，37℃温浴1h，用Superdex200凝胶过滤纯化。FPLC检测。
将MHC-I单聚体与制备的荧光标记的单克隆抗体按比例混合，37℃温浴1h，用Superdex200凝胶过滤纯化。FPLC检测。
实施例10：用HIV肽段合成MHC-肽抗体多聚体
水浴或冰冻孵箱预冷1L折叠缓冲液(装于有搅拌子的1L的烧杯中)，在折叠缓冲液加入还原型谷胱酐肽至5mM，氧化型谷胱酐肽至0.5mM，PMSF至0.2mM。计算加入1uM重链、2uM轻链和30mg/L肽的必需量，将重链和轻链加入5ml注射缓冲液中，于室温抽入5ml注射器中。并根据HIV多肽的氨基酸序列(疏水性)于500ul双蒸水或DMSO中稀释HIV多肽。将1L重悬缓冲液放于搅拌器上高速搅拌(避免反应液起泡)，用移液器逐滴加HIV多肽于搅拌的反应液中。用26号针头在尽可能接近搅拌子的位置猛烈将重链和轻链注射于搅拌的反应液中。加入轻链后，折叠缓冲液应变得轻微不透明。存放于10℃，过夜。
将复性反应物超滤浓缩至7ml。用Superdex75凝胶过滤纯化MHC-HIV抗原肽单聚体。用SDS-PAGE检测，并用ELISA法鉴定其构象。
将MHC-I单聚体与制备的荧光标记的卵黄抗体按比例混合，37℃温浴1h，用Superdex200凝胶过滤纯化。FPLC检测。
将MHC-I单聚体与制备的荧光标记的单克隆抗体按比例混合，37℃温浴1h，用Superdex200凝胶过滤纯化。FPLC检测。
实施例11：用鼻烟癌肽段合成MHC-肽抗体多聚体
水浴或冰冻孵箱预冷1L折叠缓冲液(装于有搅拌子的1L的烧杯中)，在折叠缓冲液加入还原型谷胱酐肽至5mM，氧化型谷胱酐肽至0.5mM，PMSF至0.2mM。计算加入1uM重链、2uM轻链和30mg/L肽的必需量，将重链和轻链加入5ml注射缓冲液中，于室温抽入5ml注射器中。并根据鼻烟癌多肽的氨基酸序列(疏水性)于500ul双蒸水或DMSO中稀释鼻烟癌多肽。将1L重悬缓冲液放于搅拌器上高速搅拌(避免反应液起泡)，用移液器逐滴加人组织相容性抗原多肽于搅拌的反应液中。用26号针头在尽可能接近搅拌子的位置猛烈将重链和轻链注射于搅拌的反应液中。加入轻链后，折叠缓冲液应变得轻微不透明。存放于10℃，过夜。
将复性反应物超滤浓缩至7ml。用Superdex75凝胶过滤纯化MHC-鼻烟癌抗原肽单聚体。用SDS-PAGE检测，并用ELISA法鉴定其构象。
将MHC-I单聚体与制备的荧光标记的卵黄抗体按比例混合，37℃温浴1h，用Superdex200凝胶过滤纯化。FPLC检测。
将MHC-I单聚体与制备的荧光标记的单克隆抗体按比例混合，37℃温浴1h，用Superdex200凝胶过滤纯化。FPLC检测。