一种制备D-氨基酸氧化酶的方法 【技术领域】
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种制备黄素蛋白酶D-氨基酸氧化酶的方法。具体涉及，通过构建重组工程菌株获得高效生产突变D-氨基酸氧化酶的方法。
背景技术
D-氨基酸氧化酶(D-Amino Acid Oxidase.EC 1.4.3.3.DAAO)是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作为辅基的典型黄素酶，广泛存在于动物和多种微生物中。天然酶蛋白为86kDa的二聚体，具有催化氧化头孢菌素C活力。哺乳动物的DAAO与辅基FAD结合较松，辅基易丢失而使酶失活；而某些酵母与辅基FAD结合较强，有较高活性。实际应用中，三角酵母的DAAO是最常用并且最具应用潜力(Dominguez，A，Yeast 1997，13：1399-1408)。DAAO催化D-氨基酸氧化脱氨生成α-酮酸，可用于催化氧化消旋氨基酸生产L-氨基酸和α-酮酸。在半合成头孢菌素的酶法合成工业中，DAAO与GL-7ACA酰化酶双酶催化是目前最有前景的酶法生产7-ACA的途径。头孢菌素C经DAAO催化氧化脱氨产生α-酮基己二酰-7-氨基头孢烷酸，若有H2O2存在，便自发氧化脱羧形成戊二酰-7-氨基头孢烷酸(GL-7ACA)(Shewale，JG，J.Biotechnol.1999，75：11-22)。GL-7-ACA酰化酶进一步催化GL-7ACA脱戊二酰生成7-ACA。
目前，从多种来源的DAAO基因已获得了克隆，并且在大肠杆菌和酵母中实现了重组表达。毕赤酵母表达系统具有可诱导的强启动子，可以达到高密度培养和高效表达，易于实现工业化。有报道，利用毕赤酵母表达来源于三角酵母Trigonopsis viabllis的DAAO已经获得较高水平表达(袁中一、于建中国专利CN1385521A)。然而，发现在DAAO的分离纯化过程中，总伴随着过氧化氢酶的活力，以常用的分离纯化技术难以实现二者的完全分离。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种简单、快速制备D-氨基酸氧化酶的方法。具体是通过构建重组工程菌株获得高效生产突变D-氨基酸氧化酶的方法。
本发明采用DNA重组技术改造三角酵母野生型DAAO基因，将Histag融合于野生型酶基因的N-末端和C-末端，在毕赤酵母中既实现了突变酶地高效表达，又可用亲和层析简单快速地获得高纯度的DAAO。纯化的酶可用于高效氧化转化头孢菌素C-产生戊二酰-7-ACA，与GL-7-ACA酰化酶联用可生产7-ACA.。
本发明通过下述方法和步骤进行，
1，突变D-氨基酸氧化酶基因，
以质粒pPIC3.5K-DAAO为模板，在DAAO编码序列的5’端和3’端按常规方法分别导入连续编码6个组氨酸的Histag序列，获突变基因，对应的突变D-氨基酸氧化酶N端和C端都有组氨酸序列。也可以在DAAO编码序列的5’端或3’端各单独引入6个组氨酸的Histag序列，对应的突变D-氨基酸氧化酶N端或C端有组氨酸序列。
2，构建突变酶表达菌株，
上述突变基因被平端克隆到pBluescript(SK+)，再经NotI和BamHI酶切后克隆到同样酶切的载体pPIC3.5K，得到重组质粒pPIC3.5K-hisDAAO。所述重组质粒用SalI线性化，电转化毕赤酵母宿主细胞GS115，通过PCR法筛选得到阳性重组菌株，再通过酶活力测定筛选出高产菌株，命名为Fudan0112，(已于2004年3月3日保藏，保藏单位：CGMCC，北京市海淀区中关村北一条13号，保藏编号：CGMCC No.1103，微生物分类名称：Pichia.Postori)s。
3，发酵、培养、分离突变D-氨基酸氧化酶，
将上述所得高产菌株进行发酵培养后，通过突变D-氨基酸氧化酶N端和C端带有Histag序列与亲和树脂上Ni离子的特异性亲和吸附分离D-氨基酸氧化酶。最高酶产量达到4000IU/ml。所得的菌体经超声破壁、低温离心所得上清作为粗酶液，再通过Ni柱进行亲和层析，洗脱梯度为0、5mmol/L、25mmol/L、50mmol/L、100mmol/L咪唑的磷酸缓冲液，纯化的酶回收率为50％。
本发明所述的宿主细胞购自Invitrogen公司，基因来源于专利CN 1385521A所描述的菌株和质粒。
【附图说明】
图1是本发明的包含突变D-氨基酸氧化酶基因的重组质粒构建图，
图2是本发明的SDS-PAGE电泳图谱：其中1为阳性重组菌的胞内蛋白；2为空载体pPIC3.5k转化的重组菌胞内蛋白；3为低分子量标准蛋白，
图3是本发明的毕赤酵母重组菌株表达D-氨基酸氧化酶的活力曲线，
【具体实施方式】
实施例1 获得突变D-氨基酸氧化酶基因
根据已知的三角酵母Trigonopsis Vriabllis的DAAO基因序列和组氨酸对应的密码子设计突变引物如下：
5’primer 5’GGATCC ATGCACCATCATCATCATCAT ATGGCTAAAA TCGTTGTT
3’primer 5’GCGGCCGC TTAATGATGATGATGATGATG AAGGTTT GGACGAGTAAG模板基因来源于专利CN 1385521A所描述的质粒pPIC3.5K-DAAO，用高保真PCR(Pfu酶，购自博彩)扩增DAAO基因，并且分别在编码序列的5’和3’端分别导入连续编码6个组氨酸的Histag序列，并且分别引入NotI和BamHI对应的酶切位点。PCR反应条件为：94℃ 5min，1个循环；94℃ 30s，40℃30s，72℃ 75s，5个循环；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 75s，30个循环；最后，72℃ 10min，1个循环。
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳验证后，采用DNA胶回收试剂盒(购自Promega)回收突变DAAO基因片段。
实施例2 突变DAAO基因平端克隆到质粒pBluescript(SK+)
质粒pBluescript(SK+)以SmaI线性化，作为平端克隆的载体。胶回收的突变DAAO基因片段与所述载体进行体外连接，反应体系(20μl)如下：
pBluescript(SK+) 2μl
PCR产物 10μl
10倍连接缓冲液 2μl
T4 DNA连接酶(1U/μl) 1μl
水 5μl
混合物于16℃反应过夜。所得连接产物转化E.coli TG1感受态细胞，涂布于含氨苄抗性的LB平板，挑选白色转化子抽提质粒DNA，所得DNA用PCR法和酶切法证明重组质粒为pSK-DAAO。
实施例3 构建表达质粒pPIC3.5K-hisDAAO
将pSK-DAAO用NotI和BamHI双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳，胶回收约1.3Kb的片段，再与经同样双酶切的pPIC3.5K质粒进行体外连接，反应体系如下：
pPIC3.5k(NotI和BamHI切) 2μl
DAAO基因片断 15μl
10x连接缓冲液 2μl
T4 DNA连接酶 1μ
上述混合物于16℃反应过夜。所得连接产物转化E.coli TG1感受态细胞，涂布于含氨苄抗性的LB平板，挑选转化子抽提质粒DNA，所得DNA用PCR法和酶切法证明重组质粒为pPIC3.5K-DAAO。
实施例4表达质粒电转化毕赤酵母GS115
所构建的表达质粒pPIC3.5k-DAAO用Sa/I酶切线性化。宿主菌P.pastorisGS115(his mut+)培养至OD为1.6-1.8，制备电感受态细胞，与上述质粒混合，再以GIBCOL BRL电转化仪CELL-PORATOR电转化，其中电压1500V，电容50μF，电阻4kΩ，向转化杯中加入0.5ml 1mol/L冷山梨醇，取200μl涂于MD平板，30℃培养至单菌落出现。将转化子分别涂于MM和MD平板筛选Mut+转化子，用PCR筛选阳性菌株，将得到的阳性菌株表达，筛得高产菌株，其中PDH12株表达水平最高。
实施例5 PCR方法筛选阳性毕赤酵母重组菌株
将MD平板上的转化子分别接入3ml YPD试管培养，按酵母质粒DNA抽提试剂盒提取转化子质粒DNA。按如下PCR反应体系做PCR反应：
10X缓冲液 2.5μl
dNTP(25mM each) 0.5μl
5’DAAO Primer 1μl
3’DAAO Primer 1μl
模板 1μl
Taq DNA聚合酶 0.5μl
水 18.5μl
以上混合物共25μl按实施例1条件进行PCR反应。
实施例6重组甲醇酵母菌株表达D-氨基酸氧化酶
从YPD斜面培养基挑选单菌落，接入含30mlBMGY培养基的250ml摇瓶，28-30℃，220r/min，培养24h，取1.5ml转入40ml基础盐培养基生长24h，离心(4000rpm，5min)，弃上清，菌体用40ml诱导培养基悬浮，培养。每6h取菌体测DAAO活力，每24h补甲醇至其终浓度为0.5％。
实施例7发酵罐中毕赤酵母重组菌株表达D-氨基酸氧化酶
发酵罐为美国NBS公司Bio F110自动控制发酵系统，含pH自动调节、温度自动控制、溶氧监测、搅拌、进气系统。
发酵参数设置 温度：30℃；pH：6.0；D0(溶氧浓度)：35％；搅拌：200-800r/min.
种子液制备：从YPD斜面培养基挑选单菌落，接入含BMGY培养基40ml的摇瓶，28-30℃，220r/min培养24h，作为一级种子液。再以5％的接种量接入BMGY 400ml，同样条件下培养12-14h，至A600约8左右，作为发酵罐种子液。
发酵培养：14L发酵罐装入6L基础盐培养液，种子液以8-10％的接种量接入发酵罐。菌种生长初期，通过溶氧搅拌关联系统，使DO维持在35％左右。搅拌达800r/min，解除溶氧搅拌关联。视DO陡然上升情况，流加50％甘油，4h后停止。甘油耗完，开始流加甲醇，流加速度以维持DO 35％为宜。定时取样测菌重及活力，适时放罐，最终菌体密度达180g/L(湿重)，酶活力4000IU/mL。
实施例8分离和纯化D-氨基酸氧化酶
诱导后所得的菌体用3倍体积的磷酸缓冲液悬浮，经超声波超声16min.4℃离心(12000rpm，20min)，用30％硫酸铵沉淀上清，4℃离心(12000rpm，20min)，上清液作为上柱样品液。
Ni螯合树脂装入层析柱，平衡好后加入待分离样品，依次用含0、5mmol/L、50mmol/L、100mmol/L的磷酸缓冲液洗脱，分别收集含蛋白洗脱液，SDS-PAGE检测，结果表明，含50mmol/L咪唑的洗脱峰中含有目的蛋白。
实施例9 HisDAAO转化CPC-Na
上述纯化产物与2％的CPC-Na混合，25℃振荡反应3h，经HPLC检测3hCPC-Na转化完全，生成物为GL-7ACA。
实施例10 DAAO活力测定
取培养液1ml，离心，菌体用含30％丙酮的焦磷酸缓冲液(0.05mol/L，pHg.5)10ml重新悬浮，25℃水浴轻微震荡30min，离心，用生理盐水洗涤，菌体加入0.05mol/L的DL-蛋氨酸5ml，37℃水浴震荡30min。用10％三氯乙酸3ml终止反应，稀释10倍，取1ml，加2，4-二硝基苯肼(0.2％)0.4ml，静置10min，加3mol/LNaOH 1.5ml，静置15min，离心取上清，测A550。
所述的酶单位定义：每分钟生成1umol酮酸所需的酶量定义为1单位的DAAO，
酶单位计算公式为活力IU/ml＝K×OD×M×1000/30×D
其中K：标准曲线斜率0.592；M：稀释倍数；D：所取菌液体积(ml)。
突变基因序列
Organization Applicant
----------------------
Street：医学院路138号
City：上海
State：上海
Country：中华人民共和国
PostalCode：200032
PhoneNumber：64037324
FaxNumber：64037324
EmailAddress：patent@shmu.edu.cn
<110>OrganizationName：复旦大学
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<120>Title：一种制备D-氨基酸氧化酶的方法
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<213>OrganismName：Trigonopsis Vriabllis
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ggatccatgc accatcatca tcatcatatg ccggtgttgc cggtttaact acagctcttc
60aacttcttcg taaaggacat gaggttacaa ttgtgtccga gtttacgccc ggtgatctta
120gtatcggata tacctcgcct tgggcaggtg ccaactggct cacattttac gatggaggca
180agttagccga ctacgatgcc gtctcttatc ctatcttgcg agagctggct cgaagcagcc
240ccgaggctgg aattcgactc atcagccaac gctcccatgt tctcaagcgt gatcttccta
300aactggaagt tgccatgtcg gccatctgtc aacgcaatcc ctggttcaaa aacacagtcg
360attctttcga gattatcgag gacaggtcca ggattgtcca cgatgatgtg gcttatctag
420tcgaatttcg ttccgtttgt atccacaccg gagtctactt gaactggctg atgtcccaat
480gcttatcgct cggcgccacg gtggttaaac gtcgagtgaa ccatatcaag gatgccaatt
540tactacactc ctcaggatca cgccccgacg tgattgtcaa ctgtagtggt aaacgtcgag
600tgaaccatat caaggatgcc aatttactac actcctcagg atcacgcccc gacgtgattg
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aaaagaaaat gaagacgaag ctctatatat catgacccga ttcgatggta 840cttctatcat tggcggttgt
ttccaaccca acaactggtc atccgaaccc gatccttctc 900tcacccatcg aatcctgtct agagccctcg
accgattccc ggaactgacc aaagatggcc 960ctcttgacat tgtgcgcgaa tgcgttggcc
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