根皮苷在制备保肝药物或保健食品中的用途.pdf

本发明提供了通式I所述的化合物在制备保肝药物或保健食品中的用途，本发明还提供了含有通式I所述的化合物的药物组合物。本发明药物属于纯天然制剂，安全可靠，由食品开发成药品，毒性小，长期使用无不良反应；可当茶饮用，使用方便，味道可口；对各种原因引起的肝损伤均有保护作用，对因肝损伤出现的各种疾病均有防治作用；治疗或预防急性酒精中毒效果良好，能明显改善醉酒引起的头晕、头痛、乏力等各种症状。

1、  通式I所述的化合物在制备保肝药物或保健食品中的用途，

其中，所述的R为H，Glucose。

2、  根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的药物或保健食品是治疗或预防病毒性肝炎的药物或保健食品。

3、  根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的药物或保健食品是治疗或预防药物性肝损伤的药物或保健食品。

4、  根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的药物或保健食品是治疗或预防酒精性肝病ALD或非酒精性脂肪肝的药物或保健食品。

5、  根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的药物或保健食品是抗乙肝病毒的药物或保健食品。

6、  根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的药物或保健食品是治疗或预防肝纤维化所引起的肝功能异常或肝功能衰竭的药物或保健食品。

7、  根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的药物或保健食品是治疗或预防急性酒精中毒的药物或保健食品。

8、  一种具有保肝功效的药物或保健食品组合物，它是由有效量的权利要求1-7任意一项所述的化合物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。

9、  根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于：所述的制剂是片剂、胶囊剂、丸剂、口服液或散剂。

根皮苷在制备保肝药物或保健食品中的用途
技术领域
本发明涉及通式I所述的化合物的新用途，具体地，是在制备保肝药物或保健食品中的用途。
背景技术
根皮苷(Phloridzin)分子式：C21H24010，结构式(Phloridzin dihydrate)：1-[2-(β-D-Glucopyranosyloxy)-4，6-dihydroxyphenyl]-3-(4-hydroxyphenyl)-1-propanone；Phloretin 2`-β-D-glucopyranoside；Phloretin 2`-β-D-glucoside，别名：根皮素-2`-β-葡萄糖苷：phloretion-2`-β-glucoside中文别名：4，6-二羟基-2-(6-葡萄糖酸苷)-6-(对羟基苯)苯丙酮，弗罗利辛，它是根皮素(Phloretin)的2’-β-D-葡萄糖苷(图1)，属于植物黄酮类中的二氢查尔酮苷与其它黄酮类相比，二氢查尔酮在自然界存在很少，被称为“少数黄酮类”。根皮苷主要存在于苹果的根皮、茎、嫩叶和果实中，在其它植物如山矾科山矾属葡萄科中复叶葡萄、云南木羌科的叶中分离得到，但含量很低没有实用价值。根皮苷是一种甜度较高的天然非糖甜味剂，对于甜食爱好者和糖尿病人是一种理想的糖类替代品。根皮苷在糖尿病及其并发症的防治中具有独特效果，同时具有良好抗氧化剂、抗癌、美白作用，因而引起人们的广泛关注。国外已有其在化妆品和减肥方面的应用专利报道(JP 2002322067)。在新型药物和功能性食品的开发中具有广阔前景。
目前尚无报道根皮苷或根皮素用于保肝的相关报道。
发明内容
本发明的技术方案是提供了一种化合物的新用途，本发明的另一技术方案是提供了含有该化合物的药物或保健食品组合物。
本发明通式I所述的化合物在制备保肝药物或保健食品中的用途。

其中，所述的R为H，Glucose。
其中，所述的药物或保健食品是治疗病毒性肝炎、药物性肝损伤、酒精性肝病ALD、非酒精性脂肪肝病、肝纤维化所引起的肝功能异常或肝功能衰竭或急性酒精中毒的药物或保健食品。
本发明还提供了一种具有保肝功效的药物或保健食品组合物，它是由有效量的化合物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
其中，所述的制剂是片剂、胶囊剂、丸剂、口服液或散剂。
本发明药物或保健食品可用于多种原因引起的肝功能异常，具有抗病毒，降酶、降酯保肝多种作用，适用于病毒性肝炎，药物性肝损伤，酒精性肝病(ALD)和非酒精性脂肪肝病，肝纤维化所引起的肝功能异常或肝功能衰竭；改善乏力、食欲减退、恶心、呕吐、肝区胀痛、肝肿大及黄疸、发热等症状，修复损害的肝细胞，维护肝功能。
本发明原料还可用于制备成治疗或预防急性酒精中毒的药物或保健食品，具有保肝、提高乙醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(ALDH)活性，促进酒代谢作用；明显改善醉酒引起的头晕、头痛，乏力、恶心、呕吐，口渴、兴奋失眠等症状；减少酒对肝脏损害，短期醉酒引起的身体不适时间，具有明显的醒酒作用，可用于治疗或预防急性酒精中毒；具体用法用量：保肝，一日三次，一次一片(粒，包)，温水冲服或吞服；醒酒，饮酒前后各一片(粒，包)，温水吞服；或取一袋将粉末倒茶杯中加热水冲饮，每袋加水300-500ml。
本发明药物中原料根皮苷或根皮素来源于天然植物，属于纯天然制剂，不经有机溶解处理，安全可靠；由食品开发成药品，毒性小，长期使用无不良反应，可当茶饮用，使用方便，味道可口，对各种原因引起的肝损伤均有保护作用，对因肝损伤出现的各种疾病均有防治作用；治疗或预防急性酒精中毒效果良好，能明显改善醉酒引起的头晕、头痛，乏力等各种症状。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
实施例3  根皮苷制备方法
取海棠(湖北海棠(Malus hupehensis Rehd.)、垂丝海棠Malus HallianaKoehne、变叶海棠Malus toringoides(Rehd.)Hughes中的一种)，采用水提或醇提浸膏，上大孔吸附树脂，分别用20％，50％，80％(v/v)乙醇洗脱。取50％乙醇洗脱物经硅胶柱层析洗脱，乙醇重结晶，得根皮苷。
根皮苷的提取分离方法还可根据文献报道的方法制备成纯度较高的根皮苷。
以下通过药效学试验证明本发明的有效效果。
实验原料：
根皮苷(Phloridzin)，根皮素(Phloretin)。天然产物研究与利用湖北省重点实验室自制。
实验动物：昆明种小鼠，体重(10±2)g，(20±2)g，性别均为雄性，Balb/c小鼠，雌雄各半，5～6周龄，体重(18±2)g，SPF级，由湖北省实验动物研究中心提供，合格证号：SCXD(鄂)2003-0005。
实验试剂：RPMI1640培养液；新生小牛血清；四氯化碳(CCL₄)；二甲基亚砜；联苯双醋滴丸；丙氨酸氨基转移酶试剂盒(ALT)，天门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒，总胆红素(TBIL)试剂盒(北京利德曼生化技术有限公司)；羧甲基纤维素钠；考马斯亮蓝G-250；花生油；联苯双酯滴丸；38°白酒；土酶素注射针剂(江西省创欣动物药业有限公司)；脂必妥(成都地奥九泓制药厂)；猪油；蛋黄；猪血清；秋水仙碱等。乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)诊断试剂盒(酶联免疫法)(上海科华生物技术有限公司)，乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)诊断试剂盒(酶联免疫法)(北京科卫临床诊断试剂有限公司)；丙二醛(MDA)检测试剂盒(南京建成生物制品公司)；透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)放射免疫试剂盒(北京北方免疫试剂研究所)；秋水仙碱(西安化学试剂厂)。
实验仪器：超净工作台；96孔培养板；匀浆器；酶标仪；恒温水浴锅等。
试验例1  根皮苷、根皮素对体外肝细胞损伤的保护作用
实验方法与结果
1、肝细胞分离培养
取10g左右小鼠1只，断头放血，无菌分离肝脏，称重后置PBS液中，灌注冲洗肝脏至灰白色，将肝脏剪成1mm³左右的组织块，并用尼龙筛网碾磨，加入PBS液，1000r/min离心5min，去上清，加入10ml培养液，用滴管轻吹打成肝细胞悬液。
2、CCL₄诱导肝细胞损伤模型的建立
取50ul上述肝细胞悬液转到96孔板中，然后往每个孔中再加入30ul的培养液，并加入不同浓度的CCL₄〔(1～16mmol.L^-1)，以少量的二甲亚砜助溶，二甲亚砜终浓度为0.1％(体积分数)〕，作用不同时间(1～4h)后，收集96孔板中培养上清检测ALT。根据检测结果制备CCL₄诱导肝细胞损伤的量效和时效曲线。选择最造损伤浓度和损伤时间制备肝细胞的损伤模型，同时设溶媒对照组，每组设3个复孔。
3、根皮苷、根皮素对对CCL₄诱导肝细胞损伤的作用
取上述培养肝细胞悬液，设CCL₄损伤模型组、不同剂量给药组、正常对照组，每组设6个复孔。模型组和给药组加入4mmol.L^-1CCL₄，同时给药组加入不同浓度的药物，37℃孵育3个小时后，2000r/min离心5min，收集培养上清液检测ALT活性。结果如下：
表1  药物对CCL₄诱导肝细胞损伤的影响(X±S n＝6)

*表示与模型组比p＜0.05，**表示与模型组比p＜0.01
结果表明根皮苷及根皮苷水解产物根皮素对CCL₄诱导的肝细胞损伤均具有保护作用。根皮苷水解产物根皮素对CCL₄诱导的肝细胞损伤保护作用最强。
试验例2 根皮苷抗病毒作用
选取处于对数生长期HepG2115细胞，稀释至细胞浓度约为10⁵/ml，于96孔细胞培养板每孔加样200ul，培养24h后加入不同浓度药物2ul。设计6个浓度(50，25，12.5，6.25，3.13，1.56μmg/ml)，每个浓度3个复孔。细胞在培养箱中培养4d后，吸出培养液，换液后再加药一次。继续培养4d后，按试剂盒检测方法，表检测HBsAg和HbeAg。用酶标仪在450nm处测定OD值。以OD值代表HBsAg和HbeAg含量。同时用MTT实验在490nm波长测定OD值，判断药物的细胞毒性，计算IC₅₀。
结果：根皮苷对HBsAg和HbeAgr的IC₅₀分别为6.2μg/ml，1.7μg/ml。
试验例3 本发明化合物对HepG₂细胞四氯化碳损伤的保护作用
1材料与方法
1.1材料
HepG₂细胞株(武汉典藏中心)，湖北海棠单体化合物(由本室分离得)。RPM-I1640培养基(Invitrogen Corporation)、胎牛血清(武汉三利生物技术有限公司)、MTT(购自Gibco公司)，Stat Fax2100酶标仪(西盟生命技术有限公司)。
1.2方法
1.2.1细胞培养
HepG₂细胞，用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液于37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下静置培养。当细胞铺满瓶底80％以上，对数生长期增殖活跃的细胞传代进行分组试验。
1.2.2CCl₄损伤液制备
将DMSO与CCl₄以物质的量比1∶2混合振荡后，加入1640培养液中(终浓度为0.4μmol/μl)，得到结晶细小的CCl₄悬液，放置4℃冰箱保存。用前振荡后使用。
1.2.3分组实验
设正常对照组、CCl₄损伤组和单体化合物损伤保护组。正常对照组不做特殊处理；损伤组加入用1640配制的CCl₄悬液(终浓度为6μmol/ml)；单体化合物损伤保护组分五组(单体化合物浓度分别为10、20、50、100、125μg/ml)，每组6个复孔，于CCl₄损伤前12h加入单体化合物。三组细胞均于37℃、5％CO₂饱和湿度条件下静置培养。
1.2.4MTT法检测细胞活力
将HepG₂细胞以5×10⁴/ml接种在96孔培养板中，每孔100μl。培养12h后，保护组加入不同浓度的单体化合物，终浓度分别为10、20、50、100、125μg/ml，继续培养12h，加入CCl₄(终浓度为6μmol/ml)，正常对照组不做特殊处理。每组设6个复孔。于损伤后2h取细胞培养上清液测定各项生化指标。然后加入5mg/ml的MTT20μl，放入CO₂培养箱继续培养4h，取出培养板，小心吸去培养液，加入100μl DMSO，振摇至MTT结晶溶解后，用全自动酶联仪测定各孔吸光度(OD值)(测试波长570nm)。用以下公式计算实验组细胞存活率，细胞存活率＝实验OD/对照OD×100％(以空白组OD值调零)。
1.2.4 ALT、AST活性的测定
取细胞培养上清液，按试剂盒说明书测定ALT、AST活性。
1.3结果
对HepG₂细胞培养上清液中AST、ALT的影响

⁺P＜0.05，⁺⁺P＜0.001vs空白；*P＜0.05，**P＜0.01vs模型
试验例4本发明药物化合物对HepG₂细胞酒精性损伤的保护作用
1材料与方法
1.1材料
同试验例3中1.1。
1.2方法
1.2.1细胞培养
同试验例3中的1.2.1。
2.2.3分组实验
将细胞数调整到5×10⁴个/mL，接种于96孔培养板，培养24h，每组6个复孔，加入单体化合物终浓度分别为10，20，50，100，125μg/mL，另设模型组和对照组。加入单体化合物5h后，除正常对照组之外，其余各组添加乙醇6μL，损伤12h之后取细胞培养上清液测定各项生化指标。
2.3结果
对HepG2细胞培养上清液中AST、ALT的影响

⁺P＜0.05，⁺⁺P＜0.001vs空白；*P＜0.05，**P＜0.01vs模型
试验例5本发明药物体外抗乙肝病毒实验
1材料
HepG2.2.15细胞株乙型肝炎病毒DNA克隆转染人肝癌细胞(HepG2.2.15)由军事医学科学院引进本室自行传代培养。MEM干粉、胎牛血清、G-418，GIBCO公司，L-谷氨酰胺，EMERC公司；HBsAg、HBeAg ELISA法测定试剂由上海天呈生物科技有限公司提供。
2方法
选取处于对数生长期HepG2115细胞，稀释至细胞浓度约为10⁵/ml，于96孔细胞培养板每孔加样200ul，培养24h后加入不同浓度药物2ul。设计6个浓度(125，100，50，20，10μg/ml)，每个浓度3个复孔。细胞在培养箱中培养4d后，吸出培养液，换液后再加药一次。继续培养4d后，按试剂盒检测方法，检测HBsAg和HbeAg。用酶标仪在450nm处测定OD值。
3结果

试验例6 根皮苷体内对四氯化碳致急性肝损伤小鼠的保护作用
实验方法与结果
1、实验方法
动物分组和造模方法取90只雄性昆明小鼠，随机分成9组，每组10只，分别为正常组、模型组、根皮苷给药组(低、中、高剂量组)、联苯双酯组(BDP)。各给药组按0.2ml/20g/d)剂量灌胃给药，正常对照组和模型组予以相应体积的溶媒CMC-Na，连续灌胃给药4d。于末次给药后1h，除正常对照组腹腔注射(ip)等量生理盐水外，其余各组均ip 0.1％CCl4花生油溶液0.1ml/10g。禁食16h后，再给一次药并称重，半小时之后，所有小鼠摘眼球采血，分离血清，测定谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)。
2、实验结果如下
表2 药物对四氯化碳致急性肝损伤小鼠血清中ALT、AST、TBIL的影响(x±s)n＝10