苯并大环内酯类化合物3R去O甲基毛狄泼老素、其衍生物及其制备方法和用途.pdf

本发明涉及医药技术领域，涉及一类从中国红树林植物海芒果中提取、分离获得的化合物(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素[(3R)-des-O-methyllasiodiplodin]、其衍生物及其制备方法和用途。本发明的(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素及其衍生物结构式如下所示，当R1和R2同时为氢时，即为(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素。该化合物及其衍生物经体外检测表明具有明显的胰脂肪酶抑制活性，可望在制备预防或治疗肥胖症、糖尿病、高脂血症和脂肪肝等代谢失调性疾病药物中应用。本发明还可为研制新的预防

1、  一种由如下通式表示的苯并大环内酯类化合物(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素及其衍生物：

其中，R1为氢、C1～C4的直链或支链烷基或C2～C4的直链或支链烷酰基；R2为氢、C1～C4的直链或支链烷基或C2～C4的直链或支链烷酰基。

2、  根据权利要求1所述的苯并大环内酯类化合物(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素及其衍生物，其特征在于，R1和R2同时为氢、甲基或乙酰基。

3、  一种如权利要求1所述的苯并大环内酯类化合物(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素及其衍生物的制备方法，其包括以下步骤：
a)苯并大环内酯类化合物(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素的提取制备：将海芒果用醇渗漉提取，减压浓缩提取液得粗浸膏；将该浸膏溶于NaCl溶液，混悬均匀后用石油醚萃取，浓缩石油醚萃取液得到石油醚浸膏；石油醚浸膏经反复硅胶柱层析，后经凝胶Sephadex LH-20纯化得到苯并大环内酯类化合物(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素；
b)苯并大环内酯类化合物(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素烷基化物的制备：向上述步骤a)中制备的(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素中加入溶有碘甲烷的NaOH溶液中，在相转移催化剂作用下，在水/有机溶剂两相体系中加热回流以制得(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素的甲基化物；或者向上述步骤a)中制备的(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素中加入碘甲烷油状液体和无水碳酸钾固体混合物，在无水丙酮中加热回流以制得(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素的部分甲基化物；以及
c)苯并大环内酯类化合物(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素烷酰基化物的制备：将上述步骤a)中制备的(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素在吡啶溶液中与烷酰化试剂反应，获得其烷酰基化物。

4、  根据权利要求3所述的苯并大环内酯类(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素及其衍生物的制备方法，其特征在于用甲醇或乙醇渗漉提取。

5、  根据权利要求3所述的苯并大环内酯类(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素及其衍生物的制备方法，其特征在于所述NaCl溶液的当量为0.7～1.5N。

6、  根据权利要求3所述的苯并大环内酯类(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素及其衍生物的制备方法，其特征在于所述石油醚浸膏经100-200目硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱；其中，石油醚/乙酸乙酯体积比60∶40洗脱部分，经200-300目硅胶柱层析，以石油醚/丙酮梯度洗脱；其中，石油醚/丙酮体积比80∶20洗脱部分，经Sephadex LH-20凝胶柱层析，以氯仿/甲醇体积比1∶1洗脱并纯化得到(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素。

7、  根据权利要求1或2所述的苯并大环内酯类化合物(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素及其衍生物在制备预防或治疗肥胖症、糖尿病、高脂血症和脂肪肝等代谢失调性疾病药物中的应用。

8、  一种胰脂肪酶抑制剂，该胰脂肪酶抑制剂为权利要求1所述的苯并大环内酯类化合物(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素或其衍生物。

苯并大环内酯类化合物(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素、其衍生物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体是一类从中国红树植物海芒果(Cerbera manghas)中分离得到的苯并大环内酯类化合物(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素[(3R)-des-O-methyllasiodiplodin]、其衍生物及其制备方法和用途。该类化合物对胰脂肪酶具有明显的抑制活性，可作为一类研制新的预防或治疗肥胖症及相关代谢性疾病药物的先导化合物，也可作为治疗临床常见多发的肥胖症及相关代谢性疾病药物中应用。
背景技术
在近20年中，全世界尤其是发达国家人群中肥胖的发病率日益增多。肥胖发生的原因是多方面的，如遗传因素、环境因素、饮食习惯等，其中高脂饮食是导致肥胖的重要原因。由于经济的发展和生活水平的提高，运动不足和摄食能量相对过剩逐渐成为现代人生活方式的主要问题，代步工具的发达等导致现代人的能量消耗减少，而人类背离传统饮食模式的速度越来越快，新的饮食模式和西方化的食物特点是具有高饱和脂肪含量和较低纤维含量，以致食品能量密度过大，能量摄入过多。这导致了众多现代人机体能量的摄入超过了能量消耗。过剩的能量一部分作为脂肪贮存在脂肪组织中，一段时间后它的积累导致肥胖以及肥胖相关疾病，比如糖尿病、癌症、心脏病、高脂血症和脂肪肝等的发生。
如何合理有效地解决肥胖给人类健康带来的影响是医药界面临的重要研究课题。治疗肥胖症的药理方法集中于开发增加能量消耗的药物或减少能量摄取的药物。而减少能量摄取的主要方法就是减小身体消化和吸收食品，尤其是脂肪。胰脂肪酶是肠道中脂肪消化吸收所必需的酶。食物中的脂肪在胰脂肪酶作用下被水解为单酰甘油和游离脂肪酸后，在肠道被吸收，然后在体内重新合成脂肪，造成脂肪堆积，最终可导致肥胖以及相伴的高脂血症、糖尿病等代谢性疾病的发生。应用脂肪酶抑制剂可有效抑制肠道中脂肪酶对脂肪的分解催化作用，达到减少脂肪吸收、控制和治疗肥胖的目的。因而开发和应用有效的脂肪酶抑制剂受到人们的关注。目前用于治疗肥胖的脂肪酶抑制剂主要来源于植物提取物和化学合成。从植物中提取抑制脂肪酶活性成分的报道较多，但效果并不充分，即使某植物的提取物有效果，可是其中的活性成分以及其量并不确定。目前市场畅销的脂肪酶抑制剂是赛尼可，赛尼可具有活性强，稳定性好等特点，但是其存在着包括难以控制的肠道症状、油便和呕吐腹涨等缺点。因此寻找新的胰脂肪酶抑制剂对肥胖、糖尿病等代谢性疾病具有重要的意义。
在开发利用我国的海洋生物资源，从中寻找具有生物活性及药用前景的海洋天然产物的过程中，我们发现，红树林植物海芒果的石油醚粗提物在体外筛选实验中对胰脂肪酶具有明显的抑制活性。进一步的生物活性跟踪研究，导致了苯并大环内酯类化合物(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素的发现。体外胰脂肪酶抑制活性筛选实验表明，(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素及其衍生物对胰脂肪酶具有显著的抑制作用。经文献检索，未见该类化合物在此方面的生物活性研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从我国红树植物海芒果中提取分离得到的苯并大环内酯类化合物(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素及其衍生物。
本发明的另一目的是提供上述苯并大环内酯类化合物(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素及其衍生物的制备方法。
本发明的还一目的是提供上述苯并大环内酯类化合物(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素及其衍生物在预防或治疗肥胖症及相关代谢性疾病药物中应用或可作为预防或治疗肥胖症及相关代谢性疾病药物的先导化合物。
本发明的再一目的是提供一种胰脂肪酶抑制剂，该胰脂肪酶抑制剂为本发明的苯并大环内酯类化合物(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素或其衍生物。
本发明的苯并大环内酯类化合物(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素及其衍生物具有如下通式的化学结构式：

其中，R1为氢、C1～C4的烷基或C2～C4的烷酰基；R2为氢、C1～C4的烷基或C2～C4的烷酰基。
当R1和R2同时为氢时，即为(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素。
所述C1～C4的直链或支链的烷基是指含有1～4个碳原子的直链或支链的烷基，例如：甲基、乙基、丙基或丁基等；优选甲基。
所述烷酰基是指含有2～4个碳原子的直链或支链的烷酰基，例如：乙酰基、丙酰基或丁酰基等；优选乙酰基。
本发明提供了(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素及其衍生物的提取制备方法，步骤如下：
将我国红树植物海芒果用醇提取，减压浓缩提取液得粗浸膏。将该浸膏溶于0.7～1.5N NaCl溶液中，混悬均匀后用石油醚萃取，浓缩石油醚萃取液得到石油醚浸膏。石油醚浸膏经100-200目硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱；其中，石油醚/乙酸乙酯体积比60∶40洗脱部分经200-300目硅胶柱层析，以石油醚/丙酮梯度洗脱；其中，石油醚/丙酮体积比80∶20洗脱部分经Sephadex LH-20凝胶柱层析，以氯仿/甲醇体积比1∶1洗脱并纯化得到(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素。
进一步的，该化合物通过酯化反应、烷基化反应或成醚反应，得到其相应的衍生物。
其中，所述的用于提取的醇为甲醇或乙醇。
本发明对苯并大环内酯类化合物(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素及其衍生物进行了胰脂肪酶抑制活性测试，表明这些化合物具有明显的胰脂肪酶抑制作用。可用于制备预防或治疗肥胖症及相关代谢性疾病的药物。
具体实施方式
下面结合具体实施实例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。
1H、13C NMR用Varian Inova 400型核磁共振仪测定；MS(ESIMS及HRESIMS)用Q-TOF Micro LC-MS-MS型质谱仪测定；所使用的硅胶均为青岛海洋化工厂生产；各种溶剂均由国药集团试剂有限公司生产，均为分析纯。
如无特殊说明，以下实施例中涉及到的液/液之间比值均为体积百分比。
实施例1：
苯并大环内酯类化合物(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素的制备
(1)提取：中国红树植物海芒果干重3.1kg，用甲醇10L渗漉提取4次，提取液合并后减压浓缩，所得浸膏混悬于1000ml1N NaCl溶液，以石油醚1000ml反复萃取混悬液3次，所得萃取液合并后减压浓缩得到石油醚浸膏11g。
(2)分离：石油醚浸膏11g经100-200目硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯100∶0→95∶5→90∶10→70∶30→50∶50→30∶70→0∶100梯度洗脱，每个梯度用量1000ml；其中，石油醚/乙酸乙酯体积比60∶40洗脱部分1.2g经石油醚/丙酮90∶10→80∶20→70∶30梯度洗脱，每个梯度用量200ml；其中，石油醚/丙酮体积比80∶20洗脱部分经Sephadex LH-20凝胶柱层析，以氯仿/甲醇体积比1∶1洗脱并纯化，得到(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素20mg。
(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素理化性质和波谱数据如下：C₁₆H₂₂O₄；[α]₂₃^D+8.0(c，0.12，CH₃OH)；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)6.24(d，J＝2.6Hz，H-5′)，6.21(d，J＝2.6Hz，H-3′)，5.18(m，H-3)，3.26，2.51(m，H-10)，1.40～2.49(H-4～9)，1.37(d，J＝7.0Hz，3-Me)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ：20.0(3-Me)，21.1(C-4)，24.0，24.6，27.2，30.7，31.0，33.5(C-10)，75.2(C-3)，101.3(C-13)，105.3(C-1a)，110.9(C-11)，149.4(C-10a)，160.2(C-12)，165.2(C-14)，171.9(C-1)；ESI-MS m/z 279[M+H]⁺。
实施例2：
(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素的甲基化物(R₁和R₂均为甲基)的制备
称取实施例1中制备的(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素样品5.0mg于25mL圆底烧瓶中，加入溶有2.5倍当量碘甲烷的NaOH溶液2mL，并加入适量相转移催化剂四丁基溴化铵，在10mL水/二氯甲烷两相体系中加热回流4小时，即得(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素的甲基化物(R₁＝R₂＝CH₃)。
(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素甲基化物波谱数据如下：C₁₈H₂₈O₄；¹HNMR(300MHz，CDCl₃)6.24(d，J＝2.6Hz，H-5′)，6.21(d，J＝2.6Hz，H-3′)，5.18(m，H-3)，3.65，3.61(均为s，2×OCH₃)，3.26，2.51(m，H-10)，1.40～2.49(H-4～9)，1.37(d，J＝7.0Hz，3-Me)。
实施例3：
(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素的乙酰化物(R₁和R₂均为乙酰基)的制备
称取实施例1中制备的(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素样品5.0mg溶于4mL吡啶溶液中，加入2mL醋酐溶液，室温反应过夜，得(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素的乙酰化物(R₁＝R₂＝COCH₃)。
(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素乙酰化物波谱数据如下：C₂₀H₂₈O₆；¹HNMR(300MHz，CDCl₃)6.24(d，J＝2.6Hz，H-5′)，6.21(d，J＝2.6Hz，H-3′)，5.18(m，H-3)，3.26，2.51(m，H-10)，2.28，2.26(均为s，2×COCH₃)1.40～2.49(H-4～9)，1.37(d，J＝7.0Hz，3-Me)。
实施例4：
(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素的部分甲基化物(R₁为H，R₂为甲基)的制备
称取实施例1中制备的(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素样品5.0mg于25mL圆底烧瓶中，加入1.2倍当量的碘甲烷无色油状液体及适量无水碳酸钾固体混合物，在10mL无水丙酮中加热回流4小时，即得(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素的部分甲基化物(R₁＝H，R₂＝CH₃)。
(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素部分甲基化物波谱数据如下：C₁₈H₂₈O₄；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)6.24(d，J＝2.6Hz，H-5′)，6.21(d，J＝2.6Hz，H-3′)，5.18(m，H-3)，3.61(s，OCH₃)，3.26，2.51(m，H-10)，1.40～2.49(H-4～9)，1.37(d，J＝7.0Hz，3-Me)。
实验实施例1：
(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素的胰脂肪酶抑制活性测定
胰脂肪酶抑制活性的测定以赛尼可作为阳性对照，方法如下：
首先底物对硝基苯乙酸(p-Nitrophenyl acetate，sigma公司)用磷酸缓冲液(25mM，pH 6.8)配成1.35mM；猪胰脂肪酶(sigma公司)用磷酸缓冲液配成10mg/ml；(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素用磷酸缓冲液配制成不同浓度的溶液。然后在96孔板中依次加入50μl酶溶液、50μl底物溶液以及10μl不同浓度的受试样品，混匀。37℃下反应10分钟，在492nm下检测每孔的吸光度。
根据在492nm下的吸光度计算受试样品对胰脂肪酶的抑制率(％)，并将酶活性抑制率(％)达到50％时抑制剂的浓度测定为IC₅₀值。抑制率(％)可以根据下式进行：
抑制率(％)＝[(A-B)-(C-D)]/(A-B)×100
上式中，A表示反应后空白孔在492nm下的吸光度，
B表示反应前空白孔在492nm下的吸光度，
C表示反应后样品孔在492nm下的吸光度，
D表示反应前样品孔在492nm下的吸光度。
表1胰脂肪酶抑制作用

结果：见表1。
结论：从表1可以看出，(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素对胰脂肪酶具有强的抑制作用，其IC50仅为4.73μM。
抑制胰脂肪酶可以抑制脂肪在小肠的分解，从而抑制脂肪的吸收。由于脂肪摄入过多可能导致肥胖，以及与肥胖相关的糖尿病、高脂血症、脂肪肝等代谢失调性疾病。所以作为胰脂肪酶抑制剂，(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素可用于预防或治疗胖症、糖尿病、高脂血症和脂肪肝等疾病。