一种海星提取物及其在制备抗肿瘤药物中的应用 【技术领域】
本发明涉及有机化合物技术领域，具体涉及来源于海洋生物的有机化合物，尤其涉及一种海星提取物及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
海星(starfish)始载于《中国药用动物志》，为棘皮动物门(Echinodermata)海星纲(Asteroidea)动物。其种类繁多，资源十分丰富，有5个目，近1500多种，我国约100多种，在潮间带至600m深水内均有分布。其外形有三腕、四腕、十余腕、多至五十腕。海星为海生底栖动物，生性凶残，专食蛤蜊、牡蛎、扇贝、鲍鱼、海参等。其繁殖能力、再生能力均很强，对贝类养殖业有较大的危害。
海星味咸，性平。归心、胃、大肠经。有和胃止痛、制酸、止泻、镇静等功能。主治胃酸过多、胃溃疡、腹泻、癫痫等症(《中国药用动物志》)。现代药理学实验证明，它的棘刺、生殖腺等部位有良好的药用价值，如抗肿瘤、溶血、抗病毒、抑菌、抗炎、抗溃疡、降血压等。
海星的基本结构由棘刺，骨壳和内脏组成。它的主要成分有甾醇、糖苷、生物碱、少量的蒽醌、脂类、多糖、维生素类、蛋白质、多肽和氨基酸和萜类等。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种具有抗肿瘤活性的，来源于飞白枫海星科(Archasteridae)飞白枫海星Archaster typicus的提取物。
本发明的另一个目的在于提供上述海星提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：
一种海星提取物，该提取物是从飞白枫海星科(Archasteridae)飞白枫海星Archaster typicus中分离得到的，其制备步骤如下：
(1)将飞白枫海星(Archaster typicus)经有机溶剂提取后，收集提取液，将提取液经过滤、浓缩干燥得提取物；
(2)将步骤(1)所得提取物用水悬浮后，加入三氯甲烷分液萃取；
(3)收集步骤(3)的三氯甲烷层，浓缩蒸干后得到海星三氯甲烷层提取物；
(4)收集步骤(3)的水层，经大孔吸附树脂吸附，并用水将树脂洗脱至无色或浅黄色，然后用乙醇-水溶液洗脱，收集洗脱液，将洗脱液浓缩干燥后得到海星水层提取物。
上述海星提取物的制备方法，分别从三氯甲烷层和水层中获得海星提取物，将三氯甲烷层提取物和水层提取物进行活性分析，结果证实三氯甲烷层提取物和水层提取物均具有抗肿瘤活性。
上述步骤(1)中，采用有机溶剂对飞白枫海星进行提取处理，可将海星中的有效成分提取出来；所述有机溶剂可选择任何一类本领域技术人员常用的有机溶剂，如甲醇、乙醇、丙酮等，进行工业上操作时，优选甲醇或乙醇作为提取剂。
上述步骤(4)中，将水层萃取物进行大孔吸附树脂吸附，先用水将树脂洗脱至无色或浅黄色，然后用一系列浓度的乙醇-水溶液作为洗脱剂进行洗脱处理，浓度为5％、20％、70％和95％，所述浓度为乙醇占乙醇-水混合液的体积百分比浓度；将各个洗脱剂浓度下得到的洗脱液分别进行TLC(薄层层析)检测后，将浓度为70％和95％所得洗脱液合并，浓缩干燥后得到本发明的海星水层提取物。
上述TLC检测时，浓度为70％和95％的洗脱液中含有较多化学成分，浓度为5％和20％的洗脱主要是去除杂质的作用。
上述TLC检测时，采用式(I)所示化合物作为指标性成分，式(I)所示化合物为已知化合物，其英文名为27-nor-5α-cholestane-3β，4β，5，6α，7β，8，14，15α，24α-nonaol，中文名为：27-降-5α-胆甾烷-3β，4β，5，6α，7β，8，14，15α，24α-九醇，该化合物在海星粗提物中含量较高，容易检测，因此用于TLC检测时的指标性物质。
上述步骤(4)中，将洗脱液进行浓缩干燥采用低压浓缩干燥处理。
上述方法制备所得海星提取物，包括海星三氯甲烷层提取物和海星水层提取物，经实验证明海星三氯甲烷层提取物和海星水层提取物均具有中等细胞毒性，对Colo205(人肠癌细胞)、NCI-H446(人小细胞肺癌细胞)和MDA-MB-435(人乳腺癌细胞)三种肿瘤细胞株，均具有生长抑制作用，因此本发明的海星提取物可用于制备抗肿瘤药物，对癌症具有治疗效果，如肠癌、肺癌、乳腺癌等等。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明的海星提取物是从天然动物——飞白枫海星中制备而得，其成分安全可靠；
2.本发明的海星提取物其制备方法简单，所用试剂价格低廉；
3.本发明的海星提取物具有中等细胞毒性，对人肠癌细胞、人小细胞肺癌细胞以及人乳腺癌细胞等肿瘤细胞住具有生长抑制作用，可用于癌症治疗，尤其是肠癌、肺癌和乳腺癌的治疗。
【具体实施方式】
下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。
实施例1海星提取物的制备
本实施例以飞白枫海星Archastet typicus为原料，制备海星提取物，具体包括如下步骤：
(1)取飞白枫海星Archaster typicus干重5公斤，用5升乙醇室温提取4次，合并所得提取液，并将提取液低压浓缩至干，得到170克乙醇提取物；
(2)将上述乙醇提取物用5升水悬浮，然后加入5升三氯甲烷分液萃取，分别收集三氯甲烷层萃取物和水层萃取物；
(3)将步骤(2)所得三氯甲烷层萃取物浓缩后得到浸膏100克，该浸膏为海星三氯甲烷层提取物；
(4)将步骤(2)所得水层萃取物过大孔吸附树脂，然后用水洗脱树脂至无色或浅黄色，再用不同浓度梯度的乙醇-水溶液作为洗脱剂进行洗脱处理，浓度梯度为5％、20％、70％和95％(所述浓度为乙醇占乙醇-水混合液的体积百分比浓度)；将各个洗脱剂浓度下得到的洗脱液分别进行TLC(薄层层析)检测后，合并浓度为70％和95％时洗脱所得洗脱液，将洗脱液低压浓缩干燥得到固体50g，该固体为海星水层提取物。
将上述步骤(4)制备所得海星水层提取物过硅胶柱纯化，以氯仿-甲醇进行洗脱，洗脱液继而用中压液相色谱，以ODS反相硅胶为材料分离，最后然后用凝胶sphadex LH-20层析纯化，蒸干，得白色固体100mg。
将上述白色固体用1H-NMR谱分析，结果显示该物质有从δ4.79到δ3.36附近的多重峰指示甾核上存在6个连OH的CH。积分为3H的δ0.81为一个d峰；δ0.92为一个t峰；δ1.14和δ1.37均为s峰，从而提示该化合物一共有4个甲基，一个与CH2相连，一个与CH相连，另外2个均与季碳相连。以上信号在其13C-NMR谱中均能找到对应的碳信号，此外，δ78.8，80.0，84.1等3个季碳表明该化合物还有3个连OH的季碳。而δ40.7和849.8的两个季碳分别应该在甾醇的C-10和C-13位置(如表1所示)，由此鉴定该白色物质为27-nor-5α-cholestane-3β，4β，5，6α，7β，8，14，15α，24α-nonaol-6-sulphate，其化学结构式如式(I)所示，用HPLC测定其纯度为97.5％。
表1本发明海星水层提取物中式(I)所示物质的1H，13C核磁共振数据
上述式(I)所示化合物在TLC检测时，出现在浓度为70％和95％的洗脱液中，而且该式(I)所示化合物在本发明的海星水层提取物中含量较高，因此可作用指标性物质，用于TLC等检测中。
实施例2海星提取物的体外抗肿瘤实验
本实施例选择Colo205(人结肠癌细胞)、NCI-H446(人小细胞肺癌细胞)和MDA-MB-435(人乳腺癌细胞)这三种肿瘤细胞系，对实施例1制备所得海星提取物(海星三氯甲烷层提取物和海星水层提取物)进行MTT试验，从而检测实施例1制备所得海星提取物的抗肿瘤活性；Colo205(人结肠癌细胞)、NCI-H446(人小细胞肺癌细胞)和MDA-MB-435(人乳腺癌细胞)均为市售。
本发明分为如下三个组：
(1)空白对照组；
(2)三氯甲烷实验组：实施例1的步骤(3)中，三氯甲烷萃取所得提取物；
(3)水层实验组：实施例1的步骤(4)中，水层萃取所得提取物。
本实施例的MTT实验采用本领域技术人员的常规操作，具体步骤如下：
(1)取对数生长期的细胞，用胰酶消化制成单细胞悬液，用含15体积％新生牛血清的RPMI1640培养基(含双抗)，调节细胞浓度为4～5×104个/mL的细胞悬液100μl，每孔100μL细胞悬液的量加入至96孔细胞培养板，在饱和湿度、37℃、5体积％CO2培养箱中培养；
(2)24h后，
空白对照组：加入10μL的PBS培养基；
三氯甲烷实验组：加入10μL不同梯度浓度的海星三氯甲烷层提取物，浓度为100、10、1和0.1μg/mL；
水层实验组：加入10μL不同梯度浓度的海星水层提取物，浓度为100、10、1和0.1μg/mL
空白对照组、三氯甲烷实验组和水层实验组各组均为3个复孔，继续培养48h；
(3)在实验结束前4h，每孔加入20μL MTT(四甲基偶氮唑盐，5mg/mL，用PBS缓冲液配置)，继续在5体积％CO2培养箱中培养4h；
(4)每孔各加入100μL的二甲基亚砜(DMSO)，置培养箱内，溶解后用酶标仪在570nm处测定OD(吸光值)值。
抑制率＝(对照组OD570一样品组OD570)×100％÷对照组OD570，用SPSS软件，计算药物的EC50值，结果如表2所示。
表2海星三氯甲烷提取物和海星水层提取物对三种人体肿瘤细胞的抑制作用
从表2可以看出，将飞白枫海星用乙醇提取后，所得提取物中加入三氯甲烷和水，不论是三氯甲烷萃取层所得提取物，还是水萃取层所得提取物，均对Colo205(人结肠癌细胞)、NCI-H446(人小细胞肺癌细胞)和MDA-MB-435(人乳腺癌细胞)这三种体外培养地人肿瘤细胞具有增殖抑制作用，其EC 50值为40～90μg/mL，提示其对上述3种类型的肿瘤细胞株具有较明确的生长抑制作用，可用于制备抗肿瘤药物。