用于细胞学和免疫学调节的短的生物活性肽.pdf

用于细胞学和免疫学调节的短的生物活性肽
本申请要求享有2007年1月5日提交的美国临时申请No.60/878,849的优先权，其全文以引用方式并入本文。
发明领域
本发明涉及具有生物学和治疗活性的肽。具体地，本发明涉及具有SEQ IDNO：1的4至14个连续氨基酸残基的短肽。它们表现出对例如角化细胞等细胞的增殖、迁移和抗炎症活性。本发明进一步涉及使用这些肽治疗多种影响皮肤和如口腔等其它相关体表的损伤的方法。
发明背景
皮肤上皮由4到5个分层构成，所有这些分层大都包含角化细胞；如成纤维细胞的其它类型细胞也可以填充上皮。角化细胞来源于上皮最底部的基底层，并且逐渐的向皮肤最外部迁移，在这里它们变得角质化并最终脱落。在这一迁移期间，角化细胞分化以表达角质化所必须的酶和结构蛋白(Presland和Dale，2000)。由于角化细胞在形成上皮中的主要作用，它们代表了治疗损伤皮肤的主要靶向。角化细胞也是与上皮相连的黏膜组织的主要成分(Presland和Dale，2000)。这种组织缺乏上皮的不可渗透的、角质化的层，并且形成与口、鼻、喉咙、耳朵、肛门和外生殖器相关的内衬表面。与皮肤相似，黏膜表面对于阻止感染药剂进入体内是重要的；因此，这两种组织类型中任何一种的损伤都可能危及个体健康。
皮肤和黏膜组织损伤发生在上皮层被破坏的时候，如因裂口、烧伤或水疱。损伤还可涉及破碎或硬伤，它们涉及上皮没有同时裂口的组织损伤。皮肤感染，以及某些慢性疾病(如癌症和自身免疫性疾病)也可以确切造成上皮表面损伤。溃疡，如感染糖尿病或者与压痛相关的那些，是另一种类型的皮肤损伤。这些伤口常常非常棘手，正在发炎，易于感染，并且需要一个长期的愈合过程。通常假定一种顽固的溃疡、或者任何其它的慢性伤口，是由于一个涉及愈合的细胞过程(如细胞信号)的失败造成的(Enoch和Price，2004；Sweitzer等，2006)。一种失败是不能在损伤处发生上皮形成-在伤口边界的角化细胞尽管能够增殖，却不能迁移以覆盖伤处(Enoch和Price，2004)。关于糖尿病溃疡，另一种失败是缺乏某些信号分子；这一缺陷可能会妨碍配合伤口闭合所必需的重建进程(Sweitzer等，2006)。
其它类型的上皮损伤是难以理解的并且导致经过很长一段时期，最终在面对急性损伤时危害皮肤功能；伤口愈合在时间上延长并且不完善(如疤痕形成)。美容的问题如起皱、干燥、变薄、松垂和对硬伤更大的敏感性，是这种疾病通常的表面迹象。不奇怪地，这些磨损迹象通常与老化相关，但也能够在由于长期接触有害药剂(如紫外线(光老化))下过早的发生。由太阳光诱导的光反应过程能够导致减少皮肤厚度和弹性，同时增加皮肤韧性(Pelicci，2004；Fisher等，2002)。
急性皮肤和黏膜伤口的愈合是精心策划的，部分是通过基底的角化细胞活化，紧接着增殖、迁移和分化的路径以影响伤口愈合。这个过程伴随着一系列在损伤位置的重构活动(Enoch和Price，2004)。在一个被称为上皮形成的过程中位于伤口周围的角化细胞增殖并迁移以在伤口上形成单层。角化细胞进一步的增殖和分化能建立一个包含正常分层的上皮层。炎症反应过程可能有利于伤口愈合；浸润单核细胞抗感染并且也释放能够刺激伤口上皮形成的因子。但是，炎症反应过程也能使愈合恶化；例如，巨噬细胞引起纤维蛋白沉积促进疤痕产生。已经证明只要维持无菌条件，当免疫参与被截断时，上皮伤口愈合就出现得更快并且疤痕更少(Martin和Leibovich，2005)。正是出于这些见解，当前构思出了用于在上皮损伤处下调炎症的模型。已经证明了一些因子在皮肤和相关黏膜组织的伤口愈合中通过角化细胞刺激上皮生成，这些因子包括上皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、角化细胞生长因子(KGF)、和血小板衍生生长因子(PDGFs)(Enoch和Price，2004)。有趣的是，出现在皮肤和黏膜表面的一些抗微生物蛋白也已知在刺激细胞在愈合上皮伤口所需的增殖和迁移过程中发挥功能(Shaykhiev等人，2005；Braff和Gallo，2006；Zhang和Falla，2006)。
在已知某些生长因子在伤口愈合过程中被自然招募的情况下，研究已经指向于开发用于治疗伤口，尤其是那些通常慢性的伤口的基于生长因子的方法。例如，使用PDGF_BB(Mustoe等人，1994；Steed，1995)治疗糖尿病溃疡已经获得了FDA批准。但是，多数使用这种策略的尝试都没能达到临床显著结果，部分是由于与治疗蛋白使用相关的困难。一个问题涉及到生长因子向伤口位置的低效率递送；这些蛋白的局部施用仅仅允许外部(多数是死组织)接触治疗蛋白。其它的缺点涉及到在递送到伤口位置之后生长因子蛋白的高不稳定性和低滞留能力。
使用生长因子和其它蛋白治疗上皮伤口的困难涉及相关蛋白的大尺寸。生长因子治疗的广泛应用还受到制备大蛋白的复杂性和高成本的制约。因此，由于它涉及蛋白因子在伤口愈合方案中的使用，所以目前正在寻找较低成本和更高效制备方法。具有它们所来源的大蛋白(如，母蛋白)的活性的短肽填补了这种需求。以前已经报道了这种短肽的实例(美国专利No.6,861,406和6,693,077；Lee等，2004)。除了更便宜、更方便生产、处理和操作的直接的好处以外，小的生物活性肽还能被伤口组织更好地吸收和保留。短的生物活性肽的这种更好的吸收特性还使得它们成为治疗急性和慢性损伤之外的可行的选择，例如用于治疗与老龄和阳光接触相关的皮肤问题。
发明概述
本发明涉及可用于促进哺乳动物伤口愈合的短的生物活性肽。分离的肽所靶向的伤口优选是影响皮肤和相关黏膜表面的那些。尽管不受任何特定的机制的限制，本发明的肽能够通过刺激细胞增殖和迁移，以及通过抑制发炎(发炎会破坏最佳的愈合进程)来影响伤口愈合。本发明的肽可以体内和体外的方式使用，并且能够诱导角化细胞的上述活性。
本发明的一种实施方式涉及含有SEQ ID NO：1的4至14个连续氨基酸残基的分离的肽。这些肽代表肽HB-107的短片段。分离的肽可含有L-或D-对映体形式的氨基酸，或者它们的组合。根据发明的另一种实施方式，分离的肽可能偶联到载体蛋白，或者通过酰胺化或脂化修饰。这些附加物提高了当肽用于皮肤和其伤口时的生物活性。
根据本发明某些优选实施方式，分离的肽可在其氨基末端含有甲硫氨酸、缬氨酸、赖氨酸、或谷氨酸氨基酸残基。分离的肽也可在其羧基末端含有赖氨酸、缬氨酸、甘氨酸或或天冬酰胺氨基酸残基。在其它优选的实施方式中，分离的肽可包含：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6或者SEQ ID NO：12。分离的肽的特定的实施方式是SEQ ID NO：2、3、5、6、7、8、9、10、11、12和15，所有这些都显示出针对细胞增殖、迁移和抗炎症反应的一种或多种刺激活性。在这些特定的肽中，SEQ ID NO：2、3、5、6、7、9、10、11和12都具有细胞增殖(cell proliferative)活性；并且这些肽中，SEQ ID NO：2、3、5、6和9表现出最强的增殖活性。肽SEQ ID NO：3和6都具有细胞增殖和迁移活性。SEQ IDNO：12具有细胞增殖和抗炎症反应活性，而SEQ ID NO：8和15具有细胞抗炎症反应活性。
本发明的另一种实施方式涉及组合物，该组合物含有药学上可接受的载体和一个或多个上述的肽。在这些组合物中的肽优选浓度范围为约0.1μg/mL到约20μg/mL，或者约0.1μg/mL到约50μg/mL。组合物的优选形式是气雾剂、乳剂、液体、洗剂、霜剂、糊剂、软膏、粉剂和泡沫。
本发明还涉及将上述组合物用于哺乳动物愈合伤口的方法。一般来说，治疗方法需要向伤口，尤其是皮肤(上皮)和相关的黏膜组织的伤口给药有效量的含肽组合物有效量的时间。这些伤口包括擦伤(abrasions)、水疱(blisters)、灼伤(burns)、裂伤(lacerations)、溃疡、挫伤(bruises)、皮疹(rashes)、疤痕(scars)、以及衰老和环境接触的影响。
附图简要说明
图1：图中显示本发明的肽与母肽HB-107(SEQ ID NO：1)的比对。
图2：响应紫外线B(UVB)接触的皮肤上皮细胞的IL6表达。使细胞接触UVB照射一定的时间(0-35秒)，并且在UVB照射后24小时使用ELISA检测IL6的表达。每个处理一式三份进行。参见实施例4。
图3：短肽对于皮肤上皮细胞中UVB诱导的IL6表达的影响。细胞接触UVB照射35秒，然后将细胞在含有40μg/mL肽[HB-107(SEQ ID NO：1)、HB-802(SEQ ID NO：12)、HB-1410(SEQ ID NO：15)、HB-801(SEQ ID NO：31)]的完全培养基(无血清)中培养20小时。然后使用ELISA检测IL6的表达。参见实施例4。
发明详述
美国专利No.5,962,410和5,861,478提供了可用于理解本发明的公开内容并且它们的全文以引用方式并入。本发明涉及例如衍生自肽HB-107(SEQ IDNO：1)的短的生物活性肽、以及它们的使用方法。肽HB-107本身构成杀菌肽B的片段，杀菌肽B是存在于一种蛾中的抗菌蛋白。尽管HB-107不表现出它所来源的蛋白的抑菌作用，但是它的确表现出上皮伤口愈合能力(Lee等，2004)。
本发明的肽显示对于上调上皮组织(如皮肤和相关黏膜(例如，口腔))的愈合进程很重要的活性。不受任何具体机制的限制，这些活性涉及角化细胞，负责伤口闭合(即，上皮形成)和上皮表面发育的上皮细胞。本发明的肽对于与伤口愈合直接相关的角化细胞显示的特定活性是对细胞增殖和迁移的刺激、以及通过角化细胞下调炎症信号的能力。尽管HB-107能够诱导角化细胞的所有这些活性，但是非常令人惊讶的是，本发明的肽也能够在等于或高于HB-107的水平诱导所有这些活性。这些结果令人惊讶同时非常重要，因为发明的肽只有HB-107长度的26％-74％。
因为这种大小差别，与HB-107和全长蛋白(如PDGF-BB)的制备相比本发明的肽制备更容易并且因此更廉价。同时，与较大的肽相比，本发明所公开的肽以更直接的方式溶解、操作(例如化学修饰)和存储。它们的易于操作性使得它们具有更多药物递送选择，例如所使用的溶媒和如何施用。本发明肽的大小和更大的溶解度允许它们通过增加在伤口位置的吸收和停留、使局部的角化细胞和其它细胞接触更高的浓度肽更长的时间来增加愈合效力。
本发明中肽所引发的生物活性是细胞增殖和迁移，以及对炎症反应的抑制。前两个过程在肽调节伤口愈合的功能中发挥很大的作用。肽能够：首先刺激角化细胞环绕伤口边缘迁移；第二，刺激这些细胞增殖以在受伤位置产生新的上皮层。第三个活性抑制炎症反应，通过本发明所公开的肽对伤口处的细胞分泌细胞因子白介素6(IL-6)的负面影响而实现。已经证明IL6是上皮角化细胞响应组织损伤相关的因子释放的(Sugawara等，2001)；该细胞因子介导免疫细胞渗透进伤口中，一个能够实际上加快愈合并导致疤痕形成的过程(Martin和Leibovich，2005；Liechty，2000)。虽然炎症反应对于预防伤口感染很重要，但是在标准伤口护理过程中良好的抗菌操作的提供抵消了任何可能与阻断炎症反应相关的弊端。虽然本发明有可能是通过上面这些活性影响伤口愈合，但要注意的是，应用并不局限于任何一类特定的生物机制。
关于诱导细胞增殖和迁移，肽SEQ ID NO：3(HB-1061)和SEQ ID NO：6(HB-1072)是优选的。与HB-107的诱导相比，这些肽产生明显增加的细胞增殖，并且还比HB-107更短(参见实施例1和2)。它们也象HB-107一样能够诱导细胞迁移。肽SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：12在诱导细胞抗炎症反应活性方面是优选的(参见实施例3)。
本发明的肽还表现出针对与皮肤老化或者皮肤高度暴露于有害原(如太阳照射)相关的问题的有益效果。没有改变的短肽本身、或者通过化学修饰和/或特定的递送，可以通过上皮吸收以实现抵抗导致皮肤变薄、皱纹、脆弱性和变粗糙/硬化的过程。本发明刺激皮肤维护的主要方式是通过这些肽对角化细胞生长的正效果。由于这些细胞是上皮表面的主要成分并且在老化和损伤的皮肤中减少(Enoch和Price，2004)，通过肽刺激来补充它们有望扭转上述问题。IL6的表达包括涉及在具有某些自身免疫问题的病人中上皮的非正常增厚的过程(Sato等，2001；Oyama等，1998)；本发明的肽能够通过抑制IL6表达阻断这种炎症反应相关的后果。
肽
仅仅作为一个指导点，本发明的肽可以源自蛾抗菌肽B蛋白的HB-107片段(表1)。与这些肽相关的代谢特点是他们诱导细胞增殖、迁移、和/或抗炎症反应活性的能力。所有本发明的肽都具有的共同特点是，具有HB-107(SEQID NO：1)的4至14个连续的氨基酸残基。因此，本发明的肽可以由HB-107(SEQ ID NO：1)的4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续的氨基酸残基构成。
除了具有上面的氨基酸组成之外，上述肽可以额外的含有以下氨基酸(全名/3个字母简写/单字母简写)：丙氨酸/ala/A、精氨酸/arg/R、天冬酰胺/asn/N、天冬氨酸/asp/D、半胱氨酸/cys/C、谷氨酰胺/gln/Q、谷氨酸/glu/E、甘氨酸/gly/G、组氨酸/his/H、异亮氨酸/ile/I、亮氨酸/leu/L、赖氨酸/lys/K、甲硫氨酸/met/M、苯丙氨酸/phe/F、脯氨酸/pro/P、丝氨酸/ser/S、苏氨酸/thr/T、色氨酸/trpAV、酪氨酸/tyr/Y和缬氨酸/val/V。这些氨基酸残基特征如下：脂肪族(丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸)；芳香族(苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)；酸性(天冬氨酸、谷氨酸)；碱性(精氨酸、组氨酸、赖氨酸)，羟基类(极性)(丝氨酸、苏氨酸)；含硫类(极性)(半胱氨酸、甲硫氨酸)和酰胺类(天冬氨酸、谷氨酸)。非标准氨基酸残基也可能包含在本发明所公开的肽之内，包括但不限于硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸(pyrrolysine)和氨基酸的各种环化形式。
下列肽是本发明的非限制性实例，展示出来仅用于示例性目的(表1)
表1：本发明的肽

  SEQ ID  NO：  肽  序列  1  HB-107  MPKEKVFLKIEKMGRNIRN  2  HB-1059  EKMGRNIRN  3  HB-1061  MGRNIRN  4  HB-1062  GRNIRN  5  HB-1071  VFLKIEKMG  6  HB-1072  KIEKMG  7  HB-1074  VFLKIEK  8  HB-1076  KEKVFLKIE  9  HB-1057  KIEKMGRNIRN  10  HB-912  MPKEKVFLKIEKMG  11  HB-801  PKEKV  12  HB-802  MPKEK  13  HB-1056  LKIEKM GRNIRN  14  HB-1060  KMGRNIRN  15  HB-1410  PKEK
肽SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：15是与一种或多种上述活性(增殖、迁移、抗炎症反应)相关的肽的实例。肽SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12是能够诱导增殖的肽的实例。肽SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6是能够诱导细胞增殖和迁移的肽的实例。肽SEQ ID NO：12是同时显示增殖和抗炎症活性的肽的实例。肽SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：15是具有抗炎症活性的肽的实例。
上述肽的每一个都可以包含L-或D-氨基酸对映体形式，含有一种对映体形式的残基或者两种形式的组合的残基。肽可以化学方法或者酶学方法进一步扩大或修饰，如下面的非限制性实施例所描述。肽的羧基末端能够酸化(-COOH)或者酰胺化(如-CONH₂、-CONHR、或-CONR₂)。羧基末端的酰胺化可能导致发明的肽对于蛋白酶降解更加不敏感并且与游离酸形式相比增加溶解度，，因此而提供更高的治疗效力。肽也可以被脂化，这可能提供增强的皮肤渗透性。可以进行肽修饰以使N-末端氨基的氢被取代、C-末端的羧基的羟基被取代、整个N-末端的氨基被取代、或者整个C-末端的羧基被取代。连接每个肽的氨基酸的一个或多个分子键可以是一个非肽类键。这些非肽类键包括但不限于酰亚胺、酯肼、氨基脲(semicarbazoide)和偶氮键。
可以对肽做多种多样的修饰，只要保留其特征性的增殖、迁移和抗炎症反应活性即可。一些修饰可能用于增加肽的效力，而其它修饰可能使肽更易于操作。肽官能团可以通常被修饰以包括羟基、氨基、胍、羧基、酰胺、苯酚、咪唑环或巯基。通常，这些基团的非限制性反应包括以下这些：羟基通过卤代烷乙酰化；羧基酯化、酰胺化、氢化(如，还原为乙醇)；氨基基团(如，肽的伯胺基团或赖氨酸残基的氨基)的去酰胺化、酰化、烷基化、芳基化；酪氨酸酚基的卤化或硝化。
肽可以连接到可溶的或不可溶的载体分子以根据需要修饰他们的溶解度并且增加肽在靶组织的局部浓度。可溶性载体分子的实例包括聚乙二醇聚合物(PEG)和聚乙烯吡咯烷酮；不溶性聚合物的实例包括硅酸盐，聚苯乙烯和纤维素。肽也可以被微囊化以在治疗施用期间和之后增强它们的稳定性；通常，聚酯和PEG微球用于封装和稳定肽。
可以根据待封装的肽组合物的亲水和疏水性质采用多种制备用于肽封装的微球的方法。这类方法操作步骤的实例参见Wang HT等人(1991，J.Control.Release 17：23-25)和美国专利No.4,324,683，这两者的全文都以引用方式并入。可以进行体外肽释放研究以测定肽被整合到微球后的相对可用性。微球(200mg)悬浮在pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)(2.5mg)中，在环境孵化混匀器(G-24，New Brunswick Scientific Co.，Edison，N.J.)中37度下以100rpm搅动。在特定的采样时间(最初4天每天一次，然后隔天一次)完全移除缓冲液然后用新鲜的PBS替换。PBS中肽的含量使用Bradford法或其它合适的通常用于蛋白分析的定量分析法检测。
所有本发明所公开的肽都可以使用标准的Fmoc(9-芴甲氧羰基)固相化学法在Advanced ChemTech Apex 396肽合成仪上合成。Apex 396配备了40孔反应模块以最多同时生产0.15mmol规模的肽。肽能够使用标准氨基酸的酰胺化或游离的酸序列制备。树脂首先使用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤并预膨胀。对于Rink酰胺树脂膨胀时间是一个小时。使用含25％哌啶的DMF孵育25分钟去除Fmoc保护基团，然后完全从树脂上洗除哌啶。为了控制外消旋过程，将Fmoc氨基酸单体在DMF中的浓度为0.5M的1-羟基苯并三唑(HOBt)或1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)的平衡溶液中预激活。酰胺耦合是使用作为激活剂的O-(7-偶氮苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)或者2-(1H-苯丙三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和2.5-5.0倍摩尔数过剩的氨基酸在碱性条件下使用受阻碱(二异丙基乙胺)进行。耦合时间是1-1.5小时，然后洗涤和再耦合以在生长的肽链脱保护和连续之前完成两倍或三倍的耦合。耦合效率使用标准凯撒测试(Kaiser test)监测。一旦肽合成在树脂上的完成，则如上所述去除最后的Fmoc基，留下作为游离碱基的序列。
树脂与肽的酸不稳定连接的裂解使用95％三氟乙酸(TFA)和加了合适清除剂的水完成。在裂解之后可以允许继续进行30分钟到一个小时，释放的肽立刻从裂解模块上移除并转移到试管以在较低的压力下去除TFA。然后通过使用C18反相柱和质谱的高效液相色谱(HPLC)对肽进行纯化和分析。初级序列确认和制备性纯化使用LC/MS/MS系统(ABI API2000)完成。
上述操作步骤概括的说，肽可以使用任何本领技术人员已知的方法制备，例如在以下文献中公开的那些：Merrifield，R.B.，Solid Phase Peptide Synthesis I.，J.AM.CHEM.SOC.85：2149-2154(1963)；Carpino，L.A.等人，[(9-Fluorenylmethyl)Oxy]Carbonyl(Fmoc)Amino Acid Chlorides：Synthesis，Characterization，And Application To The Rapid Synthesis Of Short Peptides，J.ORG.CHEM.37：51：3732-3734；Merrifield，R.B.等人，Instrument For AutomatedSynthesis Of Peptides，ANAL.CHEM.38：1905-1914(1966)；或Kent，S.B.H.等人，High Yield Chemical Synthesis Of Biologically Active Peptides On An AutomatedPeptide Synthesizer Of Novel Design，IN：PEPTIDES 1984(Ragnarsson U.，编辑)Almqvist and Wiksell Int.，Stockholm(Sweden)，第185-188页。所有这些的全文以引用方式并入。优选的，肽使用能够向生长中的肽链顺序添加氨基酸的机器生产。然而，肽也可使用标准的溶液相方法学生产，这种方法能够易于大规模生产。
使用方法
本发明的其他实施方式涉及使用上述肽的方法，如在制剂中或作为治疗药剂。这些方法可以包括使用一种肽或多种肽的组合。
本发明的肽可用于治疗皮肤(上皮、真皮和皮下组织)和相关黏膜组织的伤口。本文所用的术语“相关黏膜组织”涉及与皮肤的排列方式类似并含有上皮细胞的任何组织。角化细胞是这种上皮细胞的非限定的实例。这类组织的实例有口、鼻咽、耳和泌尿生殖道的表面，以及眼睛的睑结膜。相关黏膜组织的其它实例包括消化道(包括食管、胃、小肠、大肠(结肠)和直肠)的整个内衬(即内腔)。后面的这些实例可以维持伤口/病灶，很像能够影响皮肤的那些伤口/病变，因此可以用本发明来靶向。可以影响到这些组织并且适合使用本发明的肽治疗的伤口/病变/损伤的实例为擦伤、水疱、灼伤、裂伤、刺伤、溃疡、挫伤、皮疹和疤痕。手术后组织创伤也可以使用这些肽治疗。
本发明的肽还可以用于预防或修复老化对所有上述组织的影响。以相关的方式，肽可以施用于通过接触如阳光等多种外部因素而损伤的组织。老化和接触相关衰弱(debilitation)的实例为皮肤起皱、干燥、变薄、下垂和挫伤的更易感性。本发明还可以用于作为这些方面的化妆品以呈现更年轻的外观和质感，并提供更好的功能。
使用本发明的肽有效治疗的其它组织问题涉及过敏或自身免疫。这些疾病包括皮炎、银屑病、硬皮病、天疱疮与炎症性肠病。
用于在上述治疗方法中递送肽的组合物可以是气雾剂、乳剂、液体、洗剂、霜剂、糊剂、软膏、粉剂、或泡沫，或其他药物上可接受的制剂。此外，肽可以使用更少成分的制剂，如去离子水/蒸馏水、PBS或者标准医学盐溶液递送。一般的说，药学上可接受的载体包括任何适用于人类皮肤上的载体。这些药学上可接受的载体包括乙醇、二甲基亚砜、甘油、二氧化硅、氧化铝、淀粉、和等同载体和稀释剂。制剂可任选具有妆品成分，和/或含有其他药剂如维甲酸或者能够作为发明的肽治疗作用辅佐剂的其它肽。抗生素同样可以添加到制剂中以避免感染，以此允许最大化的愈合进程发生。组合物中的肽浓度可以是约0.1μg/mL到约50μg/mL，或者0.1μg/mL到约20μg/mL；但是，使用的终浓度可以根据伤口/组织环境的性质、本发明肽的生物活性和为获得增强的组合物吸收所施用的任何辅佐剂或技术而在这些范围之外变化。
本发明的组合物可以含有一种或多种执行皮肤护理活性的额外药剂。
在本发明的一个优选的实施方式中，其中组合物欲与人类角质组织相接触，本发明的肽以外的任何额外组分都应该适合应用于角质组织；也就是说，当掺入到组合物后，这些其他组分表现出的不适当毒性、不兼容性、不稳定性、过敏性反应等在合理的医学判断范围之内。CTFA Cosmetic Ingredient Handbook，第二版(1992)介绍了常在护肤品工业中使用的各种各样的非限制性化妆品和药物成分，它们在本发明的组合物中适合使用。这些成分类别的例子包括：磨料；吸附剂；美容组分，如香料、色素、染色剂/着色剂、精油、皮肤感知物(sensate)、收敛剂等(如丁香油、薄荷脑、樟脑、桉树油、丁香酚、薄荷乳酸、金缕梅馏分)；抗粉刺剂；防结块剂；消泡剂；抗菌剂(例如，氨基甲酸碘丙基酯)；抗氧化剂；粘结剂；生物添加剂；缓冲剂；膨化剂；螯合剂；化学添加剂；美容杀菌剂；变性剂；药物收敛剂；外部止痛剂；膜生成剂或材料；遮光剂；pH值调节剂；推进剂；还原剂；螯合剂；皮肤漂白和增亮试剂(如氢醌、曲酸、抗坏血酸、抗坏血酸磷酸镁、抗坏血酸葡萄糖胺)；皮肤调理剂(如保湿剂)；皮肤光滑和/或愈合剂(如泛酰醇及其衍生物、芦荟、泛酸及其衍生物、尿囊素、没药醇(bisabolol)、甘草酸二钾)；皮肤治疗剂；增稠剂；和维生素以及其衍生物。
本发明的肽和相关组分的给药可用于人类和动物，包括所有的哺乳动物。施用还可以结合典型的和/或实验型的材料进行，如组织移植物、组织培养产品、氧气和敷料剂。一般而言，组合物可以局部、经口、经皮、全身或者其它本领域技术人员已知的用于递送本发明的肽到损伤位点的任何其他方法给药。组合物还可以通过体外或体内方式施用给例如细胞或生长在培养基中病人移植物。
由于它们很小的尺寸，预期肽能够自身获得一些穿过皮肤的渗透水平；但是，可以使用某些技术来扩大这种移动。例如，可以将亲脂性(非极性)基团添加到肽，或者使肽可以在亲脂性赋形剂中递送到皮肤，以便增强肽可到达角质层的能力以允许转位到更低的上皮层。在这种方式中这些亲脂性修饰可以认为是前体药物。可在赋形剂种使用渗透促进剂，如已知的溶剂和表面活性剂，以便使肽更好的吸收。预计将有助于加强肽到达靶组织/损伤的特定技术，包括离子电渗法(iontophoresis)、电泳法(electrophoresis)、和超声波。离子电渗设备由浸入电解质溶液中并放置到皮肤上的两个电极构成。当电流穿过电极施加时，就穿过角质层产生了电场，该电场驱动肽的递送。电穿孔(electroporation)包括高压电脉冲，以增加通过脂质双层的渗透性。这在使用电流的持续时间和强度上不同于离子电渗法(离子电渗法使用相对较恒定的低压电场)。电穿孔的高电压电脉冲被认为诱导了亲水孔在脂质层膜中的可逆形成以提供高水平的渗透增强。超声对皮肤施加频率大于16kHz的声波，这使得声波所要穿过的组织的压缩和扩大。所产生的压力变化会引起可能增强肽的渗透性的一些过程(例如，空化效应、混合、温度上升)。
所有上述肽制剂和使用都是本领域公知的。制备和使用本发明的肽的其他方式也有描述，例如，在美国专利No.6,492,326和6,974,799中，这两者的全文都以引用方式并入。
下面的实施例用于显示本发明的某些优选的实施方式。
实施例
实施例1：鉴定刺激细胞增殖的肽
由于之前已经证明了HB-107(SEQ ID NO：1)肽能够在体内刺激伤口愈合(Lee等人，2004)，因此推断HB-107序列中可能存在可以类似地或者更好地刺激伤口愈合以及相关过程的更小的肽。为了证明这一问题，使用标准固相肽化学生产了HB-107的一系列重叠的肽片段。然后将这些肽在浓度为0.22、2.15、21.5和46.4μg/mL下用于细胞增殖活性分析。一些肽在低浓度下引起上皮角化细胞增殖的显著增加(表2)，包括肽HB-1061(SEQ ID NO：3)和HB-1072(SEQ ID NO：6)，它们各自分别只含有7个和6个氨基酸。一些其它的肽表现出的刺激活性等于或高于HB-107的水平(表2)。总的来说，通过一些发明的肽诱导的细胞增殖超过了HB-107母肽诱导的水平。重要的是，这些片段中的几个肽显著地短于HB-107。
表2：使用本发明的肽诱导PAM 212鼠上皮角化细胞增殖。值代表的是相对于对照细胞(只使用PBS处理的细胞)的细胞增殖百分比。加黑的值表示增殖水平超过了对照细胞增殖的150％。
 SEQ ID NO：  肽  0.22μg/mL  2.15μg/mL  21.5μg/mL  46.4μg/mL 1  HB-107  57  75  121  126 12  HB-802  121  130  135  133 11  HB-801  101  100  113  131 10  HB-912  100  84  125  137 7  HB-1074  97  93  120  149 5  HB-1071  106  127  188  155 13  HB-1056  48  39  64  97 9  HB-1057  121  118  171  167
  SEQ ID NO：  肽  0.22μg/mL  2.15μg/mL  21.5μg/mL  46.4μg/mL  6  HB-1072  98  107  185  237  2  HB-1059  95  128  162  186  14  HB-1060  57  52  90  83  3  HB-1061  122  156  163  241
细胞增殖分析使用以下实验操作步骤进行：
使用小鼠角化细胞系进行细胞增殖分析
目的：测定当检测物品施加到培养中的上皮角化细胞时的抗增殖或者潜在细胞毒性。
检测系统：小鼠角化细胞系PAM 212或者原代正常人上皮角化细胞(NHEK，得自Clonetics)是优选的模型，尽管也可以使用其它细胞。
试剂：
1.细胞生长培养基：含10％新生牛血清、青霉素(100单位/mL)，链霉素(0.1mg/mL)，和庆大霉素(50μg/mL)的Dulbecco氏改良的Eagles培养基(DMEM-10)，或角化细胞生长培养基(KGM，得自Clonetics)用于人细胞。
2.溶媒培养基：含有1.0％新生牛血清、青霉素(100单位/mL)和链霉素(0.1mg/mL)的Dulbecco氏改良的Eagles培养基或角化细胞基础培养基(KBM，得自Clonetics)用于人细胞。
3.中性红储备溶液：中性红粉末以3mg/m的浓度L加入DulμLbecco氏磷酸盐缓冲液(DPBS)。所得溶液然后无菌过滤。
4.中性红培养基：中性红储备溶液以终浓度为50μg/mL加入DMED或者KBM培养基。
5.MTT培养基：MTT(溴化-3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑)粉末以1mg/mL加入DMEM和KBM，然后过滤或者离心以去除沉淀。MTT溶液在24小时之内使用。
6.固定溶液由1％甲醛和1％氯化钙水溶液组成。
7.洗涤溶液由PBS组成。
8.裂解溶液：1.0％冰醋酸、50％乙醇水溶液用于中性红或者酸化异丙醇用于MTT处理的细胞。
细胞接种
每天使用显微镜观察角化细胞。当培养物变为50％-75％汇合时，吸出平板中的培养基并加入0.25％的胰酶/EDTA(0.05％的胰酶用于人细胞)。当细胞变圆，通过加入等体积的添加了约10％牛血清的DMEM或KBM或者使用胰酶中和溶液(TNS，得自Clonetics)进行中和。然后离心细胞，使用1ml的DMEM-1或者KBM重悬沉淀。使用血球计数器来计数悬浮细胞，并且使用DMEM-1或者KBM将每毫升的总细胞数调整到1.5-2.5×10⁴细胞/mL。细胞然后通过每孔添加200μL的细胞悬液以3.0-5.0×10³细胞/孔接种到96孔板。通常，使用中间的60个孔，外围的孔中填满DMEM或PBS以最小化挥发的影响。
样品制备
测试物的储备溶液使用DMEM或KBM制备，所有其它稀释液都因此使用该溶液制备。通常情况下，每个稀释液在加入细胞培养物之前都要使用0.2-μM滤膜过滤。制备1.0％(w/v或者v/v)的溶液或者悬浮液，并且在培养基中制备10-倍或者3-倍系列稀释溶液。
给药：
细胞在接种18-24小时以后检测，以保证细胞附着并分裂，然后吸取100μL的培养基，每孔留下100μL。然后100μL的2倍浓度的各个测试物稀释液加入重复的孔中。对于阴性对照，向对照孔中加入100μL的溶媒培养基(DMEM-1或者KBM)。然后微量板在37度和5.0％CO₂下孵育48-72小时，并且允许细胞在不受干扰的情况下增殖。紧接在48-72小时的接触之后，吸去所有的培养基，使用下列方法中的一个对增殖进行评估。
选项A：中性红吸收法。在接触并吸去培养基之后，立刻向每孔中加入200μL的中性红培养基。将微量板再放回培养箱三个小时。紧接在这一染料吸收过程之后，微量板从培养箱中取出并轻轻反转，将中性红培养基倾倒到收集盘中。然后使用固定溶液固定细胞约一分钟左右。倒掉固定溶液，使用洗涤溶液轻轻的洗微量板三次。倒掉洗涤溶液，并加入200μL的裂解溶液。在至少15分钟以后，再反复吹吸各孔内所含之物以使各孔内的颜色平均分布。按照下面详述的方法在分光光度计上读取等分试样。
选项B：MTT转化分析。在接触并吸去培养基之后，立刻向每孔中加入200μL的MTT分析培养基(MIT应只有当测试物不能直接还原MIT时才使用，如范围-发现实验或者MIT适用性测试所测定)。将微量板再放回培养箱三个小时。紧接在这一吸收过程之后，微量板从培养箱中取出并轻轻反转，将MTT培养基倾倒到收集盘中。然后使用洗涤溶液轻轻的洗微量板三次。倒掉洗涤溶液，并加入200μL的裂解溶液。在至少60分钟以后，再反复吹吸各孔内所含之物以使每孔内的颜色平均分布。按照下面详述的方法在分光光度计上读取吸收值。
选项C：基于流式细胞仪的分析。在接触之后，将培养基调节成具有10μM的溴脱氧尿苷(BrdU)并在37度下孵育45分钟。在这个孵育过程中，胸腺嘧啶类似物BrdU，整合到正在增殖细胞的DNA中。然后使用胰酶消化收集细胞。离心，然后在0.5mL的PBS中重悬细胞沉淀并通过加入70％的乙醇固定细胞。然后洗涤细胞并用DNA-特异的(红色)荧光染料碘化丙啶进行染色。正在增殖中的细胞被BrdU-特异的荧光(绿色)抗体所染色。使用流式细胞仪测定细胞周期分析以及BrdU染色阳性的正在增殖的细胞的量。(注意：对于流式细胞仪研究，细胞培养在24孔板或者6孔板种)。
数据分析
染料吸收研究：对于基于染料的终点，孔的光密度使用Titertek MultiskanMCC/340在540nm波长下，对于中性红减去620nm参考波长的光吸收，或者对于MTT减去670nm至680nm参考波长的光吸收进行读数。输出的光吸收值通过平板读出器产生。计算每个处理组的平均光吸收和标准差。结果表述为对照组光吸收的百分比。EC50值计算：绘制对照组光吸收的百分比对于每个测试样本的浓度的数据曲线。E50值从通过Excel 5.0图形绘制的回归线推断出。另外，EC50值通过Excel 5.0图形或使用Excel 5.0宏提供的回归线方程式计算得出。
流式细胞仪研究：流式细胞分析，测定阳性BrdU-标记的百分比并计算增殖指数(即，在收集时间点活跃增殖细胞的百分比)。任选地，还可以测定其它参数，如细胞存活能力百分比和样本中凋亡细胞的百分。
实施例2：鉴定刺激细胞迁移的肽。
细胞增殖本身不足够帮助伤口愈合。受伤之后，细胞围绕伤口增殖；这些新形成的细胞迁移以闭合伤口(或者老年的慢性损伤，功能失调性组织)也是同等重要的。为了解决这一问题，使用一个基于简单组织培养刮痕测试的角化细胞迁移实验检测HB-107和它的肽片段。这一分析显示肽如HB-1072(SEQ IDNO：6)和HB-1061(SEQ ID NO：3)能够以与HB-107母肽相似的方式增加细胞迁移(表3)。感兴趣的是注意到HB-1072和HB-1061肽作为HB-107肽上的部分重叠，而类似物HB-1062(SEQ ID NO：4)没有在细胞上表现出迁移活性。用于此分析的操作步骤是标准操作步骤并且Shanley等人已经描述(2004，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.45：1088-1094)，该文章的全文以引用方式并入。
表3：使用本发明的肽诱导人上皮角化细胞迁移，并使用刮痕测试进行测量。值代表在接触肽6或10小时后，与开始时刮痕与细胞单层的宽度相比的刮痕闭合百分比。
 SEQ ID NO：  肽  6hr  10hr NA  PBS对照  11  33 1  HB-107  52  78 6  HB-1072  55  77 3  HB-1061  44  67 4  HB-1062  0  24
实施例3：肽在休止期细胞中刺激抗炎症反应活性的鉴定。
除了增加伤口的愈合速度以外，肽HB-107还显示出能够降低与伤口相关的炎症反应水平。为了鉴定小肽片段可以显示这种活性，对HB-107的片段进行降低关键的炎症反应细胞因子IL6的活性的筛选。发现肽片段HB-802(SEQID NO：12)和HB-1076(SEQ ID NO：8)与HB-107母肽相同程度地降低了IL6的表达水平(表4)。用于此分析的操作步骤是标准操作步骤并且Murakami等人已经描述(2004，J.Immunol.172：3070-3037)，该文章的全文以引用方式并入。
表4：接触本发明的肽的上皮细胞中IL6表达的抑制。在加入含有20ug/mL肽的培养基24和48小时以后检测IL6的量，表示为pg/mL(栏3-5)。IL6表达的百分比变化在栏8中给出。


实施例4：肽在细胞中抑制紫外线B(UVB)诱导的炎症反应活性的鉴定。
鉴于某些小肽能够在休止期细胞中促进抗炎症反应活性(见例3)，感兴趣的是想了解小肽在接触UVB辐射的细胞中是否能够促进这种活性。UVB辐射损伤皮肤并促进其老化。因为炎症反应在损伤组织中是该组织老化的促进因子，因此减少来自紫外线诱导损伤的上皮炎症反应会减少其老化效应。
进行分析来检测HB-107的肽片段是否可以在接触紫外线的细胞中诱导抗炎症反应活性。将人皮肤上皮细胞(ATCC CRL-2592)接种到6孔板上，并在调整到含有1.5g/L碳酸氢钠和4.5g/L葡萄糖(完全培养基)并补充有10％胎牛血清的含有4mM L-谷氨酰胺的DMEM中生长到95％汇合以上。细胞在UVB处理之前血清饥饿5小时。UVB使用UVLMS灯(4w型，3UV装配，Upland，CA)，发射波长设置在302nm。UV灯放置在组织培养板(6孔板)上方12cm并且两个孔同时处理以得到同质的UVB照射。细胞在PBS中接触UVB照射(450μW/cm²，使用放射计测量)以避免紫外光诱导毒性光化学物质的产生。检测作为响应UVB的细胞炎症反应的指示物的IL 6的表达。如图2中所示，在皮肤上皮细胞中的IL 6表达被UVB以剂量依赖的方式诱导，因此这表明紫外光在皮肤上皮细胞中刺激细胞炎症反应过程。
对单独的肽进行筛选以确定其对在皮肤上皮细胞中UVB-诱导的IL6表达的影响。细胞在PBS中接触UVB(450μW/cm²)35秒，然后PBS被含有或者不含40μg/ml肽的无血清完全培养基替代并在37度/5％二氧化碳下培养20小时。然后收集上清培养基并以10,000rpm的离心以去除碎片，然后进行人IL6(CellSciences，MA)的ELISA检测。发现HB-107肽中特定的序列能够在遭受有力的炎症反应刺激的细胞中显著降低IL6的表达(表5，结果以图形方式显示在图3中)。
表5：短肽对于皮肤上皮细胞中UVB-诱导的IL6表达的影响。细胞接触UVB然后与肽一起孵育。对照细胞不接受UVB或者肽处理。IL6表达通过使用光谱仪的ELISA检测。
  SEQ ID  NO  UV/肽处理  IL6(OD 450)  SD  对照  0.0730  0.001414  仅UV  0.7305  0.062933  1  HB-107  0.7315  0.043134  12  HB-802  0.6500  0.035423  15  HB-1410  0.5105  0.013435  11  HB-801  0.8275  0.204354
此研究结果表明如HB-1410(PKEK，SEQ ID NO：15)等肽能够显著降低由皮肤上皮细胞响应UV辐射产生的IL6水平。这一活性特别应用于阳光照射后的皮肤护理，并且还可以广泛地应用于在由于伤口或老化导致的多种皮肤条件中减少相关的炎症反应。有趣的是应注意肽序列上甚至很小的变化都可以显著改变肽对皮肤上皮细胞中IL6表达的抑制活性[例如，HB-801(PKEKV)和HB-802(MPKEK)的活性与HB-1410的抑制活性之间的比较]。有趣的是，HB-802显示了在休止期细胞中降低IL6的能力(参见实施例3，表4)。
本文所公开和要求保护的所有组合物或方法能够在不使用本发明所述的实验步骤的情况下制备和执行。尽管本发明的组合物和方法以优选实施方式进行表述，但是对那些本领域技术人员来说在不违背本发明的概念、精神和范围的条件下下，可对本文所描述的组合物和/或方法的步骤或者方法中步骤的顺序进行修改。更确切的说，某些化学上或生理上相关的药剂在达成相同或类似的结果时可以替代本文所述的药剂，这是显而易见的。所有对本领域的那些技术人员显而易见的这些替代或者修改都应视为在本发明范围之内。
本申请所引用的所有专利和公开物的全文都以引用方式并入。
参考文献
Braff MH，Gallo RL(2006).Antimicrobial peptides：an essentialcomponent of the skin defensive barrier.Curr.Top.Microbiol.Immunol.306：91-110.
Enoch S，Price P(2004).Cellular，molecular and biochemical differences inthe pathophysiology of healing between acute wounds，chronic wounds and woundsin the aged.World Wide Wounds.Online：www.worldwidewounds.com.
Fisher GJ，Kang S，Varani J，Bata-Csorgo Z，Wan Y，Datta S，Voorhees JJ(2002).Mechanisms of photoaging and chronological skin aging.Arch.Dermatol.138：1462-1470.
Kyte J，Doolittle RF(1982).A simple method for displaying the hydropathiccharacter of a protein.J.Mol.Biol.157：105-132.
Lee PH，Rudisill JA，Lin KH，Zhang L，Harris SM，Falla TJ，Gallo RL(2004).HB-107，a nonbacteriostatic fragment of the antimicrobial peptide cecropin B，accelerates murine wound repair.Wound Repair Regen.12：351-358.
Liechty KW，Adzick NS，Crombleholme TM(2000).Diminished interleukin6(IL-6)production during scarless human fetal wound repair.Cytokine.12：671-676.
Martin P，Leibovich SJ(2005).Inflammatory cells during wound repair：thegood，the bad and the ugly.Trends Cell Biol.15：599-607.
Mustoe TA，Cutler NR，Allman RM，Goode PS，Deuel TF，Prause JA，Bear M，Serdar CM，Pierce GF(1994).A phase II study to evaluate recombinantplatelet-derived growth factor-BB in the treatment of stage 3 and 4 pressure ulcers.Arch.Surg.129：213-219.
Oyama N，Sekimata M，Nihei Y，Iwatsuki K，Homma Y，Kaneko F(1998).Different growth properties in response to epidermal growth factor and interleukin-6of primary keratinocytes derived from normal and psoriatic lesional skin.J.Dermatol.Sci.16：120-128.
Pelicci PG(2004).Do tumor-suppressive mechanisms contribute to organismaging by inducing stem cell senescence？J.Clin.Invest.113：4-7.
Presland RB，Dale BA(2000).Epithelial structural proteins of the skin andoral cavity：function in health and disease.Crit.Rev.Oral Biol.Med.11：383-408.
Sato S，Hasegawa M，Takehara K(2001).Serum levels of interleukin-6 andinterleukin-10 correlate with total skin thickness score in patients with systemicsclerosis.J.Dermatol.Sci.27：140-146.
Shaykhiev R，Beisswenger C，Kandler K，Senske J，Puchner A，Damm T，BehrJ，Bals R(2005).Human endogenous antibiotic LL-37 stimulates airway epithelialcell proliferation and wound closure.Am J.Physiol.Lung Cell Mol.Physiol.289：L842-L848.
Steed DL(1995).Clinical evaluation of recombinant human platelet-derivedgrowth factor for the treatment of lower extremity diabetic ulcers.Diabetic UlcerStudy Group.J.Vasc.Surg.21：71-78.
Sugawara T，Gallucci RM，Simeonova PP，Luster MI(2001).Regulation androle of interleukin 6 in wounded human epithelial keratinocytes.Cytokine.15：328-336.
Sweitzer SM，Fann SA，Borg TK，Baynes JW，Yost MJ(2006).What is thefuture of diabetic wound care？Diabetes Educ.32：197-210.
Zhang L，Falla TJ(2006).Antimicrobial peptides：therapeutic potential.Expert Opin.Pharmacother.7：653-663.
序列表
<110>S.M.哈里斯(Harris，Scott M.)
     L.张(Zhang，Lijuan)
     T.J.法拉(Falla，Timothy J.)
<120>用于细胞学和免疫学调节的短的生物活性肽
<130>11181.0035.00PC00
<150>60/878,849
<151>2007-01-05
<160>15
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>19
<212>PRT
<213>刻克罗普斯蚕蛾(Hyalophora cecropia)
<400>1
Met Pro Lys Glu Lys Val Phe Leu Lys Ile Glu Lys Met Gly Arg Asn
1             5               10               15
Ile Arg Asn
<210>2
<211>9
<212>PRT
<213>刻克罗普斯蚕蛾
<400>2
Glu Lys Met Gly Arg Asn Ile Arg Asn
1             5
<210>3
<211>7
<212>PRT
<213>刻克罗普斯蚕蛾
<400>3
Met Gly Arg Asn Ile Arg Asn
1             5
<210>4
<211>6
<212>PRT
<213>刻克罗普斯蚕蛾
<400>4
Gly Arg Asn Ile Arg Asn
1             5
<210>5
<211>9
<212>PRT
<213>刻克罗普斯蚕蛾
<400>5
Val Phe Leu Lys Ile Glu Lys Met Gly
1            5
<210>6
<211>6
<212>PRT
<213>刻克罗普斯蚕蛾
<400>6
Lys Ile Glu Lys Met Gly
1            5
<210>7
<211>7
<212>PRT
<213>刻克罗普斯蚕蛾
<400>7
Val Phe Leu Lys Ile Glu Lys
1            5
<210>8
<211>9
<212>PRT
<213>刻克罗普斯蚕蛾
<400>8
Lys Glu Lys Val Phe Leu Lys Ile Glu
1            5
<210>9
<211>11
<212>PRT
<213>刻克罗普斯蚕蛾
<400>9
Lys Ile Glu Lys Met Gly Arg Asn Ile Arg Asn
1             5                10
<210>10
<211>14
<212>PRT
<213>刻克罗普斯蚕蛾
<400>10
Met Pro Lys Glu Lys Val Phe Leu Lys Ile Glu Lys Met Gly
1            5                10
<210>11
<211>5
<212>PRT
<213>刻克罗普斯蚕蛾
<400>11
Pro Lys Glu Lys Val
1             5
<210>12
<211>5
<212>PRT
<213>刻克罗普斯蚕蛾
<400>12
Met Pro Lys Glu Lys
1             5
<210>13
<211>12
<212>PRT
<213>刻克罗普斯蚕蛾
<400>13
Leu Lys Ile Glu Lys Met Gly Arg Asn Ile Arg Asn
1            5                10
<210>14
<211>8
<212>PRT
<213>刻克罗普斯蚕蛾
<400>14
Lys Met Gly Arg Asn Ile Arg Asn
1             5
<210>15
<211>4
<212>PRT
<213>刻克罗普斯蚕蛾
<400>15
Pro Lys Glu Lys
1