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用苯达莫司汀和抗 CD20 抗体的组合治疗癌症
    相关申请的交叉引用
     本申请要求 2009 年 1 月 16 日提交的美国专利申请序列号 61/145210 的优先权， 该申请通过引用全文并入本文。
     发明领域
     本发明涉及苯达莫司汀 (bendamustine) 与抗 CD20 抗体的组合在治疗癌症中的用途。 发明背景
     惰性非霍奇金淋巴瘤 (Indolent Non-Hodgkin′ s Lymphomas， IL) 是缓慢生长形 式的淋巴瘤。其涵盖工作方案 (Working Formulation) 中被称为低度和某些中度恶性类别 的 NHL。如果患者未能在非常早期和低度疾病时被治愈， 治疗目的在于缓解。FL 在美国和 欧洲是第二常见的淋巴瘤， 占所有非霍奇金淋巴瘤 (NHL) 的 11％到 35％ [WHO 2001]。 滤泡 性淋巴瘤 (FL) 属于惰性淋巴瘤组， 是成熟 ( 周边 )B 细胞肿瘤的亚组 [WHO 2001]。它被定
     义为生发中心 B 细胞 ( 中心细胞和中心母细胞 ) 淋巴瘤， 其具有至少部分的滤泡模式。
     虽然用基于利妥昔单抗 (rituximab) 的疗法可以很好地治疗惰性淋巴瘤， 但那些 对利妥昔单抗变得耐受的淋巴瘤则选择有限。苯达莫司汀是一种合成氮芥化合物， 表现出 对耐利妥昔单抗的惰性淋巴瘤的治疗活性并且在耐其他烷基化剂 (alkylators) 的受试对 象中显示出活性。但是， 在耐受这些早期疗法的受试对象中尤其需要替代的疗法。
     近来有许多关于新一代抗 CD20 抗体的报道。 其中一种这类新抗体是 ofatumumab。 Ofatumumab 是新一代人单克隆抗体， 其靶向 B 细胞表面 CD20 分子的独特膜近侧小的环形 表位 ( 特异结合位点 )。这一靶向导致出色地诱导出肿瘤细胞经 CDC( 补体依赖型细胞 毒 ) 活性被裂解， 特别是在具有低 CD20 密度的细胞中， 正如 CLL 的情况中， 与使用利妥昔 单抗观察到的肿瘤细胞裂解能力相比， 具有类似的 ADCC( 抗体依赖性细胞介导的细胞毒 ) 活性。在 WO2004/035607 中被描述为 2F2 抗体的 Ofatumumab 正在用于治疗非霍奇金淋巴 瘤 (NHL)、 慢性淋巴细胞白血病 (CLL) 和类风湿性关节炎的临床开发阶段 (RA)。还可参见 Teeling et al.， Blood， 104， pp 1793(2004) ； 和 Teeling et al.， J.Immunology， 177， pp 362-371(2007)。
     发明概述
     在一个实施方案中， 本发明涉及治疗任何表达 CD20 的癌症 ( 肿瘤 ) 的方法， 所述 癌症包括人患者中的前体 B 和 T 细胞肿瘤、 成熟 B 细胞肿瘤、 霍奇金淋巴瘤以及免疫缺陷相 关的淋巴增生性失调， 方法包括将抗 CD20 抗体与苯达莫司汀组合给予患者的步骤。在一个 实施方案中， 给药是同时进行的。在另一个实施方案中， 给药是顺序进行的， 其中首先给予 苯达莫司汀。再一个实施方案中首先给予抗 CD20 抗体。还有一个实施方案中， 给予抗 CD20 抗体和苯达莫司汀是交错进行的。
     在一个实施方案中， 发明涉及治疗人患者中耐利妥昔单抗的惰性非霍奇金淋巴瘤 ( 包括 FL( 滤泡性淋巴瘤 )) 的方法， 方法包括将抗 CD20 抗体与苯达莫司汀组合给予患者的步骤。在一个实施方案中， 给药是同时进行的。在另一个实施方案中， 给药是顺序进行的， 其中首先给予苯达莫司汀。再一个实施方案中首先给予抗 CD20 抗体。还有一个实施方案 中， 给予抗 CD20 抗体和苯达莫司汀是交错进行的。
     在一个实施方案中， 发明涉及包含苯达莫司汀和抗 CD20 抗体的药物组合物， 其中 组合适合单独、 顺序和 / 或同时给药。
     在一个实施方案中， 抗 CD20 抗体是分离的人抗 CD20 抗体， 该抗体结合 CD20 上的 一个表位， 它不包含或者需要位点 172 上的氨基酸残基脯氨酸， 但是包含或者需要位点 163 上的氨基酸残基天冬氨酸和位点 166 的天冬氨酸。可以在 WO2004/035607 中找到这类抗体 的实例。
     在另一个实施方案中， 抗 CD20 抗体是 ofatumuamb。
     在一个实施方案中， 发明涉及抗 CD20 抗体， 特别是 ofatumumab 在制备治疗癌症 ( 特别是耐利妥昔单抗的惰性非霍奇金淋巴瘤 ) 的药物中的用途， 其中所述药物是用于在 和苯达莫司汀的联合治疗中给予。
     在一个实施方案中， 发明涉及用于与苯达莫司汀组合治疗癌症 ( 特别是耐利妥昔 单抗的惰性非霍奇金淋巴瘤 ) 的抗 CD20 抗体 ( 特别是 ofatumuamb)。
     附图简述
     图 1 描述了 ofatumumab/ 苯达莫司汀给药的一个非限制性实例。
     图 2 描述了 CD20 在 JVM-3 细胞上的中等水平表达谱。第一个峰 ： Mab 对照 ； 第 二个峰 ： BD Bioscience 抗 CD20 抗体克隆 2H7 ； 第三个峰 ： 瑞图宣 (rituxan) ； 第四个峰 ： ofatumumab。
     图 3 描述了亚适量的 ofatumumab/ 苯达莫司汀组合的优势 (ofatumumab ： 2mg/kg& 苯达莫司汀 50mg/kg ； n ＝ 6/ 组 )
     图 4 描述了 JVM3(CLL) 模型中的 ofatumumab 和苯达莫司汀 (TREANDA) 组合 ( 皮 下， 24 天 ； n ＝ 6/ 组 )
     发明详述
     滤泡性淋巴瘤治疗策略致力于建立最大程度的疾病控制和延长寿命。 已经超越早 期阶段和组织学低度恶性的晚期疾病仍是不可治愈的。在实现有效治疗而没有毒性之间 存在着平衡。因此， 仍需要副作用有限的有效疗法用于治疗多数 FL 受试对象， 特别是那些 对烷化剂、 嘌呤类似物和利妥昔单抗变得耐受的受试对象。Ofatumumab 在利妥昔单抗抗性 受试对象中显示了活性 [Hagenbeek， et al.Blood 2008 ； 111 ： 5486-5495]， 而苯达莫司汀 在烷化剂和嘌呤类似物抗性受试对象中表现出活性 [ et al.， Ann Oncol.2000 ； 11 ： 729-734 ； Solal-Celigny et al.， Blood.2004 ； 104 ： 1258-1265 ； Heider et al.， Anticancer Drugs.2001 ； 12 ： 725-729 ； Bremer K.， J Cancer Res Clin Oncol 2002 ； 128 ： 603-609 ； Friedberg et al.， J Clin Oncol.2008 ； 26 ： 204-210]。ofatumumab 和苯达莫司 汀的联用给对其他治疗模式已经耐受的受试对象提供了效力与低毒性的结合。
     本发明涉及治疗人患者中利妥昔单抗耐受的惰性非霍奇金淋巴瘤， 包括 FL( 滤泡 性淋巴瘤 ) 的方法， 所述方法包括将抗 CD20 抗体与苯达莫司汀组合给予患者的步骤。在 一个实施方案中， 给药是同时进行的。在另一个实施方案中， 给药是顺序进行的， 其中首先 给予苯达莫司汀。再一个实施方案中首先给予抗 CD20 抗体。还有一个实施方案中， 给予抗CD20 抗体和苯达莫司汀是交错进行的。
     本发明还涉及治疗人患者中表达 CD20 的肿瘤类型的方法， 所述方法包括将抗 CD20 抗体与苯达莫司汀组合给予患者的步骤。在一个实施方案中， 给药是同时进行的。在 另一个实施方案中， 给药是顺序进行的， 其中首先给予苯达莫司汀。 再一个实施方案中首先 给予抗 CD20 抗体。 还有一个实施方案中， 给予抗 CD20 抗体和苯达莫司汀是交错进行的。 表 达 CD20 的肿瘤类型的实例包括选自前体 B 或 T 细胞肿瘤、 成熟 B 细胞肿瘤、 霍奇金淋巴瘤 或者免疫缺陷相关的淋巴增生性失调的肿瘤。
     实施例 1 中示范了苯达莫司汀和 ofatumuamb 的非限制性用药方式。
     本发明还涉及癌症的治疗方法， 所述方法包括将 ofatumuamb 和苯达莫司汀给 予人患者的步骤， 所述癌症选自 NHL(non-Hodgkin’ s lymphoma， 非霍奇金淋巴瘤 )、 B细 胞 淋 巴 母 细 胞 白 血 病 / 淋 巴 瘤 (B cell lymphoblastic leukemia/lymphoma)、 成熟 B 细胞肿瘤 (mature B cell neoplasms)、 B 细胞慢性淋巴细胞白血病 (B cell chronic lymhocytic leukemia， CLL)、 小 淋 巴 细 胞 性 淋 巴 瘤 (small lymphocytic lymphoma， SLL)、 B 细胞幼淋巴细胞白血病 (B cell prolymphocytic leukemia)、 淋巴浆细胞淋巴 瘤 (lymphoplasmacytic lymphoma)、 套细胞淋巴瘤 (mantle cell lymphoma， MCL)、 滤泡 性淋巴瘤 (follicular lymphoma， FL)( 包括低度、 中度和高度恶性 FL)、 皮肤滤泡中心淋 巴瘤 (cutaneous follicle center lymphoma)、 边缘区 B 细胞淋巴瘤 (marginal zone B cell lymphoma ： MALT 型、 节结型和脾型 )、 毛细胞白血病 (hairy cell leukemia)、 弥漫 性大 B 细胞淋巴瘤 (diffuse large B cell lymphoma)、 伯基特氏淋巴瘤 (Burkitt ′ s lymphoma)、 浆细胞瘤 (plasmacytoma)、 浆细胞骨髓瘤 (plasma cell myeloma)、 移植后淋巴 增殖性疾病 (post-transplant lymphoproliferative disorder)、 沃登斯通巨球蛋白血症 (Waldenstrom ′ s macroglobulinemia)、 间变性大细胞淋巴瘤 (anaplastic large-cell lymphoma， ALCL)、 T- 细胞非霍奇金淋巴瘤和黑素瘤。在一个实施方案中， 给药是同时进行 的。在另一个实施方案中， 给药是顺序进行的， 其中首先给予苯达莫司汀。再一个实施方案 中首先给予抗 CD20 抗体。还有一个实施方案中， 给予抗 CD20 抗体和苯达莫司汀是交错进 行的。
     利妥昔单抗 (R) 耐受性惰性淋巴瘤 (Rituximab refractory indolent lymphoma) 定义如下。所述淋巴瘤对作为单药治疗给予的或者与任何化疗组合给予的利妥昔单抗耐 受， 或者对利妥昔单抗加化疗之后作为维持治疗给予的利妥昔单抗耐受。 淋巴瘤是耐受的， 如果 ：
     1. 对作为单药疗法或者与任何化疗组合的利妥昔单抗没有至少部分反应 (PR) ； 或者
     2. 使用利妥昔单抗 ( 作为单药治疗给予的或者与任何化疗组合给予的， 或者在 R- 化疗之后的利妥昔单抗维持治疗期间 ) 的同时疾病仍在发展 ； 或者
     3. 在最后一剂利妥昔单抗 ( 作为单药治疗给予的或者与任何化疗组合给予的， 或 者在 R- 化疗之后利妥昔单抗维持治疗方案 ) 后 6 个月之内， 疾病又有进展。
     在发明的一个实施方案中， 抗 CD20 抗体是单克隆抗体。
     在一个实施方案中， 抗 CD20 抗体具有 Fc 介导的效应子功能。
     在一个实施方案中， 抗 CD20 抗体具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒 (ADCC) 效应子功能。 在一个实施方案中， 抗 CD20 抗体具有补体依赖性细胞毒 (CDC) 效应子功能。
     在发明的一个实施方案中， 抗 CD20 抗体是嵌合的、 人源化的或者人单克隆抗体。
     在一个实施方案中， 抗 CD20 的单克隆抗体 ( 抗 CD20 抗体 ) 是选自下述的全长抗 体： 全长 IgG1 抗体、 全长 IgG2 抗体、 全长 IgG3 抗体、 全长 IgG4 抗体、 全长 IgM 抗体、 全长 IgA1 抗体、 全长 IgA2 抗体、 全长分泌型 IgA 抗体、 全长 IgD 抗体和全长 IgE 抗体， 其中所述 抗体在真核细胞中被糖基化。
     在一个实施方案中， 抗 CD20 抗体是全长抗体， 比如全长 IgG1 抗体。
     在 一 个 实 施 方 案 中， 抗 CD20 抗 体 是 抗 体 片 段， 比 如 scFv 或 UniBodyTM(WO 2007/059782 中公开的单价抗体 )。在发明的一个实施方案中， 针对 CD20 的抗体 ( 抗 CD20 抗体 ) 是结合结构域免疫球蛋白融合蛋白， 其包含 (i) 结合结构域多肽， 处于 SEQ ID NO ： 1 的重链可变区形式或者 SEQ ID NO ： 2 对轻链可变区形式， 该多肽与免疫球蛋白铰链区多肽 融合， (ii) 与铰链区融合的免疫球蛋白重链 CH2 恒定区， 以及 (iii) 与 CH2 恒定区融合的 免疫球蛋白重链 CH3 恒定区。
     在一个实施方案中， 抗 CD20 抗体与突变体 P172S CD20( 位点 172 的脯氨酸被突变 为丝氨酸 ) 结合的亲和力至少与和人 CD20 结合的亲和力相同。
     在发明的一个实施方案中， 抗 CD20 抗体与 CD20 上的表位结合， 所述表位 (i) 不包含或者不需要位点 172 的氨基酸残基脯氨酸 ； (ii) 不包含或者不需要位点 170 的丙氨酸或者位点 172 的脯氨酸 ； (iii) 不包含或者不需要位点 163 的氨基酸残基天冬氨酸和位点 166 的天冬氨酸； (iv) 不包含或者不需要位点 172 的氨基酸残基脯氨酸， 但是包含或者需要位点 163 的氨基酸残基天冬氨酸和位点 166 的天冬氨酸 ； 或者
     (v) 不包含或者不需要位点 170 的氨基酸残基丙氨酸或位点 172 的脯氨酸， 但是包 含或者需要位点 163 的天冬氨酸和位点 166 的天冬氨酸这些氨基酸残基。
     在一个实施方案中， 抗 CD20 抗体结合位于人 CD20 的第一个小胞外环中的表位。
     在一个实施方案中， 抗 CD20 抗体结合 CD20 上的不连续表位。
     在一个实施方案中， 抗 CD20 抗体结合 CD20 上的不连续表位， 其中所述表位包含第 一个小胞外环的一部分和第二个胞外环的一部分。
     在一个实施方案中， 抗 CD20 抗体结合 CD20 上的不连续表位， 其中所述表位含有第 一个小胞外环的 AGIYAP 残基和第二个胞外环的 MESLNFIRAHTPYI 残基。
     在一个实施方案中， 抗 CD20 抗体具有选自下述的一或多个特征 ：
     (i) 能够在有补体的情况下， 诱导表达 CD20 的细胞的补体依赖性细胞毒 (CDC) ；
     (ii) 能够在有补体的情况下， 诱导表达 CD20 和高水平 CD55 和 / 或 CD59 的细胞的 补体依赖性细胞毒 (CDC) ；
     (iii) 能够诱导表达 CD20 的细胞的细胞凋亡 ；
     (iv) 能够在有效应细胞的情况下， 诱导表达 CD20 的细胞的抗体依赖性细胞毒 (ADCC) ；
     (v) 能够诱导表达 CD20 的细胞的同型粘附 ；
     (vi) 能够在结合 CD20 后迁移到脂膜筏 (lipid rafts) ； (vii) 能够消除表达 CD20 的细胞 ； (viii) 能够消除表达低水平 CD20 的细胞 ( 低 CD20 细胞 ) ； 以及 (ix) 能够在人组织中有效地原位消除 B 细胞。 在发明的一个实施方案中， 抗 CD20 抗体包含选自 SEQ ID NOs ： 5、 9 或 11 的 VH CDR3序列。 在一个实施方案中， 抗 CD20 抗体包含 SEQ ID NO ： 3 的 VH CDR1、 SEQ ID NO ： 4的 VH CDR2、 SEQ ID NO ： 5 的 VH CDR3、 SEQ ID NO ： 6 的 VL CDR1、 SEQ ID NO ： 7 的 VL CDR2 和 SEQ ID NO ： 8 的 VL CDR3 序列。
     在发明的一个实施方案中， 抗 CD20 抗体包含 SEQ ID NO ： 10 的 VH CDR1-CDR3 跨越 序列。
     在发明的一个实施方案中， 抗 CD20 抗体含有人重链和人轻链可变区， 所述可变区 包含分别如 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 2 所示的氨基酸序列 ； 或者包含分别与 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 2 所示的氨基酸序列有至少 95％同一性， 更优选至少 98％， 或者至少 99％ 同一性的氨基酸序列。
     在 发 明 的 一 个 实 施 方 案 中， 抗 CD20 抗 体 选 自 WO 2004/035607 中 公 开 的 抗 CD20 抗 体 之 一， 比 如 ofatumumab(2F2)、 11B8 或 7D8 ； WO 2005/103081 中 公 开 的 抗 体 之 一， 比 如 2C6 ； WO 2004/103404 中 公 开 的 抗 体 之 一， AME-133( 由 Applied Molecular Evolution 开发的人源化和优化抗 CD20 单克隆抗体 ) ； US2003/0118592 中公开的抗体 之 一， TRU-015(CytoxB20G， 由 Trubion Pharmaceuticals Inc 开 发 的 来 源 于 抗 CD20 抗 体 上 的 关 键 结 构 域 的 小 分 子 immunopharmaceutical 融 合 蛋 白 ) ； WO 2003/68821 中 公 开 的 抗 体 之 一 IMMU-106( 人 源 化 抗 CD20 单 克 隆 抗 体 ) ； WO 2004/56312 中 公 开 的 抗 体 之 一， ocrelizumab(2H7.v16， PRO-70769， R-1594)、 (tositumomab) 和 ( 利妥昔单抗 )。名词 “CD20” 和 “CD20 抗原” 在文中可互换使 用， 包括由细胞天然表达的或者转染了 CD20 基因的细胞上表达的人 CD20 的任何变体、 同种 型和物种同源物。本领域认可的 CD20 的同义词包括 B- 淋巴细胞表面抗原 B1、 Leu-16 和 Bp35。人 CD20 的 UniProtKB/Swiss-Prot 登记号为 P11836。
     用于本文， 名词 “免疫球蛋白” 是指一类结构相关的糖蛋白， 其由两对多肽链构成， 即一对低分子量轻 (L) 链和一对重 (H) 链， 这四条链通过二硫键相连。 免疫球蛋白的结构已 研究清楚。参见例如 Fundamental Immunology Ch.7(Paul， W.， ed.， 2nd ed.Raven Press， N.Y.(1989))。简单来说， 每个重链通常由重链可变区 ( 文中缩写为 VH) 和重链恒定区。重 链恒定区 CH 一般由三个结构域构成， CH1、 CH2 和 CH3。每个轻链通常由轻链可变区 ( 文中 缩写为 VL) 和轻链恒定区构成。轻链恒定区一般由一个结构域 CL 构成。VH 和 VL 区可以进 一步分成高度可变的区域 ( 或者结构明确的环的序列和 / 或形式高度可变的区域 )， 又称为 补体决定区 (CDRs)， 散布于被称为框架区 (FR) 的更保守区域中。
     每个 VH 和 VL 通常由三个 CDRs 和四个 FRs 构成， 从氨基端到羧基端以如下顺序排 列： FR1、 CDR1、 FR2、 CDR2、 FR3、 CDR3、 FR4( 还可参见 Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196， 901-917(1987))。 通 常， 这 个 区 域 的 氨 基 酸 残 基 的 编 号 按 照 Kabat et al， Sequences of Proteins of Immunological Interest， 5th Ed.Public Health Service， National
     Institutes of Health， Bethesda， MD.(1991) 中描述的方法进行 ( 文中诸如 “Kabat 中或 者根据 Kabat 的可变结构域残基编号” 的短语是指用于重链可变结构域或轻链可变结构域 的该编号系统 )。 采用这种编号系统， 肽的实际线性氨基酸序列可能含有减少的或者增加了 的氨基酸， 对应着缩短了的或者含有插入的可变结构域 FR 或 CDR。例如， 重链可变结构域 可能包含在 VH CDR2 残基 52 后面的单个氨基酸插入 ( 例如， 根据 Kabat， 残基 52a)， 和重链 FR 残基 82 后面的插入残基 ( 例如， 根据 Kabat， 残基 82a、 82b 和 82c 等 )。特定抗体的残基 Kabat 编号可以通过将抗体序列的同源区域与 “标准” 的 Kabat 编号序列进行比对来确定。
     用于本文， 名词 “抗体” 是指这样的免疫球蛋白分子， 免疫球蛋白分子片段或者它 们中之一的衍生物， 其具有在典型的生理条件下与抗原特异结合相当一段时间的能力， 比 如结合至少大约 30 分钟、 至少大约 45 分钟、 至少大约一小时、 至少大约两小时、 至少大约四 小时、 至少大约 8 小时、 至少大约 12 小时、 大约 24 小时或更长、 大约 3、 4、 5、 6、 7 或更多天等， 或者其他有关的功能限定的时期 ( 比如足够诱发、 促进、 加强和 / 或调整与抗体结合抗原关 联的生理反应的时间， 和 / 或足够抗体召集 Fc 介导的效应子活性的时间 )。
     免疫球蛋白分子重链和轻链可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。 抗体的恒 定区可能介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合， 包括免疫系统的各种细胞 ( 比如效应 细胞 ) 和补体系统的成分 ( 比如补体活化经典途径中的第一个成分 C1q)。
     抗 CD20 抗体可以是单、 双或多特异性的。的确， 本发明提供的双特异性抗体、 二体 等可以在部分 CD20 之外， 结合任何合适的靶分子。
     正如上文指出的， 除非另有说明或者上下文清楚地与之抵触， 用于本文的名词 “抗 体” 包括通过任何已知技术提供的保留了与抗原特异结合能力的抗体片段， 所述技术是比 如酶解、 肽合成和重组技术。已证实抗体的抗原结合功能可能由全长 ( 完整 ) 抗体的片段 来实现。涵盖在名词 “抗体” 中的抗原结合片段的例子包括， 但不限于 (i)Fab 片段， 由 VL、 VH、 CL 和 CH1 结构域构成的单价片段 ； (ii)F(ab)2 和 F(ab ′ )2 片段、 包含由铰链区二硫 键连接的两个 Fab 片段的二价片段 ； (iii) 基本由 VH 和 CH1 结构域构成的 Fd 片段 ； (iv) 基本由抗体单个臂的 VL 和 VH 结构域构成的 Fv 片段 ； (v)dAb 片段 (Ward et al.， Nature 341， 544-546(1989))， 其基本由 VH 结构域构成， 又称为结构域抗体 (Holt et al.(November 2003)Trends Biotechnol.21(11) ： 484-90) ； (vi)camelid 抗 体 或 纳 米 抗 体 (Revets et al.(January 2005)Expert Opin Biol Ther.5(1) ： 111-24) ； (vii) 分 离 的 互 补 决 定 区 TM (CDR)， 比如 VH CDR3， (viii)UniBody ， WO 2007/059782 中公开的单价抗体 ； (ix) 单链抗 体或单链 Fv(scFv)， 参见例如 Bird et al.， Science 242， 423-426(1988) 和 Huston et al.， PNAS USA 85， 5879-5883(1988)) ； (x) 二体 (scFv 二聚体 )， 可以是单特异性或双特 异性的 ( 关于二体的描述参见例如 PNAS USA 90(14)， 6444-6448(1993)、 EP 404097 或 WO 93/11161)、 三体或四体。虽然这些片段通常包含在抗体的定义中， 它们全部并且每个单独 地是本发明的独特特性， 表现出不同的生物属性和用途。这些和其他对于本发明有用的抗 体片段在文中有进一步讨论。
     应当明白， 名词抗体通常包括单克隆抗体和多克隆抗体。 抗体可以是人的、 人源化 的、 嵌合的、 小鼠的等。所生产的抗体可以具备任何同种型。
     用于本文， 名词 “人抗体” 意图包括含有来自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒 定区的抗体。本发明的人抗体可以包括不是人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基 ( 例如， 通过在体外或体内体细胞突变， 随机或定点突变引入的突变 )。但是， 用于本文的名词 “人抗体” 不包括这样的抗体， 这些抗体中来源于另一个哺乳动物物种 ( 比如小鼠 ) 种系的 CDR 序列被移植到了人框架序列上。
     用于本文， 人抗体如果是利用人免疫球蛋白序列从某系统中获得的， 例如通过给 携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠免疫接种或者通过筛选人免疫球蛋白文库， 并且其中 选中的人抗体与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列有至少 95％、 比如至少 95％、 例如 至少 96％、 比如至少 97％、 例如至少 98％， 或者比如至少 99％的氨基酸序列同一性， 则抗体 是 “来源于” 特定种系序列。一般来说， 来源于特定人种系序列的人抗体会表现出不超过 10 个氨基酸的不同， 比如与种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列有不超过 5 个， 例如不 超过 4、 3、 2、 或 1 个氨基酸不同。对于 VH 抗体序列， VH CDR3 结构域不包括在这种比较中。
     名词 “嵌合抗体” 是指这样的抗体， 所述抗体含有一或多个区域来自一个抗体， 还 有一或多个区域来自一或多个其他抗体。名词 “嵌合抗体” 包括单价、 二价或多价抗体。单 价嵌合抗体是由嵌合 H 链与嵌合 L 链通过二硫键关联起来形成的二聚体 (HL))。二价嵌合 抗体是由两个 HL 二聚体通过至少一个二硫键桥关联起来的四聚体 (H2L2)。多价嵌合抗 体的制备还可以通过例如采用组装到具有 2+ 结合位点的分子 ( 例如来自 IgM H 链或 μ 链 ) 中的 CH 区。一般来说， 嵌合抗体是指这样的抗体， 所述抗体中重链和 / 或轻链的一部 分与来源于特定物种的或者属于特定抗体类型或亚型的抗体中的相应序列是相同或者同 源的， 而链的其他部分与来源于其他物种的或者属于另一个抗体类型或亚型的抗体中的相 应序列是相同或者同源的， 嵌合抗体还包括所述抗体的片段， 只要它们表现出所需的生物 活性 ( 参见例如 US 4,816,567 和 Morrison et al.， PNAS USA 81， 6851-6855(1984))。嵌 合抗体是通过本领域已知的重组过程产生的 ( 参见例如 Cabilly et al.， PNAS USA 81， 3273-3277(1984)、 Morrison et al.， PNAS USA 81， 6851-6855(1984)、 Boulianne et al.， Nature 312， 643-646(1984)、 EP125023、 Neuberger et al.， Nature 314， 268-270(1985)、 EP171496 、 EP173494 、 WO 86/01533 、 EP184187 、 Sahagan et al. ， J.Immunol.137 ， 1066-1074(1986)、 WO 87/02671、 Liu et al.， PNAS USA 84， 3439-3443(1987)、 Sun et al.， PNAS USA 84， 214-218(1987)、 Better et al.， Science 240， 1041-1043(1988) 和 Harlow et al.， Antibodies ： A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， N.Y.， (1988))。
     名词 “人源化抗体” 是指含有最少来源于非人抗体的序列的人抗体。一般来说， 人 源化抗体是这样的人免疫球蛋白 ( 受体抗体 )， 其中来自受体高变区的残基被来自非人物 种 ( 供体抗体， 比如小鼠、 大鼠、 兔或非人灵长类 ) 具有所需特异性、 亲和力和容量的高可变 区残基所替代。
     此外， 人源化抗体可能包含受体抗体或者供体抗体中没有的残基。进行这些改动 是为了进一步优化抗体的性能。通常， 人源化抗体包含至少一个， 一般是两个可变结构域 的基本全部， 其中与非人免疫球蛋白对应的全部或基本全部高变环以及全部或基本全部 FR 区都是人免疫球蛋白序列。人源化抗体任选还包含人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。更 多细节参见 Jones et al.， Nature 321， 522-525(1986)、 Riechmann et al.， Nature 332， 323-329(1988) 和 Presta， Curr.Op.Struct.Biol.2， 593-596(1992)。
     名词 “患者” 指人患者。用于本文， 名词 “单克隆抗体” 或 “单克隆抗体组合物” 是指单分子组合物的抗体 分子制品。单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。相应地， 名 词 “人单克隆抗体” 是指表现出单一结合特异性的含有来源于人种系免疫球蛋白序列的可 变区和恒定区的抗体。可以由包含从转基因或转染色体非人动物 ( 比如转基因小鼠 ) 获得 的 B 细胞的杂交瘤来产生人单克隆抗体， 所述含有包含人重链转基因和轻链转基因的基因 组的 B 细胞与永生细胞融合。
     用于本文， 名词 “重组人抗体” 包括所有通过重组手段制备、 表达、 形成或分离的人 抗体， 比如 (a) 抗体， 所述抗体分离自人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体动物 ( 比如小 鼠 ) 或由此制备的杂交瘤 ( 文中其他地方有进一步描述 )， (b) 抗体， 所述抗体分离自被转 化用于表达抗体的宿主细胞， 比如分离自转染瘤， (c) 抗体， 所述抗体分离自重组、 组合人抗 体文库， 和 (d) 抗体， 所述抗体通过任何其他涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他 DNA 序列上的手段制备、 表达、 形成或分离。 这些重组人抗体含有来源于人种系免疫球蛋白序列 的可变区和恒定区。但是在某些实施方案中， 这些重组人抗体可能接受体外突变 ( 或者， 在 使用人 Ig 序列的转基因动物时， 接受体内体细胞突变 )， 因此重组抗体的 VH 和 VL 区氨基酸 序列， 虽然是来源于并且与人种系 VH 和 VL 序列有关， 但可能并不天然存在于人体内抗体种 系库。
     名词 “转基因的非人动物” 是指这样的非人动物， 所述动物的基因组包含一或多个 人重链和 / 或轻链转基因或转染色体 ( 整合或者没有整合到动物的天然基因组 DNA 中 ) 并 且能够充分地表达人抗体。例如， 转基因小鼠可以含有人轻链转基因和人重链转基因或者 人重链转染色体， 这样小鼠在被免疫接种 CD20 抗原和 / 或表达 CD20 的细胞时会产生人抗 CD20 抗体。人重链转基因可以整合到小鼠的染色体 DNA 中， 象转基因小鼠的情况中， 例如 比如 HCo7 或 HCo12 小鼠 ； 或者人重链转基因可以维持在染色体外， 象 WO 02/43478 中描述的转染色体 的情况。 这类转基因和转染色体小鼠 ( 文中 统称为 “转基因小鼠” ) 能够通过 V-D-J 重组和同种型转换对给定抗原产生多种同种型的人 单克隆抗体 ( 比如 IgG、 IgA、 IgM、 IgD 和 / 或 IgE)。转基因非人动物还可以用于通过引入 编码特定抗体的基因来产生抗特定抗原的该抗体， 例如通过将所述基因与在动物乳汁中表 达的基因可操纵地连接。
     对于氨基酸 ( 多肽 ) 序列而言， 名词 “同一性” 或 “同源性” 表明在有合适的插入 和缺失的情况下， 最佳对位排列和比较时两个氨基酸序列之间的一致程度。两个序列之间 的同一性百分比是所述序列共用的相同位点数目的函数 ( 即％同一性＝相同位点数 / 位点 总数乘以 100)， 并考虑到两序列最佳比对所需要引入的空位数量、 每个空位的长度。 序列的 比较以及确定两个序列之间同一性百分比可以如下所述利用数学算法来实现。
     两个多肽序列之间的同一性百分比可以利用 GCG 软件包中的 GAP 程序， 使用 NWSgapdna.CMP 矩阵和 40、 50、 60、 70 或 80 的空位权重以及 1、 2、 3、 4、 5 或 6 的长度权重来确 定。 两个氨基酸序列之间的同一性百分比还可以利用已被合并到 ALIGN 程序 (2.0 版本 ) 中 的 E.Meyers 和 W.Miller(Comput.Appl.Biosci.， 4： 11-17(1988)) 的算法， 使用 PAM120 残 基权重表、 空位长度罚分 12 和空位罚分 4 来确定。此外， 两个氨基酸序列之间的同一性百 分比可以利用已合并到 GCG 软件包中 GAP 程序里的 Needleman 和 Wunsch(J.Mol.Biol.48 ： 444-453(1970)) 的算法， 使用 Blossum 62 矩阵或 PAM250 矩阵， 16、 14、 12、 10、 8、 6 或 4 的空位权重和 1、 2、 3、 4、 5 或 6 的长度权重来确定。
     举例来说， 多肽序列可能与多肽参照序列 ( 例如 SEQ ID NO ： 1) 相同， 即 100 ％ 同一性 ； 或者可能与参照序列相比， 包含最多某整数个氨基酸改变， 这样％同一性则低于 100％， 比如至少 50、 60、 70、 75、 80、 85、 90、 95、 98 或 99％同一性。这类改变选自至少一个氨 基酸缺失、 取代 ( 包括保守和非保守性取代 ) 或者插入， 其中所述改变可以发生在参照多肽 序列的氨基或者羧基端， 或者末端位点之间的任何地方， 是各自分散在参照序列中的氨基 酸之间或者以一或多个连续群分散在参照序列中。 对于给定％同一性的氨基酸改变数目是 通过将多肽参照序列 ( 例如 SEQ ID NO ： 1) 所编码的多肽序列中的氨基酸总数乘以分别的 百分比同一性 ( 除以 100) 的百分数， 然后从文中描述的多肽参照序列 ( 例如 SEQ ID NO ： 1) 中的所述氨基酸总数中减去该乘积， 或者 ：
     na ≤ xa-(xa·y)，
     其中 na 是氨基酸改变的数目 ； xa 是 SEQ ID NO ： 1 所编码的多肽序列中氨基酸的总 数； y 对 50％是 0.50， 对 60％是 0.60， 对 70％是 0.70， 对 75％是 0.75， 对 80％是 0.80， 对 85％是 0.85， 对 90％是 0.90， 对 95％是 0.95， 对 98％是 0.98， 对 99％是 0.99， 或者对 100％ 是 1.00 ； ·代表乘号， 其中 xa 和 y 的任何非整数乘积在从 xa 中减去之前， 下舍入最近的整 数。 本发明还提供了包含苯达莫司汀的药物组合物 ( 制剂 )。这种组合物包含治疗有 效量的苯达莫司汀， 还可能包含药物可接受载体、 稀释剂或赋形剂。 所述药物载体可以是无 菌液体， 比如水和油， 包括石油、 动物、 蔬菜或合成来源的油， 比如花生油、 豆油、 矿物油、 芝 麻油等。 当药物组合物是静脉内给予时， 可以使用水作为载体。 盐溶液以及右旋糖和甘油水 溶液也可以作为例如注射液的液体载体。 合适的药物赋形剂包括淀粉、 葡萄糖、 乳糖、 蔗糖、 明胶、 麦芽、 大米、 面粉、 白垩、 硅胶、 硬脂酸钠、 甘油单硬脂酸酯、 滑石、 氯化钠、 脱脂奶粉、 甘 油、 丙烯、 乙二醇、 水、 乙醇等。 如果需要， 组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂， 或者 pH 缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、 悬浮液、 乳液、 片剂、 丸剂、 胶囊、 粉剂、 缓释制剂等的形 式。组合物可以用传统的粘合剂和载体 ( 比如甘油三酯 ) 配制成锭剂。口服制剂可以包含 标准载体， 比如药物级的甘露醇、 乳糖、 淀粉、 硬脂酸镁、 糖精钠、 纤维素、 碳酸镁等。合适的 药物载体的例子在 E.W.Martin 的 REMINGTON′ SPHARMACEUTICAL SCIENCES 中有描述。 这类组合物含有通 常是纯化形式的治疗有效量的化合物， 以及适当量的载体来提供适合患者给药的形式。制 剂应当适合给药模式。
     在发明的一个实施方案中， 组合物按照常规过程配制成适合静脉内给予人的药物 组合物。一般来说， 静脉内给药的组合物是溶于无菌等渗缓冲液的溶液。合适的情况中， 组 合物还可以包含稳定剂和局部麻醉剂， 比如利诺卡因来减轻注射部位的疼痛。 通常， 组分是 分开或者混在一起以单位剂量形式提供的， 例如以标明活性剂含量的诸如安瓿或药包的密 封容器中的冻干粉或者无水浓缩物提供。组合物要通过输液给予的情况中， 可以用含有无 菌药物级水或盐水的输液瓶来配药。组合物要通过注射给予的情况中， 可以提供无菌注射 用水或盐水的安瓿， 这样组分可以在给药前进行混合。
     相应地， 苯达莫司汀可以用于制备药剂。本发明的药物组合物可以配制成用于肠 胃外给药的溶液或者冻干粉。粉末可以在使用前， 通过加入合适的稀释剂或其他药物可接 受载体来重配。液体制剂可以是缓冲的等渗水溶液。合适稀释剂的例子是常规的等渗盐溶
     液、 标准 5％葡萄糖水溶液、 或者缓冲的钠或醋酸铵溶液。 这样的制剂尤其适合肠胃外给药， 但也可以用于口服或包含在计量的吸入器或雾化器中用于吸入。 可能希望向这些药物组合 物中加入赋形剂， 比如聚乙烯吡咯烷酮、 明胶、 羟基纤维素、 阿拉伯胶、 聚乙二醇、 甘露醇、 氯 化钠或柠檬酸钠。
     替代地， 可以将苯达莫司汀胶囊化、 成片剂或者制备到乳液或糖浆中用于口服。 可 以添加药物可接受的固态或液态载体来增强或稳定组合物， 或者协助组合物的制备。固态 载体包括淀粉、 乳糖、 二水硫酸钙、 白土、 硬脂酸镁或硬脂酸、 滑石、 果胶、 阿拉伯胶、 琼脂或 明胶。液态载体包括糖浆、 花生油、 橄榄油、 盐水和水。载体还可以包含缓释物质， 比如单独 或者与蜡混合的单硬脂酸甘油或二硬脂酸甘油。固态载体的量可以变化， 但在每剂量单位 大约 20mg 到大约 1g 之间。 药物制品按照常规的药学技术制备， 对片剂形式包括碾磨、 混合、 粒化和压缩 ； 或者对硬的明胶胶囊形式包括碾磨、 混合和填充。使用液态载体时， 制品可以 采取糖浆、 酏剂、 乳液， 或者水性或非水性悬浮液的形式。这种液态制剂可以直接经口给药 ( 口服 ) 或者注入软明胶胶囊。
     苯达莫司汀可以制备为药物组合物， 所述组合物含有处于药物可接受载体中的有 效量作为活性成分的化合物。 本发明的组合物中， 可以采用缓冲到生理 pH、 适合注射用的含 有苯达莫司汀的水性悬浮液或溶液。 用于肠胃外给药的组合物通常包含苯达莫司汀溶液或 者其溶于诸如水性载体的药物可接受载体的混合液。可以应用的水性载体有许多种， 例如 0.4％盐水、 0.3％甘氨酸等。这些溶液是无菌的， 一般不含微粒物质。这些溶液可以通过常 规的公知灭菌技术 ( 例如过滤 ) 来灭菌。根据向生理条件靠拢的需要， 组合物可以含有药 物可接受辅助物质， 比如 pH 调节和缓冲剂等。本发明这种药物制剂中的苯达莫司汀浓度可 以非常不同， 即从重量比低于大约 0.5％， 通常在或者至少大约 1％， 到高达 15 或 20％， 并且 根据选定的给药模式， 主要在液体体积、 粘度等的基础上来选择。
     因此， 用于肌内注射的苯达莫司汀药物组合物可以制备成含有 1mL 缓冲无菌水和 大约 1ng 到大约 100mg 之间的苯达莫司汀， 例如大约 50ng 到大约 30mg， 或者大约 5mg 到大 约 25mg。类似地， 用于静脉内输液的苯达莫司汀药物组合物可以配制成含有大约 250mL 无 菌林格氏液， 以及大约 1mg 到大约 30mg， 或者大约 5mg 到大约 25mg 的苯达莫司汀。制备肠 胃外给药的组合物的实际方法是已知的或者对本领域技术人员是显而易见的， 并且在例如 REMINGTON′ S PHARMACEUTICAL SCIENCE(15th ed.， Mack Publishing Company， Easton， Pennsylvania) 中有更详细描述。
     当苯达莫司汀被制备成药物制品时， 可以处于单位剂量的形式。本领域技术人员 可以容易地确定出适当的治疗有效剂量。如果合适， 这种剂量可以由医师在反应期选择恰 当的时间间隔来反复给予。此外， 任选采用体外检测法来帮助鉴定最佳剂量范围。制剂时 采用的确切剂量还取决于给药途径， 以及疾病或紊乱的严重程度， 应当根据执业医生的判 断和每个患者的情况来决定。可以根据从体外或动物模型测试系统得到的剂量 - 反应曲线 来推出有效剂量。
     对于苯达莫司汀， 给予患者的剂量通常是 0.1mg-100mg/kg 患者体重。给予患者的 剂量可以在 0.1mg 和 20mg/kg 患者体重， 或者替代地， 1mg 到 10mg/kg 患者体重。
     发明还提供了包含一或多个容器的药物包或试剂盒， 所述容器装有苯达莫司汀药 物组合物的一或多种成分。任选与这种容器关联着由规范药物或生物制品的制造、 使用或销售的政府机构发布的简介， 该简介反应了所述机构对用于人类给药的制造、 使用或销售 的批准。在发明的另一个实施方案中， 试剂盒可以与满足治疗特定病征所需要的剂量的适 当数量容器一起提供。
     在另一个实施方案中， 可以在介质， 特别是脂质体中递送苯达莫司汀 ( 参见 Langer， Science 249 ： 1527-1533(1990) ； Treat， et al.， in LIPOSOMES IN THE THERAPY OF INFECTIOUS DISEASE AND CANCER， Lopez-Berestein and Fidler(eds.)， Liss， New York， pp.353-365(1989) ； Lopez-Berestein， ibid.， pp.317-327 ； 总体同前 .)。
     再一个实施方案中， 苯达莫司汀可以在控释系统中递送。在一个实施方案中， 可 以 使 用 泵 ( 参 见 Langer， supra ； Sefton， CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14 ： 201(1987) ； Buchwald ， et al. ， Surgery 88 ： 507(1980) ； Saudek ， et al. ， N.Engl.J.Med.321 ： 574(1989))。 在 另 一 个 实 施 方 案 中， 可 以 使 用 聚 合 物 材 料 ( 参 见 MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE， Langer and Wise(eds.)， CRCPres.， Boca Raton， Fla.(1974) ； CONTROLLED DRUG BIOAVAILABILITY， DRUGPRODUCT DESIGN AND PERFORMANCE， Smolen and Ball(eds.)， Wiley， New York(1984) ； Ranger， et al.， J.， Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23 ： 61(1983) ； 还可参见 Levy， et al.， Science 228 ： 190(1985) ； During， et al.， Ann.Neurol.25 ： 351(1989) ； Howard， et al.， J.Neurosurg.71 ： 105(1989))。再一个实施方案中， 可以将控释系统放置在治疗目标， 即脑的附近， 因此只需要系统剂量的一部分 ( 参见例如 Goodson， in MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE， 同前， vol.2， pp.115-138(1984))。 Langer(Science 249 ： 1527-1533(1990)) 的综述中讨论了其他控释系统。
     苯达莫司汀可以通过任何合适的体内途径进行给药， 并且可以按照需要反复给 予， 例如频率在每日一到三次地给药 1 天到大约三周， 到每周一次或者两周一次。替代地， 可以改变苯达莫司汀减少电荷密度， 从而得到口腔生物利用率。治疗的剂量和持续时间与 发明所述分子在人循环系统中停留时间有关， 可以由本领域技术人员根据患者要治疗的状 况和整体健康情况来调节。
     各种递送系统是已知的， 可以用于苯达莫司汀的给药， 例如包裹在脂质体中、 微颗 粒、 微胶囊、 能够表达化合物的重组细胞、 受体介导的胞吞 ( 参见例如 Wu， et al.， J.Biol. Chem.262 ： 4429-4432(1987))、 将核酸构建为逆转录病毒或其他载体的一部分等。 导入的方 法包括， 但不限于皮内、 肌内、 腹膜内、 静脉内、 皮下、 鼻内、 硬膜和经口途径。苯达莫司汀可 以通过任何方便的途径给予， 例如通过输液或大剂量注射、 通过经表皮或粘膜层 ( 例如口 腔粘膜、 直肠和小肠粘膜等 ) 吸收， 也可以与其他生物活性剂一起给予。给药可以是系统或 局部的。此外， 可能希望将本发明的药物化合物或组合物通过任何合适的途径引入中枢神 经系统， 所述途径包括心室内和椎管内注射 ； 心室内注射可以用心室内导管来协助， 例如接 在贮器， 比如 Ommaya 贮器上的导管。也可以采用肺部给药， 例如借助吸入器或雾化器， 以及 与雾化剂一起成剂。
     抗 CD20 抗体
     具有本领域普通技术的医师或兽医可以很容易地确定包含抗 CD20 抗体的药物组 合物的有效量并处方。例如， 医师或兽医开始可以给予比达到希望治疗效果所需要的剂量 低的药物组合物中应用的发明所述化合物， 然后逐渐增加剂量直到达到希望的效果。 通常， 发明所述组合物的合适每日剂量是足够产生治疗效果的最低剂量的化合物用量。优选， 给药是经静脉内、 肌内、 腹腔内或者皮下。如果需要， 治疗组合物的有效每日剂量可以作为两 个、 三个、 四个、 五个、 六个或更多个亚剂量， 任选以单位剂量形式在一天内以合适的间隔分 别给予。虽然可能将抗 CD20 抗体单独给药， 优选将化合物以药物制剂 ( 组合物 ) 给予。
     在一个实施方案中， 根据发明的人单克隆抗体可以通过输液以每周 10 到 2000mg/ 2 m 的剂量给予， 通常是 10 到 500mg/m2， 比如 200 到 400mg/m2， 比如 375mg/m2。这种给药可以 重复例如 1 到 8 次， 比如 3 到 5 次。给药可以通过持续输液在 2 到 24 小时， 比如 2 到 12 小 时内进行。
     在另一个实施方案中， 抗体通过缓慢连续的输液在长时间内， 比如超过 24 小时给 予， 以便减少毒副作用。
     在再一个实施方案中， 抗体以每周 250mg 到 2000mg 的剂量给药， 比如例如 300mg、 500mg、 700mg、 1000mg、 1500mg 或 2000mg 给予最多 8 次， 比如 4 到 6 次。给药可以通过连续 输液在 2 到 24 小时， 比如 2 到 12 小时的时期内进行。这样的方案可以根据需要在例如 6 个月或 12 个月后重复一或多次。可以通过利用靶向抗 CD20 抗体的抗独特型抗体， 测量给 药后生物样品中循环抗 CD20 抗体的量， 从而确定剂量或对它进行调节。
     还有一个实施方案中， 抗体通过维持疗法给药， 比如例如每周一次进行 6 个月或 更长的时期。 在一个实施方案中， 本发明提供了包含治疗有效量抗 CD20 抗体的药物组合物。所 述药物组合物可以按照比如 Remington ： The Science and Practice of Pharmacy(19th Edition， Gennaro， Ed.， Mack Publishing Co.， Easton， PA， 1995) 中描述的常规技术， 与药 物可接受载体或稀释剂以及其他任何已知助剂和赋形剂一起成剂。 药物组合物可以包含稀 释剂、 填充剂、 盐、 缓冲液、 去污剂 ( 例如， 非离子型去污剂， 比如 Tween-80)、 稳定剂 ( 例如糖 或不含蛋白质的氨基酸 )、 防腐剂、 组织固定剂、 增溶剂和 / 或适合包括在药物组合物中的 其他物质。 药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化从而达到活性成分的量足以在 特定患者、 组合物和给药模式中实现希望的治疗反应， 而对患者没有毒性。 选中的剂量水平 取决于多种药代动力学因素， 包括应用的特定组合物的活性 ； 给药途径 ； 给药时间 ； 使用的 特定化合物的外排速度 ； 治疗时长 ； 与所用特定组合物联用的其他药物 / 化合物和 / 或物 质； 接受治疗的患者的年龄、 性别、 体重、 状况、 整体健康情况和以前的病史， 以及医学领域 已知的其他因素。
     本发明的抗 CD20 抗体可以经任何合适途径给予， 比如口、 鼻、 吸入、 支气管内、 肺 泡内、 局部 ( 包括颊、 透皮和舌下 )、 直肠、 阴道和 / 或肠胃外途径。 在一个实施方案中， 本发 明的药物组合物是经肠胃外给药的。
     用 于 本 文， 短语 “肠 胃 外 给 药 (parenteral administration 和 administered parenterally)” 意味着非肠内和局部给药的给药模式， 通常通过注射， 包括表皮、 静脉内、 肌内、 动脉内、 鞘内、 囊内、 眶内、 心内、 皮内、 腹膜内、 腱内、 经气管、 皮下、 表皮下、 关节内、 囊 下、 蛛网膜下、 椎管内、 颅内、 胸内、 硬膜和胸骨内注射和输液。
     在一个实施方案中， 抗 CD20 抗体药物组合物通过静脉内或皮下注射或输液进行 给药。例如， 药物组合物可以在 2-8 小时， 比如 4 小时期间给药， 从而减少副作用。
     在一个实施方案中， 抗 CD 抗体药物组合物通过吸入进行给药。 抗 CD20 抗体的 Fab 片段可能适合这种给药途径， 参见 Crowe et al.(February 15， 1994)Proc Natl Acad Sci
     USA， 91(4) ： 1386-1390。
     在一个实施方案中， 抗 CD20 抗体药物组合物是以晶体形式通过皮下注射进行给 药的， 参见 Yang et al.， PNAS USA 100(12)， 6934-6939(2003)。
     药物可接受载体包括任何和全部合适的溶剂、 分散介质、 包衣、 抗细菌和抗真菌 剂、 等渗剂、 抗氧化剂和吸收延缓剂等等与本发明的化合物生理相容的物质。
     可以应用在本发明的药物组合物中的水和非水载体的合适例子包括水、 盐水、 磷 酸盐缓冲液、 乙醇、 右旋糖、 多醇 ( 比如甘油、 丙二醇、 聚乙二醇等 )、 和它们的合适混合液、 蔬菜油 ( 比如橄榄油、 玉米油、 花生油、 棉籽油和芝麻油 )、 羧甲基纤维素胶质溶液、 黄蓍胶 和可注射用的有机酯 ( 比如油酸乙酯 ) 和 / 或各种缓冲液。 其他载体也是药学领域公知的。
     药物可接受载体包括无菌水溶液或悬液以及用于即时制备无菌注射液或悬液的 无菌粉末。用于药物活性物质的这类介质和试剂是本领域已知的。除非任何常规介质或试 剂与活性化合物不相容， 都可以考虑将它们用在本发明的药物组合物中。
     适当的流动性可以借助诸如卵磷脂的包衣材料 ； 在悬浮液的情况中通过保持需要 的颗粒大小 ； 以及利用表面活性剂来维持。
     含有抗 CD20 抗体的药物组合物还可以包含药物可接受抗氧化剂， 例如 (1) 水溶性 抗氧化剂， 比如抗坏血酸、 盐酸半胱氨酸、 硫酸氢钠、 焦亚硫酸钠、 亚硫酸钠等 ； (2) 油溶性 抗氧化剂， 比如抗坏血酸棕榈酸盐、 叔丁基羟基茴香醚 (BHA)、 二叔丁基对甲酚 (BHT)、 卵磷 脂、 没食子酸丙酯、 α- 生育酚等 ； 和 (3) 金属螯合剂， 比如柠檬酸、 乙二胺四乙酸 (EDTA)、 山 梨醇、 酒石酸、 磷酸等。 含有抗 CD20 抗体的药物组合物还可以在组合物中包含等渗剂， 比如糖 ； 诸如甘露 醇、 山梨醇、 甘油的多醇或者氯化钠。
     药物可接受稀释剂包括盐水和水缓冲液。
     含有抗 CD20 抗体的药物组合物还可以含有适合选中给药途径的一或多种助剂， 比如能够延长药物组合物的保存期或效率的防腐剂、 润湿剂、 乳化剂、 分散剂、 防腐剂或缓 冲剂。本发明的抗 CD20 抗体可以例如与乳糖、 蔗糖、 粉末 ( 例如淀粉 )、 烷酸酯纤维素、 硬 脂酸、 滑石、 硬脂酸镁、 氧化镁、 钠和钙的磷酸和硫酸盐、 阿拉伯胶、 明胶、 海藻酸钠、 聚乙烯 吡咯烷酮和 / 或聚乙烯醇混合。助剂的其他例子有 QS21、 GM-CSF、 SRL-172、 二盐酸组胺、 胸腺卡汀 (thymocartin)、 Tio-TEPA、 单磷酰 - 脂质 A/ 微生物组合物、 明矾、 不完全弗氏 佐剂、 Montanide ISA、 Ribi 佐剂系统、 TiterMax 佐剂、 Syntex 佐剂制剂、 免疫刺激复合体 (ISCOMs)、 Gerbu 佐剂、 CpG 寡脱氧核苷酸、 脂多糖和聚肌苷酸胞苷酸。
     微生物的预防可以通过灭菌过程和加入各种抗细菌和抗真菌剂来保证， 例如对羟 基苯甲酸酯、 氯丁醇、 苯酚、 山梨酸等。此外， 通过加入能够延缓吸收的试剂， 比如单硬脂酸 铝和明胶可以使得可注射药物形式的吸收延长。
     含有抗 CD20 抗体的药物组合物可以处于多种适合的形式。这些形式包括， 例如液 态、 半液态和固态剂量形式， 比如液体溶液 ( 例如， 可用于注射和输液的溶液 )、 分散液或悬 浮液、 乳液、 微乳液、 胶、 霜剂、 颗粒剂、 粉末、 片剂、 丸剂、 粉末、 脂质体、 树状大分子和其他纳 米颗粒 ( 参见例如 Baek et al.， Methods Enzymol.362， 240-9(2003)， Nigavekar et al.， Pharm Res.21(3)， 476-83(2004))、 微粒和栓剂。
     最佳形式取决于选中的给药模式和组合物的性质。 剂型可以包括例如粉末、 糊剂、
     膏剂、 凝胶剂、 蜡、 油、 脂、 含脂 ( 阳离子或阴离子型 ) 媒介、 DNA 偶联体、 无水吸收膏剂、 水包 油和油包水乳剂、 碳蜡乳剂 ( 各种分子量的聚乙二醇 )、 含有碳蜡的半固态胶和半固态混合 物。任何以上剂型都适合本发明所述的治疗和疗法， 只要药物组合物中的抗 CD20 抗体不被 成剂过程失活并且剂型与给药途径生理相容和耐受。 与药物化学家已知的赋形剂和载体相 关的其他信息还可参见 Powell et al.，″ Compendium of excipients for parenteral formulations″ PDA J Pharm Sci Technol.52， 238-311(1998) 和本文中的引用。
     抗 CD20 抗体可以与能够保护它不被快速释放的载体一起制备比如控释剂型， 包 括植入物、 透皮贴剂和微囊化的递送系统。这类载体可以包括明胶、 单硬脂酸甘油、 二硬脂 酸甘油、 生物可降解 / 生物相容的聚合物 ( 比如乙烯醋酸乙烯共聚物、 聚酣、 聚乙醇酸、 胶 原蛋白、 多正酯类和聚乳酸单独或与蜡一起 )， 或其他本领域已知的物质。制备这类制剂 的方法是本领域技术人员已知的。参见例如 Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems， J.R.Robinson， ed.， Marcel Dekker， Inc.， New York， 1978。
     为了按照发明， 将含有抗 CD20 抗体的药物组合物通过某种给药途径进行给药， 可 能有必要将抗 CD20 抗体包被上防止它被失活的物质， 或者与所述物质共同给予。例如， 可 以将抗 CD20 抗体放在合适的载体中给予受试者， 例如， 脂质体或稀释剂。脂质体包括水包 油包水 CGF 乳液和常规的脂质体 (Strejan et al.， J.Neuroimmunol.7， 27(1984))。
     根据给药途径， 可以将抗 CD20 抗体包被在某物质中保护抗体免于酸和其他会 使化合物失活的天然条件的作用。例如， 可以将抗 CD20 抗体放在合适的载体， 例如脂质 体中给予受试者。脂质体包括水包油包水 CGF 乳液和常规的脂质体 (Strejan et al.， J.Neuroimmunol.7， 27(1984))。
     用于肠胃外给药的药物可接受载体包括无菌水溶液或悬浮液和用于即时制备无 菌注射液或悬液的无菌粉末。用于药物活性物质的这类介质和试剂是本领域已知的。除 非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容， 都可以考虑将它们用在本发明的药物组合物 中。额外的活性化合物也可以并入组合物中。
     用于注射的药物组合物一般必须是无菌的， 并且在制造和保存条件下保持稳定。 组合物可以配制成溶液、 微乳剂、 脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。 载体可以是水 或非水溶剂或者含有诸如水、 乙醇、 多元醇 ( 比如甘油、 丙二醇、 聚乙二醇等 ) 及其合适混合 物的分散介质、 诸如橄榄油的蔬菜油、 和注射可用的有机酯， 比如油酸乙酯。适当的流动性 可以借助诸如卵磷脂的包衣材料 ； 在悬浮液的情况中通过保持需要的颗粒大小 ； 以及利用 表面活性剂来维持。许多情况中， 组合物中优选包含等渗剂， 例如糖、 多元醇 ( 比如甘油、 甘 露醇、 山梨醇 ) 或氯化钠。通过在组合物中加入能够延缓吸收的试剂， 例如单硬脂酸盐和明 胶可以使得注射用组合物的吸收得以延长。 无菌注射用溶液的制备可以通过将所需量的活 性化合物与如上列举的一种成分或者成分的组合并入合适的溶剂中， 然后按照需要进行微 过滤灭菌。
     通常， 分散液是通过将活性化合物并入含有基本分散介质和所需其他成分 ( 例如 以上列举的 ) 的无菌媒介中制备的。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况中， 制备方 法的例子是真空干燥和冷冻干燥 ( 冻干 )， 所述方法从先前的无菌过滤溶液得出活性成分 加上任何其他需要的成分的粉末。
     无菌注射用溶液的制备可以通过将所需量的活性化合物与如上列举的一或多种成分并入合适的溶剂中， 然后按照需要进行微过滤灭菌而制得。 通常， 分散液是通过将活性 化合物并入含有基本分散介质和所需其他成分 ( 例如以上列举的 ) 的无菌媒介中制备的。 在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况中， 制备方法的例子是真空干燥和冷冻干燥 ( 冻 干 )， 所述方法从先前的无菌过滤溶液得出活性成分加上任何其他需要的成分的粉末。
     本发明还可以在不脱离发明的精神或关键属性的情况下， 体现为其他具体形式， 相应地， 表明发明范围的应当是所附权利要求， 而非以上说明书或下文的实施例。
     用于本文， 名词 “载体” 是指稀释剂、 助剂、 赋形剂或治疗剂与之一起给药的媒介。
     “分离的” 意味着 “被人力” 从其天然状态改变， 即如果它是天然存在的， 它已经被 改变或脱离原来的环境， 或者是这两种情况同时发生。 例如， 活生物体中天然存在的多核苷 酸或多肽不是 “分离的” ， 但正如该名词在本文的使用， 相同的多核苷酸或多肽与天然状态 下和它共存的至少一种细胞物质分开了就是 “分离的” 。 而且， 通过转化、 基因操纵或任何其 他重组方法引入生物体的多核苷酸或多肽是 “分离的” ， 即使它仍存在于所述可能是有活力 或者没有活力的生物体中。
     用于本文， 名词 “药物” 包括本发明的兽医学应用。名词 “治疗有效量” 是指能够 减轻指定状况的治疗剂用量。
     用于本文， 名词 “药物可接受” 意味着被联邦或州政府的管理机构批准， 或者列在 美国药典或其他公认的药典中可以用于动物， 特别是人中。
     为了避免疑问， 在一个实施方案中， 苯达莫司汀与抗 CD20 抗体的给药是交错给 药， 其中交替给予苯达莫司汀和抗 CD20 抗体。为了避免疑问， 在交错给药中， 可以首先给予 苯达莫司汀或者抗 CD20 抗体。
     实施例 1.oftatumumab/ 苯达莫司汀组合给药的非限制性实施例
     为了治疗耐受利妥昔单抗的滤泡性淋巴瘤， 在一个实施方案中， ofatumumab 经 i.v. 给药， 第 1 轮中， 第1天1： 300mg， 第8天： 1000mg ； 之后在第 2 到第 6 轮中， 第1天 2 1000mg ； 苯达莫司汀在第 1 到第 6 轮， 每 28 天的第 1 和第 2 天给予 60-120mg/m ( 每轮是每
     28 天 )。 在另一个实施方案中， ofatumumab 经 i.v. 给药， 第 1 轮中， 第1天 ： 300mg， 第8天 ： 1000mg ； 之后在第 2 到第 6 轮中， 第 1 天 1000mg( 对 ofatumuamb， 每轮是每 28 天 ) ； 苯达莫 2 司汀在第 1 到第 8 轮， 每 21 天的第 1 和第 2 天给予 60-120mg/m ( 对苯达莫司汀， 每轮是每 21 天 )。
     在另一个实施方案中， ofatumumab 经 i.v. 给药， 第 1 轮中， 第1天 ： 300mg， 第8天 ： 1000mg ； 之后在第 2 到第 6 轮中， 第 1 天 1000mg ； 苯达莫司汀在第 1 到第 6 轮， 每 28 天的第 2 1 和第 2 天给予 90mg/m ( 每轮是每 28 天 )。
     在另一个实施方案中， ofatumumab 经 i.v. 给药， 第 1 轮中， 第1天 ： 300mg， 第8天 ： 1000mg ； 之后在第 2 到第 6 轮中， 第 1 天 1000mg( 对 ofatumuamb， 每轮是 28 天 ) ； 苯达莫司汀 2 在第 1 到第 8 轮， 每 21 天的第 1 和第 2 天给予 120mg/m ( 对苯达莫司汀， 每轮是每 21 天 )。
     另一实施方案中， 结束 6 轮 ofatumumab 给药 ( 每轮是每 28 天 ) 后， 可以进一步每 2 个月给予 ofatumumab 1000mg， 给 2 年。
     另一实施方案中， 结束 6 轮 ofatumumab 给药 ( 每轮是每 28 天 ) 后， 可以进一步每 2 个月给予 ofatumumab 2000mg。
     另一实施方案中， 结束 6 轮 ofatumumab 给药 ( 每轮是 28 天 ) 后， 可以进一步每 2 个月给予 ofatumumab 500mg。
     另一实施方案中， 结束 6 轮 ofatumumab 给药 ( 每轮是 28 天 ) 后， 可以进一步每个 月或者每 3 个月给予 ofatumumab 500mg、 1000mg 或 2000mg。
     另一实施方案中， 结束 6 轮 ofatumumab 给药 ( 每轮是 28 天 ) 后， 可以进一步每 2 个月给予 ofatumumab 300-2000mg， 给两年。
     另一实施方案中， 结束 6 轮 ofatumumab 给药 ( 每轮是 28 天 ) 后， 可以进一步每 2 个月给予受试者 ofatumumab 300-2000mg， 给两年， 以达到完全消退 (complete remission， CR)、 部分消退 (partial remission， PR) 或病情稳定 (stable disease， SD)。
     实施例 2 显示 ofatumumab 和苯达莫司汀在 CLL 模型中的治疗效果的体内研究
     因为瑞图宣和 ofatumumab 是抗人抗体， 它们需要利用 Invitrogen 的 Zenon 标记 试剂盒 (Z-25455) 直接标记上荧光标签。在 PBS 中准备 1 微克各种抗体， 向抗体溶液中加 入 5 微升 Zenon 人 IgG 标记试剂 (Component A)。将混合液在室温下温育 5 分钟， 然后向 反应混合液中加入 5 微升 Zenon 封闭试剂 (Component B)。室温下再过 5 分钟， 复合体即 可以使用。将 5x106 细胞 /ml 活 JVM-3 细胞重悬在 PBS 中。每个试管中加入 100ul 细胞。 加入 10ul 人 IgG 封闭非特异性结合。将细胞和人 IgG 温育 10 分钟。10ul 每种荧光标记 的抗 CD20 抗体加入合适的试管中 ( 瑞图宣、 Ofatumumab 和 BDBioscience 抗 CD20 抗体克 隆 2H7)。混合液于暗处在冰上再孵育 30 分钟。然后给细胞加入 500ul PBS， 在 1000rpm 离 心 5 分钟。移去上清， 加入 500ulPBS， 将细胞再次离心。再移去上清， 将细胞重悬在 300ul PBS 中。细胞在 BD FACSCanto 上进行分析。
     结论 ：
     来自 BD Bioscience 的直接标记抗 CD20 抗体比瑞图宣或 ofatumumab 抗体结合较 少的细胞表面受体。这可能是由于标记过程的差别。但是， 瑞图宣和 ofatumumab 的标记方 式相同， 而 ofatumumab 比瑞图宣抗体结合的细胞表面受体更多。参见图 2。
     人 B 细胞白血病 JVM-3 细胞系通过一个材料转移协议从 DSMZ(German Collection of Microorganisms and Cell Culture) 获得并被深低温保藏。 从保藏处取得 JVM-3 细胞， 在 37℃的加湿 5％ CO2 培养箱中， 培养在补充了 10％胎牛血清、 1％丙酮酸钠和 1％谷氨酰 胺的 RPMI 1640 培养基中。CB.17-SCID 雌性小鼠在侧腹处接受皮下注射 4x106 个 JVM-3 细 胞。每周两次用卡尺测量肿瘤直径， 肿瘤体积用公式体积＝宽度 2x 长度 /2 计算。将小鼠 随机分到治疗组中， 在移植后第 14 天当肿瘤达到平均体积 66-76mm3 时开始疗法。处理组 接受每周两次 ofatumumab 2mg/kg i.p.( 在第 14、 17 和 21 天 )， 和 / 或在第 15 天注射一次 烷化剂苯达莫司汀 50mg/kg i.v.。 肿瘤体积数据用 Prism GraphPad 软件作图， 统计计算采用单向 ANOVA 进行， 然后做 Bonferroni 多重比较检验。
     结论 ：
     本申请要求 2009 年 1 月 16 日提交的美国专利申请序列号 61/145210 的优先权， 该申请通过引用全文并入本文。
    【发明领域】
     本发明涉及苯达莫司汀 (bendamustine) 与抗 CD20 抗体的组合在治疗癌症中的用途。 发明背景
     惰性非霍奇金淋巴瘤 (Indolent Non-Hodgkin′ s Lymphomas， IL) 是缓慢生长形 式的淋巴瘤。其涵盖工作方案 (Working Formulation) 中被称为低度和某些中度恶性类别 的 NHL。如果患者未能在非常早期和低度疾病时被治愈， 治疗目的在于缓解。FL 在美国和 欧洲是第二常见的淋巴瘤， 占所有非霍奇金淋巴瘤 (NHL) 的 11％到 35％ [WHO 2001]。 滤泡 性淋巴瘤 (FL) 属于惰性淋巴瘤组， 是成熟 ( 周边 )B 细胞肿瘤的亚组 [WHO 2001]。它被定
     义为生发中心 B 细胞 ( 中心细胞和中心母细胞 ) 淋巴瘤， 其具有至少部分的滤泡模式。
     虽然用基于利妥昔单抗 (rituximab) 的疗法可以很好地治疗惰性淋巴瘤， 但那些 对利妥昔单抗变得耐受的淋巴瘤则选择有限。苯达莫司汀是一种合成氮芥化合物， 表现出 对耐利妥昔单抗的惰性淋巴瘤的治疗活性并且在耐其他烷基化剂 (alkylators) 的受试对 象中显示出活性。但是， 在耐受这些早期疗法的受试对象中尤其需要替代的疗法。
     近来有许多关于新一代抗 CD20 抗体的报道。 其中一种这类新抗体是 ofatumumab。 Ofatumumab 是新一代人单克隆抗体， 其靶向 B 细胞表面 CD20 分子的独特膜近侧小的环形 表位 ( 特异结合位点 )。这一靶向导致出色地诱导出肿瘤细胞经 CDC( 补体依赖型细胞 毒 ) 活性被裂解， 特别是在具有低 CD20 密度的细胞中， 正如 CLL 的情况中， 与使用利妥昔 单抗观察到的肿瘤细胞裂解能力相比， 具有类似的 ADCC( 抗体依赖性细胞介导的细胞毒 ) 活性。在 WO2004/035607 中被描述为 2F2 抗体的 Ofatumumab 正在用于治疗非霍奇金淋巴 瘤 (NHL)、 慢性淋巴细胞白血病 (CLL) 和类风湿性关节炎的临床开发阶段 (RA)。还可参见 Teeling et al.， Blood， 104， pp 1793(2004) ； 和 Teeling et al.， J.Immunology， 177， pp 362-371(2007)。
     发明概述
     在一个实施方案中， 本发明涉及治疗任何表达 CD20 的癌症 ( 肿瘤 ) 的方法， 所述 癌症包括人患者中的前体 B 和 T 细胞肿瘤、 成熟 B 细胞肿瘤、 霍奇金淋巴瘤以及免疫缺陷相 关的淋巴增生性失调， 方法包括将抗 CD20 抗体与苯达莫司汀组合给予患者的步骤。在一个 实施方案中， 给药是同时进行的。在另一个实施方案中， 给药是顺序进行的， 其中首先给予 苯达莫司汀。再一个实施方案中首先给予抗 CD20 抗体。还有一个实施方案中， 给予抗 CD20 抗体和苯达莫司汀是交错进行的。
     在一个实施方案中， 发明涉及治疗人患者中耐利妥昔单抗的惰性非霍奇金淋巴瘤 ( 包括 FL( 滤泡性淋巴瘤 )) 的方法， 方法包括将抗 CD20 抗体与苯达莫司汀组合给予患者的步骤。在一个实施方案中， 给药是同时进行的。在另一个实施方案中， 给药是顺序进行的， 其中首先给予苯达莫司汀。再一个实施方案中首先给予抗 CD20 抗体。还有一个实施方案 中， 给予抗 CD20 抗体和苯达莫司汀是交错进行的。
     在一个实施方案中， 发明涉及包含苯达莫司汀和抗 CD20 抗体的药物组合物， 其中 组合适合单独、 顺序和 / 或同时给药。
     在一个实施方案中， 抗 CD20 抗体是分离的人抗 CD20 抗体， 该抗体结合 CD20 上的 一个表位， 它不包含或者需要位点 172 上的氨基酸残基脯氨酸， 但是包含或者需要位点 163 上的氨基酸残基天冬氨酸和位点 166 的天冬氨酸。可以在 WO2004/035607 中找到这类抗体 的实例。
     在另一个实施方案中， 抗 CD20 抗体是 ofatumuamb。
     在一个实施方案中， 发明涉及抗 CD20 抗体， 特别是 ofatumumab 在制备治疗癌症 ( 特别是耐利妥昔单抗的惰性非霍奇金淋巴瘤 ) 的药物中的用途， 其中所述药物是用于在 和苯达莫司汀的联合治疗中给予。
     在一个实施方案中， 发明涉及用于与苯达莫司汀组合治疗癌症 ( 特别是耐利妥昔 单抗的惰性非霍奇金淋巴瘤 ) 的抗 CD20 抗体 ( 特别是 ofatumuamb)。
     附图简述
     图 1 描述了 ofatumumab/ 苯达莫司汀给药的一个非限制性实例。
     图 2 描述了 CD20 在 JVM-3 细胞上的中等水平表达谱。第一个峰 ： Mab 对照 ； 第 二个峰 ： BD Bioscience 抗 CD20 抗体克隆 2H7 ； 第三个峰 ： 瑞图宣 (rituxan) ； 第四个峰 ： ofatumumab。
     图 3 描述了亚适量的 ofatumumab/ 苯达莫司汀组合的优势 (ofatumumab ： 2mg/kg& 苯达莫司汀 50mg/kg ； n ＝ 6/ 组 )
     图 4 描述了 JVM3(CLL) 模型中的 ofatumumab 和苯达莫司汀 (TREANDA) 组合 ( 皮 下， 24 天 ； n ＝ 6/ 组 )
     发明详述
     滤泡性淋巴瘤治疗策略致力于建立最大程度的疾病控制和延长寿命。 已经超越早 期阶段和组织学低度恶性的晚期疾病仍是不可治愈的。在实现有效治疗而没有毒性之间 存在着平衡。因此， 仍需要副作用有限的有效疗法用于治疗多数 FL 受试对象， 特别是那些 对烷化剂、 嘌呤类似物和利妥昔单抗变得耐受的受试对象。Ofatumumab 在利妥昔单抗抗性 受试对象中显示了活性 [Hagenbeek， et al.Blood 2008 ； 111 ： 5486-5495]， 而苯达莫司汀 在烷化剂和嘌呤类似物抗性受试对象中表现出活性 [ et al.， Ann Oncol.2000 ； 11 ： 729-734 ； Solal-Celigny et al.， Blood.2004 ； 104 ： 1258-1265 ； Heider et al.， Anticancer Drugs.2001 ； 12 ： 725-729 ； Bremer K.， J Cancer Res Clin Oncol 2002 ； 128 ： 603-609 ； Friedberg et al.， J Clin Oncol.2008 ； 26 ： 204-210]。ofatumumab 和苯达莫司 汀的联用给对其他治疗模式已经耐受的受试对象提供了效力与低毒性的结合。
     本发明涉及治疗人患者中利妥昔单抗耐受的惰性非霍奇金淋巴瘤， 包括 FL( 滤泡 性淋巴瘤 ) 的方法， 所述方法包括将抗 CD20 抗体与苯达莫司汀组合给予患者的步骤。在 一个实施方案中， 给药是同时进行的。在另一个实施方案中， 给药是顺序进行的， 其中首先 给予苯达莫司汀。再一个实施方案中首先给予抗 CD20 抗体。还有一个实施方案中， 给予抗CD20 抗体和苯达莫司汀是交错进行的。
     本发明还涉及治疗人患者中表达 CD20 的肿瘤类型的方法， 所述方法包括将抗 CD20 抗体与苯达莫司汀组合给予患者的步骤。在一个实施方案中， 给药是同时进行的。在 另一个实施方案中， 给药是顺序进行的， 其中首先给予苯达莫司汀。 再一个实施方案中首先 给予抗 CD20 抗体。 还有一个实施方案中， 给予抗 CD20 抗体和苯达莫司汀是交错进行的。 表 达 CD20 的肿瘤类型的实例包括选自前体 B 或 T 细胞肿瘤、 成熟 B 细胞肿瘤、 霍奇金淋巴瘤 或者免疫缺陷相关的淋巴增生性失调的肿瘤。
     实施例 1 中示范了苯达莫司汀和 ofatumuamb 的非限制性用药方式。
     本发明还涉及癌症的治疗方法， 所述方法包括将 ofatumuamb 和苯达莫司汀给 予人患者的步骤， 所述癌症选自 NHL(non-Hodgkin’ s lymphoma， 非霍奇金淋巴瘤 )、 B细 胞 淋 巴 母 细 胞 白 血 病 / 淋 巴 瘤 (B cell lymphoblastic leukemia/lymphoma)、 成熟 B 细胞肿瘤 (mature B cell neoplasms)、 B 细胞慢性淋巴细胞白血病 (B cell chronic lymhocytic leukemia， CLL)、 小 淋 巴 细 胞 性 淋 巴 瘤 (small lymphocytic lymphoma， SLL)、 B 细胞幼淋巴细胞白血病 (B cell prolymphocytic leukemia)、 淋巴浆细胞淋巴 瘤 (lymphoplasmacytic lymphoma)、 套细胞淋巴瘤 (mantle cell lymphoma， MCL)、 滤泡 性淋巴瘤 (follicular lymphoma， FL)( 包括低度、 中度和高度恶性 FL)、 皮肤滤泡中心淋 巴瘤 (cutaneous follicle center lymphoma)、 边缘区 B 细胞淋巴瘤 (marginal zone B cell lymphoma ： MALT 型、 节结型和脾型 )、 毛细胞白血病 (hairy cell leukemia)、 弥漫 性大 B 细胞淋巴瘤 (diffuse large B cell lymphoma)、 伯基特氏淋巴瘤 (Burkitt ′ s lymphoma)、 浆细胞瘤 (plasmacytoma)、 浆细胞骨髓瘤 (plasma cell myeloma)、 移植后淋巴 增殖性疾病 (post-transplant lymphoproliferative disorder)、 沃登斯通巨球蛋白血症 (Waldenstrom ′ s macroglobulinemia)、 间变性大细胞淋巴瘤 (anaplastic large-cell lymphoma， ALCL)、 T- 细胞非霍奇金淋巴瘤和黑素瘤。在一个实施方案中， 给药是同时进行 的。在另一个实施方案中， 给药是顺序进行的， 其中首先给予苯达莫司汀。再一个实施方案 中首先给予抗 CD20 抗体。还有一个实施方案中， 给予抗 CD20 抗体和苯达莫司汀是交错进 行的。
     利妥昔单抗 (R) 耐受性惰性淋巴瘤 (Rituximab refractory indolent lymphoma) 定义如下。所述淋巴瘤对作为单药治疗给予的或者与任何化疗组合给予的利妥昔单抗耐 受， 或者对利妥昔单抗加化疗之后作为维持治疗给予的利妥昔单抗耐受。 淋巴瘤是耐受的， 如果 ：
     1. 对作为单药疗法或者与任何化疗组合的利妥昔单抗没有至少部分反应 (PR) ； 或者
     2. 使用利妥昔单抗 ( 作为单药治疗给予的或者与任何化疗组合给予的， 或者在 R- 化疗之后的利妥昔单抗维持治疗期间 ) 的同时疾病仍在发展 ； 或者
     3. 在最后一剂利妥昔单抗 ( 作为单药治疗给予的或者与任何化疗组合给予的， 或 者在 R- 化疗之后利妥昔单抗维持治疗方案 ) 后 6 个月之内， 疾病又有进展。
     在发明的一个实施方案中， 抗 CD20 抗体是单克隆抗体。
     在一个实施方案中， 抗 CD20 抗体具有 Fc 介导的效应子功能。
     在一个实施方案中， 抗 CD20 抗体具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒 (ADCC) 效应子功能。 在一个实施方案中， 抗 CD20 抗体具有补体依赖性细胞毒 (CDC) 效应子功能。
     在发明的一个实施方案中， 抗 CD20 抗体是嵌合的、 人源化的或者人单克隆抗体。
     在一个实施方案中， 抗 CD20 的单克隆抗体 ( 抗 CD20 抗体 ) 是选自下述的全长抗 体： 全长 IgG1 抗体、 全长 IgG2 抗体、 全长 IgG3 抗体、 全长 IgG4 抗体、 全长 IgM 抗体、 全长 IgA1 抗体、 全长 IgA2 抗体、 全长分泌型 IgA 抗体、 全长 IgD 抗体和全长 IgE 抗体， 其中所述 抗体在真核细胞中被糖基化。
     在一个实施方案中， 抗 CD20 抗体是全长抗体， 比如全长 IgG1 抗体。
     在 一 个 实 施 方 案 中， 抗 CD20 抗 体 是 抗 体 片 段， 比 如 scFv 或 UniBodyTM(WO 2007/059782 中公开的单价抗体 )。在发明的一个实施方案中， 针对 CD20 的抗体 ( 抗 CD20 抗体 ) 是结合结构域免疫球蛋白融合蛋白， 其包含 (i) 结合结构域多肽， 处于 SEQ ID NO ： 1 的重链可变区形式或者 SEQ ID NO ： 2 对轻链可变区形式， 该多肽与免疫球蛋白铰链区多肽 融合， (ii) 与铰链区融合的免疫球蛋白重链 CH2 恒定区， 以及 (iii) 与 CH2 恒定区融合的 免疫球蛋白重链 CH3 恒定区。
     在一个实施方案中， 抗 CD20 抗体与突变体 P172S CD20( 位点 172 的脯氨酸被突变 为丝氨酸 ) 结合的亲和力至少与和人 CD20 结合的亲和力相同。
    
    
    
    
    在发明的一个实施方案中， 抗 CD20 抗体与 CD20 上的表位结合， 所述表位 (i) 不包含或者不需要位点 172 的氨基酸残基脯氨酸 ； (ii) 不包含或者不需要位点 170 的丙氨酸或者位点 172 的脯氨酸 ； (iii) 不包含或者不需要位点 163 的氨基酸残基天冬氨酸和位点 166 的天冬氨酸； (iv) 不包含或者不需要位点 172 的氨基酸残基脯氨酸， 但是包含或者需要位点 163 的氨基酸残基天冬氨酸和位点 166 的天冬氨酸 ； 或者
     (v) 不包含或者不需要位点 170 的氨基酸残基丙氨酸或位点 172 的脯氨酸， 但是包 含或者需要位点 163 的天冬氨酸和位点 166 的天冬氨酸这些氨基酸残基。
     在一个实施方案中， 抗 CD20 抗体结合位于人 CD20 的第一个小胞外环中的表位。
     在一个实施方案中， 抗 CD20 抗体结合 CD20 上的不连续表位。
     在一个实施方案中， 抗 CD20 抗体结合 CD20 上的不连续表位， 其中所述表位包含第 一个小胞外环的一部分和第二个胞外环的一部分。
     在一个实施方案中， 抗 CD20 抗体结合 CD20 上的不连续表位， 其中所述表位含有第 一个小胞外环的 AGIYAP 残基和第二个胞外环的 MESLNFIRAHTPYI 残基。
     在一个实施方案中， 抗 CD20 抗体具有选自下述的一或多个特征 ：
     (i) 能够在有补体的情况下， 诱导表达 CD20 的细胞的补体依赖性细胞毒 (CDC) ；
     (ii) 能够在有补体的情况下， 诱导表达 CD20 和高水平 CD55 和 / 或 CD59 的细胞的 补体依赖性细胞毒 (CDC) ；
     (iii) 能够诱导表达 CD20 的细胞的细胞凋亡 ；
     (iv) 能够在有效应细胞的情况下， 诱导表达 CD20 的细胞的抗体依赖性细胞毒 (ADCC) ；
     (v) 能够诱导表达 CD20 的细胞的同型粘附 ；
     (vi) 能够在结合 CD20 后迁移到脂膜筏 (lipid rafts) ； (vii) 能够消除表达 CD20 的细胞 ； (viii) 能够消除表达低水平 CD20 的细胞 ( 低 CD20 细胞 ) ； 以及 (ix) 能够在人组织中有效地原位消除 B 细胞。 在发明的一个实施方案中， 抗 CD20 抗体包含选自 SEQ ID NOs ： 5、 9 或 11 的 VH CDR3序列。 在一个实施方案中， 抗 CD20 抗体包含 SEQ ID NO ： 3 的 VH CDR1、 SEQ ID NO ： 4的 VH CDR2、 SEQ ID NO ： 5 的 VH CDR3、 SEQ ID NO ： 6 的 VL CDR1、 SEQ ID NO ： 7 的 VL CDR2 和 SEQ ID NO ： 8 的 VL CDR3 序列。
     在发明的一个实施方案中， 抗 CD20 抗体包含 SEQ ID NO ： 10 的 VH CDR1-CDR3 跨越 序列。
     在发明的一个实施方案中， 抗 CD20 抗体含有人重链和人轻链可变区， 所述可变区 包含分别如 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 2 所示的氨基酸序列 ； 或者包含分别与 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 2 所示的氨基酸序列有至少 95％同一性， 更优选至少 98％， 或者至少 99％ 同一性的氨基酸序列。
    在 发 明 的 一 个 实 施 方 案 中， 抗 CD20 抗 体 选 自 WO 2004/035607 中 公 开 的 抗 CD20 抗 体 之 一， 比 如 ofatumumab(2F2)、 11B8 或 7D8 ； WO 2005/103081 中 公 开 的 抗 体 之 一， 比 如 2C6 ； WO 2004/103404 中 公 开 的 抗 体 之 一， AME-133( 由 Applied Molecular Evolution 开发的人源化和优化抗 CD20 单克隆抗体 ) ； US2003/0118592 中公开的抗体 之 一， TRU-015(CytoxB20G， 由 Trubion Pharmaceuticals Inc 开 发 的 来 源 于 抗 CD20 抗 体 上 的 关 键 结 构 域 的 小 分 子 immunopharmaceutical 融 合 蛋 白 ) ； WO 2003/68821 中 公 开 的 抗 体 之 一 IMMU-106( 人 源 化 抗 CD20 单 克 隆 抗 体 ) ； WO 2004/56312 中 公 开 的 抗 体 之 一， ocrelizumab(2H7.v16， PRO-70769， R-1594)、 (tositumomab) 和 ( 利妥昔单抗 )。名词 “CD20” 和 “CD20 抗原” 在文中可互换使 用， 包括由细胞天然表达的或者转染了 CD20 基因的细胞上表达的人 CD20 的任何变体、 同种 型和物种同源物。本领域认可的 CD20 的同义词包括 B- 淋巴细胞表面抗原 B1、 Leu-16 和 Bp35。人 CD20 的 UniProtKB/Swiss-Prot 登记号为 P11836。
     用于本文， 名词 “免疫球蛋白” 是指一类结构相关的糖蛋白， 其由两对多肽链构成， 即一对低分子量轻 (L) 链和一对重 (H) 链， 这四条链通过二硫键相连。 免疫球蛋白的结构已 研究清楚。参见例如 Fundamental Immunology Ch.7(Paul， W.， ed.， 2nd ed.Raven Press， N.Y.(1989))。简单来说， 每个重链通常由重链可变区 ( 文中缩写为 VH) 和重链恒定区。重 链恒定区 CH 一般由三个结构域构成， CH1、 CH2 和 CH3。每个轻链通常由轻链可变区 ( 文中 缩写为 VL) 和轻链恒定区构成。轻链恒定区一般由一个结构域 CL 构成。VH 和 VL 区可以进 一步分成高度可变的区域 ( 或者结构明确的环的序列和 / 或形式高度可变的区域 )， 又称为 补体决定区 (CDRs)， 散布于被称为框架区 (FR) 的更保守区域中。
     每个 VH 和 VL 通常由三个 CDRs 和四个 FRs 构成， 从氨基端到羧基端以如下顺序排 列： FR1、 CDR1、 FR2、 CDR2、 FR3、 CDR3、 FR4( 还可参见 Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196， 901-917(1987))。 通 常， 这 个 区 域 的 氨 基 酸 残 基 的 编 号 按 照 Kabat et al， Sequences of Proteins of Immunological Interest， 5th Ed.Public Health Service， National
     Institutes of Health， Bethesda， MD.(1991) 中描述的方法进行 ( 文中诸如 “Kabat 中或 者根据 Kabat 的可变结构域残基编号” 的短语是指用于重链可变结构域或轻链可变结构域 的该编号系统 )。 采用这种编号系统， 肽的实际线性氨基酸序列可能含有减少的或者增加了 的氨基酸， 对应着缩短了的或者含有插入的可变结构域 FR 或 CDR。例如， 重链可变结构域 可能包含在 VH CDR2 残基 52 后面的单个氨基酸插入 ( 例如， 根据 Kabat， 残基 52a)， 和重链 FR 残基 82 后面的插入残基 ( 例如， 根据 Kabat， 残基 82a、 82b 和 82c 等 )。特定抗体的残基 Kabat 编号可以通过将抗体序列的同源区域与 “标准” 的 Kabat 编号序列进行比对来确定。
     用于本文， 名词 “抗体” 是指这样的免疫球蛋白分子， 免疫球蛋白分子片段或者它 们中之一的衍生物， 其具有在典型的生理条件下与抗原特异结合相当一段时间的能力， 比 如结合至少大约 30 分钟、 至少大约 45 分钟、 至少大约一小时、 至少大约两小时、 至少大约四 小时、 至少大约 8 小时、 至少大约 12 小时、 大约 24 小时或更长、 大约 3、 4、 5、 6、 7 或更多天等， 或者其他有关的功能限定的时期 ( 比如足够诱发、 促进、 加强和 / 或调整与抗体结合抗原关 联的生理反应的时间， 和 / 或足够抗体召集 Fc 介导的效应子活性的时间 )。
     免疫球蛋白分子重链和轻链可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。 抗体的恒 定区可能介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合， 包括免疫系统的各种细胞 ( 比如效应 细胞 ) 和补体系统的成分 ( 比如补体活化经典途径中的第一个成分 C1q)。
     抗 CD20 抗体可以是单、 双或多特异性的。的确， 本发明提供的双特异性抗体、 二体 等可以在部分 CD20 之外， 结合任何合适的靶分子。
     正如上文指出的， 除非另有说明或者上下文清楚地与之抵触， 用于本文的名词 “抗 体” 包括通过任何已知技术提供的保留了与抗原特异结合能力的抗体片段， 所述技术是比 如酶解、 肽合成和重组技术。已证实抗体的抗原结合功能可能由全长 ( 完整 ) 抗体的片段 来实现。涵盖在名词 “抗体” 中的抗原结合片段的例子包括， 但不限于 (i)Fab 片段， 由 VL、 VH、 CL 和 CH1 结构域构成的单价片段 ； (ii)F(ab)2 和 F(ab ′ )2 片段、 包含由铰链区二硫 键连接的两个 Fab 片段的二价片段 ； (iii) 基本由 VH 和 CH1 结构域构成的 Fd 片段 ； (iv) 基本由抗体单个臂的 VL 和 VH 结构域构成的 Fv 片段 ； (v)dAb 片段 (Ward et al.， Nature 341， 544-546(1989))， 其基本由 VH 结构域构成， 又称为结构域抗体 (Holt et al.(November 2003)Trends Biotechnol.21(11) ： 484-90) ； (vi)camelid 抗 体 或 纳 米 抗 体 (Revets et al.(January 2005)Expert Opin Biol Ther.5(1) ： 111-24) ； (vii) 分 离 的 互 补 决 定 区 TM (CDR)， 比如 VH CDR3， (viii)UniBody ， WO 2007/059782 中公开的单价抗体 ； (ix) 单链抗 体或单链 Fv(scFv)， 参见例如 Bird et al.， Science 242， 423-426(1988) 和 Huston et al.， PNAS USA 85， 5879-5883(1988)) ； (x) 二体 (scFv 二聚体 )， 可以是单特异性或双特 异性的 ( 关于二体的描述参见例如 PNAS USA 90(14)， 6444-6448(1993)、 EP 404097 或 WO 93/11161)、 三体或四体。虽然这些片段通常包含在抗体的定义中， 它们全部并且每个单独 地是本发明的独特特性， 表现出不同的生物属性和用途。这些和其他对于本发明有用的抗 体片段在文中有进一步讨论。
     应当明白， 名词抗体通常包括单克隆抗体和多克隆抗体。 抗体可以是人的、 人源化 的、 嵌合的、 小鼠的等。所生产的抗体可以具备任何同种型。
     用于本文， 名词 “人抗体” 意图包括含有来自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒 定区的抗体。本发明的人抗体可以包括不是人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基 ( 例如， 通过在体外或体内体细胞突变， 随机或定点突变引入的突变 )。但是， 用于本文的名词 “人抗体” 不包括这样的抗体， 这些抗体中来源于另一个哺乳动物物种 ( 比如小鼠 ) 种系的 CDR 序列被移植到了人框架序列上。
     用于本文， 人抗体如果是利用人免疫球蛋白序列从某系统中获得的， 例如通过给 携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠免疫接种或者通过筛选人免疫球蛋白文库， 并且其中 选中的人抗体与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列有至少 95％、 比如至少 95％、 例如 至少 96％、 比如至少 97％、 例如至少 98％， 或者比如至少 99％的氨基酸序列同一性， 则抗体 是 “来源于” 特定种系序列。一般来说， 来源于特定人种系序列的人抗体会表现出不超过 10 个氨基酸的不同， 比如与种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列有不超过 5 个， 例如不 超过 4、 3、 2、 或 1 个氨基酸不同。对于 VH 抗体序列， VH CDR3 结构域不包括在这种比较中。
     名词 “嵌合抗体” 是指这样的抗体， 所述抗体含有一或多个区域来自一个抗体， 还 有一或多个区域来自一或多个其他抗体。名词 “嵌合抗体” 包括单价、 二价或多价抗体。单 价嵌合抗体是由嵌合 H 链与嵌合 L 链通过二硫键关联起来形成的二聚体 (HL))。二价嵌合 抗体是由两个 HL 二聚体通过至少一个二硫键桥关联起来的四聚体 (H2L2)。多价嵌合抗 体的制备还可以通过例如采用组装到具有 2+ 结合位点的分子 ( 例如来自 IgM H 链或 μ 链 ) 中的 CH 区。一般来说， 嵌合抗体是指这样的抗体， 所述抗体中重链和 / 或轻链的一部 分与来源于特定物种的或者属于特定抗体类型或亚型的抗体中的相应序列是相同或者同 源的， 而链的其他部分与来源于其他物种的或者属于另一个抗体类型或亚型的抗体中的相 应序列是相同或者同源的， 嵌合抗体还包括所述抗体的片段， 只要它们表现出所需的生物 活性 ( 参见例如 US 4,816,567 和 Morrison et al.， PNAS USA 81， 6851-6855(1984))。嵌 合抗体是通过本领域已知的重组过程产生的 ( 参见例如 Cabilly et al.， PNAS USA 81， 3273-3277(1984)、 Morrison et al.， PNAS USA 81， 6851-6855(1984)、 Boulianne et al.， Nature 312， 643-646(1984)、 EP125023、 Neuberger et al.， Nature 314， 268-270(1985)、 EP171496 、 EP173494 、 WO 86/01533 、 EP184187 、 Sahagan et al. ， J.Immunol.137 ， 1066-1074(1986)、 WO 87/02671、 Liu et al.， PNAS USA 84， 3439-3443(1987)、 Sun et al.， PNAS USA 84， 214-218(1987)、 Better et al.， Science 240， 1041-1043(1988) 和 Harlow et al.， Antibodies ： A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， N.Y.， (1988))。
     名词 “人源化抗体” 是指含有最少来源于非人抗体的序列的人抗体。一般来说， 人 源化抗体是这样的人免疫球蛋白 ( 受体抗体 )， 其中来自受体高变区的残基被来自非人物 种 ( 供体抗体， 比如小鼠、 大鼠、 兔或非人灵长类 ) 具有所需特异性、 亲和力和容量的高可变 区残基所替代。
     此外， 人源化抗体可能包含受体抗体或者供体抗体中没有的残基。进行这些改动 是为了进一步优化抗体的性能。通常， 人源化抗体包含至少一个， 一般是两个可变结构域 的基本全部， 其中与非人免疫球蛋白对应的全部或基本全部高变环以及全部或基本全部 FR 区都是人免疫球蛋白序列。人源化抗体任选还包含人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。更 多细节参见 Jones et al.， Nature 321， 522-525(1986)、 Riechmann et al.， Nature 332， 323-329(1988) 和 Presta， Curr.Op.Struct.Biol.2， 593-596(1992)。
     名词 “患者” 指人患者。用于本文， 名词 “单克隆抗体” 或 “单克隆抗体组合物” 是指单分子组合物的抗体 分子制品。单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。相应地， 名 词 “人单克隆抗体” 是指表现出单一结合特异性的含有来源于人种系免疫球蛋白序列的可 变区和恒定区的抗体。可以由包含从转基因或转染色体非人动物 ( 比如转基因小鼠 ) 获得 的 B 细胞的杂交瘤来产生人单克隆抗体， 所述含有包含人重链转基因和轻链转基因的基因 组的 B 细胞与永生细胞融合。
     用于本文， 名词 “重组人抗体” 包括所有通过重组手段制备、 表达、 形成或分离的人 抗体， 比如 (a) 抗体， 所述抗体分离自人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体动物 ( 比如小 鼠 ) 或由此制备的杂交瘤 ( 文中其他地方有进一步描述 )， (b) 抗体， 所述抗体分离自被转 化用于表达抗体的宿主细胞， 比如分离自转染瘤， (c) 抗体， 所述抗体分离自重组、 组合人抗 体文库， 和 (d) 抗体， 所述抗体通过任何其他涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他 DNA 序列上的手段制备、 表达、 形成或分离。 这些重组人抗体含有来源于人种系免疫球蛋白序列 的可变区和恒定区。但是在某些实施方案中， 这些重组人抗体可能接受体外突变 ( 或者， 在 使用人 Ig 序列的转基因动物时， 接受体内体细胞突变 )， 因此重组抗体的 VH 和 VL 区氨基酸 序列， 虽然是来源于并且与人种系 VH 和 VL 序列有关， 但可能并不天然存在于人体内抗体种 系库。
    名词 “转基因的非人动物” 是指这样的非人动物， 所述动物的基因组包含一或多个 人重链和 / 或轻链转基因或转染色体 ( 整合或者没有整合到动物的天然基因组 DNA 中 ) 并 且能够充分地表达人抗体。例如， 转基因小鼠可以含有人轻链转基因和人重链转基因或者 人重链转染色体， 这样小鼠在被免疫接种 CD20 抗原和 / 或表达 CD20 的细胞时会产生人抗 CD20 抗体。人重链转基因可以整合到小鼠的染色体 DNA 中， 象转基因小鼠的情况中， 例如 比如 HCo7 或 HCo12 小鼠 ； 或者人重链转基因可以维持在染色体外， 象 WO 02/43478 中描述的转染色体 的情况。 这类转基因和转染色体小鼠 ( 文中 统称为 “转基因小鼠” ) 能够通过 V-D-J 重组和同种型转换对给定抗原产生多种同种型的人 单克隆抗体 ( 比如 IgG、 IgA、 IgM、 IgD 和 / 或 IgE)。转基因非人动物还可以用于通过引入 编码特定抗体的基因来产生抗特定抗原的该抗体， 例如通过将所述基因与在动物乳汁中表 达的基因可操纵地连接。
     对于氨基酸 ( 多肽 ) 序列而言， 名词 “同一性” 或 “同源性” 表明在有合适的插入 和缺失的情况下， 最佳对位排列和比较时两个氨基酸序列之间的一致程度。两个序列之间 的同一性百分比是所述序列共用的相同位点数目的函数 ( 即％同一性＝相同位点数 / 位点 总数乘以 100)， 并考虑到两序列最佳比对所需要引入的空位数量、 每个空位的长度。 序列的 比较以及确定两个序列之间同一性百分比可以如下所述利用数学算法来实现。
     两个多肽序列之间的同一性百分比可以利用 GCG 软件包中的 GAP 程序， 使用 NWSgapdna.CMP 矩阵和 40、 50、 60、 70 或 80 的空位权重以及 1、 2、 3、 4、 5 或 6 的长度权重来确 定。 两个氨基酸序列之间的同一性百分比还可以利用已被合并到 ALIGN 程序 (2.0 版本 ) 中 的 E.Meyers 和 W.Miller(Comput.Appl.Biosci.， 4： 11-17(1988)) 的算法， 使用 PAM120 残 基权重表、 空位长度罚分 12 和空位罚分 4 来确定。此外， 两个氨基酸序列之间的同一性百 分比可以利用已合并到 GCG 软件包中 GAP 程序里的 Needleman 和 Wunsch(J.Mol.Biol.48 ： 444-453(1970)) 的算法， 使用 Blossum 62 矩阵或 PAM250 矩阵， 16、 14、 12、 10、 8、 6 或 4 的空位权重和 1、 2、 3、 4、 5 或 6 的长度权重来确定。
     举例来说， 多肽序列可能与多肽参照序列 ( 例如 SEQ ID NO ： 1) 相同， 即 100 ％ 同一性 ； 或者可能与参照序列相比， 包含最多某整数个氨基酸改变， 这样％同一性则低于 100％， 比如至少 50、 60、 70、 75、 80、 85、 90、 95、 98 或 99％同一性。这类改变选自至少一个氨 基酸缺失、 取代 ( 包括保守和非保守性取代 ) 或者插入， 其中所述改变可以发生在参照多肽 序列的氨基或者羧基端， 或者末端位点之间的任何地方， 是各自分散在参照序列中的氨基 酸之间或者以一或多个连续群分散在参照序列中。 对于给定％同一性的氨基酸改变数目是 通过将多肽参照序列 ( 例如 SEQ ID NO ： 1) 所编码的多肽序列中的氨基酸总数乘以分别的 百分比同一性 ( 除以 100) 的百分数， 然后从文中描述的多肽参照序列 ( 例如 SEQ ID NO ： 1) 中的所述氨基酸总数中减去该乘积， 或者 ：
     na ≤ xa-(xa·y)，
     其中 na 是氨基酸改变的数目 ； xa 是 SEQ ID NO ： 1 所编码的多肽序列中氨基酸的总 数； y 对 50％是 0.50， 对 60％是 0.60， 对 70％是 0.70， 对 75％是 0.75， 对 80％是 0.80， 对 85％是 0.85， 对 90％是 0.90， 对 95％是 0.95， 对 98％是 0.98， 对 99％是 0.99， 或者对 100％ 是 1.00 ； ·代表乘号， 其中 xa 和 y 的任何非整数乘积在从 xa 中减去之前， 下舍入最近的整 数。 本发明还提供了包含苯达莫司汀的药物组合物 ( 制剂 )。这种组合物包含治疗有 效量的苯达莫司汀， 还可能包含药物可接受载体、 稀释剂或赋形剂。 所述药物载体可以是无 菌液体， 比如水和油， 包括石油、 动物、 蔬菜或合成来源的油， 比如花生油、 豆油、 矿物油、 芝 麻油等。 当药物组合物是静脉内给予时， 可以使用水作为载体。 盐溶液以及右旋糖和甘油水 溶液也可以作为例如注射液的液体载体。 合适的药物赋形剂包括淀粉、 葡萄糖、 乳糖、 蔗糖、 明胶、 麦芽、 大米、 面粉、 白垩、 硅胶、 硬脂酸钠、 甘油单硬脂酸酯、 滑石、 氯化钠、 脱脂奶粉、 甘 油、 丙烯、 乙二醇、 水、 乙醇等。 如果需要， 组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂， 或者 pH 缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、 悬浮液、 乳液、 片剂、 丸剂、 胶囊、 粉剂、 缓释制剂等的形 式。组合物可以用传统的粘合剂和载体 ( 比如甘油三酯 ) 配制成锭剂。口服制剂可以包含 标准载体， 比如药物级的甘露醇、 乳糖、 淀粉、 硬脂酸镁、 糖精钠、 纤维素、 碳酸镁等。合适的 药物载体的例子在 E.W.Martin 的 REMINGTON′ SPHARMACEUTICAL SCIENCES 中有描述。 这类组合物含有通 常是纯化形式的治疗有效量的化合物， 以及适当量的载体来提供适合患者给药的形式。制 剂应当适合给药模式。
     在发明的一个实施方案中， 组合物按照常规过程配制成适合静脉内给予人的药物 组合物。一般来说， 静脉内给药的组合物是溶于无菌等渗缓冲液的溶液。合适的情况中， 组 合物还可以包含稳定剂和局部麻醉剂， 比如利诺卡因来减轻注射部位的疼痛。 通常， 组分是 分开或者混在一起以单位剂量形式提供的， 例如以标明活性剂含量的诸如安瓿或药包的密 封容器中的冻干粉或者无水浓缩物提供。组合物要通过输液给予的情况中， 可以用含有无 菌药物级水或盐水的输液瓶来配药。组合物要通过注射给予的情况中， 可以提供无菌注射 用水或盐水的安瓿， 这样组分可以在给药前进行混合。
     相应地， 苯达莫司汀可以用于制备药剂。本发明的药物组合物可以配制成用于肠 胃外给药的溶液或者冻干粉。粉末可以在使用前， 通过加入合适的稀释剂或其他药物可接 受载体来重配。液体制剂可以是缓冲的等渗水溶液。合适稀释剂的例子是常规的等渗盐溶
     液、 标准 5％葡萄糖水溶液、 或者缓冲的钠或醋酸铵溶液。 这样的制剂尤其适合肠胃外给药， 但也可以用于口服或包含在计量的吸入器或雾化器中用于吸入。 可能希望向这些药物组合 物中加入赋形剂， 比如聚乙烯吡咯烷酮、 明胶、 羟基纤维素、 阿拉伯胶、 聚乙二醇、 甘露醇、 氯 化钠或柠檬酸钠。
     替代地， 可以将苯达莫司汀胶囊化、 成片剂或者制备到乳液或糖浆中用于口服。 可 以添加药物可接受的固态或液态载体来增强或稳定组合物， 或者协助组合物的制备。固态 载体包括淀粉、 乳糖、 二水硫酸钙、 白土、 硬脂酸镁或硬脂酸、 滑石、 果胶、 阿拉伯胶、 琼脂或 明胶。液态载体包括糖浆、 花生油、 橄榄油、 盐水和水。载体还可以包含缓释物质， 比如单独 或者与蜡混合的单硬脂酸甘油或二硬脂酸甘油。固态载体的量可以变化， 但在每剂量单位 大约 20mg 到大约 1g 之间。 药物制品按照常规的药学技术制备， 对片剂形式包括碾磨、 混合、 粒化和压缩 ； 或者对硬的明胶胶囊形式包括碾磨、 混合和填充。使用液态载体时， 制品可以 采取糖浆、 酏剂、 乳液， 或者水性或非水性悬浮液的形式。这种液态制剂可以直接经口给药 ( 口服 ) 或者注入软明胶胶囊。
     苯达莫司汀可以制备为药物组合物， 所述组合物含有处于药物可接受载体中的有 效量作为活性成分的化合物。 本发明的组合物中， 可以采用缓冲到生理 pH、 适合注射用的含 有苯达莫司汀的水性悬浮液或溶液。 用于肠胃外给药的组合物通常包含苯达莫司汀溶液或 者其溶于诸如水性载体的药物可接受载体的混合液。可以应用的水性载体有许多种， 例如 0.4％盐水、 0.3％甘氨酸等。这些溶液是无菌的， 一般不含微粒物质。这些溶液可以通过常 规的公知灭菌技术 ( 例如过滤 ) 来灭菌。根据向生理条件靠拢的需要， 组合物可以含有药 物可接受辅助物质， 比如 pH 调节和缓冲剂等。本发明这种药物制剂中的苯达莫司汀浓度可 以非常不同， 即从重量比低于大约 0.5％， 通常在或者至少大约 1％， 到高达 15 或 20％， 并且 根据选定的给药模式， 主要在液体体积、 粘度等的基础上来选择。
     因此， 用于肌内注射的苯达莫司汀药物组合物可以制备成含有 1mL 缓冲无菌水和 大约 1ng 到大约 100mg 之间的苯达莫司汀， 例如大约 50ng 到大约 30mg， 或者大约 5mg 到大 约 25mg。类似地， 用于静脉内输液的苯达莫司汀药物组合物可以配制成含有大约 250mL 无 菌林格氏液， 以及大约 1mg 到大约 30mg， 或者大约 5mg 到大约 25mg 的苯达莫司汀。制备肠 胃外给药的组合物的实际方法是已知的或者对本领域技术人员是显而易见的， 并且在例如 REMINGTON′ S PHARMACEUTICAL SCIENCE(15th ed.， Mack Publishing Company， Easton， Pennsylvania) 中有更详细描述。
     当苯达莫司汀被制备成药物制品时， 可以处于单位剂量的形式。本领域技术人员 可以容易地确定出适当的治疗有效剂量。如果合适， 这种剂量可以由医师在反应期选择恰 当的时间间隔来反复给予。此外， 任选采用体外检测法来帮助鉴定最佳剂量范围。制剂时 采用的确切剂量还取决于给药途径， 以及疾病或紊乱的严重程度， 应当根据执业医生的判 断和每个患者的情况来决定。可以根据从体外或动物模型测试系统得到的剂量 - 反应曲线 来推出有效剂量。
     对于苯达莫司汀， 给予患者的剂量通常是 0.1mg-100mg/kg 患者体重。给予患者的 剂量可以在 0.1mg 和 20mg/kg 患者体重， 或者替代地， 1mg 到 10mg/kg 患者体重。
     发明还提供了包含一或多个容器的药物包或试剂盒， 所述容器装有苯达莫司汀药 物组合物的一或多种成分。任选与这种容器关联着由规范药物或生物制品的制造、 使用或销售的政府机构发布的简介， 该简介反应了所述机构对用于人类给药的制造、 使用或销售 的批准。在发明的另一个实施方案中， 试剂盒可以与满足治疗特定病征所需要的剂量的适 当数量容器一起提供。
     在另一个实施方案中， 可以在介质， 特别是脂质体中递送苯达莫司汀 ( 参见 Langer， Science 249 ： 1527-1533(1990) ； Treat， et al.， in LIPOSOMES IN THE THERAPY OF INFECTIOUS DISEASE AND CANCER， Lopez-Berestein and Fidler(eds.)， Liss， New York， pp.353-365(1989) ； Lopez-Berestein， ibid.， pp.317-327 ； 总体同前 .)。
     再一个实施方案中， 苯达莫司汀可以在控释系统中递送。在一个实施方案中， 可 以 使 用 泵 ( 参 见 Langer， supra ； Sefton， CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14 ： 201(1987) ； Buchwald ， et al. ， Surgery 88 ： 507(1980) ； Saudek ， et al. ， N.Engl.J.Med.321 ： 574(1989))。 在 另 一 个 实 施 方 案 中， 可 以 使 用 聚 合 物 材 料 ( 参 见 MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE， Langer and Wise(eds.)， CRCPres.， Boca Raton， Fla.(1974) ； CONTROLLED DRUG BIOAVAILABILITY， DRUGPRODUCT DESIGN AND PERFORMANCE， Smolen and Ball(eds.)， Wiley， New York(1984) ； Ranger， et al.， J.， Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23 ： 61(1983) ； 还可参见 Levy， et al.， Science 228 ： 190(1985) ； During， et al.， Ann.Neurol.25 ： 351(1989) ； Howard， et al.， J.Neurosurg.71 ： 105(1989))。再一个实施方案中， 可以将控释系统放置在治疗目标， 即脑的附近， 因此只需要系统剂量的一部分 ( 参见例如 Goodson， in MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE， 同前， vol.2， pp.115-138(1984))。 Langer(Science 249 ： 1527-1533(1990)) 的综述中讨论了其他控释系统。
     苯达莫司汀可以通过任何合适的体内途径进行给药， 并且可以按照需要反复给 予， 例如频率在每日一到三次地给药 1 天到大约三周， 到每周一次或者两周一次。替代地， 可以改变苯达莫司汀减少电荷密度， 从而得到口腔生物利用率。治疗的剂量和持续时间与 发明所述分子在人循环系统中停留时间有关， 可以由本领域技术人员根据患者要治疗的状 况和整体健康情况来调节。
     各种递送系统是已知的， 可以用于苯达莫司汀的给药， 例如包裹在脂质体中、 微颗 粒、 微胶囊、 能够表达化合物的重组细胞、 受体介导的胞吞 ( 参见例如 Wu， et al.， J.Biol. Chem.262 ： 4429-4432(1987))、 将核酸构建为逆转录病毒或其他载体的一部分等。 导入的方 法包括， 但不限于皮内、 肌内、 腹膜内、 静脉内、 皮下、 鼻内、 硬膜和经口途径。苯达莫司汀可 以通过任何方便的途径给予， 例如通过输液或大剂量注射、 通过经表皮或粘膜层 ( 例如口 腔粘膜、 直肠和小肠粘膜等 ) 吸收， 也可以与其他生物活性剂一起给予。给药可以是系统或 局部的。此外， 可能希望将本发明的药物化合物或组合物通过任何合适的途径引入中枢神 经系统， 所述途径包括心室内和椎管内注射 ； 心室内注射可以用心室内导管来协助， 例如接 在贮器， 比如 Ommaya 贮器上的导管。也可以采用肺部给药， 例如借助吸入器或雾化器， 以及 与雾化剂一起成剂。
     抗 CD20 抗体
     具有本领域普通技术的医师或兽医可以很容易地确定包含抗 CD20 抗体的药物组 合物的有效量并处方。例如， 医师或兽医开始可以给予比达到希望治疗效果所需要的剂量 低的药物组合物中应用的发明所述化合物， 然后逐渐增加剂量直到达到希望的效果。 通常， 发明所述组合物的合适每日剂量是足够产生治疗效果的最低剂量的化合物用量。优选， 给药是经静脉内、 肌内、 腹腔内或者皮下。如果需要， 治疗组合物的有效每日剂量可以作为两 个、 三个、 四个、 五个、 六个或更多个亚剂量， 任选以单位剂量形式在一天内以合适的间隔分 别给予。虽然可能将抗 CD20 抗体单独给药， 优选将化合物以药物制剂 ( 组合物 ) 给予。
     在一个实施方案中， 根据发明的人单克隆抗体可以通过输液以每周 10 到 2000mg/ 2 m 的剂量给予， 通常是 10 到 500mg/m2， 比如 200 到 400mg/m2， 比如 375mg/m2。这种给药可以 重复例如 1 到 8 次， 比如 3 到 5 次。给药可以通过持续输液在 2 到 24 小时， 比如 2 到 12 小 时内进行。
     在另一个实施方案中， 抗体通过缓慢连续的输液在长时间内， 比如超过 24 小时给 予， 以便减少毒副作用。
     在再一个实施方案中， 抗体以每周 250mg 到 2000mg 的剂量给药， 比如例如 300mg、 500mg、 700mg、 1000mg、 1500mg 或 2000mg 给予最多 8 次， 比如 4 到 6 次。给药可以通过连续 输液在 2 到 24 小时， 比如 2 到 12 小时的时期内进行。这样的方案可以根据需要在例如 6 个月或 12 个月后重复一或多次。可以通过利用靶向抗 CD20 抗体的抗独特型抗体， 测量给 药后生物样品中循环抗 CD20 抗体的量， 从而确定剂量或对它进行调节。
     还有一个实施方案中， 抗体通过维持疗法给药， 比如例如每周一次进行 6 个月或 更长的时期。 在一个实施方案中， 本发明提供了包含治疗有效量抗 CD20 抗体的药物组合物。所 述药物组合物可以按照比如 Remington ： The Science and Practice of Pharmacy(19th Edition， Gennaro， Ed.， Mack Publishing Co.， Easton， PA， 1995) 中描述的常规技术， 与药 物可接受载体或稀释剂以及其他任何已知助剂和赋形剂一起成剂。 药物组合物可以包含稀 释剂、 填充剂、 盐、 缓冲液、 去污剂 ( 例如， 非离子型去污剂， 比如 Tween-80)、 稳定剂 ( 例如糖 或不含蛋白质的氨基酸 )、 防腐剂、 组织固定剂、 增溶剂和 / 或适合包括在药物组合物中的 其他物质。 药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化从而达到活性成分的量足以在 特定患者、 组合物和给药模式中实现希望的治疗反应， 而对患者没有毒性。 选中的剂量水平 取决于多种药代动力学因素， 包括应用的特定组合物的活性 ； 给药途径 ； 给药时间 ； 使用的 特定化合物的外排速度 ； 治疗时长 ； 与所用特定组合物联用的其他药物 / 化合物和 / 或物 质； 接受治疗的患者的年龄、 性别、 体重、 状况、 整体健康情况和以前的病史， 以及医学领域 已知的其他因素。
     本发明的抗 CD20 抗体可以经任何合适途径给予， 比如口、 鼻、 吸入、 支气管内、 肺 泡内、 局部 ( 包括颊、 透皮和舌下 )、 直肠、 阴道和 / 或肠胃外途径。 在一个实施方案中， 本发 明的药物组合物是经肠胃外给药的。
     用 于 本 文， 短语 “肠 胃 外 给 药 (parenteral administration 和 administered parenterally)” 意味着非肠内和局部给药的给药模式， 通常通过注射， 包括表皮、 静脉内、 肌内、 动脉内、 鞘内、 囊内、 眶内、 心内、 皮内、 腹膜内、 腱内、 经气管、 皮下、 表皮下、 关节内、 囊 下、 蛛网膜下、 椎管内、 颅内、 胸内、 硬膜和胸骨内注射和输液。
     在一个实施方案中， 抗 CD20 抗体药物组合物通过静脉内或皮下注射或输液进行 给药。例如， 药物组合物可以在 2-8 小时， 比如 4 小时期间给药， 从而减少副作用。
     在一个实施方案中， 抗 CD 抗体药物组合物通过吸入进行给药。 抗 CD20 抗体的 Fab 片段可能适合这种给药途径， 参见 Crowe et al.(February 15， 1994)Proc Natl Acad Sci
     USA， 91(4) ： 1386-1390。
     在一个实施方案中， 抗 CD20 抗体药物组合物是以晶体形式通过皮下注射进行给 药的， 参见 Yang et al.， PNAS USA 100(12)， 6934-6939(2003)。
     药物可接受载体包括任何和全部合适的溶剂、 分散介质、 包衣、 抗细菌和抗真菌 剂、 等渗剂、 抗氧化剂和吸收延缓剂等等与本发明的化合物生理相容的物质。
     可以应用在本发明的药物组合物中的水和非水载体的合适例子包括水、 盐水、 磷 酸盐缓冲液、 乙醇、 右旋糖、 多醇 ( 比如甘油、 丙二醇、 聚乙二醇等 )、 和它们的合适混合液、 蔬菜油 ( 比如橄榄油、 玉米油、 花生油、 棉籽油和芝麻油 )、 羧甲基纤维素胶质溶液、 黄蓍胶 和可注射用的有机酯 ( 比如油酸乙酯 ) 和 / 或各种缓冲液。 其他载体也是药学领域公知的。
     药物可接受载体包括无菌水溶液或悬液以及用于即时制备无菌注射液或悬液的 无菌粉末。用于药物活性物质的这类介质和试剂是本领域已知的。除非任何常规介质或试 剂与活性化合物不相容， 都可以考虑将它们用在本发明的药物组合物中。
     适当的流动性可以借助诸如卵磷脂的包衣材料 ； 在悬浮液的情况中通过保持需要 的颗粒大小 ； 以及利用表面活性剂来维持。
     含有抗 CD20 抗体的药物组合物还可以包含药物可接受抗氧化剂， 例如 (1) 水溶性 抗氧化剂， 比如抗坏血酸、 盐酸半胱氨酸、 硫酸氢钠、 焦亚硫酸钠、 亚硫酸钠等 ； (2) 油溶性 抗氧化剂， 比如抗坏血酸棕榈酸盐、 叔丁基羟基茴香醚 (BHA)、 二叔丁基对甲酚 (BHT)、 卵磷 脂、 没食子酸丙酯、 α- 生育酚等 ； 和 (3) 金属螯合剂， 比如柠檬酸、 乙二胺四乙酸 (EDTA)、 山 梨醇、 酒石酸、 磷酸等。 含有抗 CD20 抗体的药物组合物还可以在组合物中包含等渗剂， 比如糖 ； 诸如甘露 醇、 山梨醇、 甘油的多醇或者氯化钠。
     药物可接受稀释剂包括盐水和水缓冲液。
     含有抗 CD20 抗体的药物组合物还可以含有适合选中给药途径的一或多种助剂， 比如能够延长药物组合物的保存期或效率的防腐剂、 润湿剂、 乳化剂、 分散剂、 防腐剂或缓 冲剂。本发明的抗 CD20 抗体可以例如与乳糖、 蔗糖、 粉末 ( 例如淀粉 )、 烷酸酯纤维素、 硬 脂酸、 滑石、 硬脂酸镁、 氧化镁、 钠和钙的磷酸和硫酸盐、 阿拉伯胶、 明胶、 海藻酸钠、 聚乙烯 吡咯烷酮和 / 或聚乙烯醇混合。助剂的其他例子有 QS21、 GM-CSF、 SRL-172、 二盐酸组胺、 胸腺卡汀 (thymocartin)、 Tio-TEPA、 单磷酰 - 脂质 A/ 微生物组合物、 明矾、 不完全弗氏 佐剂、 Montanide ISA、 Ribi 佐剂系统、 TiterMax 佐剂、 Syntex 佐剂制剂、 免疫刺激复合体 (ISCOMs)、 Gerbu 佐剂、 CpG 寡脱氧核苷酸、 脂多糖和聚肌苷酸胞苷酸。
     微生物的预防可以通过灭菌过程和加入各种抗细菌和抗真菌剂来保证， 例如对羟 基苯甲酸酯、 氯丁醇、 苯酚、 山梨酸等。此外， 通过加入能够延缓吸收的试剂， 比如单硬脂酸 铝和明胶可以使得可注射药物形式的吸收延长。
     含有抗 CD20 抗体的药物组合物可以处于多种适合的形式。这些形式包括， 例如液 态、 半液态和固态剂量形式， 比如液体溶液 ( 例如， 可用于注射和输液的溶液 )、 分散液或悬 浮液、 乳液、 微乳液、 胶、 霜剂、 颗粒剂、 粉末、 片剂、 丸剂、 粉末、 脂质体、 树状大分子和其他纳 米颗粒 ( 参见例如 Baek et al.， Methods Enzymol.362， 240-9(2003)， Nigavekar et al.， Pharm Res.21(3)， 476-83(2004))、 微粒和栓剂。
     最佳形式取决于选中的给药模式和组合物的性质。 剂型可以包括例如粉末、 糊剂、
     膏剂、 凝胶剂、 蜡、 油、 脂、 含脂 ( 阳离子或阴离子型 ) 媒介、 DNA 偶联体、 无水吸收膏剂、 水包 油和油包水乳剂、 碳蜡乳剂 ( 各种分子量的聚乙二醇 )、 含有碳蜡的半固态胶和半固态混合 物。任何以上剂型都适合本发明所述的治疗和疗法， 只要药物组合物中的抗 CD20 抗体不被 成剂过程失活并且剂型与给药途径生理相容和耐受。 与药物化学家已知的赋形剂和载体相 关的其他信息还可参见 Powell et al.，″ Compendium of excipients for parenteral formulations″ PDA J Pharm Sci Technol.52， 238-311(1998) 和本文中的引用。
     抗 CD20 抗体可以与能够保护它不被快速释放的载体一起制备比如控释剂型， 包 括植入物、 透皮贴剂和微囊化的递送系统。这类载体可以包括明胶、 单硬脂酸甘油、 二硬脂 酸甘油、 生物可降解 / 生物相容的聚合物 ( 比如乙烯醋酸乙烯共聚物、 聚酣、 聚乙醇酸、 胶 原蛋白、 多正酯类和聚乳酸单独或与蜡一起 )， 或其他本领域已知的物质。制备这类制剂 的方法是本领域技术人员已知的。参见例如 Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems， J.R.Robinson， ed.， Marcel Dekker， Inc.， New York， 1978。
     为了按照发明， 将含有抗 CD20 抗体的药物组合物通过某种给药途径进行给药， 可 能有必要将抗 CD20 抗体包被上防止它被失活的物质， 或者与所述物质共同给予。例如， 可 以将抗 CD20 抗体放在合适的载体中给予受试者， 例如， 脂质体或稀释剂。脂质体包括水包 油包水 CGF 乳液和常规的脂质体 (Strejan et al.， J.Neuroimmunol.7， 27(1984))。
     根据给药途径， 可以将抗 CD20 抗体包被在某物质中保护抗体免于酸和其他会 使化合物失活的天然条件的作用。例如， 可以将抗 CD20 抗体放在合适的载体， 例如脂质 体中给予受试者。脂质体包括水包油包水 CGF 乳液和常规的脂质体 (Strejan et al.， J.Neuroimmunol.7， 27(1984))。
     用于肠胃外给药的药物可接受载体包括无菌水溶液或悬浮液和用于即时制备无 菌注射液或悬液的无菌粉末。用于药物活性物质的这类介质和试剂是本领域已知的。除 非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容， 都可以考虑将它们用在本发明的药物组合物 中。额外的活性化合物也可以并入组合物中。
     用于注射的药物组合物一般必须是无菌的， 并且在制造和保存条件下保持稳定。 组合物可以配制成溶液、 微乳剂、 脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。 载体可以是水 或非水溶剂或者含有诸如水、 乙醇、 多元醇 ( 比如甘油、 丙二醇、 聚乙二醇等 ) 及其合适混合 物的分散介质、 诸如橄榄油的蔬菜油、 和注射可用的有机酯， 比如油酸乙酯。适当的流动性 可以借助诸如卵磷脂的包衣材料 ； 在悬浮液的情况中通过保持需要的颗粒大小 ； 以及利用 表面活性剂来维持。许多情况中， 组合物中优选包含等渗剂， 例如糖、 多元醇 ( 比如甘油、 甘 露醇、 山梨醇 ) 或氯化钠。通过在组合物中加入能够延缓吸收的试剂， 例如单硬脂酸盐和明 胶可以使得注射用组合物的吸收得以延长。 无菌注射用溶液的制备可以通过将所需量的活 性化合物与如上列举的一种成分或者成分的组合并入合适的溶剂中， 然后按照需要进行微 过滤灭菌。
     通常， 分散液是通过将活性化合物并入含有基本分散介质和所需其他成分 ( 例如 以上列举的 ) 的无菌媒介中制备的。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况中， 制备方 法的例子是真空干燥和冷冻干燥 ( 冻干 )， 所述方法从先前的无菌过滤溶液得出活性成分 加上任何其他需要的成分的粉末。
     无菌注射用溶液的制备可以通过将所需量的活性化合物与如上列举的一或多种成分并入合适的溶剂中， 然后按照需要进行微过滤灭菌而制得。 通常， 分散液是通过将活性 化合物并入含有基本分散介质和所需其他成分 ( 例如以上列举的 ) 的无菌媒介中制备的。 在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况中， 制备方法的例子是真空干燥和冷冻干燥 ( 冻 干 )， 所述方法从先前的无菌过滤溶液得出活性成分加上任何其他需要的成分的粉末。
     本发明还可以在不脱离发明的精神或关键属性的情况下， 体现为其他具体形式， 相应地， 表明发明范围的应当是所附权利要求， 而非以上说明书或下文的实施例。
     用于本文， 名词 “载体” 是指稀释剂、 助剂、 赋形剂或治疗剂与之一起给药的媒介。
     “分离的” 意味着 “被人力” 从其天然状态改变， 即如果它是天然存在的， 它已经被 改变或脱离原来的环境， 或者是这两种情况同时发生。 例如， 活生物体中天然存在的多核苷 酸或多肽不是 “分离的” ， 但正如该名词在本文的使用， 相同的多核苷酸或多肽与天然状态 下和它共存的至少一种细胞物质分开了就是 “分离的” 。 而且， 通过转化、 基因操纵或任何其 他重组方法引入生物体的多核苷酸或多肽是 “分离的” ， 即使它仍存在于所述可能是有活力 或者没有活力的生物体中。
     用于本文， 名词 “药物” 包括本发明的兽医学应用。名词 “治疗有效量” 是指能够 减轻指定状况的治疗剂用量。
     用于本文， 名词 “药物可接受” 意味着被联邦或州政府的管理机构批准， 或者列在 美国药典或其他公认的药典中可以用于动物， 特别是人中。
     为了避免疑问， 在一个实施方案中， 苯达莫司汀与抗 CD20 抗体的给药是交错给 药， 其中交替给予苯达莫司汀和抗 CD20 抗体。为了避免疑问， 在交错给药中， 可以首先给予 苯达莫司汀或者抗 CD20 抗体。
    实施例 1.oftatumumab/ 苯达莫司汀组合给药的非限制性实施例
     为了治疗耐受利妥昔单抗的滤泡性淋巴瘤， 在一个实施方案中， ofatumumab 经 i.v. 给药， 第 1 轮中， 第1天1： 300mg， 第8天： 1000mg ； 之后在第 2 到第 6 轮中， 第1天 2 1000mg ； 苯达莫司汀在第 1 到第 6 轮， 每 28 天的第 1 和第 2 天给予 60-120mg/m ( 每轮是每
    28 天 )。 在另一个实施方案中， ofatumumab 经 i.v. 给药， 第 1 轮中， 第1天 ： 300mg， 第8天 ： 1000mg ； 之后在第 2 到第 6 轮中， 第 1 天 1000mg( 对 ofatumuamb， 每轮是每 28 天 ) ； 苯达莫 2 司汀在第 1 到第 8 轮， 每 21 天的第 1 和第 2 天给予 60-120mg/m ( 对苯达莫司汀， 每轮是每 21 天 )。
     在另一个实施方案中， ofatumumab 经 i.v. 给药， 第 1 轮中， 第1天 ： 300mg， 第8天 ： 1000mg ； 之后在第 2 到第 6 轮中， 第 1 天 1000mg ； 苯达莫司汀在第 1 到第 6 轮， 每 28 天的第 2 1 和第 2 天给予 90mg/m ( 每轮是每 28 天 )。
     在另一个实施方案中， ofatumumab 经 i.v. 给药， 第 1 轮中， 第1天 ： 300mg， 第8天 ： 1000mg ； 之后在第 2 到第 6 轮中， 第 1 天 1000mg( 对 ofatumuamb， 每轮是 28 天 ) ； 苯达莫司汀 2 在第 1 到第 8 轮， 每 21 天的第 1 和第 2 天给予 120mg/m ( 对苯达莫司汀， 每轮是每 21 天 )。
     另一实施方案中， 结束 6 轮 ofatumumab 给药 ( 每轮是每 28 天 ) 后， 可以进一步每 2 个月给予 ofatumumab 1000mg， 给 2 年。
     另一实施方案中， 结束 6 轮 ofatumumab 给药 ( 每轮是每 28 天 ) 后， 可以进一步每 2 个月给予 ofatumumab 2000mg。
     另一实施方案中， 结束 6 轮 ofatumumab 给药 ( 每轮是 28 天 ) 后， 可以进一步每 2 个月给予 ofatumumab 500mg。
     另一实施方案中， 结束 6 轮 ofatumumab 给药 ( 每轮是 28 天 ) 后， 可以进一步每个 月或者每 3 个月给予 ofatumumab 500mg、 1000mg 或 2000mg。
     另一实施方案中， 结束 6 轮 ofatumumab 给药 ( 每轮是 28 天 ) 后， 可以进一步每 2 个月给予 ofatumumab 300-2000mg， 给两年。
     另一实施方案中， 结束 6 轮 ofatumumab 给药 ( 每轮是 28 天 ) 后， 可以进一步每 2 个月给予受试者 ofatumumab 300-2000mg， 给两年， 以达到完全消退 (complete remission， CR)、 部分消退 (partial remission， PR) 或病情稳定 (stable disease， SD)。
     实施例 2 显示 ofatumumab 和苯达莫司汀在 CLL 模型中的治疗效果的体内研究
     因为瑞图宣和 ofatumumab 是抗人抗体， 它们需要利用 Invitrogen 的 Zenon 标记 试剂盒 (Z-25455) 直接标记上荧光标签。在 PBS 中准备 1 微克各种抗体， 向抗体溶液中加 入 5 微升 Zenon 人 IgG 标记试剂 (Component A)。将混合液在室温下温育 5 分钟， 然后向 反应混合液中加入 5 微升 Zenon 封闭试剂 (Component B)。室温下再过 5 分钟， 复合体即 可以使用。将 5x106 细胞 /ml 活 JVM-3 细胞重悬在 PBS 中。每个试管中加入 100ul 细胞。 加入 10ul 人 IgG 封闭非特异性结合。将细胞和人 IgG 温育 10 分钟。10ul 每种荧光标记 的抗 CD20 抗体加入合适的试管中 ( 瑞图宣、 Ofatumumab 和 BDBioscience 抗 CD20 抗体克 隆 2H7)。混合液于暗处在冰上再孵育 30 分钟。然后给细胞加入 500ul PBS， 在 1000rpm 离 心 5 分钟。移去上清， 加入 500ulPBS， 将细胞再次离心。再移去上清， 将细胞重悬在 300ul PBS 中。细胞在 BD FACSCanto 上进行分析。
     结论 ：
     来自 BD Bioscience 的直接标记抗 CD20 抗体比瑞图宣或 ofatumumab 抗体结合较 少的细胞表面受体。这可能是由于标记过程的差别。但是， 瑞图宣和 ofatumumab 的标记方 式相同， 而 ofatumumab 比瑞图宣抗体结合的细胞表面受体更多。参见图 2。
     人 B 细胞白血病 JVM-3 细胞系通过一个材料转移协议从 DSMZ(German Collection of Microorganisms and Cell Culture) 获得并被深低温保藏。 从保藏处取得 JVM-3 细胞， 在 37℃的加湿 5％ CO2 培养箱中， 培养在补充了 10％胎牛血清、 1％丙酮酸钠和 1％谷氨酰 胺的 RPMI 1640 培养基中。CB.17-SCID 雌性小鼠在侧腹处接受皮下注射 4x106 个 JVM-3 细 胞。每周两次用卡尺测量肿瘤直径， 肿瘤体积用公式体积＝宽度 2x 长度 /2 计算。将小鼠 随机分到治疗组中， 在移植后第 14 天当肿瘤达到平均体积 66-76mm3 时开始疗法。处理组 接受每周两次 ofatumumab 2mg/kg i.p.( 在第 14、 17 和 21 天 )， 和 / 或在第 15 天注射一次 烷化剂苯达莫司汀 50mg/kg i.v.。 肿瘤体积数据用 Prism GraphPad 软件作图， 统计计算采用单向 ANOVA 进行， 然后做 Bonferroni 多重比较检验。
     结论 ：
     我们的数据显示， 与用单药疗法 ( 抗体或者苯达莫司汀 ) 或媒介处理的组相比， ofatumumab(2mg/kg i.p. 每周两次 ) 和苯达莫司汀化疗 (50mg/kg i.v. 单一剂量 ) 的组合 导致肿瘤生长有明显延迟。我们的数据以在 CLL 患者中存活率的提高和毒性的下降表明了 ofatumumab/ 苯达莫司汀组合疗法在临床上的益处。21102355907 A CN 102355917
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