通过抑制肿瘤抑制基因的天然反义转录物治疗肿瘤抑制基因相关性疾病.pdf

通过抑制肿瘤抑制基因的天然反义转录物治疗肿瘤抑制基 因相关性疾病
    交叉引用
     本申请要求 2008 年 12 月 4 日申请的美国临时申请号 61/119,973、 2009 年 3 月 4 日申请的美国临时申请号 61/157,249、 2009 年 4 月 3 日申请的美国临时申请号 61/166,381 和 2009 年 2 月 23 日申请的美国临时申请号 61/154,594 的权益， 这些申请通过引用其全部 内容结合到本申请。
     发明领域
     本发明的实施方案包括调节肿瘤抑制基因的表达和 / 或功能的寡核苷酸和相关 分子。
     发明背景
     DNA-RNA 和 RNA-RNA 杂交对核酸功能的许多方面起重要作用， 包括 DNA 复制、 转录 和翻译。杂交对于检测具体核酸或改变核酸表达的各种技术也很重要。反义核苷酸， 例如， 通过杂交至靶 RNA 而破坏基因表达， 从而干扰 RNA 剪接、 转录、 翻译和复制。反义 DNA 还具 有 DNA-RNA 杂交体作为核糖核酸酶 H 消化底物的特征， 这种活性存在于大多数的细胞类型 中。 反义分子可以被运送进入细胞 ( 例如寡脱氧核苷酸 (ODNs))， 或者他们可由内源基因表 TM 达为 RNA 分子。FDA 最近批准了一种反义药物 -VITRAVENE ( 用于治疗巨细胞病毒视网膜 炎 )， 说明反义分子有治疗实用性。
     发明概述
     该概述部分概括介绍本发明， 简要说明本发明的性质及实质。应理解的是概述部 分不能用来解释或限制权利要求的范围或含义。
     在一个实施方案中， 本发明提供通过使用反义寡核苷酸靶向天然反义转录物的任 何区域从而抑制天然反义转录物的作用， 导致相应的有义基因上调的方法。本文还考虑到 抑制天然反义转录物可以通过 siRNA、 核酶和小分子来实现， 这些也被认为属于本发明的范 围内。
     一个实施方案提供体内或体外调节患者细胞或组织里肿瘤抑制基因多核苷酸的 功能和 / 或表达的方法， 其包括使所述细胞或组织与 5-30 个核苷酸长度的反义寡核苷酸接 触， 其中所述寡核苷酸与一种多核苷酸的反向互补序列具有至少 50％的序列同一性， 所述 多核苷酸包含以下核苷酸序列内的 5-30 个连续核苷酸 ： SEQ ID NO ： 4 的核苷酸 1-1675、 或 者 SEQ ID NO ： 5 的核苷酸 1-518、 或者 SEQ ID NO ： 6 的核苷酸 1-759、 或者 SEQ ID NO ： 6a 的 核苷酸 1-25892、 或者 SEQ ID NO ： 6b 的核苷酸 1-279、 或者 SEQ ID NO ： 7 的核苷酸 1-1982、 或者 SEQ ID NO ： 8 的核苷酸 1-789 或者 SEQ ID NO ： 9 的核苷酸 1-467( 图 5)， 从而在体内 或体外调节患者细胞或组织中的肿瘤抑制基因多核苷酸的功能和 / 或表达。
     在另一个优选的实施方案中， 寡核苷酸靶向肿瘤抑制基因多核苷酸的天然反义序 列， 例如 SEQ ID NO ： 4、 5、 6、 6a、 6b、 7、 8 或 9 的核苷酸以及它们的任何变体、 等位基因、 同系 物、 突变体、 衍生物、 片段和互补序列。反义寡核苷酸的实例为 SEQ ID NO ： 10-30( 图 6-9)。另一个实施方案提供在体内或体外调节患者细胞或组织中的肿瘤抑制基因多核 苷酸的功能和 / 或表达的方法， 所述方法包括 ： 使所述细胞或组织与 5-30 个核苷酸长度的 反义寡核苷酸接触， 其中所述寡核苷酸与肿瘤抑制基因多核苷酸的反义序列的反向互补序 列具有至少 50％的序列同一性， 从而在体内或体外调节患者细胞或组织中的肿瘤抑制基因 多核苷酸的功能和 / 或表达。
     另一个实施方案提供了在体内或体外调节患者细胞或组织中的肿瘤抑制基因多 核苷酸的功能和 / 或表达的方法， 所述方法包括 ： 使所述细胞或组织与 5-30 个核苷酸长度 的反义寡核苷酸接触， 其中所述寡核苷酸与肿瘤抑制基因反义多核苷酸的反义寡核苷酸具 有至少 50％的序列同一性， 从而在体内或体外调节患者细胞或组织中的肿瘤抑制基因多核 苷酸的功能和 / 或表达。
     在优选的实施方案中， 组合物包含一种或多种结合至有义和 / 或反义肿瘤抑制基 因多核苷酸的反义寡核苷酸。
     在另一个优选的实施方案中， 寡核苷酸包含一种或多种修饰的或置换的核苷酸。
     在另一个优选的实施方案中， 寡核苷酸包含一种或多种修饰的键。
     在再一个实施方案中， 修饰的核苷酸包含修饰的碱基， 其包含硫代磷酸酯、 甲基膦 酸酯、 肽核酸、 2’ -O- 甲基、 氟代或碳、 亚甲基或其它锁定核酸 (LNA) 分子。优选修饰的核苷 酸是锁定核酸分子， 包括 α-L-LNA。 在另一个优选的实施方案中， 寡核苷酸通过皮下、 肌内、 静脉或腹膜内给予患者。
     在另一个优选的实施方案中， 寡核苷酸以药学组合物给药。治疗方案包括给予患 者至少一次反义化合物 ； 但是， 可修改该治疗方案以包括在一段时间内多次给药。 该治疗可 以结合一种或多种其它类型的疗法。
     在另一个优选的实施方案中， 寡核苷酸包裹于脂质体中或结合于载体分子 ( 例如 胆固醇、 TAT 肽 )。
     一个实施方案提供一种体内或体外调节患者细胞或组织中的肿瘤抑制基因多核 苷酸的功能和 / 或表达的方法， 所述方法包括 ： 使所述细胞或组织与至少一种 5-30 个核苷 酸长度的反义寡核苷酸接触， 其中所述至少一种寡核苷酸与肿瘤抑制基因多核苷酸的天然 反义序列的反向互补序列具有至少 50％的序列同一性， 从而在体内或体外调节患者细胞或 组织中的肿瘤抑制基因多核苷酸的功能和 / 或表达。
     一个实施方案提供一种体内或体外调节患者细胞或组织中的肿瘤抑制基因多核 苷酸的功能和 / 或表达的方法， 所述方法包括 ： 使所述细胞或组织与 5-30 个核苷酸长度的 反义寡核苷酸接触， 其中所述寡核苷酸与肿瘤抑制基因多核苷酸的反义寡核苷酸具有至少 50％的序列同一性， 从而在体内或体外调节患者细胞或组织中的肿瘤抑制基因多核苷酸的 功能和 / 或表达。
     另一个实施方案提供了体内或体外调节患者细胞或组织中的肿瘤抑制基因多核 苷酸的功能和 / 或表达的方法， 所述方法包括使所述细胞或组织与至少一种靶向肿瘤抑制 基因多核苷酸的天然反义序列的区域的反义寡核苷酸接触 ； 从而在体内或体外调节患者细 胞或组织中的肿瘤抑制基因多核苷酸的功能和 / 或表达。
     在一个实施方案中， 相对于对照， 在体内或体外增加肿瘤抑制基因多核苷酸的功 能和 / 或表达。
     在另一个实施方案中， 至少一种反义寡核苷酸靶向肿瘤抑制基因多核苷酸的天然 反义序列。
     在一个实施方案中， 至少一种反义寡核苷酸靶向包含肿瘤抑制基因多核苷酸的编 码和 / 或非编码核酸序列的核酸序列。
     在一个实施方案中， 至少一种反义寡核苷酸靶向肿瘤抑制基因多核苷酸的重叠和 / 或非重叠序列。
     在一个具体的实施方案中， 至少一种反义寡核苷酸包含的一种或多种修饰选自 ： 至少一种修饰的糖部分、 至少一种修饰的核苷间键合、 至少一种修饰的核苷酸和它们的组 合。
     在一个相关的实施方案中， 一种或多种修饰包含的至少一种修饰的糖部分选自 ： 2’ -O- 甲氧乙基修饰的糖部分、 2’ - 甲氧基修饰的糖部分、 2’ -O- 烷基修饰的糖部分、 二环 糖部分和它们的组合。
     在另一个实施方案中， 一种或多种修饰包含的至少一种修饰的核苷间键合选自 ： 硫代磷酸酯、 2′ -O- 甲氧乙基 (MOE)、 2′ - 氟代、 烷基膦酸酯、 二硫代磷酸酯、 烷基硫代膦酸 酯、 氨基磷酸酯、 氨基甲酸酯、 碳酸酯、 磷酸三酯、 氨基乙酸酯 (acetamidate)、 羧甲酯和它们 的组合。 在一个实施方案中， 一种或多种修饰包含的至少一种修饰的核苷酸选自 ： 肽核酸 (PNA)、 锁定核酸 (LNA)、 阿拉伯糖核酸 (FANA)、 类似物、 衍生物和它们的组合。
     在另一个实施方案中， 至少一种寡核苷酸包含 SEQ ID NO ： 10-30 所示的至少一种 寡核苷酸序列。
     本发明还提供一种体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中的肿瘤抑制基因的功 能和 / 或表达的方法， 所述方法包括 ： 使所述细胞或组织与至少一种 5-30 个核苷酸长度的 短干扰 RNA(siRNA) 寡核苷酸接触， 所述至少一种 siRNA 对肿瘤抑制基因多核苷酸的反义多 核苷酸是特异性的， 其中所述寡核苷酸与肿瘤抑制基因多核苷酸的反义和 / 或有义核酸分 子的至少大约 5 个连续核酸的互补序列有至少 50％的序列同一性 ； 和在体内或体外调节哺 乳动物细胞或组织中的肿瘤抑制基因的功能和 / 或表达。
     在一个实施方案中， 寡核苷酸与肿瘤抑制基因多核苷酸的反义和 / 或有义核酸分 子的至少大约 5 个连续核酸的互补序列有至少 80％的序列同一性。
     另一个实施方案提供一种体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中的肿瘤抑制基 因的功能和 / 或表达的方法， 所述方法包括 ： 使所述细胞或组织与至少一种对肿瘤抑制基 因多核苷酸的有义和 / 或天然反义链的非编码和 / 或编码序列特异性的大约 5-30 个核苷 酸长度的反义寡核苷酸接触， 其中所述至少一种反义寡核苷酸与 SEQ ID NO ： 1、 1a、 1b、 2、 2a、 2b、 3、 3a、 4、 5、 6、 6a、 6b、 7、 8 和 9 中的至少一种核酸序列具有至少 50％的序列同一性 ； 和 在体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中的肿瘤抑制基因的功能和 / 或表达。
     一个实施方案提供包含至少一种修饰的合成的修饰的寡核苷酸， 其中所述至少一 种修饰选自 ： 至少一种修饰的糖部分、 至少一种修饰的核苷酸间键合、 至少一种修饰的核 苷酸和它们的组合 ； 和进一步地其中所述寡核苷酸是反义化合物， 其在体内或体外杂交至 肿瘤抑制基因多核苷酸， 并且与正常对照相比调节肿瘤抑制基因多核苷酸的表达和 / 或功 能。
     在一个实施方案中， 至少一种修饰包含的核苷酸间键合选自 ： 硫代磷酸酯、 烷基膦 酸酯、 二硫代磷酸酯、 烷基硫代膦酸酯、 氨基磷酸酯、 氨基甲酸酯、 碳酸酯、 磷酸三酯、 氨基乙 酸酯、 羧甲酯和它们的组合。
     在另一个实施方案中， 寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键合。
     在一个相关的实施方案中， 寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷酸间键合骨架。
     在一个实施方案中， 寡核苷酸包含至少一种修饰的核苷酸， 所述修饰的核苷酸选 自： 肽核酸、 锁定核酸 (LNA)、 类似物、 衍生物和它们的组合。
     在另一个实施方案中， 寡核苷酸包含多种修饰， 其中所述修饰包含的核苷酸间键 合选自 ： 硫代磷酸酯、 烷基膦酸酯、 二硫代磷酸酯、 烷基硫代膦酸酯、 氨基磷酸酯、 氨基甲酸 酯、 碳酸酯、 磷酸三酯、 氨基乙酸酯、 羧甲酯和它们的组合。
     在一个实施方案中， 寡核苷酸包含多种修饰， 其中所述修饰包含修饰的核苷酸选 自： 肽核酸、 锁定核酸 (LNA)、 类似物、 衍生物和它们的组合。
     在 另 一 个 实 施 方 案 中， 寡核苷酸包含至少一种选自以下的修饰的糖部分 ： 2’ -O- 甲氧乙基修饰的糖部分、 2’ - 甲氧基修饰的糖部分、 2’ -O- 烷基修饰的糖部分、 二环 糖部分和它们的组合。
     在另一个实施方案中， 寡核苷酸包含多种修饰， 其中所述修饰包含修饰的糖部分 选自 ： 2’ -O- 甲氧乙基修饰的糖部分、 2’ - 甲氧基修饰的糖部分、 2’ -O- 烷基修饰的糖部分、 二环糖部分和它们的组合。
     在另一个实施方案中， 寡核苷酸是长度至少大约 5-30 个核苷酸并且杂交至肿瘤 抑制基因多核苷酸的反义和 / 或有义链的寡核苷酸， 其中所述寡核苷酸与肿瘤抑制基因多 核苷酸的反义和 / 或有义编码和 / 或非编码核酸序列的至少大约 5 个连续核酸的互补序列 有至少大约 20％的序列同一性。
     在另一个实施方案中， 寡核苷酸与肿瘤抑制基因多核苷酸的反义和 / 或有义编码 和 / 或非编码核酸序列的至少大约 5 个连续核酸的互补序列有至少大约 80％的序列同一 性。
     在另一个实施方案中， 在体内或体外所述寡核苷酸与至少一种肿瘤抑制基因多核 苷酸杂交， 并且与正常对照相比调节所述肿瘤抑制基因多核苷酸的表达和 / 或功能。
     在一个实施方案中， 寡核苷酸包含 SEQ ID NO ： 10-30 所示的一种序列。
     本发明进一步提供包含对一种或多种肿瘤抑制基因多核苷酸特异性的一种或多 种寡核苷酸的组合物， 所述多核苷酸包含反义序列、 互补序列、 等位基因、 同系物、 同种型、 变体、 衍生物、 突变体、 片段或它们的组合。
     在特定的实施方案中， 其中寡核苷酸与 SEQ ID NO ： 10-30 所示的任一种核苷酸序 列相比具有至少大约 40％的序列同一性。
     在一个实施方案中， 一种或多种寡核苷酸包含 SEQ ID NO ： 10-30 所示的任一种核 苷酸序列。
     在另一个实施方案中， SEQ ID NO ： 10-30 所示的寡核苷酸包含一种或多种修饰或 核苷酸置换。
     在另一个实施方案中， 一种或多种修饰选自 ： 硫代磷酸酯、 甲基膦酸酯、 肽核酸、 锁 定核酸 (LNA) 分子和它们的组合。本发明的一个实施方案提供一种预防或治疗与至少一种肿瘤抑制基因多核苷酸 和 / 或其至少一种编码产物相关的疾病的方法， 所述方法包括 ： 给予患者治疗有效剂量的 至少一种结合所述至少一种肿瘤抑制基因多核苷酸的天然反义序列的反义寡核苷酸， 并且 所述反义寡核苷酸调节所述至少一种肿瘤抑制基因多核苷酸的表达 ； 从而预防或治疗与所 述至少一种肿瘤抑制基因多核苷酸和 / 或其至少一种编码产物相关的疾病。
     在特定的实施方案中， 与所述至少一种肿瘤抑制基因多核苷酸相关的疾病选自 ： 凋亡减少或增加相关性疾病、 组织 / 细胞老化、 癌症 ( 包括表 1 所列的癌症 )、 自身免疫性 疾病、 包括 AIDS 在内的免疫缺陷病、 衰老、 神经变性疾病或障碍 ( 例如阿尔茨海默氏病、 运 动失调性毛细血管扩张症、 帕金森氏病、 肌萎缩性脊髓侧索硬化、 亨廷顿氏病等 )、 过度增 生性疾病 ( 例如瘢痕瘤 )、 类风湿性关节炎、 冠心病、 局部缺血性细胞死亡、 淋巴增生性障 碍、 动脉粥样硬化、 骨质疏松症、 骨髓增生异常综合征、 毒素诱发性疾病、 病毒感染、 伤口愈 合、 考登氏病 (CD)、 Lhermitte-Duclos 病 (LDD)、 Bannayan-Zonana 综合征 (BZS， 也称为 Bannayan-Riley-Ruvalcaba 综合征、 Ruvalcaba-Myhre-Smith 综合征和 Riley-Smith 综合 征 )、 移植、 凋亡相关性疾病或障碍、 代谢疾病或病症 ( 例如糖尿病 )、 肾病或障碍、 心肌梗塞 / 心力衰竭、 局部缺血、 脓毒症、 其中特别的造血炎症细胞过量的炎性疾病、 增殖性疾病或者 其中有治疗范例通过增加凋亡治疗炎症性疾病的疾病或障碍。 一个实施方案提供一种鉴定和选择用于体内给药的至少一种寡核苷酸的方法， 所 述方法包括 ： 选择与疾病状态有关的目标多核苷酸 ； 鉴定至少一种包含与选定目标多核苷 酸互补或其反义方向的至少 5 个连续核苷酸的寡核苷酸 ； 检测在严格杂交条件下反义寡核 苷酸和所述目标多核苷酸的杂合体的热熔点 ； 以及根据获得的信息选择用于体内给药的至 少一种寡核苷酸。
     以下介绍本发明其它方面。
     附图简述
     图1：
     图 1A 和 1B 为实时 PCR 结果图， 其显示相对于对照， HepG2 细胞用 Lipofectamine 2000 导入硫代磷酸寡核苷酸处理后， TP73mRNA 的倍数变化。实时 PCR 结果显示， 用针对 p73as 设计的寡聚体处理 HepG2 细胞 48 小时后， p73 mRNA 的水平显著增加 ( 图 1A)。用针 对 p73as 的寡聚体处理的同一样品中， p73as RNA 的水平显著减少 ( 图 1B)。图柱寡聚体 1、 寡聚体 2 和寡聚体 3 分别对应于用 SEQ ID NO 10、 11 和 12 处理的样品。
     图 1C 为实时 PCR 结果图， 其显示相对于对照， HepG2 细胞用 Lipofectamine 2000 导入 siRNA 寡核苷酸处理后， TP73 mRNA 的倍数变化 + 标准差。实时 PCR 结果显示， 用针 对 p73 反义 Hs.668503 设计的其中两种寡聚体和针对 p73 反义 Hs.674463 设计的其中一 种寡聚体处理 HepG2 细胞 48 小时后， p73 mRNA 的水平显著增加。图柱 p73Hs.668503_1、 p73Hs.668503_2、 p73Hs.674463_1 和 p73Hs.674463_2 分别对应于用 SEQ ID NO 13、 14、 15 和 16 处理的样品。
     图 1D 为实时 PCR 结果图， 其显示相对于对照， TM4 细胞用 Lipofectamine 2000 导 入硫代磷酸寡核苷酸处理后， TP73 mRNA 的倍数变化 + 标准差。 实时 PCR 结果显示， 用针对小 鼠 p73 反义 Hs.668503 设计的其中一种寡聚体和针对小鼠 p73 反义 WDR8 设计的其中一种寡 聚体处理小鼠 TM4 细胞 48 小时后， p73mRNA 的水平显著增加。图柱 p73 小鼠 Hs.668503_1、
     p73 小鼠 Hs.668503_10、 p73 小鼠 Hs.668503_14、 p73 小鼠 Hs.668503_15、 p73 小鼠 WDr8_1、 p73 小鼠 WDr8_7、 p73 小鼠 WDr8_8 和 p73 小鼠 WDr8_3 分别对应于用 SEQ ID NO 14-24 处 理的样品。
     图 2 为实时 PCR 结果图， 其显示相对于对照， HUVEC 细胞用 Lipofectamine 2000 导 入硫代磷酸寡核苷酸处理后， p53mRNA 的倍数变化。实时 PCR 结果显示， 用针对 p53as 设计 的所有 siRNA 处理 HUVEC 细胞 48 小时后， p53mRNA 的水平显著增加 ( 寡聚体 1P ＝ 0.003， 寡聚体 2P ＝ 0.001 和寡聚体 2P ＝ 0.03)。图柱寡聚体 1、 寡聚体 2 和寡聚体 3 分别对应于 用 SEQ ID NO ： 25、 26 和 27 处理的样品。
     图 3 为实时 PCR 结果图， 其显示相对于对照， HepG2 细胞用 Lipofectamine 2000 导 入硫代磷酸寡核苷酸处理后， PTEN mRNA 的倍数变化。实时 PCR 结果显示， 用针对 PTEN 反 义 Hs.624903 设计的其中一种寡聚体处理 HepG2 细胞 48 小时后， PTEN mRNA 水平显著增加。 图柱 PTEN Hs.607931_2、 PTEN Hs.624903_2、 PTEN Hs.624903_3 分别对应于用 SEQ ID NO 28、 29 和 30 处理的样品。
     图 4 显示 ：
     SEQ ID NO ： 1： 人 肿 瘤 抑 制 基 因 (TP73) 转 录 物 变 体 1， mRNA。(NCBI 注 册 号 ： NM_005427.2)。 SEQ ID NO ： 1a 显示 p73 的基因组序列 ( 外显子用大写字母表示， 内含子用小写字 母表示 )。
     SEQ ID NO ： 1b 显示 p73 的小鼠基因组序列 ( 外显子用大写字母表示， 内含子用小 写字母表示 )。
     SEQ ID NO ： 2： 人 肿 瘤 蛋 白 p53(TP53)， 转 录 物 变 体 1， mRNA。(NCBI 注 册 号 ： NM_000546.4)
     SEQ ID NO ： 2a ： 显示 p53 的基因组序列 ( 外显子用大写字母表示， 内含子用小写字 母表示 )。
     SEQ ID NO ： 2b 显示 p53 同种型 D 的基因组序列 (NCBI 注册号 ： NM_001126115)。
     SEQ ID NO ： 3： 人 磷 酸 酶 和 张 力 蛋 白 同 系 物 (PTEN)， mRNA。(NCBI 注 册 号 ： NM_000314)。
     SEQ ID NO ： 3a ： 显示 PTEN 的基因组序列 ( 外显子用大写字母表示， 内含子用小写 字母表示 )。
     图 5 显示 ：
     SEQ ID NO ： 4： 天然反义序列 p73as(NCBI 注册号 ： NM_017818.2)
     SEQ ID NO ： 5： p73 天然反义序列 Hs.668503
     SEQ ID NO ： 6： p73 天然反义序列 Hs.674463
     SEQ ID NO ： 6a ： p73 小鼠天然反义序列
     SEQ ID NO ： 6b ： p73 小鼠天然反义序列 ： Hs.668503( 大写字母表示 cDNA 和基因组 序列中匹配的碱基 )
     SEQ ID NO ： 7： p53 天然反义序列 (NCBI 注册号 ： NM_018081.2)
     SEQ ID NO ： 8： PTEN 天然反义序列 (Hs.624903)
     SEQ ID NO ： 9： PTEN 天然反义序列 (Hs.607931)
     图 6 显示反义寡核苷酸 SEQ ID NO ： 10-16。 ‘r’ 代表 RNA 和 * 代表硫代磷酸酯键。
     图 7 显示反义寡核苷酸 SEQ ID NO ： 17-24。* 代表硫代磷酸酯键。
     图 8 显示针对天然反义序列 NM_018081 的 p53 反义寡核苷酸 SEQ ID NO ： 25-27。
     图 9 显示针对天然反义序列 Hs.624903 和 Hs.607931 的 PTEN 反义寡核苷酸 SEQ ID NO ： 28-30。 ‘r’ 代表 RNA。
     图 10 显示有义寡核苷酸 SEQ ID NO ： 31-34。 ‘r’ 代表 RNA。
     有义寡核苷酸 SEQ ID NO ： 31 是反义寡核苷酸 SEQ ID NO ： 13 的反向互补序列，
     有义寡核苷酸 SEQ ID NO ： 32 是反义寡核苷酸 SEQ ID NO ： 14 的反向互补序列，
     有义寡核苷酸 SEQ ID NO ： 33 是反义寡核苷酸 SEQ ID NO ： 15 的反向互补序列 ； 和
     有义寡核苷酸 SEQ ID NO ： 34 是反义寡核苷酸 SEQ ID NO ： 16 的反向互补序列。
     图 11 显示由 Applied Biosystems Taqman gene Expression Assay 设计的测定 的 SEQ ID NO ： 35 和 36。
     SEQ ID No. ： 35 是 p73 靶序列， 外显子 2(Hs00232088_m1)
     SEQ ID No. ： 36 是 p73as 靶序列， 外显子 7(Hs0021535_m1 和 Hs00892470_g1)
     图 12 显示由 Applied Biosystems Taqman gene Expression Assay 设计的测定 的 SEQ ID NO ： 37 和 38。
     SEQ ID No. ： 37 是 p53 靶序列 (Hs00153340_m1)
     SEQ ID No. ： 38 是 p53as(WDR79) 靶序列 (Hs00216360_m1)
     图 13 显示有义寡核苷酸 SEQ ID NO ： 39-41。 ‘r’ 代表 RNA。
     有义寡核苷酸 SEQ ID NO ： 39 是反义寡核苷酸 SEQ ID NO ： 28 的反向互补序列，
     有义寡核苷酸 SEQ ID NO ： 40 是反义寡核苷酸 SEQ ID NO ： 29 的反向互补序列 ； 和
     有义寡核苷酸 SEQ ID NO ： 41 是反义寡核苷酸 SEQ ID NO ： 30 的反向互补序列。
     发明详述
     本发明的几个方面在下面参照实例应用进行例证性说明。 应当理解的是所列的无 数具体细节、 关系和方法是为了完整理解本发明。 但是， 相关领域的普通技术人员容易认识 到省去一个或多个具体细节或采用其它方法， 本发明也可以实施。本发明不受动作或事件 的顺序限制， 因为某些动作可以不同的顺序发生和 / 或与其它动作或事件同时发生。另外， 实施本发明方法并不需要所有例证的动作或事件。
     本文公开的所有基因、 基因名称和基因产物意指本文公开的组合物和方法适用的 任何物种的对应同系物。因此， 所述术语包括但不限于人和小鼠的基因和基因产物。应当 理解的是， 当公开来自具体物种的基因或基因产物时， 该公开仅仅是示例性的， 不能解释为 一种限制， 除非文中明确表示一种限制。因此， 例如本文公开的基因， 其在一些实施方案中 与哺乳动物核酸和氨基酸序列相关， 还包括来自其它动物的同源和 / 或直向同源基因和基 因产物， 其它动物包括但不限于其它哺乳动物、 鱼类、 两栖类、 爬行类和鸟类。 在优选的实施 方案中， 基因或核酸序列都是人基因或核酸序列。
     定义
     本文所用的术语只是为了描述具体实施方案的目的， 并无意限制本发明。本文所 用的单数形式″一种″、 “所述” 和″该″包括复数形式， 除非文中另有明确说明。另外， 在 发明详述和 / 或权利要求书中使用了术语″包括″、″具有″、″有″或它们的变体， 这类术语类似于术语″包含″。
     术语″大约″或″近似″意指本领域普通技术人员确定的具体值的允许误差范 围， 其部分取决于如何测量或确定该值， 即测量系统的限制。 例如″大约″按照本领域的实 践可意指 1 以内或超过 1 的标准差。或者，″大约″可意指给定值的至多 20％的范围， 优 选至多 10％， 更优选至多 5％， 甚至更优选至多 1％的范围。 或者， 具体对生物系统或方法而 言， 该术语可意指在数量级范围内， 优选 5 倍值以内， 更优选 2 倍值以内。在应用和权利要 求中描述了具体值， 除非另有说明， 否则术语″大约″指在具体值的允许误差范围之内。
     本文所用的术语″ mRNA″意指靶基因目前公知的 mRNA 转录物， 以及任何可以阐 明的其它转录物。
     ″反义寡核苷酸″或″反义化合物″意指结合另一种 RNA 或 DNA( 靶 RNA、 DNA) 的 RNA 或 DNA 分子。例如， 如果它是 RNA 寡核苷酸， 它则以 RNA-RNA 相互作用的方式结合另一 种 RNA 靶， 并改变靶 RNA 的活性 (Eguchi 等， (1991)Ann.Rev.Biochem.60， 631-652)。反义 寡核苷酸能上调或下调特定多核苷酸的表达和 / 或功能。该定义包括以治疗、 诊断或其它 观点来看有用的任何外源 RNA 或 DNA 分子。这种分子包括杂交至靶核酸的至少一部分的分 子， 例如反义 RNA 或 DNA 分子、 干扰 RNA(RNAi)、 微小 RNA、 诱饵 RNA 分子、 siRNA、 酶促 RNA、 治 疗编辑 RNA 和激动剂以及拮抗剂 RNA、 反义寡聚化合物、 反义寡核苷酸、 外部指导序列 (EGS) 寡核苷酸、 可变剪接子、 引物、 探针和寡聚化合物。 因此， 这些化合物可以以单链、 双链、 部分 单链或环形寡聚化合物的形式导入。
     在本发明上下文中， 术语″寡核苷酸″指寡聚体或多聚体核糖核酸 (RNA) 或脱氧 核糖核酸 (DNA) 或它们的模拟物。术语″寡核苷酸″也包含天然的和 / 或修饰的单体或 键链体的线性或环状寡聚体， 包括脱氧核糖核苷、 核糖核苷、 它们的取代和 α 异头形式、 肽 核酸 (PNA)、 锁定核酸 (LNA)、 硫代磷酸酯、 甲基膦酸酯等。寡核苷酸能以单体 - 单体相互 作用 ( 例如碱基配对的华生 - 克里克 (Watson-Crick) 类型、 碱基配对的 类型等 ) 的规律模式特异性地结合靶多核苷酸。
     或反寡核苷酸可以是″嵌合的″， 也就是由不同的区域组成。在本发明中，″嵌合的 ( 型 )″化合物是寡核苷酸， 其包含两种或更多种化学区域， 例如 DNA 区域、 RNA 区域、 PNA 区 域等。每个化学区域由至少一个单体单位组成， 在寡核苷酸化合物情况下单体单位为核苷 酸。这些寡核苷酸通常包含至少一个区域， 其中寡核苷酸被修饰以具有一种或多种所需的 特征。所需的寡核苷酸特征包括但不限于例如增加对核酸酶降解的抗性、 增加细胞摄取和 / 或增加对靶核酸的结合亲和力。寡核苷酸的不同区域可以因此具有不同的特征。本发明 的嵌合寡核苷酸可以上述两种或更多种寡核苷酸、 修饰的寡核苷酸、 寡核苷和 / 或寡核苷 酸类似物的混合结构制成。寡核苷酸可以以″套准对齐 (register)″的方式连接的区域组成， 即单体连续连 接， 例如天然 DNA， 或通过间隔区连接。 间隔区构成区域之间的共价″桥″， 并且优选其长度 不超过大约 100 个碳原子。间隔区可以具有不同功能性， 例如带正电荷或负电荷的， 具有特 殊核酸结合特征 ( 嵌入剂、 沟结合剂、 毒素、 荧光团等 )， 具有亲脂性， 诱导特殊二级结构例 如诱导 α 螺旋的含丙氨酸的肽。
     本文所用的″肿瘤抑制基因″包括所有的家族成员、 突变体、 等位基因、 片段、 种 型 (species)、 编码和非编码序列、 有义和反义多核苷酸链等。
     本文所用词语肿瘤蛋白 73、 p73、 TP73 在本申请中可交换使用。
     本文所用的词语 TRP53、 肿瘤抑制基因 p53、 p53、 p53 抗原 NY-CO-13、 细胞肿瘤抗原 p53、 FLJ92943、 LFS1 和磷蛋白 p53 在本申请中可交换使用。
     本文所用的词语 PTEN、 10q23del、 BZS、 MGC11227、 MHAM、 MMAC1、 在多发性晚期癌症 1 中的突变、 磷酸酶和张力蛋白同系物、 磷脂酰肌醇 -3， 4， 5- 三磷酸 3- 磷酸酶和双重特异性 蛋白磷酸酶 PTEN、 PTEN1、 TEP1 在本申请中可交换使用。
     本文所用的术语″对 ... 特异 ( 性 ) 的寡核苷酸″或″靶向 ... 的寡核苷酸″指 寡核苷酸具有这样的序列 ： (i) 能与靶基因的一部分形成稳定复合体， 或 (ii) 能与靶基因 的 mRNA 转录物的一部分形成稳定双链体。复合体和双链体的稳定性能通过理论计算和 / 或体外测定确定。测定杂交复合体和双链体稳定性的示例性测定在下面的实施例中介绍。
     本文所用的术语″靶 / 目标核酸″包括 DNA、 从这种 DNA 转录而来的 RNA( 包括 premRNA 和 mRNA)、 和从这种 RNA 衍生而来的 cDNA、 编码序列、 非编码序列、 有义或反义多核 苷酸。寡聚化合物与其靶核酸的特异性杂交干扰靶核酸的正常功能。这种通过化合物调节 靶核酸的功能 ( 化合物特异性地杂交至核酸 ) 一般称为″反义″。待被干扰的 DNA 的功能 包括， 例如复制和转录。待被干扰的 RNA 的功能包括所有重要功能， 例如 RNA 转移至蛋白翻 译位点、 从 RNA 翻译蛋白、 剪接 RNA 产生一种或多种 mRNA 和由 RNA 参与或促进的催化活性。 这种干扰靶核酸功能的总体效果是调节编码产物或寡核苷酸的表达。
     RNA 干扰″ RNAi ″由对它们的″靶″核酸序列具有序列特异性同源性的双链 RNA(dsRNA) 分子介导 (Caplen， N.J. 等 (2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98 ： 9742-9747)。 在本发明的某些实施方案中， 介导物是 5-25 个核苷酸的″小干扰″ RNA 双链体 (siRNA)。 siRNA 来 自 被 称 为 Dicer 的 RNAase 酶 加 工 dsRNA(Bernstein， E. 等 (2001)Nature 409 ： 363-366)。siRNA 双 链 体 产 物 被 募 集 入 称 为 RISC(RNA 诱 导 的 沉 默 复 合 体 ) 的 多 蛋 白 siRNA 复合体。尽管不希望被任何具体理论所束缚， 人们还是认为 RISC 被指引至靶核 酸 ( 适合的 mRNA)， 其中 siRNA 双链体以序列特异方式相互作用， 从而以催化形式介导切 割 (Bernstein， E. 等 (2001)Nature409 ： 363-366 ； Boutla， A. 等 (2001)Curr.Biol.11 ： 1776-1780)。适用于本发明的小干扰 RNA 可以根据本领域公知的方法和普通技术人员熟悉 的方法合成和使用。 用于本发明的方法中的小干扰 RNA 适合包含大约 1 到大约 50 个核苷酸 (nt)。在非限制性实施方案的实施例中， siRNA 可以包含大约 5- 大约 40 个 nt、 大约 5- 大 约 30 个 nt、 大约 10- 大约 30 个 nt、 大约 15- 大约 25 个 nt 或者大约 20-25 个核苷酸。
     使用自动比对核酸序列和指明同一性或同源性区域的计算机程序可以帮助选择 适合的寡核苷酸。 这类程序用于比较例如搜索数据库 ( 例如 GenBank) 或测序 PCR 产物所获 得的核酸序列。 比较不同物种之间的核酸序列允许选择物种间表现出适度同一性的核酸序 列。在没有进行基因测序的情形下， 进行 DNA 印迹 (Southern blots) 使得可以确定靶物种 和其它物种基因之间的同一性程度。通过进行如本领域公知的不同严格程度的 DNA 印迹， 可能获得同一性的近似值。 这些方法允许选择表现出与待控制对象的靶核酸序列具有高度 互补性的寡核苷酸， 以及选择与其它物种的相应核酸序列具有较低程度的互补性的寡核苷 酸。本领域技术人员将会意识到选择用于本发明的合适基因区域相当大的自由度。
     ″ 酶 促 RNA ″ 意 指 RNA 分 子 具 有 酶 活 性 (Cech， (1988)J.American.Med. Assoc.260， 3030-3035)。酶促核酸 ( 核酶 ) 通过首先结合靶 RNA 起作用。这种结合通过酶促核酸的靶结合部分实现， 该靶结合部分与所述 RNA 分子的起切割靶 RNA 作用的酶活性部 分非常靠近。因此酶促核酸首先识别靶 RNA， 然后通过碱基配对结合靶 RNA， 一旦结合到正 确的位点， 即发挥酶促作用切割靶 RNA。
     ″诱饵 RNA″意指模拟针对配体的天然结合结构域的 RNA 分子。因此诱饵 RNA 与 天然结合靶竞争结合特异性配体。例如， 已经证实过表达的 HIV 反式激活应答 (TAR)RNA 能作为″诱饵″， 并且有效结合 HIV tat 蛋白， 从而阻止其结合 HIV RNA 编码的 TAR 序列 (Sullenger 等 (1990)Cell， 63， 601-608)。这是一个具体的实例说明。本领域技术人员应 认识到这仅是一个实例， 利用本领域公知的方法可容易地产生其它实施方案。
     本文所用的术语″单体″通常指由磷酸二酯键或其类似物连接的单体， 从而形成 大小从几个单体单位 ( 例如大约 3-4 个 ) 到几百个单体单位的寡核苷酸。磷酸二酯键的类 似物包括硫代磷酸酯、 二硫代磷酸酯、 甲基膦酸酯、 硒代磷酸酯、 氨基磷酸酯等， 下文将进行 更全面的描述。
     术语″核苷酸″包括天然核苷酸和非天然核苷酸。本领域技术人员应该清楚的 是， 以前被认为是″非天然 ( 的 )″的各种核苷酸后来发现存在于在自然界中。因此″核 苷酸″不仅包括公知的包含嘌呤和嘧啶杂环的分子， 而且包括杂环类似物和其互变异构 体。其它类型核苷酸示例性的实例是包含以下碱基的分子 ： 腺嘌呤、 鸟嘌呤、 胸腺嘧啶、 胞 嘧啶、 尿嘧啶、 嘌呤、 黄嘌呤、 二氨基嘌呤、 8- 氧代 -N6- 甲基腺嘌呤、 7- 脱氮黄嘌呤、 7- 脱 氮鸟嘌呤、 N4， N4- 桥亚乙基胞嘧啶、 N6， N6- 桥亚乙基 -2， 6- 二氨基嘌呤、 5- 甲基胞嘧啶、 5-(C3-C6)- 炔基胞嘧啶、 5- 氟尿嘧啶、 5- 溴尿嘧啶、 假异胞嘧啶、 2- 羟基 -5- 甲基 -4- 三 唑并吡啶、 异胞嘧啶、 异鸟嘌呤、 肌苷， 以及描述于 Benner 等的美国专利公开号 5,432,272 中″非天然″核苷酸。术语″核苷酸″包括全部实例以及其类似物和互变异构体。特别 令人感兴趣的核苷酸是那些包含腺嘌呤、 鸟嘌呤、 胸腺嘧啶、 胞嘧啶和尿嘧啶的核苷酸， 它 们被认为是与人类治疗和诊断应用相关的天然核苷酸。核苷酸包含天然的 2′ - 脱氧和 2 ′ - 羟基糖 ( 例如描述于 Kornberg 和 Baker， DNA Replication， 第二版 (Freeman， San Francisco， 1992)) 和它们的类似物。
     关于核苷酸的″类似物″包括合成的具有修饰的碱基部分和 / 或修饰的糖部分 的核苷酸 ( 参见例如全面描述的下列文献 ： Scheit， Nucleotide Analogs， John Wiley， New York， 1980 ； Freier&Altmann， (1997)Nucl.Acid.Res.， 25(22)， 4429-4443， Toulmé， J.J.， (2001)Nature Biotechnology 19 ： 17-18 ； Manoharan M.， (1999)Biochemica et Biophysica Acta 1489 ： 117-139 ； Freier S.M.， (1997)Nucleic Acid Research， 25 ： 4429-4443， Uhlman， E.， (2000)Drug Discovery&Development， 3： 203-213， Herdewin P.， (2000)Antisense&Nucleic Acid Drug Dev.， 10 ： 297-310) ； 2′ -O， 3`-C- 连接的 [3.2.0] 二 环 阿 拉 伯 糖 核 苷 ( 参 见 例 如 N.K Christiensen. 等， (1998)J.Am.Chem.Soc.， 120 ： 5458-5463 ； Prakash TP， Bhat B.(2007)Curr Top Med Chem.7(7) ： 641-9 ； Cho EJ， 等 (2009)Annual Review of Analytical Chemistry， 2， 241-264)。 这样的类似物包括被设计 为提高结合特征 ( 例如双链体或三链体稳定性、 特异性等 ) 的合成核苷酸。
     本文所用的″杂交″意指寡聚化合物的基本互补链的配对。 一种配对机制包括氢 键， 其可以是寡聚化合物的链的互补核苷或核苷酸碱基 ( 核苷酸 ) 之间的华生 - 克里克、 或反 氢键。例如， 腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过氢键形成的配对互补核苷酸。杂交可以在各种条件下发生。
     反义化合物是″可特异性杂交的″是指 ： 反义化合物与靶核酸的结合干扰靶核酸 的正常功能而引起功能和 / 或活性的调节， 并且存在足够程度的互补性， 从而在期望特异 性结合的条件下 ( 即在体内测定或治疗处理情形的生理条件下， 和在体外测定中进行测定 的条件下 ) 避免反义化合物非特异性地结合非靶核酸序列。
     本文所用的短语″严格 ( 的 ) 杂交条件″或″严格 ( 的 ) 条件″是指这样的条件 ： 本发明的化合物将杂交至它的靶序列， 且只和最少数量的其它序列杂交。严格条件是序列 依赖的， 且在不同的条件下不同， 在本发明中， 寡聚化合物杂交至靶序列的″严格条件″取 决于寡聚化合物的本质和组成以及对它们进行研究的测定。 一般地， 严格 ( 的 ) 杂交条件包 ++ ++ 括低浓度 ( ＜ 0.15M) 盐和无机阳离子例如 Na 或 K ( 即低离子强度 )， 温度高于 20℃ -25℃ 但是低于寡聚化合物 : 靶序列复合体的 Tm， 以及存在变性剂例如甲酰胺、 二甲基甲酰胺、 二 甲亚砜或去污剂十二烷基硫酸钠 (SDS)。例如， 对于每 1％甲酰胺， 杂交率降低 1.1％。高严 格杂交条件的实例是 0.1X 氯化钠 - 柠檬酸钠缓冲液 (SSC)/0.1％ ( 重量 / 体积 )SDS， 60℃， 30 分钟。
     本文所用的″互补″指在一条或两条寡聚体链上的两个核苷酸之间的精确配对 的能力。例如， 如果反义化合物的某一位置上的核酸碱基 (nucleobase) 能与靶核酸的某一 位置的核酸碱基形成氢键， 所述靶核酸为 DNA、 RNA 或寡核苷酸分子， 那么所述寡核苷酸和 靶核酸之间的氢键位置就被看作为互补位置。 当每个分子的足够数量的互补位置被能彼此 形成氢键的核苷酸占据时， 则寡聚化合物和其它 DNA、 RNA 或寡核苷酸分子是彼此互补的。 因此， 术语″ ( 可 ) 特异性杂交 ( 的 )″和″互补 ( 的 )″是用于指示足够程度的精确配对 或者足够数量核苷酸的互补以便寡聚化合物和靶核酸之间发生稳定的特异性结合。 本领域应当理解寡聚化合物的序列不需要 100 ％互补于其将特异性杂交的靶核 酸序列。而且， 寡核苷酸可以杂交一个或多个区段， 从而相间隔的区或相邻的区段不参与 该杂交事件 ( 例如， 环结构、 错配或发夹结构 )。本发明的寡聚化合物与它们将靶向的靶 核酸序列内的靶区域具有至少大约 70％、 或至少大约 75％、 或者至少大约 80％、 或者至少 大约 85％、 或者至少大约 90％、 或者至少大约 95％、 或者至少大约 99％的序列互补性。例 如， 20 个核苷酸的反义化合物中 18 个核苷酸与靶区域互补并因此而特异性杂交， 则该反义 化合物表现 90％的序列互补性。在该实例中， 余下的非互补核苷酸可以与互补核苷酸是成 簇的或分散的， 且不需要彼此邻接或与互补核苷酸邻接。同样地， 长度为 18 个核苷酸的反 义化合物有 4 个非互补的核苷酸处于靶核酸序列完全互补的两个区域侧翼， 该反义化合物 与所述靶核酸的总互补性为 77.8％， 并且因此属于本发明的范围。反义化合物与靶核酸的 某区域的百分互补性可应用本领域公知的 BLAST 程序 (basic local alignment search tools( 碱 基 局 部 比 对 检 索 工 具 )) 和 PowerBLAST 程 序 常 规 测 定 (Altschul 等， (1990) J.Mol.Biol.， 215， 403-410 ； Zhang and Madden， (1997)Genome Res.， 7， 649-656)。百分同 源性、 序列同一性或互补性可以通过例如应用 Smith 和 Waterman 算法 (Adv.Appl.Math.， (1981)2， 482-489) 的 Gap 程序 (Wisconsin Sequence Analysis Package， Version 8for Unix， genetics Computer Group， University Research Park， Madison Wis.) 利用默认设 置确定。
     本文所用的术语″热熔点 (Tm)″指在规定的离子强度、 pH 和核酸浓度下， 50％的
     互补于靶序列的寡核苷酸与靶序列杂交达到平衡的温度。 通常， 严格条件是 ： 盐浓度至少是 大约 0.01 到 1.0M Na 离子浓度 ( 或其它盐 )， pH7.0-8.3， 温度对短寡核苷酸 ( 例如 10-50 个核苷酸 ) 是至少大约 30℃。严格条件也可以添加去稳定剂例如甲酰胺实现。
     本文所用的″调节″意指增加 ( 刺激 ) 或降低 ( 抑制 ) 基因的表达。
     术语″变体″， 当用于多核苷酸序列时， 可以包含与野生型基因相关的多核苷酸 序列。该定义也可以包括， 例如″等位基因 ( 的 )″、″剪接 ( 的 )″、″种 ( 的 )″或″ 多态性 ( 的 )″变体。剪接变体可以和参比分子有显著同一性， 但是由于 mRNA 加工中外显 子的可变剪接一般会含有更多或较少数量的多核苷酸。 相应的多肽可具有其它的功能性结 构域或缺失某些结构域。种变体是种与种之间相异的多核苷酸序列。在本发明特别有用的 是野生型基因产物的变体。变体可以由核酸序列中的至少一个突变所致， 且可以导致改变 的 mRNA 或者结构或功能可能有改变或没有改变的多肽。任何给定的天然或重组基因可能 没有等位基因形式， 也可能有一种或多种等位基因形式。导致变体的普通突变改变一般见 于核苷酸的天然缺失、 添加或置换。 这些改变类型的每一种都可以在给定序列中单独地、 或 与其它联合地出现一次或多次。
     得到的多肽一般彼此具有显著的氨基酸同一性。多态性变体是给定物种中不同 个体之间具体基因的多核苷酸序列的变异。多态性变体也可以包括″单核苷酸多态性 (SNP)″， 或是多核苷酸序列中一个碱基变化的单碱基突变。SNP 的存在可能说明例如某一 人群对某一疾病状态的倾向性， 即易感性 / 抵抗性。
     衍生多核苷酸包含进行了化学修饰的核酸， 例如烷基、 酰基或氨基基团取代氢。 衍 生物， 例如衍生寡核苷酸， 可以包含非天然部分， 例如改变的糖部分或糖间键合。其中的示 例是硫代磷酸酯和本领域公知的其它含硫种类。衍生核酸也可以包含标记， 包括放射性核 苷酸、 酶、 荧光试剂、 化学发光试剂、 显色剂、 底物、 辅因子、 抑制剂、 磁性颗粒等。
     ″衍生 ( 的 )″多肽或肽是被修饰的多肽或肽， 例如糖基化、 聚乙二醇化、 磷酸化、 硫酸化、 还原 / 烷基化、 酰化、 化学耦合或温和福尔马林处理。衍生物也可以被修饰为直接 或间接包含可检测的标记， 包括但是不限于放射性同位素、 荧光和酶标记。
     本文所用的术语″动物″或″患者″包括， 例如人、 绵羊、 麋鹿、 鹿、 长耳鹿、 水貂、 哺乳动物、 猴、 马、 牛、 猪、 山羊、 狗、 猫、 大鼠、 小鼠、 鸟类、 鸡、 爬行动物、 鱼、 昆虫和蜘蛛类。
     ″哺乳动物″包括通常处于医疗护理下的温血哺乳动物 ( 例如人和家畜 )。实例 包括猫科动物、 犬科动物、 马科动物、 牛科动物和人， 以及只包括人。
     ″治疗″覆盖哺乳动物疾病状态的治疗， 包括 ： (a) 预防疾病状态在哺乳动物出 现， 特别是当这种哺乳动物对这种疾病状态易感但还没有被诊断为患病时 ； (b) 抑制疾病 状态， 例如阻止其发展 ； 和 / 或 (c) 减轻疾病状态， 例如促成疾病状态的消退直至达到所需 最终状态。 治疗也包括疾病症状的改善 ( 例如减轻疼痛或不适 )， 其中这种改善可以或不可 以直接影响疾病 ( 例如引起、 传播、 表达等 )。
     本文所用的术语″癌症″指任何恶性肿瘤， 特别是源于肺、 肾或甲状腺的肿瘤。 癌 症本身可表现为″肿瘤″或包含这种癌症的恶性细胞的组织。肿瘤的实例包括各种肉瘤 和癌， 例如但不限于 ： 纤维肉瘤、 粘液肉瘤、 脂肪肉瘤、 软骨肉瘤、 骨肉瘤、 脊索瘤、 血管肉瘤、 内皮肉瘤、 淋巴管肉瘤、 淋巴管内皮肉瘤、 滑膜瘤、 间皮瘤、 尤因氏瘤 (Ewing′ s tumor)、 平 滑肌肉瘤、 横纹肌肉瘤、 结肠癌、 胰腺癌、 乳腺癌、 卵巢癌、 前列腺癌、 鳞状上皮细胞癌、 基底细胞癌、 腺癌、 汗腺癌、 皮脂腺癌、 乳头状癌、 乳头状腺癌、 囊腺癌、 髓样癌、 支气管癌、 肾细胞 癌、 肝癌、 胆管癌、 绒毛膜癌、 精原细胞瘤、 胚胎性癌、 维尔姆斯氏肿瘤 (Wilms′ tumor)、 子 宫颈癌、 睾丸肿瘤、 肺癌、 小细胞肺癌、 膀胱癌、 上皮癌、 神经胶质瘤、 星形细胞瘤、 髓母细胞 瘤、 颅咽管瘤、 室管膜瘤、 松果体瘤、 成血管细胞瘤、 听神经瘤、 少突神经胶质瘤、 脑膜瘤、 黑 素瘤、 成神经细胞瘤和视网膜母细胞瘤。如上所述， 本发明特别允许肺、 肾和甲状腺瘤的鉴 别诊断。
     多核苷酸和寡核苷酸组合物和分子
     靶 / 目标 ： 在一个实施方案中， 靶包含肿瘤抑制基因的核酸序列， 包括但不限于和 肿瘤抑制基因相关的有义和 / 或反义非编码和 / 或编码序列。
     肿瘤抑制基因是其产物的作用是控制细胞分裂的基因。它们和癌基因的区别在 于如果没有达到生长的条件， 肿瘤抑制基因产生抑制细胞分裂的产物。触发细胞 ‘刹车’ 的 条件包括 DNA 损伤、 缺乏生长因子或分裂装置的缺陷。当肿瘤抑制基因突变而造成其功能 丧失或降低时， 通常组合其它遗传改变， 细胞可能发展为癌症。 这和以其突变形式获得功能 ( 或者丧失被控制的能力 ) 的癌基因相反。肿瘤抑制基因的实例包括 p53(TP53) ： 一种调节 细胞分裂的转录因子 ； Rb ： 改变转录因子的活性和因此控制细胞分裂 ； APC ： 控制转录因子 的可用性 ； BRCA ： 参与 DNA 修复。
     p53 肿瘤抑制基因在各种类型的应激作用下， 发挥抗增殖作用， 包括生长停滞、 凋 亡和细胞衰老 (Levine A.J.， (1997)Cell 88 ： 323-31 ； Oren M.， (1999)J.Biol.Chem.274 ： 36031-034)。 p53 可被认为是监控来自不同来源的信号传导通路的调节回路的中枢节点， 包 括 DNA 损伤反应 ( 例如 ATM/ATR 激活 )、 异常致癌事件 ( 例如 Myc 或 Ras 激活 ) 和日常细 胞活动 ( 例如生长因子刺激 )。尽管 p53 突变见于所有人类肿瘤一半以上 (Hollstein 等， (1999)Mutat Res.431 ： 199-209)， 但是保有野生型 p53 的肿瘤细胞中发现 p53 通路的其它 组分 ( 例如 ARF 肿瘤抑制基因 ) 的缺陷 (Sherr， C.J.， (2001)Nat Rev Mol Cell Biol 2 ： 731-737 ； Sharpless N.E. 等， (2004)J Clin Invest 113 ： 160-8)。p53 通路的激活看起来 是人癌症的常见 ( 如果不是普遍的话 ) 特征。
     调节这些多核苷酸对治疗其中异常细胞增殖起作用的癌症和其它障碍有极大的 好处。 例如， p53 是一种短命的蛋白， 其活性在正常细胞中保持低水平。 抑制肿瘤需要的 p53 的分子功能包括 p53 作为调节内源基因表达的转录因子的能力。因此 p53 自身的调节在它 对肿瘤发生的作用和维持正常细胞生长都很重要。 反义化合物是特异性可杂交的化合物是 指： 反义化合物结合靶 DNA 或 RNA 而引起功用丧失， 并且具有足够程度的互补性， 以避免在 特异性结合是理想的条件下时反义化合物非特异性地结合非靶核酸序列， 所述条件即体内 测定或治疗性处理情形下的生理条件和体外测定时进行测定的条件。
     表 1 列出了一些肿瘤抑制基因
     应该明白该列表是非限制性的。 本发明包括使用本文未特别列出的其它肿瘤抑制 基因。 在肿瘤抑制基因领域工作的技术人员能鉴别例如描述于出版文献中的其它肿瘤抑制 基因。
     应该理解的是在上表 1 中， 指明的基因意指基因和其所有目前已知的变体， 包括 基因和其变体能产生的不同 mRNA 转录物， 可被阐明的进一步的基因变体和反义序列。该列 表也包括非编码 RNA 分子或多核苷酸的部分。但是一般这种变体和上表 1 中的任何多核 苷酸序列具有显著的序列同一性， 例如变体和上表 1 中的序列具有至少大约 70％的序列同 一性， 通常和上表 1 中的序列具有至少大约 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 97％、 98％或 99％ 的序列同一性。变体序列同一性可以通过许多标准方法例如 BLAST 程序 (ncbi.nclm.nih. gov/blast/) 测定。
     在另一个实施方案中， 寡核苷酸对一种或多种抑制异常细胞生长或肿瘤的分子是 特异性的。这包括抑制分子活性的因子 ( 例如转化细胞 )、 参与前肿瘤时期的因子、 恶变、 前转移、 转移等。其它实例包括但不限于 ： 发育基因产物 ( 例如黏着分子、 细胞周期激酶抑 制子、 Wnt 家族成员、 Pax 家族成员、 Winged 螺旋家族成员、 Hox 家族成员、 细胞因子 / 淋巴
     因子和它们的受体、 生长 / 分化因子和它们的受体、 神经递质和它们的受体 ) ； 癌基因产物 ( 例如 ABL1、 BCL1、 BCL2、 BCL6、 CBFA2、 CBL、 CSF1R、 ERBA、 ERBB、 ERB2、 ETS1、 ETV6、 FGR、 FOS、 FYN、 HCR、 HRAS、 JUN、 KRAS、 LCK、 LYN、 MDM2、 MLL、 MYB、 MYC、 MYCL1、 MYCN、 NRAS、 PIM1、 PML、 RET、 SRC、 TAL1、 TCL3 和 YES) ； 肿瘤抑制基因产物 ( 例如 APC、 BRCA1、 BRCA2、 MADH4、 MCC、 NF1、 NF2、 RBI、 TP53 和 WT1) 和酶 ( 例如 ACC 合酶和氧化酶、 ACP 去饱和酶和羟化酶、 ADP 葡糖焦磷酸 化酶、 三磷酸腺苷酶、 醇脱氢酶、 淀粉酶、 淀粉葡萄糖苷酶、 过氧化氢酶、 纤维素酶、 查耳酮合 酶、 几丁质酶、 环加氧酶、 脱羧酶、 糊精酶、 DNA 和 RNA 聚合酶、 半乳糖苷酶、 葡聚糖酶、 葡萄糖 氧化酶、 颗粒结合淀粉合酶、 鸟苷三磷酸酶、 解螺旋酶、 半纤维素酶、 整合酶、 复旋花粉酶、 转 化酶、 异构酶、 激酶、 乳糖酶、 脂肪酶、 脂加氧酶、 溶菌酶、 胭脂氨酸合成酶、 章鱼碱合酶、 果胶 酯酶、 过氧化物酶、 磷酸酶、 磷脂酶、 磷酸化酶、 肌醇六磷酸酶、 植物生长调节子合成酶、 多聚 半乳糖醛酸酶、 蛋白酶和肽酶、 支链淀粉酶 (pullanases)、 重组酶、 反转录酶、 RUBISCOs、 拓 扑异构酶和木聚糖酶 )。
     可用反义化合物获得的从干细胞再生的细胞 / 组织治疗的示例性的肿瘤抑制基 因介导的疾病和障碍包括凋亡减少或增加的相关性疾病、 组织 / 细胞老化、 癌症 ( 包括列 示于表 1 的癌症 )、 自身免疫性疾病、 包括艾滋病的免疫缺陷病、 衰老、 神经变性疾病或障碍 ( 例如阿尔茨海默氏病、 运动失调性毛细血管扩张症、 帕金森氏病、 肌萎缩性脊髓侧索硬化 (ALS)、 亨廷顿氏病等 )、 增生疾病 ( 例如瘢痕瘤 )、 类风湿性关节炎、 冠心病、 局部缺血性细 胞死亡、 淋巴增生性障碍、 动脉粥样硬化、 骨质疏松症、 骨髓增生异常综合征、 毒素诱发性疾 病和病毒感染、 伤口愈合、 考登氏病 (CD)、 Lhermitte-Duclos 病 (LDD)、 Bannayan-Zonana 综 合征 (BZS， 也称为 Bannayan-Riley-Ruvalcaba 综合征、 Ruvalcaba-Myhre-Smith 综合征和 Riley-Smith 综合征 )、 移植、 凋亡相关性疾病或障碍、 在急性病中调节凋亡的代谢疾病或 病症 ( 例如糖尿病 )、 肾病或障碍、 心肌梗塞 / 心力衰竭、 局部缺血、 脓毒症、 其中特别的造血 炎症细胞过量的炎性疾病、 增殖性疾病、 或者其中有治疗范例通过增加凋亡治疗炎症性疾 病的疾病或障碍。
     在一个优选的实施方案中， 寡核苷酸对肿瘤抑制基因多核苷酸是特异性的， 肿瘤 抑制基因多核苷酸包括但并不限于非编码区域。肿瘤抑制基因靶包含肿瘤抑制基因的变 体、 肿瘤抑制基因的突变体 ( 包括 SNP)、 肿瘤抑制基因的非编码序列、 等位基因、 片段等。 优 选寡核苷酸是反义 RNA 分子。
     根据本发明的实施方案， 靶核酸分子并不仅限于肿瘤抑制基因多核苷酸， 还延伸 到肿瘤抑制基因的任何同种型、 受体、 同系物、 非编码区域等。
     在另一个优选的实施方案中， 寡核苷酸靶向肿瘤抑制基因靶的天然反义序列 ( 编 码和非编码区域的天然反义序列 )， 其包括但不限于它的变体、 等位基因、 同系物、 突变体、 衍生物、 片段和互补序列。优选寡核苷酸是反义 RNA 或 DNA 分子。
     在另一个优选的实施方案中， 本发明的寡聚化合物也包括在化合物的一个或多个 核苷酸位置上存在不同碱基的变体。 例如， 如果第一个核苷酸是腺嘌呤， 那么可产生在此位 置包含胸腺嘧啶核苷、 鸟苷、 胞苷或其它天然或非天然的核苷酸的变体。 这可以在反义化合 物的任何位置上进行。然后通过本文描述的方法测试这些化合物， 以确定它们抑制靶核酸 表达的能力。
     在一些实施方案中， 反义化合物和靶之间的同源性、 序列同一性或互补性大约50％到大约 60％。 在一些实施方案中， 同源性、 序列同一性或互补性大约 60％到大约 70％。 在一些实施方案中， 同源性、 序列同一性或互补性大约 70％到大约 80％。在一些实施方案 中， 同源性、 序列同一性或互补性大约 80％到大约 90％。在一些实施方案中， 同源性、 序列 同一性或互补性是大约 90％、 大约 92％、 大约 94％、 大约 95％、 大约 96％、 大约 97％、 大约 98％、 大约 99％或大约 100％。
     反义化合物是特异性杂交的是指 ： 反义化合物结合靶核酸时， 干扰靶核酸的正常 功能而引起活性丧失， 并且有足够程度的互补性， 以在期望特异性结合的条件下避免反义 化合物非特异性地结合非靶核酸序列， 所述条件包括在体内测定或治疗性处理情形下的生 理条件和在体外测定情形下进行测定的条件。
     反义化合物， 不管是 DNA、 RNA、 嵌合体、 取代的化合物等， 都是特异性杂交的， 表现 为： 反义化合物结合靶 DNA 或 RNA 分子时， 干扰靶 DNA 或 RNA 的正常功能， 进而引起功效丧 失， 并且有足够程度的互补性， 以在期望特异性结合的条件下避免反义化合物非特异性地 结合非靶核酸序列， 这种条件包括在体内测定或治疗性处理情形下的生理条件和在体外测 定情形下进行测定的条件。
     在另一个优选的实施方案中， 靶向肿瘤抑制基因 ( 包括但不限于利用例如 PCR、 杂 交等鉴定或扩增的反义序列， SEQ ID NO. ： 4、 5、 6、 6a、 6b、 7、 8 和 9 等中的一种或多种序列 ) 调节肿瘤抑制基因的表达或功能。 在一个实施方案中， 表达或功能相对于对照是上调的。 在 另一个优选的实施方案中， 表达或功能相对于对照是下调的。
     在另一个优选的实施方案中， 寡核苷酸包括 SEQ ID NO ： 10-30 所示的核酸序列， 包 括利用例如 PCR、 杂交等鉴定或扩增的反义序列。这些寡核苷酸可以包含一种或多种修饰 的核苷酸、 较短或较长的片段、 修饰的键等。 修饰的键或核苷酸间键合的实例包括硫代磷酸 酯、 二硫代磷酸酯等。在另一个优选的实施方案中， 核苷酸包含磷衍生物。可以结合本发明 修饰的寡核苷酸的糖或糖类似物部分的磷衍生物 ( 或修饰的磷酸基团 ) 可以是一磷酸、 二 磷酸、 三磷酸、 烷基磷酸、 链烷磷酸、 硫代磷酸等。 制备上述的磷酸类似物并将它们掺入核苷 酸、 修饰的核苷酸和寡核苷酸本身也是公知的， 不需要在此描述。
     本领域技术人员可利用反义的特异性和灵敏性用于治疗用途。 反义寡核苷酸已经 作为治疗剂部分用于治疗动物和人的疾病。反义寡核苷酸已被安全和有效地给予人， 并且 无数临床试验目前也在进行中。因此确定寡核苷酸是有益的治疗形式， 配置后可用于治疗 细胞、 组织和动物、 尤其是人的治疗方案。
     在本发明的实施方案中， 反义寡聚化合物、 特别是寡核苷酸结合靶核酸分子， 并调 节靶基因编码的分子的表达和 / 或功能。可干扰的 DNA 的功能包括例如复制和转录。可干 扰的 RNA 的功能包括所有重要的功能， 例如转移 RNA 至蛋白翻译位点、 由 RNA 翻译蛋白、 剪 接 RNA 产生一种或多种 mRNA 和由 RNA 进行或促进的催化活性。根据所需的功能， 这些功能 可被上调或抑制。
     反义化合物包括杂交至靶核酸至少一部分的反义寡聚化合物、 反义寡核苷酸、 外 部指导序列 (EGS) 寡核苷酸、 可变剪接子、 引物、 探针和其它寡聚化合物。同样， 这些化合物 可以单链、 双链、 部分单链或环形寡聚化合物的形式导入。
     在本发明中， 反义化合物靶向具体核酸分子可以是多步骤的过程。该过程通常开 始是鉴定需要调节其功能的靶核酸。 该靶核酸可以是例如其表达与具体病症或疾病状态相关的细胞基因 ( 或自该基因转录的 mRNA)， 或者来自传染致病因子的核酸分子。本发明中， 靶核酸编码肿瘤抑制基因。
     靶向过程通常还包括在靶核酸内确定至少一个发生反义相互作用的靶区域、 片段 或位点， 以便产生所需的效应 ( 例如调节表达 )。在本发明中， 术语″区 / 区域″被定义为 具有至少一种可鉴定结构、 功能或特征的靶核酸部分。 在靶核酸的区域内是区段。 ″区段″ 被定义为靶核酸内的区域中的较小部分或亚部分。 本发明所用的″位点″被定义为靶核酸 内的位置。
     在优选的实施方案中， 反义寡核苷酸结合肿瘤抑制基因的天然反义序列并调节肿 瘤抑制基因 (SEQ ID NO ： 1、 2 和 3) 的表达和 / 或功能。反义序列的实例包括 SEQ ID NO ： 4-30。
     在另一个优选的实施方案中， 反义寡核苷酸结合肿瘤抑制基因多核苷酸的一个或 多个区段， 并调节肿瘤抑制基因的表达和 / 或功能。区段包含肿瘤抑制基因有义或反义多 核苷酸的至少 5 个连续核苷酸。
     在另一个优选的实施方案中， 反义寡核苷酸对肿瘤抑制基因的天然反义序列是特 异的， 其中反义寡核苷酸与肿瘤抑制基因的天然反义序列结合调节肿瘤抑制基因的表达和 / 或功能。
     在另一个优选的实施方案中， 寡核苷酸化合物包括 SEQ ID NO ： 10-30 所示的序列， 利用例如 PCR、 杂交等鉴定和扩增的反义序列。 这些寡核苷酸可以包含一个或多个修饰的核 苷酸、 较短或较长的片段、 修饰的键等。修饰的键或核苷酸间键合的实例包含硫代磷酸酯、 二硫代磷酸酯等。在另一个优选的实施方案中， 核苷酸包含磷衍生物。可以结合本发明修 饰的寡核苷酸的糖或糖类似物部分的磷衍生物 ( 或修饰的磷酸基团 ) 可以是一磷酸、 二磷 酸、 三磷酸、 烷基磷酸、 链烷磷酸、 硫代磷酸等。制备上述磷酸类似物和将它们掺入核苷酸、 修饰的核苷酸和寡核苷酸本身同样是公知的， 不需要在此描述。
     如本领域公知的， 由于翻译起始密码子通常是 5′ -AUG( 在转录的 mRNA 分子中 ； 而对应的 DNA 分子中是 5′ -ATG)， 所以翻译起始密码子也称作″ AUG 密码子″、 ″起始密 码子″或″ AUG 起始密码子″。少数基因具有 RNA 序列为 5′ -GUG、 5′ -UUG 或 5′ -CUG 的翻译起始密码子 ； 已显示 5′ -AUA、 5′ -ACG 和 5′ -CUG 在体内具有功能。因此术语″ 翻译起始密码子″和″起始密码子″可包含许多密码子序列， 但是每种情况下的起始氨基 酸通常都是甲硫氨酸 ( 在真核生物中 ) 或甲酰甲硫氨酸 ( 在原核生物中 )。真核和原核基 因可以有两个或更多个可选起始密码子， 在具体细胞类型或组织中或在具体条件组下， 其 中一种起始密码子可被优选用于翻译起始。在本发明中， ″起始密码子″和″翻译起始密 码子″指不管密码子序列如何， 体内用于启动从编码肿瘤抑制基因的基因转录的 mRNA 的 翻译的密码子。基因的翻译终止密码子 ( 或″终止密码子″ ) 可具有以下三个序列中的一 种， 即 5′ -UAA、 5′ -UAG 和 5′ -UGA( 它们对应的 DNA 序列分别是 5′ -TAA、 5′ -TAG 和 5′ -TGA)。
     术语″起始密码子区域″和″翻译起始密码子区域″指从翻译起始密码子的任 一方向 ( 即 5′或 3′ ) 包含大约 25 个到大约 50 个连续核苷酸的 mRNA 或基因的部分。 类似 地， 术语″终止密码子区域″和″翻译终止密码子区域″指从翻译终止密码子的任一方向 ( 即 5′或 3′ ) 包含大约 25 个到大约 50 个连续核苷酸的 mRNA 或基因的部分。因此，″起始密码子区域″ ( 或″翻译起始密码子区域″ ) 和″终止密码子区域″ ( 或″翻译终止 密码子区域″ ) 是可以被本发明的反义化合物有效靶中的所有区域。
     开放阅读框 (ORF) 或″编码区″， 本领域公知指翻译起始密码子和翻译终止密码 子之间的区域， 它也是可以有效靶中的区域。 在本发明上下文中， 中靶区域是包含基因开放 阅读框 (ORF) 的翻译起始密码子或终止密码子的基因内区域。
     另一个靶区域包括 5′非翻译区域 (5′ UTR)， 本领域公知指始自翻译起始密码子 的 mRNA 5′方向的部分， 因此包含 mRNA 5′帽位点和翻译起始密码子之间的核苷酸 ( 或 基因上对应的核苷酸 )。再一个靶区域包含 3′非翻译区域 (3′ UTR)， 本领域公知指始自 翻译终止密码子的 mRNA3′方向的部分， 因此包含翻译终止密码子和 mRNA 3′末端之间的 核苷酸 ( 或基因上对应的核苷酸 )。mRNA 的 5′帽位点包含 N7 甲基化的鸟苷残基， 其通过 5′ -5′三磷酸酯键合与 mRNA 5′末端残基结合。mRNA 的 5′帽区域被认为包含 5′帽结 构本身和与该帽位点相邻的前 50 个核苷酸。本发明的另一个靶区域是 5′帽区域。
     虽然一些真核 mRNA 转录物可被直接翻译， 但是许多 mRNA 转录物包含一个或多个 在其翻译之前从转录物切除掉的称为″内含子″的区域。余下的 ( 并因此翻译的 ) 区域称 为″外显子″， 被拼接在一起形成连续的 mRNA 序列。 在一个实施方案中， 靶向剪接位点 ( 即 内含子 - 外显子接点或外显子 - 内含子接点 ) 尤其有益于下列情形 ： 疾病涉及异常剪接， 或 疾病涉及过度产生特殊的剪接产物。 靶位点的另一个实施方案是由于重排或缺失而带来的 异常融合连接。通过剪接加工两种 ( 或更多种 ) 从不同基因来源的 mRNA 而产生的 mRNA 转 录物称为″融合转录物″。利用靶向例如 DNA 或 pre-mRNA 的反义化合物可以有效地靶中 内含子。
     在另一个优选的实施方案中， 反义寡核苷酸结合靶多核苷酸的编码和 / 或非编码 区域， 并调节靶分子的表达和 / 或功能。
     在另一个优选的实施方案中， 反义寡核苷酸结合天然反义多核苷酸， 并调节靶分 子的表达和 / 或功能。
     在另一个优选的实施方案中， 反义寡核苷酸结合有义多核苷酸， 并调节靶分子的 表达和 / 或功能。
     选择性 (altemative)RNA 转录物可以从 DNA 的相同基因组区域产生。这些选择性 转录物一般称为″变体″。更具体地，″ premRNA 变体″是由相同基因组 DNA 产生的、 与 在起始位置或终止位置不同的相同基因组 DNA 产生的其它转录物的转录物， 并且包含内含 子和外显子序列。
     在剪接时剪切掉一个或多个外显子或内含子区域、 或它们的部分， premRNA 变体产 生较小″ mRNA 变体″。因此， mRNA 变体是剪接后的 premRNA 变体， 每个独特的 premRNA 变 体必定总是产生作为剪接结果的独特 mRNA 变体。这些 mRNA 变体也称为″选择性剪接变 体″。如果没有对 premRNA 变体的剪接， 则 premRNA 变体与 mRNA 变体相同。
     变体可通过利用起始或终止转录的选择性信号产生。 premRNA 和 mRNA 可以具有不 止一个起始密码子或终止密码子。源自使用选择性起始密码子的 premRNA 或 mRNA 的变体 称为 premRNA 或 mRNA 的″选择性起始变体″。使用选择性终止密码子的那些转录物称为 premRNA 或 mRNA 的″选择性终止变体″。一种选择性终止变体的具体类型是″多聚 A 变 体″， 其中产生的多种转录物因为转录装置选择性选择″多聚 A 终止信号″的一种而来，因此产生终止在独特多聚 A 位点的转录物。在本发明中， 本文描述的各种类型变体也是靶 核酸的实施方案。
     靶核酸上反义化合物杂交的位置定义为活性反义化合物靶向的靶区域的至少 5 个核苷酸长度部分。
     虽然本文给出了某些示例性靶区段的具体序列， 但是本领域技术人员应认识到这 些是作为举例说明和描述的本发明范围内的具体的实施方案。 本领域普通技术人员根据本 申请公开内容可容易地鉴定其它靶区段。
     包含一段至少 5 个连续核苷酸的、 选自举例说明性优选靶区段的 5-100 个核苷酸 长度的靶区段被认为是合适的靶。
     靶区段可以包括 DNA 或 RNA 序列， 其包含举例说明性的优选靶区段之一的自 5′ 末端的至少 5 个连续核苷酸 ( 余下的核苷酸是同一 DNA 或 RNA 的连续核苷酸段， 从靶区段 的 5′末端上游开始到 DNA 或 RNA 包含大约 5 个到大约 100 个核苷酸 )。类似的是， 优选的 靶区段由 DNA 或 RNA 序列代表， 其包含举例说明性的优选靶区段之一的自 3′末端的至少 5 个连续核苷酸 ( 余下的核苷酸是同一 DNA 或 RNA 的连续核苷酸段， 从靶区段的 3′末端下游 开始直到 DNA 或 RNA 包含大约 5 个到大约 100 个核苷酸 )。本领域技术人员根据本文举例 说明的靶区段能鉴定 ( 无需过度试验 ) 进一步优选的靶区段。
     鉴定一个或多个靶区域、 区段或位点后， 选择将与靶有足够互补程度的反义化合 物 ( 即充分杂交和足够特异性 )， 从而产生所需效果。
     在本发明的实施方案中， 寡核苷酸结合具体靶的反义链。寡核苷酸长度为至少 5 个核苷酸， 它们可以合成， 这样每个寡核苷酸靶向重叠序列， 以便合成的多个寡核苷酸覆盖 靶多核苷酸的全长。靶也包括编码和非编码区域。
     在一个实施方案中， 优选由反义寡核苷酸靶向具体的核酸。使反义化合物靶向具 体核酸是多步骤过程。该过程通常开始是鉴定需要调节其功能的核酸序列。这可以是例如 其表达与具体病症或疾病状态相关的细胞基因 ( 或该基因转录的 mRNA)， 或者非编码多核 苷酸， 例如非编码 RNA(ncRNA)。
     RNA 可分类成 (1) 翻译为蛋白的信使 RNA(mRNA)， 和 (2) 非蛋白编码 RNA(ncRNA)。 ncRNA 包含微小 RNA、 反义转录物和包含高密度的终止密码子和缺乏任何延展性″开放阅 读框″的其它转录单位 (TU)。许多 ncRNA 看起来是从蛋白编码基因座的 3′非翻译区域 (3′ UTR) 的起始位点开始。ncRNA 通常罕见， FANTOM 组织 (the FANTOM consortium) 测 序的至少半数的 ncRNA 似乎没有多腺苷酸化。大多数研究人员因为显而易见的原因集中 研究加工多腺苷酸化 mRNA 和输送至细胞质。最近表明非多腺苷酸化核 RNA 的集合可能非 常大， 许多这种转录物源自所谓的基因间区域 (Cheng， J. 等 (2005)Science 308(5725)， 1149-1154 ； Kapranov， P. 等 (2005).Genome Res 15(7)， 987-997)。ncRNA 可以调控基因表 达的机制是通过与靶转录物的碱基配对。通过碱基配对起作用的 RNA 可分组为 (1) 顺式编 码 RNA ： 其在相同遗传位点被编码， 但是它们作用于 RNA 的相反链， 因此展现出与它们的靶 完美的互补性， 和 (2) 反式编码 RNA ： 它们在与它们作用的 RNA 不同的染色体位点上编码， 一般不具有与它们的靶完美的碱基配对潜力。
     不希望被任何理论所束缚， 通过本文描述的反义寡核苷酸干扰反义多核苷酸能改 变相应的有义 mRNA 的表达。但是， 这种调节可以是不协调的 ( 反义敲低 (knockdown) 导致mRNA 升高 ) 或协调的 ( 反义敲低导致伴随的 mRNA 减少 )。在这些情况下， 反义寡核苷酸可 靶向反义转录物的重叠或非重叠部分， 导致其敲低或隔绝。编码和非编码反义序列能以相 同的方式靶向， 任一种类都能以协调或不协调的方式调节对应的有义转录物。用于鉴定对 抗靶使用的新寡核苷酸的策略可以根据反义寡核苷酸敲低反义 RNA 转录物或任何其它调 节所需靶的方式。
     策略 1 ： 在不协调调节的情形下， 敲低反义转录物增加常规 ( 有义 ) 基因的表达。 如果后面的基因编码已知或推定的药物靶， 那么敲低其反义对应物能令人信服地模拟受体 激动剂或酶刺激剂的作用。
     策略 2 ： 在协调调节的情形下， 人们可同时敲低反义和有义转录物， 因此实现常规 ( 有义 ) 基因表达的协同减少。例如， 如果反义寡核苷酸用于实现敲低， 那么这种策略可用 于使一个反义寡核苷酸靶向有义转录物， 且另一个反义寡核苷酸靶向对应的反义转录物， 或者单一有力的对称反义寡核苷酸同时靶向重叠的有义和反义转录物。
     根据本发明， 反义化合物包括杂交至靶核酸至少一部分并调节其功能的反义寡核 苷酸、 核酶、 外部指导序列 (EGS) 寡核苷酸、 siRNA 化合物、 单链或双链 RNA 干扰 (RNAi) 化 合物 ( 例如 siRNA 化合物 ) 和其它寡聚化合物。因此， 它们可以是 DNA、 RNA、 DNA 样、 RNA 样 或它们的组合， 或可以是这些中的一种或多种的模拟物。这些化合物可以是单链、 双链、 环 状或发夹寡聚化合物， 可以包含结构元素 ( 例如内部或末端膨胀、 错配或环 )。反义化合物 可以按常规制备成为线性的， 但是也可以结合或制备成环状和 / 或分枝状。反义化合物可 以包括各种构建体， 例如两条链杂交形成全部或部分双链化合物或具有足够自身互补性的 单链杂交和形成全部或部分双链的化合物。两条链可以内部连接而留下游离 3′或 5′末 端， 或可以连接而形成连续的发夹结构或环。发夹结构可以在 5′或 3′末端包含产生单链 性状延伸的突出端。双链化合物任选在末端包含突出端。进一步的修饰可以包括连接到一 个末端、 选定的核苷酸位置、 糖位置或一个核苷间键合的缀合基团。或者， 两条链可以通过 非核酸部分或连接基团连接。当仅由一条链形成时， dsRNA 可以形成自身对折形成双链体 的自身互补的发夹型分子。因此， dsRNA 可以是完整或部分的双链。可通过在转基因细胞 系中稳定表达 dsRNA 发夹实现基因表达的特异性调节， 但是在一些实施方案中， 基因表达 或功能是上调的。当由两条链形成或自身互补单链对折形成双链体的发夹型分子时， 两条 链 ( 或单链的双链体形成区域 ) 是华生 - 克里克形式碱基配对的互补 RNA 链。
     一旦导入系统， 本发明的化合物可以引发一种或多种酶或结构蛋白的作用， 实现 对靶核酸的切割或其它修饰， 或者可以通过占领型 (occupancy-based) 机制而发挥作用。 通常， 核酸 ( 包括寡核苷酸 ) 可以描述为″ DNA 样″ ( 即一般具有一个或多个 2′脱氧糖， 和一般为 T 而非 U 碱基 ) 或″ RNA 样″ ( 即一般具有一个或多个 2′羟基或 2′修饰糖， 和 一般为 U 而非 T 碱基 )。核酸螺旋可以采用不止一种结构类型， 最常见的是 A 和 B 型。据 信， 一般具有 B 型样结构的寡核苷酸是″ DNA 样″的， 而那些具有 A 型样结构的寡核苷酸则 是″ RNA 样″的。在一些 ( 嵌合 ) 实施方案中， 反义化合物可以包含 A 型和 B 型区域。
     在另一个优选的实施方案中， 所需的寡核苷酸或反义化合物包含至少一种以下物 质： 反义 RNA、 反义 DNA、 嵌合反义寡核苷酸、 包含修饰键的反义寡核苷酸、 干扰 RNA(RNAi)、 短干扰 RNA(siRNA)、 微小干扰 RNA(miRNA)、 小时序 RNA(stRNA)、 或短发夹 RNA(shRNA)、 小 RNA 诱导的基因激活 (RNAa)、 小激活 RNAs(saRNAs) 或它们的组合。dsRNA 也可以激活基因表达， 其是被称为″小 RNA 诱导的基因激活″或 RNAa 的机 制。dsRNA 靶向基因启动子诱导相关基因有效的转录激活。RNAa 利用合成 dsRNA 已在人细 胞得到了证实， 称为″小激活 RNAs″ (saRNA)。目前不知道 RNAa 是否在其它生物中保守存 在。
     小双链 RNA(dsRNA)， 例如小干扰 RNA(siRNA) 和微小 RNA(miRNA)， 已被发现触发进 化保守的称为 RNA 干扰 (RNAi) 的机制。 RNAi 通过重塑染色质总是导致基因沉默， 从而抑制 转录、 降解互补 mRNA 或阻断蛋白翻译。但是， 在随后实施例部分详细描述的情况中， 显示寡 核苷酸增强肿瘤抑制基因多核苷酸和其编码产物的表达和 / 或功能。dsRNA 也可以充当小 激活 RNA(saRNA) 的角色。不希望被理论所束缚， 通过靶向基因启动子的序列， saRNA 诱导 靶基因表达的现象称为 dsRNA 诱导的转录激活 (RNAa)。
     在进一步的实施方案中， 本文鉴定的″优选靶区段″可以用于筛选调节肿瘤抑制 基因多核苷酸表达的其它化合物。 ″调节剂″是降低或增加编码肿瘤抑制基因的核酸分子 的表达的那些化合物， 其至少包含与优选靶区段互补的 5 个核苷酸部分。筛选方法包括的 步骤是 ： 使编码肿瘤抑制基因的有义或天然反义多核苷酸的核酸分子的优选靶区段与一种 或多种候选调节剂接触， 和选择降低或增加编码肿瘤抑制基因多核苷酸的核酸分子表达的 一种或多种候选调节剂 ( 例如 SEQ ID NO ： 10-30)。一旦显示候选调节剂或调节剂能调节 ( 例如降低或增加 ) 编码肿瘤抑制基因多核苷酸的核酸分子的表达， 则该调节剂可以进一 步用于研究肿瘤抑制基因多核苷酸的功能， 或用作本发明的研究、 诊断或治疗制剂。
     靶 向 天 然 反 义 序 列 优 选 调 节 靶 基 因 的 功 能， 例 如 p73 基 因 (NCBI 注 册 号 ： NM_005427.2)、 p53 基 因 (NCBI 注 册 号 ： NM_000546.4) 和 PTEN 基 因 (NCBI 注 册 号 ： NM_000314)。在优选的实施方案中， 靶是肿瘤抑制基因的反义多核苷酸。在优选的实施方 案中， 反义寡核苷酸靶向肿瘤抑制基因多核苷酸的有义和 / 或天然反义序列 (p73 ： NCBI 注 册号 ： NM_005427.2 ； p53 ： NCBI 注册号 ： NM_000546.4 ； PTEN ： NCBI 注册号 ： NM_000314)、 它们 的变体、 等位基因、 同种型、 同系物、 突变体、 衍生物、 片段和互补序列。 优选寡核苷酸是反义 分子， 靶包括反义和 / 或有义肿瘤抑制基因多核苷酸的编码和非编码区域。
     本发明优选的靶区段也可以和本发明它们各自的互补反义化合物结合， 从而形成 稳定的双链 ( 双链体 ) 寡核苷酸。
     这种双链寡核苷酸部分已经在本领域显示通过反义机制调节靶表达和调节翻译 以及 RNA 剪接。另外， 双链部分可以进行化学修饰 (Fire 等， (1998)Nature， 391， 806-811 ； Timmons and Fire， (1998)Nature， 395， 854 ； Timmons 等， (2001)gene， 263， 103-112 ； Tabara 等， (1998)Science， 282， 430-431 ； Montgomery 等， (1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 95， 15502-15507 ； Tuschl 等， (1999)genes Dev.， 13， 3191-3197 ； Elbashir 等， (2001)Nature， 411， 494-498 ； Elbashir 等， (2001)genes Dev.15， 188-200)。例如， 这种双链部分已经显 示通过双链体反义链与靶的经典杂交抑制靶， 从而触发靶的酶促降解 (Tijsterman 等， (2002)Science， 295， 694-697)。
     在优选的实施方案中， 反义寡核苷酸靶向肿瘤抑制基因多核苷酸 (p73 ： NCBI 注册 号： NM_005427.2 ； p53 ： NCBI 注册号 ： NM_000546.4 ； PTEN ： NCBI 注册号 ： NM_000314) 和它们 的变体、 等位基因、 同种型、 同系物、 突变体、 衍生物、 片段和互补序列。 优选寡核苷酸是反义 分子。根据本发明的实施方案， 靶核酸分子并不仅限于肿瘤抑制基因， 还扩展至肿瘤抑 制基因分子的任何同种型、 受体、 同系物等。
     在另一个优选的实施方案中， 寡核苷酸靶向肿瘤抑制基因多核苷酸的天然反义序 列， 例如 SEQ ID NO ： 4、 5、 6、 6a、 6b、 7、 8 和 9 所示的多核苷酸， 和它们的变体、 等位基因、 同系 物、 突变体、 衍生物、 片段和互补序列。反义寡核苷酸的实例例如 SEQ ID NO ： 10-30。
     在一个实施方案中， 寡核苷酸互补于或结合至肿瘤抑制基因反义的核酸序列， 包 括但不限于与肿瘤抑制基因多核苷酸有关的非编码有义和 / 或反义序列， 和调节肿瘤抑制 基因分子的表达和 / 或功能。
     在另一个优选的实施方案中， 寡核苷酸互补于或结合肿瘤抑制基因天然反义的核 酸序列 ( 如 SEQ ID NO ： 4、 5、 6、 6a、 6b、 7、 8 和 9 所示 )， 并调节肿瘤抑制基因分子的表达和 / 或功能。
     在一个优选的实施方案中， 寡核苷酸包含 SEQ ID NO ： 10-30 的至少 5 个连续核苷 酸的序列， 和调节肿瘤抑制基因分子的表达和 / 或功能。
     多核苷酸靶包括肿瘤抑制基因 ( 包含其家族成员 )、 肿瘤抑制基因的变体、 肿瘤抑 制基因的突变体 ( 包含 SNP)、 肿瘤抑制基因的非编码序列、 肿瘤抑制基因的等位基因、 种变 体、 片段等。优选寡核苷酸是反义分子。
     在另一个优选的实施方案中， 寡核苷酸靶向肿瘤抑制基因多核苷酸， 包括 ： 反义 RNA、 干扰 RNA(RNAi)、 短干扰 RNA(siRNA)、 微小干扰 RNA(miRNA)、 小时序 RNA(stRNA)、 或短 发夹 RNA(shRNA)、 小 RNA 诱导基因激活 (RNAa) 或小激活 RNA(saRNA)。
     在另一个优选的实施方案中， 打靶肿瘤抑制基因多核苷酸， 例如 SEQ ID NO ： 4、 5、 6、 6a、 6b、 7、 8 和 9， 可以调节这些靶的表达或功能。在一个实施方案中， 相对于对照表达或 功能被上调。在另一个实施方案中， 相对于对照表达或功能被下调。
     在另一个优选的实施方案中， 反义化合物包括 SEQ ID NO ： 10-30 的序列。这些寡 核苷酸可包含一种或多种修饰的核苷酸、 较短或较长片段、 修饰的键等。
     在另一个优选的实施方案中， SEQ ID NO ： 10-30 包含一种或多种 LNA 核苷酸。
     调节期望靶核酸可用本领域公知的几种方式进行。例如反义寡核苷酸、 siRNA 等。酶促核酸分子 ( 例如核酶 ) 是能催化一种或多种反应的核酸分子， 包括以核苷酸碱基 序列特异性方式的反复切割其它独立核酸分子的能力。这种酶促核酸分子可用于， 例如靶 向几乎任何 RNA 转录物 (Zaug 等， 324， Nature 429 1986 ； Cech， 260 JAMA 3030， 1988 ； 和 Jefferies 等， 17 Nucleic Acids Research 1371， 1989)。
     因为它们的序列特异性， 反式切割酶促核酸分子显示作为人疾病治疗药物的希望 (Usman&McSwiggen， (1995)Ann.Rep.Med.Chem.30， 285-294 ； Christoffersen and Marr， (1995)J.Med.Chem.38， 2023-2037)。可将酶促核酸分子设计为在细胞 RNA 的背景下切割具 体 RNA 靶。这种切割事件致使 mRNA 无功能和废除从 RNA 的蛋白表达。以这种方式， 可选择 性地抑制与疾病状态相关的蛋白的合成。
     总体上， 具有 RNA 切割活性的酶促核酸通过首先结合到靶 RNA 起作用。这种结合 通过酶促核酸的靶结合部分发生， 该酶促核酸分子靶结合部分与作用为切割靶 RNA 分子的 酶促部分紧密相邻。因此， 酶促核酸首先通过互补性碱基配对识别并结合靶 RNA， 一旦结合 到正确的位点， 就酶促切割靶 RNA。 这种靶 RNA 的关键性切割将破坏其直接合成编码蛋白的能力。在酶促核酸结合和切割其 RNA 靶后， 酶促核酸从该 RNA 释放出来再寻找其它靶， 重复 结合并切割新靶。
     几种方法例如体外选择 ( 进化 ) 策略 (Orgel， (1979)Proc.R.Soc.London， B 205， 435) 已被用于进化新的能催化各种反应 ( 例如切割和连接磷酸二酯键和酰胺键 ) 的核酸 催化剂 (Joyce， (1989)gene， 82， 83-87 ； Beaudry 等， (1992)Science 257， 635-641 ； Joyce， (1992)ScientificAmerican 267， 90-97 ； Breaker 等， (1994)TIBTECH 12， 268 ； Bartel 等， (1993)Science 261 ： 1411-1418 ； Szostak， (1993)TIBS 17， 89-93 ； Kumar 等， (1995)FASEB J.， 9， 1183 ； Breaker， (1996)Curr.Op.Biotech.， 7， 442)。
     开发催化活性最佳的核酶将显著有助于采用 RNA 切割核酶从而调节基因表达的 任何策略。锤头核酶例如在 Mg2+ 辅助因子的饱和浓度 (10mM) 存在下催化率 (kcat) 大约是 1 分钟 -1。人工″ RNA 连接酶″核酶显示以比率大约是 100 分钟 -1 催化对应的自修饰反应。 另外， 已知某些修饰的具有由 DNA 构成的底物结合臂的锤头核酶催化性 RNA 切割， 其具有接 -1 近 100 分钟 的复式转化率 (multiple turn-over rate)。最后， 用特定核苷酸类似物置 换锤头内催化核心的具体残基产生催化率增加大约 10 倍的修饰的核酶。这些发现表明核 酶可以催化率显著大于绝大多数天然自切割核酶体外催化率促进化学转化。 因此可以优化 某些自切割核酶的结构而产生最大催化活性， 或可制备对 RNA 磷酸二酯键的切割效率显著 更快的全新 RNA 基序。
     1987 年首次证实了通过拟合″锤头″模型的 RNA 催化剂的 RNA 底物的分子间切割 (Uhlenbeck， O.C.(1987)Nature， 328 ： 596-600)。回收 RNA 催化剂与多 RNA 分子反应， 表明 其真实的催化性。
     通过改变催化性 RNA 的合适的碱基而保持必需的与靶序列的碱基配对， 根据″锤 头″基序设计的催化性 RNA 已经被用于切割具体靶序列 (Haseloff and Gerlach， (1988) Nature， 334， 585 ； Walbot and Bruening， (1988)Nature， 334， 196 ； Uhlenbeck， O.C.(1987) Nature， 328 ： 596-600 ； Koizumi， M. 等， (1988)FEBS Lett.， 228 ： 228-230)。 这允许利用催化 性 RNA 切割具体靶序列， 表明根据″锤头″模型设计的催化性 RNA 可能可以体内切割具体 的底物 RNA( 参见 Haseloff and Gerlach， (1988)Nature， 334， 585 ； Walbot and Bruening， (1988)Nature， 334， 196 ； Uhlenbeck， O.C.(1987)Nature， 328 ： 596-600)。
     RNA 干扰 (RNAi) 已经成为调节哺乳动物和哺乳动物细胞基因表达的强有力工具。 该方法需要利用表达质粒或病毒以及加工成 siRNA 的小发夹 RNA 的编码序列递送作为 RNA 自身或作为 DNA 的小干扰 RNA(siRNA)。该系统能有效运输前 siRNA 进入细胞质， 在此它们 有活性并允许利用用于基因表达的调节和组织特异性启动子。
     在优选的实施方案中， 寡核苷酸或反义化合物包括核糖核酸 (RNA) 和 / 或脱氧核 糖核酸 (DNA) 寡聚体或多聚体， 或它们的模拟物、 嵌合体、 类似物或同系物。该术语包括由 天然核苷酸、 糖和共价核苷间 ( 骨架 ) 键合组成的寡核苷酸， 以及具有类似功能的、 具有非 天然部分的寡核苷酸。由于所需的特征 ( 例如增高的细胞摄取、 增高对靶核酸的亲和力、 增 高在核酸酶存在下的稳定性 ) 常常需要相对于天然形式的这种修饰或置换的寡核苷酸。
     根据本发明， 寡核苷酸或″反义化合物″包括杂交至靶核酸的至少一部分并调节 靶核酸功能的反义寡核苷酸 ( 例如它们的 RNA、 DNA、 模拟物、 嵌合体、 类似物或同系物 )、 核 酶、 外部指导序列 (EGS) 寡核苷酸、 siRNA 化合物、 单链或双链 RNA 干扰 (RNAi) 化合物 ( 例如 siRNA 化合物、 saRNA、 aRNA) 和其它寡聚化合物。因此， 它们可以是 DNA、 RNA、 DNA 样、 RNA 样、 或它们的混合物， 或可以是这些中一种或多种的模拟物。 这些化合物可以是单链、 双链、 环状或发夹寡聚化合物， 并可以包含结构因素例如内部或末端膨胀、 错配或环。 反义化合物 可以按常规制备成为线性的， 但是也可以结合或制备成环状和 / 或分枝状。反义化合物可 以包括构建体， 例如两条链杂交形成完整或部分双链化合物或具有足够自身互补性的单链 允许杂交和形成完整或部分双链的化合物。两条链可以内部连接而留下游离 3′或 5′末 端， 或可以连接而形成连续的发夹结构或环。发夹结构可以在 5′或 3′末端包含产生单链 性状延伸的突出端。双链化合物任选在末端包含突出端。进一步的修饰可以包含连接到 一个末端、 选定的核苷酸位置、 糖位置或一个核苷间键合的缀合基团。或者， 两条链可以通 过非核酸部分或连接基团连接。当仅由一条链形成时， dsRNA 可以形成自身对折形成双链 体的自身互补的发夹型分子。因此， dsRNA 可以是完整或部分的双链。可通过在转基因细 胞系中稳定表达 dsRNA 发夹实现对基因表达的特异性调节 (Hammond 等， (1991)Nat.Rev. genet.， 2， 110-119 ； Matzke 等， (2001)Curr.Opin.genet.Dev.， 11， 221-227 ； Sharp， (2001) genes Dev.， 15， 485-490)。 当由两条链形成或单链自身对折形成双链体的自身互补的发夹 型分子时， 两条链 ( 或单链的双链体形成区域 ) 是华生 - 克里克形式碱基配对的互补 RNA 链。
     导入系统后， 本发明的化合物可以引发一种或多种酶或结构蛋白的作用， 实现对 靶核酸的切割或其它修饰， 或者可以通过占领型 (occupancy-based) 机制而发挥作用。通 常， 核酸 ( 包括寡核苷酸 ) 可以描述为″ DNA 样″ ( 即一般具有一个或多个 2′脱氧糖， 和 一般为 T 而非 U 碱基 ) 或″ RNA 样″ ( 即一般具有一个或多个 2′羟基或 2′修饰糖， 和 一般为 U 而非 T 碱基 )。核酸螺旋可以采用不止一种结构类型， 最常见的是 A 和 B 型。据 信， 一般具有 B 型样结构的寡核苷酸是″ DNA 样″的， 而那些具有 A 型样结构的寡核苷酸则 是″ RNA 样″的。在一些 ( 嵌合 ) 实施方案中， 反义化合物可以包含 A 型和 B 型区域。
     根据本发明， 反义化合物可包含长度大约 5 个到大约 80 个核苷酸的反义部分 ( 即 大约 5 个到大约 80 个连接的核苷 )。这指的是反义化合物的反义链或部分的长度。换句 话说， 本发明的单链反义化合物包含 5 个到大约 80 个核苷酸， 而本发明的双链反义化合物 ( 例如 dsRNA) 包含长度是 5 个到大约 80 个核苷酸的有义和反义链或部分。本领域普通技 术人员理解的是， 这包含下列核苷酸长度或其任何核苷酸长度范围的反义部分 ： 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79 或 80 个核苷酸。
     在一个实施方案中， 本发明的反义化合物具有核苷酸长度是 10 个到 50 个的反义 部分。本领域普通技术人员理解的是， 本发明寡核苷酸具有下列核苷酸长度或其中任何核 苷酸长度范围的反义部分 ： 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49 或 50 个 核 苷 酸。在一些实施方案中， 寡核苷酸长度是 15 个核苷酸。
     在一个实施方案中， 本发明的反义或寡核苷酸化合物具有核苷酸长度是 12 个或 13 个到 30 个核苷酸的反义部分。 本领域普通技术人员应理解， 本发明的反义化合物具有下 列核苷酸长度或其中任何核苷酸长度范围的反义部分 ： 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29 或 30 个核苷酸。
     在另一个优选的实施方案中， 本发明的寡聚化合物也包含变体， 其中化合物内一 个或多个核苷酸位置上存在不同的碱基。 例如， 如果第一个核苷酸是腺苷， 则可产生在此位 置包含胸苷、 鸟苷或胞苷的变体。 这种变化可以在反义或 dsRNA 化合物的任何位置进行。 然 后通过本文描述的方法测试这些化合物， 进而确定它们抑制靶核酸表达的能力。
     在一些实施方案中， 反义化合物和靶之间的同源性、 序列同一性或互补性是大约 40 ％到大约 60 ％。在一些实施方案中， 同源性、 序列同一性或互补性是大约 60 ％到大约 70％。在一些实施方案中， 同源性、 序列同一性或互补性是大约 70％到大约 80％。在一些 实施方案中， 同源性、 序列同一性或互补性是大约 80％到大约 90％。在一些实施方案中， 同 源性、 序列同一性或互补性是大约 90％、 大约 92％、 大约 94％、 大约 95％、 大约 96％、 大约 97％、 大约 98％、 大约 99％或大约 100％。
     在另一个优选的实施方案中， 反义寡核苷酸 ( 例如 SEQ ID NO ： 10-30 所示的核酸 分子 ) 包含一种或多种置换或修饰。在一个实施方案中， 核苷酸被锁定核酸 (LNA) 置换。
     在另一个优选的实施方案中， 寡核苷酸靶向与肿瘤抑制基因相关的编码和 / 或非 编码序列的核酸分子有义和 / 或反义的一个或多个区域， 所述寡核苷酸序列示于 SEQ ID NO ： 1、 1a、 1b、 2、 2a、 2b、 3、 3a、 4、 5、 6、 6a、 6b、 7、 8 和 9。寡核苷酸也靶向 SEQ ID NO ： 1、 1a、 1b、 2、 2a、 2b、 3、 3a、 4、 5、 6、 6a、 6b、 7、 8 和 9 的重叠区域。 本发明某些优选的寡核苷酸是嵌合寡核苷酸。本发明中， ″嵌合寡核苷酸″或″ 嵌合体″是包含两个或更多个化学上不同的区域的寡核苷酸， 每个区域至少由一种核苷酸 构成。这些寡核苷酸通常包含至少一个赋予一种或更多有益特征 ( 例如增加的核酸酶抗 性、 增加摄取入细胞、 增加对靶的结合亲和力 ) 的修饰核苷酸的区域， 和能切割 RNA:DNA 或 RNA:RNA 杂交体的酶的底物的区域。举例来说， RNA 酶 H 是切割 RNA:DNA 双链体的 RNA 链的 细胞内切核酸酶。激活 RNA 酶 H 因此导致切割 RNA 靶， 从而极大增加基因表达反义调节的 效率。因此， 与杂交至相同靶区域的硫代磷酸脱氧寡核苷酸相比， 用嵌合寡核苷酸时， 用较 短的寡核苷酸常常可以得到相当的结果。RNA 靶的切割可由凝胶电泳和必要时联合本领域 公知的相关核酸杂交方法常规进行检测。在一个优选的实施方案中， 嵌合寡核苷酸包含至 少一个修饰的增加靶结合亲和力的区域和通常作为 RNA 酶 H 底物的区域。寡核苷酸与其靶 的亲和力 ( 在这种情况下为编码 ras 的核酸 ) 由检测寡核苷酸 / 靶配对的 Tm 常规决定， Tm 是寡核苷酸和靶解离时的温度。解离由分光光度计检测。Tm 越高， 寡核苷酸与靶的亲和力 越大。
     本发明的嵌合反义化合物可由上述两种或更多种寡核苷酸、 修饰的寡核苷酸、 寡核苷和 / 或寡核苷酸模拟物形成复合结构。这种化合物在本领域被称为杂合物或杂 合体或 gapmer。教导制备这种杂合物结构的代表性美国专利包括但不限于美国专利公 开 号 5,013,830、 5,149,797、 5,220,007、 5,256,775、 5,366,878、 5,403,711、 5,491,133、 5,565,350、 5,623,065、 5,652,355、 5,652,356 和 5,700,922， 上述每一个都通过引用结合 到本申请中。
     在另一个优选的实施方案中， 修饰的寡核苷酸区域包含至少一个在糖的 2′位置 修饰的核苷酸， 最优选 2′ -O 烷基、 2′ -O- 烷基 -O- 烷基或 2′ - 氟代修饰的核苷酸。在 其它优选的实施方案中， RNA 修饰包括在嘧啶的核糖上的 2′ - 氟代、 2′ - 氨基和 2′ O- 甲
     基， 脱碱基残基， 或在 RNA 3′末端的或倒置碱基。这样的修饰常规掺入寡核苷酸中， 这些 寡核苷酸已经显示出比 2′ - 脱氧寡核苷酸对给定靶具有更高的 Tm( 即更高的靶结合亲和 力 )。这种增加的亲和力效果极大地增强了 RNAi 寡核苷酸对基因表达的抑制。RNA 酶 H 是 切割 RNA:DNA 双链体 RNA 链的细胞内切核酸酶。激活该酶从而导致 RNA 靶的切割， 并因此 能极大地增加 RNAi 抑制的效率。RNA 靶的切割常规可由凝胶电泳证实。在另一个优选的实 施方案中， 嵌合寡核苷酸也被修饰以提高核酸酶抗性。细胞包含各种可以降解核酸的外切 和内切核酸酶。 已经证实其中掺入了一定量修饰的核苷酸和核苷的寡核苷酸比天然寡脱氧 核苷酸对核酸酶消化具有更大的抗性。核酸酶抗性通常如下检测 ： 通过温育寡核苷酸与细 胞提取物或分离的核酸酶溶液， 然后通常由凝胶电泳检测随时间变化完整寡核苷酸的保持 量。已被修饰提高了其核酸酶抗性的寡核苷酸比未修饰的寡核苷酸完整存在更长的时间。 已经证明各种寡核苷酸修饰增加或赋予核酸酶抗性。 目前更优选包含至少一种硫代磷酸酯 修饰的寡核苷酸。在一些情况下， 提高靶结合亲和力的寡核苷酸修饰也能独立地增强核酸 酶抗性。一些所需的修饰可参见 De Mesmaeker 等 (1995)Acc.Chem.Res.， 28 ： 366-374。
     本发明设想的一些优选寡核苷酸的具体实例包括那些包含修饰的骨架的寡核苷 酸， 例如硫代磷酸酯、 磷酸三酯、 甲基膦酸酯、 短链烷基或环烷基糖间键合或短链杂原子或 杂环糖间键合。最优选有硫代磷酸骨架的寡核苷酸和那些有杂原子骨架的寡核苷酸， 特别 是 CH2--NH--O--CH2、 CH， --N(CH3)--O--CH2[ 称为亚甲基 ( 甲基亚氨基 ) 或 MMI 骨架 ]、 CH2--O--N(CH3)--CH2、 CH2-N(CH3)--N(CH3)--CH2 和 O--N(CH3)--CH2--CH2 骨 架，其 中 天然磷酸二酯键骨架表示为 O--P--O--CH)。也优选 De Mesmaeker 等 (1995)Acc.Chem. Res.28 ： 366-374 所公开的酰胺骨架。还优选具有吗啉代骨架结构的寡核苷酸 (Summerton and Weller， 美国专利公开号 5,034,506)。 在其它优选的实施方案中， 例如肽核酸 (PNA) 骨 架， 寡核苷酸的磷酸二酯键骨架被聚酰胺骨架取代， 核苷酸直接或间接地结合于聚酰胺骨 架上的氮杂氮原子 (Nielsen 等 (1991)Science 254， 1497)。寡核苷酸也可以包含一种或 多种取代的糖部分。优选的寡核苷酸在 2′位置包含一种下列基团 ： OH、 SH、 SCH3、 F、 OCN、 OCH3OCH3、 OCH3O(CH2)n CH3、 O(CH2)nNH2 或 O(CH2)n CH3( 其中 n 是从 1 到大约 10) ； C1-C10 低级烷基、 烷氧基烷氧基、 取代的低级烷基、 烷芳基或芳烷基 ； Cl ； Br ； CN ； CF3 ； OCF3 ； O--、 S-- 或 N- 烷基 ； O--、 S-- 或 N- 烯基 ； SOCH3 ； SO2CH3 ； ONO2 ； NO2 ； N3 ； NH2 ； 杂环烷基 ； 杂环烷 芳基 ； 氨基烷基氨基 ； 聚烷基氨基 ； 取代的甲硅烷基 ； RNA 切割基团 ； 肿瘤抑制基因报告基 团 (rTumor Suppressor generter group)、 嵌入剂 ； 增加寡核苷酸药物代谢动力学特征的 基团 ； 或增加寡核苷酸药效学特征的基团和其它具有类似特征的取代基。优选的修饰包括 2 ′ - 甲氧乙氧基 [2 ′ -O-CH2CH2OCH3， 也称为′ -O-(2- 甲氧乙基 )](Martin 等， (1995) Helv.Chim.Acta， 78， 486)。其它优选的修饰包括 2′ - 甲氧基 (2′ -O--CH3)、 2′ - 丙氧 基 (2′ -OCH2CH2CH3) 和 2′ - 氟代 (2′ -F)。类似的修饰也可以在寡核苷酸的其它位置 上进行， 特别是在 3′末端核苷酸上糖的 3′位置和 5′末端核苷酸上的 5′位置。寡核苷 酸也可以有糖模拟物， 例如环丁基替代戊呋喃糖 (pentofuranosyl) 基团。
     寡核苷酸也可另外或选择性地包括核酸碱基 ( 本领域经常简称为″碱基″ ) 修饰 或取代。 本文所用的″未修饰 ( 的 )″或″天然 ( 的 )″核苷酸包括腺嘌呤 (A)、 鸟嘌呤 (G)、 胸腺嘧啶 (T)、 胞嘧啶 (C) 和尿嘧啶 (U)。修饰的核苷酸包括在天然核酸中不常或暂时发现 的核苷酸， 例如次黄嘌呤、 6- 甲基腺嘌呤、 5- 甲基嘧啶， 特别是 5- 甲基胞嘧啶 ( 也称为 5- 甲基 -2′脱氧胞嘧啶， 在本领域中常称为 5-Me-C)、 5- 羟甲基胞嘧啶 (HMC)、 糖基 HMC 和龙胆 二糖基 (gentobiosyl)HMC ； 和合成核苷酸例如 2- 氨基腺嘌呤、 2-( 甲氨基 ) 腺嘌呤、 2-( 咪 唑基烷基 ) 腺嘌呤、 2-( 氨基烷基氨基 ) 腺嘌呤或其它杂取代的烷基腺嘌呤、 2- 硫尿嘧啶、 2- 硫胸腺嘧啶、 5- 溴尿嘧啶、 5- 羟甲基尿嘧啶、 8- 氮杂鸟嘌呤、 7- 脱氮鸟嘌呤、 N6(6- 氨基 己基 ) 腺嘌呤和 2， 6- 二氨基嘌呤 (Kornberg， A.， DNA Replication， W.H.Freeman&Co.， San Francisco， 1980， pp75-77 ； Gebeyehu， G.， (1987) 等 Nucl.Acids Res.15 ： 4513)。可包括 本领域公知的″通用″碱基， 例如肌苷。已经证实 5-Me-C 取代增加核酸双链体的稳定性 0.6-1.2℃ (Sanghvi， Y.S.， in Crooke， S.T.and Lebleu， B. 主编， Antisense Research and Applications， CRC Press， Boca Raton， 1993， pp.276-278)， 并且是目前优选的碱基取代。
     本发明寡核苷酸的另一修饰包括化学连接一种或多种提高寡核苷酸活性或者 细胞摄取的部分或缀合物到所述寡核苷酸。这类部分包括但不限于脂部分例如胆固醇 部 分、 胆 甾 烯 基 部 分 (Letsinger 等， (1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86， 6553)、 胆酸 (Manoharan 等 (1994)Bioorg.Med.Chem.Let.4， 1053)、 硫 醚 例 如 己 基 -S- 三 苯 甲 硫 醇 (Manoharan 等 (1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.660， 306 ； Manoharan 等 (1993)Bioorg.Med.Chem. Let.3， 2765)、 硫代胆固醇 (Oberhauser 等， (1992)Nucl.Acids Res.20， 533)、 脂肪族链例 如十二烷双醇或十一烷基残基 (Saison-Behmoaras 等 EMBO J.1991， 10， 111 ； Kabanov 等 (1990)FEBS Lett.259， 327 ； Svinarchuk 等 (1993)Biochimie 75， 49)、 磷脂例如二 - 十六 烷基 -rac- 甘油或三乙基铵 1， 2- 二 -O- 十六烷基 -rac- 甘油基 -3-H- 膦酸酯 (Manoharan 等 (1995)Tetrahedron Lett.36， 3651 ； Shea 等 (1990)Nucl.Acids Res.18， 3777)、多 胺 或 聚 乙 二 醇 链 (Manoharan 等 (1995)Nucleosides&Nucleotides， 14， 969) 或 金 刚 烷 乙 酸 (Manoharan 等 (1995)Tetrahedron Lett.36， 3651)。本领域公知包含亲脂部分的寡核苷酸 和制备这类寡核苷酸的方法， 例如美国专利公开号 5,138,045、 5,218,105 和 5,459,255。
     对给定寡核苷酸的所有位点进行一致的修饰是不必要的， 实际上可以将上述修饰 中 2 种以上修改掺入单一寡核苷酸内甚至寡核苷酸的单一核苷内。本发明也包括如上定义 的嵌合寡核苷酸的寡核苷酸。
     在另一个实施方案中， 本发明的核酸分子缀合了另一部分， 其包括但不限于脱碱 基核苷酸、 聚醚、 多胺、 聚酰胺、 肽、 糖、 脂或聚烃化合物。本领域技术人员知道， 可将这些分 子连接到一个或多个构成所述核酸分子的任何核苷酸的糖、 碱基或磷酸基团上的若干位点 上。
     根据本发明所用的寡核苷酸可以通过公知的固相合成技术方便地常规制备。 若干 公司包括 Applied Biosystems 出售这种合成设备。 也可采用这类合成的任何其它方法。 本 领域普通技术人员熟知寡核苷酸的实际合成。 还已知利用相似方法制备其它寡核苷酸例如 硫代磷酸酯和烷基化衍生物。同样已知利用类似的方法和商业有售的修饰的 amidites 和 孔径控制的玻璃 (CPG) 产物例如生物素、 荧光素、 吖啶或补骨脂素修饰的 amidites 和 / 或 CPG(Glen Research， Sterling VA 有售 ) 合成荧光标记的、 生物素化的或其它修饰的寡核 苷酸， 例如胆固醇修饰的寡核苷酸。
     根据本发明， 利用修饰 ( 例如利用 LNA 单体增高作用的潜能、 特异性和持续时间 以及扩大寡核苷酸的给药途径 ) 包括当前的化学物例如 MOE、 ANA、 FANA、 PS 等 (Uhlman， 等 (2000)Current Opinions in Drug Discovery&Development Vol.3 No 2)。 这可通过用 LNA单体置换当前寡核苷酸中的某些单体实现。LNA 修饰的寡核苷酸的大小与母体化合物相似 或大一些或优选小一些。优选这种 LNA 修饰的寡核苷酸包含小于大约 70％、 更优选小于大 约 60％， 最优选小于大约 50％的 LNA 单体， 并且它们的大小在大约 5-25 个核苷酸之间， 优 选在大约 12-20 个核苷酸之间。
     优选修饰的寡核苷酸骨架包括但不限于硫代磷酸酯、 手性硫代磷酸酯、 二硫代磷 酸酯、 磷酸三酯、 氨基烷基磷酸三酯、 甲基和其它烷基膦酸酯 ( 包括 3′亚烷基膦酸酯和手 性膦酸酯 )、 次膦酸酯、 包含 3′ - 氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯的氨基磷酸酯、 硫 代氨基磷酸酯、 硫代烷基膦酸酯、 硫代烷基磷酸三酯和包含正常 3′ -5′键合的磷酸硼酯、 这些中的 2′ -5′连接类似物、 和那些包含倒置极性寡核苷酸骨架， 其中相邻核苷单位对 由 3′ -5′到 5′ -3′或 2′ -5′到 5′ -2′连接。也包括各种盐、 混合盐和游离酸形式。
     教导制备上述含磷键合的代表性美国专利包括但不限于美国专利公开号 3,687,808 、 4,469,863 、 4,476,301 、 5,023,243 、 5,177,196 、 5,188,897 、 5,264,423 、 5,276,019 、 5,278,302 、 5,286,717 、 5,321,131 、 5,399,676 、 5,405,939 、 5,453,496 、 5,455,233 、 5,466,677 、 5,476,925 、 5,519,126 、 5,536,821 、 5,541,306 、 5,550,111 、 5,563,253、 5,571,799、 5,587,361 和 5,625,050， 上述每一个都通过引用结合到本申请中。
     优选其中不包含磷原子的修饰寡核苷酸骨架具有由以下部分形成的骨架 ： 短链 烷基或环烷基核苷间键合、 混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键合、 或一种或多种短链杂 原子或杂环核苷间键合。这些包括那些具有吗啉代键合 ( 部分由核苷的糖部分形成 ) 的 骨架、 硅氧烷骨架、 ( 硫化物、 亚砜和砜 ) 骨架、 甲乙酰基 (Formacetyl) 和硫代甲乙酰基 (thioformacetyl) 骨架、 亚甲基甲乙酰基和硫代甲乙酰基骨架、 含烯骨架、 氨基磺酸酯骨 架、 亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架、 磺酸酯和磺酰胺骨架、 酰胺骨架和其它具有混合 N、 O、 S 和 CH2 组分部分的骨架。
     教导制备上述寡核苷的代表性美国专利包括但不限于美国专利公开号 5,034,506 、 5,166,315 、 5,185,444 、 5,214,134 、 5,216,141 、 5,235,033 、 5,264,562 、 5,264,564 、 5,405,938 、 5,434,257 、 5,466,677 、 5,470,967 、 5,489,677 、 5,541,307 、 5,561,225 、 5,596,086 、 5,602,240 、 5,610,289 、 5 ,602,240 、 5,608,046 、 5,610,289 、 5,618,704、 5,623,070、 5,663,312、 5,633,360、 5,677,437 和 5,677,439， 上述每一个都通 过引用结合到本申请中。
     在其它优选的寡核苷酸模拟物中， 核苷酸单位的糖和核苷间键合 ( 即骨架 ) 被新 颖基团取代。碱基单位被保留用于与合适的核酸靶化合物杂交。一种这样的寡聚化合物 即显示具有优秀的杂交特性的寡核苷酸模拟物被称为肽核酸 (PNA)。在 PNA 化合物中， 寡 核苷酸的糖骨架被含酰胺的骨架取代， 尤其是氨基乙基甘氨酸骨架。 核酸碱基被保留， 并且 其直接或间接地结合到骨架酰胺部分的氮杂氮原子。教导制备 PNA 化合物的代表性美国专 利包括但不限于美国专利公开号 5,539,082、 5,714,331 和 5,719,262， 其中每一个都通过 引用结合到本申请中。PNA 化合物进一步的教导可参见 Nielsen 等 (1991)Science 254， 1497-1500。
     在本发明另一个优选的实施方案中， 寡核苷酸具有硫代磷酸酯骨架和寡核苷具有 杂原子骨架， 尤其是 CH2-NH-O-CH2-、 称为亚甲基 ( 甲基亚氨基 ) 或 MMI 骨架的 -CH2-N(CH3 )-O-CH2-、 -CH2-O-N(CH3)-CH2-、 -CH2N(CH3)-N(CH3)CH2- 和 -O-N(CH3)-CH2-CH2-， 其中天然磷酸二酯骨架表示为 -O-P-O-CH2-， 参见上面提及的美国专利公开号 5,489,677， 以及酰 胺骨架， 参见上面提及的美国专利公开号 5,602,240。还优选上面提及的美国专利公开号 5,034,506 的具有吗啉代骨架结构的寡核苷酸。
     修饰的寡核苷酸也可以包括一种或多种取代的糖部分。优选寡核苷酸的 2 ′位 置包含以下基团中的一种 ： OH ； F； O-、 S-、 或 N- 烷基 ； O-、 S-、 或 N- 烯基 ； O-、 S- 或 N- 炔 基； 或 O 烷基 -O- 烷基， 其中烷基、 烯基和炔基可以是取代或未取代的 C 到 CO 烷基或 C2 到 CO 烯基和炔基。尤其优选的是 O(CH2)n OmCH3、 O(CH2)n、 OCH3、 O(CH2)nNH2、 O(CH2)nCH3、 O(CH2)nONH2 和 O(CH2nON(CH2)nCH3)2， 其中 n 和 m 可以是 1 到大约 10。其它优选的寡核 苷酸在 2 ′位置包含以下基团中的一种 ： C 到 CO、 低级烷基、 取代的低级烷基、 烷芳基、 芳 烷基、 O- 烷芳基或 O- 芳烷基、 SH、 SCH3、 OCN、 Cl、 Br、 CN、 CF3、 OCF3、 SOCH3、 SO2CH3、 ONO2、 NO2、 N3、 NH2、 杂环烷基、 杂环烷芳基、 氨基烷基氨基、 聚烷基氨基、 取代的甲硅烷基、 RNA 切 割基团、 肿瘤抑制基因报告基团、 嵌入剂、 增加寡核苷酸药代动力学特征的基团或增加寡核 苷酸药效学特征的基团和其它具有相似特性的取代基。优选的修饰包括 2′ - 甲氧乙氧基 (2 ′ -O-CH2CH2OCH3， 也称为′ -O-(2- 甲氧乙基 ) 或 2 ′ -MOE)(Martin 等， (1995)Helv. Chim.Acta， 78， 486-504)， 即烷氧基烷氧基基团。 进一步优选的修饰包括描述于以下实施例 的 2′ - 二甲基氨基氧乙氧基， 即 O(CH2)2ON(CH3)2 基团， 也称为 2′ -DMAOE， 和 2′ - 二甲 基氨基乙氧基乙氧基 ( 本领域也称为 2′ -O- 二甲基氨基乙氧基乙基或 2′ -DMAEOE)， 即 2′ -O-CH2-O-CH2-N(CH2)2。
     其 它 优 选 的 修 饰 包 括 2 ′ - 甲 氧 基 (2 ′ -OCH3)、 2′-氨基丙氧基 (2′ -OCH2CH2CH2NH2) 和 2’ - 氟代 (2′ -F)。在寡核苷酸的其它位置也可进行类似的修 饰， 尤其在 3′末端核苷酸或 2′ -5′连接的寡核苷酸的糖的 3′位置和 5′末端核苷酸的 5′位置。寡核苷酸也可以具有糖模拟物例如环丁基部分取代戊呋喃糖基糖。教导制备这 种修饰的糖结构的美国专利包括但不限于 4,981,957、 5,118,800、 5,319,080、 5,359,044、 5,393,878 、 5,446,137 、 5,466,786 、 5,514,785 、 5,519,134 、 5,567,811 、 5,576,427 、 5,591,722 、 5,597,909 、 5,610,300 、 5,627,053 、 5,639,873 、 5,646,265 、 5,658,873 、 5,670,633 和 5,700,920， 上述每一个专利都通过引用结合到本申请中。
     寡核苷酸也可以包括核酸碱基 ( 本领域经常简称为″碱基″ ) 修饰或取代。本文 所用的″未修饰 ( 的 )″或″天然 ( 的 )″核苷酸包含嘌呤碱基腺嘌呤 (A) 和鸟嘌呤 (G)， 和嘧啶碱基胸腺嘧啶 (T)、 胞嘧啶 (C) 和尿嘧啶 (U)。修饰的核苷酸包括其它合成和天然核 苷酸， 例如 5- 甲基胞嘧啶 (5-me-C)、 5- 羟甲基胞嘧啶、 黄嘌呤、 次黄嘌呤、 2- 氨基腺嘌呤、 腺嘌呤和鸟嘌呤的 6- 甲基和其它烷基衍生物、 腺嘌呤和鸟嘌呤的 2- 丙基和其它烷基衍生 物、 2- 硫尿嘧啶、 2- 硫胸腺嘧啶和 2- 硫胞嘧啶、 5- 卤素尿嘧啶和胞嘧啶、 5- 丙炔基尿嘧啶 和胞嘧啶、 6- 氮杂尿嘧啶、 胞嘧啶和胸腺嘧啶、 5- 尿嘧啶 ( 假尿嘧啶 )、 4- 硫尿嘧啶、 8- 卤 素、 8- 氨基、 8- 硫醇、 8- 硫代烷基、 8- 羟基和其它 8- 取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、 5- 卤素尤其是 5- 溴、 5- 三氟甲基和其它 5- 取代的尿嘧啶和胞嘧啶、 7- 甲基奎宁和 7- 甲基腺嘌呤、 8- 氮 杂鸟嘌呤和 8- 氮杂腺嘌呤、 7- 脱氮鸟嘌呤和 7- 脱氮腺嘌呤以及 3- 脱氮鸟嘌呤和 3- 脱氮 腺嘌呤。
     另外， 核苷酸包括那些公开于美国专利公开号 3,687,808、 公开于′ The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering′， 858-859 页， Kroschwitz， J.I.，主编 John Wiley&Sons， 1990、 公开于 Englisch 等， ′ Angewandle Chemie， International Edition′， 1991， 30， 613 页和公开于 Sanghvi， Y.S.， Chapter 15，′ Antisense Research and Applications′， 289-302 页， Crooke， S.T.and Lebleu， B.ea.， CRC Press， 1993 中的 核苷酸。这些核苷酸中的某些对增加本发明的寡聚化合物的结合亲和力特别有用。这些核 苷酸包括 5- 取代的嘧啶、 6- 氮杂嘧啶和 N-2、 N-6 和 0-6 取代的嘌呤， 包括 2- 氨基丙基腺 嘌呤、 5- 丙炔基尿嘧啶和 5- 丙炔基胞嘧啶。 5- 甲基胞嘧啶取代显示增加 0.6-1.2℃的核酸 双链体稳定性 (Sanghvi， Y.S.， Crooke， S.T.and Lebleu， B. 主编′ Antisense Research and Applications′， CRC Press， Boca Raton， 1993， pp.276-278)， 并且为目前优选的碱基 取代， 在结合 2′ -O 甲氧乙基糖修饰时甚至更优选。
     教导制备上述的修饰核苷酸和其它修饰的核苷酸的代表性美国专利包括但 不 限 于 美 国 专 利 公 开 号 3,687,808 和 4,845,205、 5,130,302、 5,134,066、 5,175,273、 5,367,066 、 5,432,272 、 5,457,187 、 5,459,255 、 5,484,908 、 5,502,177 、 5,525,711 、 5,552,540、 5,587,469、 5,596,091、 5,614,617、 5,750,692 和 5,681,941， 上述每一个专利 都通过引用结合到本申请中。
     本发明寡核苷酸的另一种修饰包括化学连接一种或多种部分或缀合物到寡核苷 酸， 所述部分或缀合物增加寡核苷酸的活性、 细胞分布或细胞摄取。
     这类部分包括但不限于脂部分， 例如胆固醇部分 (Letsinger 等， (1989)Proc. Natl.Acad.Sci.USA 86， 6553-6556)、 胆 酸 (Manoharan 等， (1994)Bioorg.Med.Chem. Let.4， 1053-1060)、 硫醚例如己基 -S- 三苯甲硫醇 (Manoharan 等， (1992)Ann.N.Y.Acad. Sci.660， 306-309 ； Manoharan 等， (1993)Bioorg.Med.Chem.Let.3， 2765-2770)、硫 代 胆 固醇 (Oberhauser 等， (1992)Nucl.Acids Res.， 20， 533-538)、 脂肪族链例如十二烷双醇 或 十 一 烷 基 残 基 (Kabanov 等， (1990)FEBS Lett.， 259， 327-330 ； Svinarchuk 等 (1993) Biochimie 75， 49-54)、 磷脂例如二 - 十六烷基 -rac- 甘油或三乙基铵 1， 2- 二 -O- 十六烷 基 -rac- 甘油基 -3-H- 磷酸酯 (Manoharan 等， (1995)Tetrahedron Lett.， 36， 3651-3654 ； Shea 等， (1990)Nucl.Acids Res.， 18， 3777-3783)、 多 胺 或 聚 乙 二 醇 链 (Manoharan 等， (1995)Nucleosides&Nucleotides， 14， 969-973) 或 金 刚 烷 乙 酸 (Manoharan 等， (1995) Tetrahedron Lett.， 36， 3651-3654)、 棕 榈 基 部 分 (Mishra 等， (1995)Biochim.Biophys. Acta， 1264， 229-237)、 或十八胺或己基氨基 - 羰基 -t 羟胆固醇部分 (Crooke 等， (1996) J.Pharmacol.Exp.Ther.， 277， 923-937)。
     教导制备这类寡核苷酸缀合物的代表性美国专利包括但不限于美国专利 号 4,828,979 、 4,948,882 、 5,218,105 、 5,525,465 、 5,541,313 、 5,545,730 、 5,552,538 、 5,578,717,5,580,731 、 5,580,731 、 5,591,584 、 5,109,124 、 5,118,802 、 5,138,045 、 5,414,077 、 5,486,603 、 5,512,439 、 5,578,718 、 5,608,046 、 4,587,044 、 4,605,735 、 4,667,025 、 4,762,779 、 4,789,737 、 4,824,941 、 4,835,263 、 4,876,335 、 4,904,582 、 4,958,013 、 5,082,830 、 5,112,963 、 5,214,136 、 5,082,830 、 5,112,963 、 5,214,136 、 5,245,022 、 5,254,469 、 5,258,506 、 5,262,536 、 5,272,250 、 5,292,873 、 5,317,098 、 5,371,241 、 5,391,723 、 5,416,203 、 5,451,463 、 5,510,475 、 5,512,667 、 5,514,785 、 5,565,552 、 5,567,810 、 5,574,142 、 5,585,481 、 5,587,371 、 5,595,726 、 5,597,696 、 5,599,923、 5,599,928 和 5,688,941， 上述每一个专利文献都通过引用结合到本申请中。药物发现 ： 本发明的化合物也可用于药物发现和靶确认的领域。本发明包括在药 物发现工作中使用本文鉴定的化合物和优选靶区段， 进而阐明存在于肿瘤抑制基因多核苷 酸和疾病状态、 表型或症状之间的关系。 这些方法包括检测或调节肿瘤抑制基因多核苷酸， 包括使样品、 组织、 细胞或生物接触本发明的化合物 ； 检测处理后某时间时的肿瘤抑制基因 多核苷酸的核酸或蛋白水平和 / 或相关表型或化学终点 ； 以及任选比较未处理样品或用本 发明进一步的化合物处理的样品的检测值。 这些方法也可以平行进行或与其它试验组合进 行， 从而确定标靶确认过程中的未知基因的功能或者确定具体基因产物作为治疗或预防具 体疾病、 症状或表型的标靶的有效性。
     评价基因表达的上调或抑制 ：
     传送外源核酸进入宿主细胞或生物体可以直接通过检测细胞或生物体中该核酸 的存在来评价。这种检测可用本领域已知的几种方法实现。例如， 例如外源核酸的存在 可用 DNA 印迹法 (Southern blot) 或用特异性扩增与核酸相关的核苷酸序列的引物进行 聚合酶链式反应 (PCR) 方法检测。外源核酸的表达也可以利用包括基因表达分析的常规 方法来检测。例如， 从外源核酸产生的 mRNA 的检测和定量可以通过 RNA 印迹法和反转录 PCR(RT-PCR)。 外源核酸的表达 RNA 也可以通过检测酶活性或报道蛋白活性来检测。例如， 反义 调节活性可间接地通过靶核酸表达的减少或增加来检测， 说明外源核酸在产生效应子 RNA。 根据序列保守性， 可设计引物并用于扩增靶基因的编码区域。 最初， 每个基因的最高表达的 编码区可用来建立模型对照基因， 但也可以使用任何编码或非编码区。通过在报告编码区 和其多聚 (A) 信号之间插入各个编码区装配每个对照基因。这些质粒将产生在该基因的上 游部分具有肿瘤抑制基因报告基因 (a rTumor Suppressor generter gene) 和在 3′非编 码区具有潜在 RNAi 靶的 mRNA。通过调节肿瘤抑制基因报告基因分析单个反义寡核苷酸的 有效性。在本发明方法中有用的肿瘤抑制基因报告基因包括乙酰羟酸合酶 (AHAS)、 碱性磷 酸酶 (AP)、 β 半乳糖苷酶 (LacZ)、 β- 葡萄糖醛酸苷酶 (GUS)、 氯霉素乙酰转移酶 (CAT)、 绿 色荧光蛋白 (GFP)、 红色荧光蛋白 (RFP)、 黄色荧光蛋白 (YFP)、 青色荧光蛋白 (CFP)、 辣根过 氧化物酶 (HRP)、 萤光素酶 (Luc)、 胭脂氨酸合成酶 (NOS)、 章鱼碱合酶 (OCS) 和它们的衍生 物。已有多种赋予抗以下抗生素的选择性标记 ： 氨苄青霉素、 博来霉素、 氯霉素、 庆大霉素、 潮霉素、 卡那霉素、 林可霉素、 氨甲喋呤、 膦丝菌素、 嘌呤霉素和四环素。本领域公知测定肿 瘤抑制基因报告基因的调节的方法， 包括但不限于使用荧光计的方法 ( 例如荧光光谱、 荧 光激活细胞分选术 (FACS)、 荧光显微镜术 )、 抗生素抗性测定。
     试剂盒、 研究试剂、 诊断和治疗
     本发明的化合物可以用于诊断、 治疗和预防， 以及作为研究试剂和试剂盒组分。 另 外， 可以极好的特异性抑制基因表达的反义寡核苷酸经常被本领域普通技术人员用于阐明 具体基因的功能或区分生物通路中不同成员之间的功能。
     对于用于试剂盒和诊断以及各种生物系统， 单独或联合其它化合物或治疗剂的本 发明的化合物是有用的工具， 其用于差别和 / 或组合分析中阐明在细胞或组织内表达基因 的一部分或全部的表达模式。
     本文所用的术语″生物系统″或″系统″定义为表达或被赋予能力表达肿瘤抑 制基因产物的任何生物体、 细胞、 细胞培养物或组织。 这些包括但不限于人、 转基因动物、 细
     胞、 细胞培养物、 组织、 异种移植物、 移植物和它们的组合。
     作为一个非限制性的实例， 比较用一种或多种反义化合物处理的细胞或组织和未 用反义化合物处理的对照细胞或组织的表达模式， 所产生的模式用于分析基因表达的差别 水平， 因为它们涉及所检测基因的例如疾病关联、 信号转导通路、 细胞定位、 表达水平、 大 小、 结构或功能。这些分析可以在刺激或未刺激细胞和影响表达模式的其它化合物存在或 不存在情况下进行。
     本领域公知的基因表达分析方法实例包括 DNA 阵列或微阵列 (Brazma and Vilo， (2000)FEBS Lett.， 480， 17-24 ； Celis 等， (2000)FEBS Lett.， 480， 2-16)、 SAGE( 基因表达 系列分析 )(Madden 等， (2000)Drug Discov.Today， 5， 415-425)、 READS( 消化 cDNA 的限制 性酶扩增 )(Prashar and Weissman， (1999)Methods Enzymol.， 303， 258-72)、 TOGA( 全基 因表达分析 )(Sutcliffe 等， (2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.， 97， 1976-81)、 蛋白质阵 列和蛋白组学 (Celis 等， (2000)FEBS Lett.， 480， 2-16 ； Jungblut 等， Electrophoresis， 1999， 20， 2100-10)、 表达性序列标签 (EST) 测序 (Celis 等， FEBS Lett.， 2000， 480， 2-16 ； Larsson 等， J.Biotechnol.， 2000， 80， 143-57)、 消减式 RNA 指纹法 (SuRF)(Fuchs 等， (2000) Anal.Biochem.286， 91-98 ； Larson 等， (2000)Cytometry 41， 203-208)、 消减克隆、 差异展 示 (DD)(Jurecic and Belmont， (2000)Curr.Opin.Microbiol.3， 316-21)、 比较基因组杂交 (Carulli 等， (1998)J.Cell Biochem.Suppl.， 31， 286-96)、 FISH( 荧光原位杂交 ) 法 (Going and Gusterson， (1999)Eur.J.Cancer， 35， 1895-904) 和质谱分析法 (To， Comb.(2000)Chem. High Throughput Screen， 3， 235-41)。
     本发明的化合物对于研究和诊断有用， 因为这些化合物杂交至编码肿瘤抑制基因 的核酸。例如， 以本文公开的这种效率和这种条件下杂交的作为有效的肿瘤抑制基因调节 剂的寡核苷酸， 分别是在基因扩增或检测有利条件下的有效引物或探针。这些引物和探针 可用于需要特异性检测编码肿瘤抑制基因的核酸分子的方法， 以及可用于扩增所述核酸分 子以用于进行检测或者用于肿瘤抑制基因的进一步研究。本发明的反义寡核苷酸 ( 特别是 引物和探针 ) 和编码肿瘤抑制基因的核酸的杂交可用本领域公知的方法检测。这类方法可 以包括缀合酶到寡核苷酸、 放射标记寡核苷酸或任何其它适合的检测手段。也可以制备利 用这类检测手段检测样品中肿瘤抑制基因水平的试剂盒。
     本领域技术人员也可以利用反义的特异性和灵敏性用于治疗用途。 反义化合物已 被用于治疗包括人的动物疾病状态的治疗剂部分。 反义寡核苷酸药物已经安全有效地给予 人， 并且无数临床试验目前正在进行中。 因此确立了反义化合物是有用的治疗形式， 其可以 配制用于治疗细胞、 组织和动物、 特别是人的治疗方案中。
     对于治疗学， 对怀疑患有可通过调节肿瘤抑制基因多核苷酸的表达来治疗的疾病 或障碍的动物 ( 优选人 ) 可以给予根据本发明的反义化合物来治疗。例如， 在一个非限制 性实施方案中， 所述方法包括给予需要治疗的动物治疗有效剂量的肿瘤抑制基因调节剂的 步骤。 本发明的肿瘤抑制基因调节剂有效地调节肿瘤抑制基因的活性或调节肿瘤抑制基因 蛋白的表达。 在一个实施方案中， 相对于对照， 动物中肿瘤抑制基因的活性或表达被抑制大 约 10％。优选动物中肿瘤抑制基因的活性或表达被抑制大约 30％， 更优选动物中肿瘤抑制 基因的活性或表达被抑制 50％以上。 因此， 相对于对照， 所述寡聚化合物调节肿瘤抑制基因 mRNA 的表达至少 10％、 至少 50％、 至少 25％、 至少 30％、 至少 40％、 至少 50％、 至少 60％、至少 70％、 至少 75％、 至少 80％、 至少 85％、 至少 90％、 至少 95％、 至少 98％、 至少 99％或 100％。
     在一个实施方案中， 与对照相比， 动物中肿瘤抑制基因的活性或表达增加了大约 10％。 优选动物中肿瘤抑制基因的活性或表达增加大约 30％。 更优选动物中肿瘤抑制基因 的活性或表达增加 50％以上。因此， 相对于对照， 寡聚化合物调节肿瘤抑制基因 mRNA 的表 达至少 10％、 至少 50％、 至少 25％、 至少 30％、 至少 40％、 至少 50％、 至少 60％、 至少 70％、 至少 75％、 至少 80％、 至少 85％、 至少 90％、 至少 95％、 至少 98％、 至少 99％或 100％。
     例如， 肿瘤抑制基因表达的减少可以在动物的血清、 血液、 脂肪组织、 肝脏或任何 其它体液、 组织或器官中检测。 优选包含在被分析的所述液体、 组织或器官的细胞包含编码 肿瘤抑制基因肽的核酸分子和 / 或肿瘤抑制基因蛋白本身。
     通过添加有效量的化合物到适合的药学上可接受的稀释剂或载体中， 本发明的化 合物可以药学组合物使用。本发明的化合物的用途和本发明的方法在预防疾病上同样有 用。
     缀合物
     本发明寡核苷酸的另一种修饰涉及化学连接一种或多种提高寡核苷酸活性、 细胞 分布或细胞摄取的部分或缀合物到所述寡核苷酸。 这些部分或缀合物可以包括共价连接到 官能团 ( 例如伯羟基或仲羟基 ) 的缀合物基团。 本发明的缀合物基团包括嵌入剂、 肿瘤抑制 基因报告分子、 多胺、 聚酰胺、 聚乙二醇、 聚醚、 提高寡聚体药效特征的基团和提高寡聚体药 物代谢动力学特征的基团。典型的缀合物基团包括胆固醇、 脂质、 磷脂、 生物素、 吩嗪、 叶酸 酯、 菲啶、 蒽醌、 吖啶、 荧光素、 罗丹明、 香豆素类和染料。 本发明中提高药效学特征的基团包 括促进摄取、 提高降解抗性和 / 或增强和靶核酸的序列特异性杂交的基团。本发明中提高 药物代谢动力学的基团包括促进本发明化合物的摄取、 分布、 代谢或排泄的基团。 代表性的 缀合物基团公开于 1992 年 10 月 23 日申请的国际专利申请号 PCT/US92/09196 和美国专利 公开号 6,287,860 中， 它们通过引用结合到本文中。缀合物部分包括但不限于脂质部分例 如胆固醇部分、 胆酸、 硫醚 ( 例如己基 -5- 三苯甲硫醇、 硫代胆固醇 )、 脂肪族链 ( 例如十二 烷双醇或十一烷基残基 )、 磷脂例如二 - 十六烷基 -rac- 甘油或三乙基铵 1， 2- 二 -O- 十六 烷基 -rac- 甘油基 -3-H 膦酸酯、 多胺或聚乙二醇链、 或金刚烷乙酸、 棕榈基部分、 或十八胺 或己基氨基 - 羰基 - 羟胆固醇部分。 本发明的寡核苷酸也可以缀合到活性药物， 例如阿司匹 林、 华法林、 保泰松、 布洛芬、 舒洛芬、 芬布芬、 酮洛芬、 (S)-(+)- 普拉洛芬、 卡洛芬、 丹磺酰肌 氨酸、 2， 3， 5- 三碘苯甲酸、 氟芬那酸、 亚叶酸、 苯并噻二嗪、 氯噻嗪、 二氮杂卓 (diazepine)、 吲哚美辛、 巴比妥酸盐、 头孢菌素、 磺胺药、 抗糖尿病药、 抗菌药或抗生素。
     教导制备这类寡核苷酸缀合物的代表性美国专利包括但不限于 ： 4,828,979 ； 4,948,882 ； 5,218,105 ； 5,525,465 ； 5,541,313 ； 5,545,730 ； 5,552,538 ； 5,578,717 ； 5,580,731 ； 5,580,731 ； 5,591,584 ； 5,109,124 ； 5,118,802 ； 5,138,045 ； 5,414,077 ； 5,486,603 ； 5,512,439 ； 5,578,718 ； 5,608,046 ； 4,587,044 ； 4,605,735 ； 4,667,025 ； 4,762,779 ； 4,789,737 ； 4,824,941 ； 4,835,263 ； 4,876,335 ； 4,904,582 ； 4,958,013 ； 5,082,830 ； 5,112,963 ； 5,214,136 ； 5,082,830 ； 5,112,963 ； 5,214,136 ； 5, 245,022 ； 5,254,469 ； 5,258,506 ； 5,262,536 ； 5,272,250 ； 5,292,873 ； 5,317,098 ； 5,371,241 ； 5,391,723 ； 5,416,203 ； 5,451,463 ； 5,510,475 ； 5,512,667 ； 5,514,785 ； 5,565,552 ；5,567,810 ； 5,574,142 ； 5,585,481 ； 5,587,371 ； 5,595,726 ； 5,597,696 ； 5,599,923 ； 5,599,928 和 5,688,941。
     制剂
     本发明的化合物可以和其它分子、 分子结构或化合物的混合物混合、 囊化、 缀合或 其它方式缔合以有利于摄取、 分布和 / 或吸收， 例如脂质体、 靶向受体的分子、 口服、 直肠、 局部或其它制剂， 。教导制备这类有助于摄取、 分布和 / 或吸收制剂的代表性美国专利包 括但不限于美国专利公开号 5,108,921 ； 5,354,844 ； 5,416,016 ； 5,459,127 ； 5,521,291 ； 5,543,165 ； 5,547,932 ； 5,583,020 ； 5,591,721 ； 4,426,330 ； 4,534,899 ； 5,013,556 ； 5,108,921 ； 5,213,804 ； 5,227,170 ； 5,264,221 ； 5,356,633 ； 5,395,619 ； 5,416,016 ； 5,417,978 ； 5,462,854 ； 5,469,854 ； 5,512,295 ； 5,527,528 ； 5,534,259 ； 5,543,152 ； 5,556,948 ； 5,580,575， 上述每一个专利都通过引用结合到本文中。
     虽然， 为了调节靶的表达和 / 或功能， 本发明反义寡核苷酸不需要以载体形式给 药， 但是本发明的实施方案涉及用于表达反义寡核苷酸的表达载体构建体， 其包含启动子、 杂合启动子基因序列并具有强组成型启动子活性， 或在所需的情形下能被诱导的启动子活 性。
     在一个实施方案中， 发明实践包括给予至少一种具有合适的核酸递送系统的前述 反义寡核苷酸。在一个实施方案中， 该系统包含可操作连接到多核苷酸的非病毒载体。这 种非病毒载体的实例包括单独的寡核苷酸 ( 例如 SEQ ID NO ： 10-30 中的任一种或多种 ) 或 者联合合适的蛋白、 多糖或脂质制剂。
     其它合适的核酸递送系统包括病毒载体， 通常为来自至少一种以下病毒的序 列： 腺病毒、 腺病毒相关病毒 (AAV)、 依赖辅助病毒的腺病毒、 逆转录病毒或日本血凝病毒 (HVJ) 脂质体复合体。 优选病毒载体包含可操作连接到多核苷酸的强真核启动子， 例如巨细 胞病毒 (CMV) 启动子。
     其它优选的载体包括病毒载体、 融合蛋白和化学缀合物。逆转录病毒载体包括莫 洛尼鼠白血病病毒和 HIV 型病毒。 一个优选的 HIV 型病毒载体包含至少两种载体， 其中 gag 和 pol 基因来自 HIV 基因组， env 基因来自另一种病毒。优选 DNA 病毒载体。这些载体包 括痘病毒载体， 例如正痘病毒 (orthopox) 或禽痘病毒 (avipox) 载体 ； 疱疹病毒载体， 例 如单纯疱疹病毒 I(HSV) 载体 [Geller， A.I. 等， (1995)J.Neurochem， 64 ： 487 ； Lim， F. 等， DNA Cloning ： Mammalian Systems， D.Glover， Ed.(Oxford Univ.Press， Oxford England) (1995) ； Geller， A.I. 等， (1993)Proc Natl.Acad.Sci. ： U.S.A. ： 90 7603 ； Geller， A.I. 等， (1990)Proc Natl.Acad.Sci USA ： 87 ： 1149] ； 腺 病 毒 载 体 (LeGal LaSalle 等， Science， 259 ： 988(1993) ； Davidson 等， (1993)Nat.genet.3 ： 219 ； Yang 等， (1995)J.Virol.69 ： 2004) 和腺伴随病毒载体 (Kaplitt， M.G. 等， (1994)Nat.genet.8 ： 148)。
     本发明的反义化合物包括任何药学上可接受的盐、 酯、 或这类酯的盐、 或任何其它 化合物， 其一旦给予包括人的动物能提供 ( 直接或间接 ) 生物活性代谢物或其残基。
     术语″药学上可接受的盐″指本发明化合物的生理学和药学上可接受的盐， 即保 留母体化合物的所需生物活性且没有不需要的毒性作用的盐。对于寡核苷酸， 优选的药学 上可接受的盐的实例和它们的用途详见美国专利公开号 6,287,860， 其通过引用结合到本 文中。本发明也包括包含本发明的反义化合物的药学组合物和制剂。 本发明的药学组合 物可根据需要局部治疗还是全身治疗以及待治疗的部位以多种方式给药。给药可以是局 部给药 ( 包括眼部给药和粘膜 ( 包括阴道和直肠递送 ) 给药 ) ； 肺部给药 ( 例如吸入或吹 入粉末或气雾剂 ( 包括通过喷雾器 )、 气管内、 鼻内、 表皮和透皮的方式 ) ； 口服或胃肠外给 药。 胃肠外给药包括静脉内、 动脉内、 皮下、 腹膜内或肌内注射或输注、 或颅内例如鞘膜内或 心室内给药。人们认为具有至少一个 2′ -O- 甲氧乙基修饰的寡核苷酸尤其有益于口服给 药。局部给药的药学组合物和制剂可以包括透皮贴剂、 药膏、 洗剂、 乳剂、 凝胶剂、 滴剂、 栓 剂、 喷雾剂、 液体剂和粉末剂。常规药学载体、 水性、 粉末或油基、 增稠剂等可能是需要的或 理想的。涂覆的避孕套、 手套等也可能是有用的。
     本发明药学制剂可以方便地采取单位剂型， 其可通过药学工业上公知的常规方法 制备。 这类方法包括使所述活性成分和药学载体或赋形剂混合的步骤。 通常， 制备制剂通过 使活性成分和液体载体或精细固体载体或两者均匀充分混合， 然后如果需要， 使产品成型。
     本发明的组合物可以制备成许多可能剂型中的任一种， 例如但不限于片剂、 胶囊 剂、 凝胶胶囊剂、 液体糖浆剂、 软凝胶剂、 栓剂和灌肠剂。本发明的组合物也可以制备成水 性、 非水性或混合性介质的混悬剂。 水性混悬剂可以进一步包含增加悬浮粘度的物质， 例如 羧甲基纤维素钠、 山梨糖醇和 / 或葡聚糖。混悬剂也可以包含稳定剂。
     本发明的药学组合物包括但不限于溶液、 乳剂、 泡沫和含脂质体的制剂。 本发明的 药学组合物和制剂可以包含一种或多种穿透促进剂、 载体、 赋形剂或其它活性或非活性成 分。
     乳剂通常是一种液体分散在另一种流体中的非均相系统， 乳剂液滴直径通常超过 0.1μm。除了分散相， 乳剂还可以包含其它成分， 活性药物可以为水相、 油相或其自身为独 立相的溶液。本发明的一个实施方案包括微乳剂。本领域公知乳剂和它们的用途， 详见美 国专利公开号 6,287,860。
     本发明的制剂包括脂质体制剂。 本文所用的术语″脂质体″意指由排列成球形双 层或多双层的两亲的脂质组成的小泡。脂质体是单层或多层小泡， 其具有亲脂物质形成的 膜和包含待递送组合物的水性内含物。阳离子脂质体是带正电的脂质体， 人们认为其与带 负电的 DNA 分子互相作用形成稳定的复合体。pH 敏感性或带负电的脂质体被认为是捕获 DNA 而不是与它复合。阳离子和非阳离子脂质体均已用于递送 DNA 到细胞。
     脂质体也包括″立体稳定的″脂质体， 本文所用的该术语指包含一种或多种特殊 化脂质的脂质体。当掺入脂质体中时， 这些特殊化的脂质导致脂质体相对于无这种特殊化 脂质的脂质体具有更长的循环寿命。立体稳定的脂质体的实例是 ： 脂质体中形成小泡的脂 质部分包含一种或多种糖脂， 或者其衍生自一种或多种亲水聚合物， 例如聚乙二醇 (PEG) 部分。脂质体和它们的用途详见美国专利公开号 6,287,860。
     本发明的药学制剂和组合物还可以包括表面活性剂。表面活性剂在药品、 制剂和 乳剂中的用途是本领域公知的。表面活性剂和它们的用途进一步描述于美国专利公开号 6,287,860， 其通过引用结合到本文中。
     在一个实施方案中， 本发明采用各种穿透促进剂影响核酸 ( 尤其是寡核苷酸 ) 的有效递送。除了帮助非亲脂性药物扩散穿过细胞膜， 穿透促进剂也提高亲脂药物的渗 透性。穿透促进剂可以归类到属于五大类的其中一种， 即表面活性剂、 脂肪酸、 胆汁盐、 螯合剂和非螯合性非表面活性剂。穿透促进剂和它们的用途进一步描述于美国专利公开号 6,287,860， 其通过引用结合到本文中。
     本领域技术人员应认识到， 根据制剂的预定用途， 即给药途径， 常规设计制剂。
     优选的用于局部给药的制剂包括本发明的寡核苷酸与局部递送剂混合的制剂， 局 部递送剂例如脂质、 脂质体、 脂肪酸、 脂肪酸酯、 类固醇、 螯合剂和表明活性剂。优选的脂 质和脂质体包括中性的 ( 例如二油酰基 - 磷脂酰基乙醇胺 DOPE、 二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱 DMPC、 二硬脂酰磷脂酰胆碱 )、 阴性的 ( 例如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油 DMPG) 和阳离子的 ( 例 如二油酰基四甲基氨基丙基 DOTAP 和二油酰基 - 磷脂酰基乙醇胺 DOTMA)。
     对于局部或其它给药， 本发明寡核苷酸可包囊在脂质体中或可与其形成其复合 物， 特别是阳离子脂质体。或者， 寡核苷酸可以复合脂质， 特别是阳离子脂质。优选的脂肪 酸和酯、 它们药学上可接受的盐和它们的用途详见美国专利公开号 6,287,860。
     用于口服给药的组合物和制剂包括粉末或颗粒、 微粒、 纳米微粒、 在水或非水性介 质中的混悬剂或溶液剂、 胶囊、 凝胶胶囊、 小囊剂、 片剂或小片剂。增稠剂、 矫味剂、 稀释剂、 乳化剂、 分散助剂或粘合剂可能是需要的。 优选的口服制剂是 ： 其中本发明的寡核苷酸与一 种或多种穿透促进剂、 表面活性剂和螯合剂联合给予的制剂。优选的表面活性剂包括脂肪 酸和 / 或其酯或其盐、 胆酸和 / 或其盐。优选的胆酸 / 盐和脂肪酸以及它们的用途描述于 美国专利公开号 6,287,860， 其通过引用结合到本文中。还优选穿透促进剂 ( 例如脂肪酸 / 盐 ) 联合胆酸 / 盐的组合。特别优选的组合是月桂酸的钠盐、 癸酸和 UDCA。进一步的穿透 促进剂包括聚氧乙烯 -9- 月桂基醚、 聚氧乙烯 -20- 十六烷基醚。本发明的寡核苷酸可以颗 粒形式口服递送， 包括喷雾干颗粒或复合形成微米或纳米颗粒。寡核苷酸复合剂和它们的 用途进一步描述于美国专利公开号 6,287,860， 其通过引用结合到本文中。
     用于肠胃外、 鞘内或腔室内给予的组合物和制剂可以包括无菌水溶液， 该无菌水 溶液也可以包含缓冲剂、 稀释剂和其它合适的添加剂， 例如但不限于穿透促进剂、 载体化合 物和其它药学上可接受的载体或赋形剂。
     本发明某些实施方案提供包含一种或多种寡聚化合物和一种或多种通过非 反义机制起作用的其它化学治疗剂的药学组合物。这类化学治疗剂的实施包括但不 限 于 癌 症 化 学 治 疗 药 物 例 如 柔 红 霉 素、 道 诺 霉 素、 放 线 菌 素、 多 柔 比 星、 表 柔 比 星、 伊 达比星、 依索比星、 博来霉素、 马磷酰胺、 异环磷酰胺、 阿糖胞苷、 二氯乙基 - 亚硝基脲 (bischloroethyl-nitrosurea)、 白消安、 丝裂霉素 C、 放线菌素 D、 普卡霉素、 泼尼松、 羟孕 酮、 睾酮、 他莫昔芬、 达卡巴嗪、 丙卡巴肼、 六甲蜜胺、 五甲蜜胺、 米托蒽醌、 安吖啶、 苯丁酸氮 芥、 甲基环己基亚硝基脲 (methylcyclohexylnitrosurea)、 氮芥、 美法仑、 环磷酰胺、 6- 巯 嘌呤、 6- 硫代鸟嘌呤、 阿糖胞苷、 5- 氮杂胞苷、 羟基脲、 脱氧柯福霉素 (deoxycoformycin)、 4- 羟基过氧环磷酰胺、 5- 氟尿嘧啶 (5-FU)、 5- 氟脱氧尿苷 (5-FUdR)、 甲氨蝶呤 (MTX)、 秋 水仙碱、 泰素、 长春新碱、 长春碱、 依托泊苷 (VP-16)、 三甲曲沙、 伊立替康、 托泊替康、 吉西他 滨、 替尼泊苷、 顺铂和己烯雌酚 (DES)。 当与本发明的化合物联用时， 这些化学治疗剂可单独 使用 ( 例如 5-FU 和寡核苷酸 )、 序贯使用 ( 例如 5-FU 和寡核苷酸用药一段时间， 接着使用 MTX 和寡核苷酸 )， 或与一种或多种其它这样的化学治疗剂联用 ( 例如 5-FU、 MTX 和寡核苷 酸联用， 或 5-FU、 放射疗法和寡核苷酸联用 )。消炎药 ( 包括但不限于非类固醇消炎药和皮 质激素 ) 和抗病毒药物 ( 包括但不限于利巴韦林 (ribivirin)、 阿糖腺苷、 阿昔洛韦和更昔洛韦 ) 也可以结合到本发明的组合物。反义化合物和其它非反义药物的组合也属于本发明 的范围内。两种或更多种结合型化合物可以一起使用或序贯使用。
     在另一个相关的实施方案中， 本发明的组合物可以包含一种或多种靶向第一核酸 的反义化合物 ( 尤其是寡核苷酸 )， 和一种或多种靶向第二核酸靶的其它反义化合物。例 如， 第一个靶可以是肿瘤抑制基因的特定反义序列， 而第二个靶可以是另一核苷酸序列的 一个区域。或者， 本发明的组合物可以包含两种或更多种靶向相同肿瘤抑制基因核酸目标 的不同区域的反义化合物。本文举例说明了很多反义化合物的实例， 可从本领域已知的适 合化合物中选择其它反义化合物。两种或更多种结合型化合物可以一起使用或序贯使用。
     定量给药 ：
     治疗性组合物的制剂和其随后的给药 ( 定量给药 ) 在本领域技术人员技术知识范 围内。 定量给药根据待治疾病的严重性和反应性来决定， 治疗过程持续几天到几个月， 或直 到治愈或达到减轻疾病的状态。最佳给药方案可从检测患者体内药物累积来计算。本领域 普通技术人员可容易地决定最佳剂量、 给药方法和重复率。最佳剂量可以根据各个寡核苷 酸的相对功效来改变， 以及一般可以根据体外和体内动物模型中获得的有效的 EC50 来估 算。总体而言， 剂量是 0.01μg-100g/kg 体重， 可以每天、 每周、 每月或每年给药一次或多 次， 甚至每 4 到 30 年给药一次。本领域普通技术人员能根据检测到的药物在体液或组织中 的停留时间和浓度容易地估算重复给药率。成功治疗后， 理想的是让患者进行维持疗法以 预防疾病状态的复发， 其中寡核苷酸以维持剂量给药 ： 0.01μg-100g/kg 体重， 每天一次或 多次到每 20 年一次。
     尽管上面已经描述了本发明的各种实施方案， 但是应当理解的是它们仅以实施例 的方式来说明本发明， 而非限制性的。根据本文的公开内容在不脱离本发明宗旨或范围内 可对公开的实施方案进行许多改变。因此， 本发明的宽度和范围不应该受上述任何实施方 案的限制。
     本文提到的所有文献都通过引用结合到本文中。出于所有目的， 本申请中引用的 所有出版物和专利文献都通过引用结合到本文中， 引用的程度就好像每一出版物或专利文 献单独指明一样。在本文中引用各种参考文献， 申请人并不承认任何具体的参考文献对于 他们的发明是 “先有技术” 。发明性组合物和方法的实施方案用下列实施例予以说明。 实施例 以下非限制性实施例用来举例说明本发明的选定实施方案。应理解的是， 显示的 组分的比例变化和元件替代对本领域技术人员来说是显而易见的并属于本发明实施方案 的范围内。
     实施例 1 ： 设计对肿瘤抑制基因多核苷酸的反义链和 / 或有义链核酸分子特异性 的反义寡核苷酸
     如上所述， 术语″对 ... 特异性的寡核苷酸″或″寡核苷酸靶″指具有以下特征 序列的寡核苷酸 ： (i) 能与靶基因的一部分形成稳定的复合物， 或 (ii) 能与靶基因的 mRNA 转录物的一部分形成稳定的双链体。
     利用自动比对核酸序列并且指示同一性或同源性区域的计算机程序辅助选择适 当的寡核苷酸。这种程序用于比较例如通过搜索数据库 ( 例如 GenBank) 或通过测序 PCR
     产物得到的核酸序列。 比较一定范围内物种的核酸序列允许选择在物种之间展示出合适同 一性程度的核酸序列。在基因还没有测序的情况下， 可进行 DNA 印迹从而测定目标物种和 其它物种基因之间的同一性程度。本领域公知通过在不同严格程度下进行 DNA 印迹， 可能 获得同一性的近似值。 这些程序允许选择与需要控制的个体中的靶核酸序列显示高度互补 性， 而和其它物种的相应核酸序列互补性程度较低的寡核苷酸。 本领域的技术人员应知道， 用于本发明的基因的合适区域的选择空间相当大。
     反义化合物是″可特异性杂交″是指 ： 当所述化合物与靶核酸的结合干扰靶核酸 的正常功能而引起功能和 / 或活性的调节， 并且有足够程度的互补性以避免在理想的特异 性结合的条件下 ( 即体内测定或治疗性处理情形下的生理条件下， 和在体外测定时进行测 定的条件下 ) 反义化合物非特异性地结合非靶核酸序列。
     本文描述的寡核苷酸的杂交特性可以通过本领域公知的一种或多种体外试验测 定。 例如， 本文描述的寡核苷酸的特性可以如下获得 ： 利用解链曲线分析测定靶天然反义序 列和潜在药物分子之间的结合强度。
     靶天然反义序列和潜在药物分子 ( 分子 ) 之间的结合强度可以利用任何已经建立 的检测分子间相互作用强度的方法来估算， 例如解链曲线分析。
     解链曲线分析确定天然反义 / 分子双链体发生双链到单链构象快速转化时的温 度。广泛认为该温度是两个分子间相互作用强度的可靠测量指标。
     解链曲线测定可利用对应于所述分子结合位点的实际天然反义 RNA 分子的 cDNA 拷贝或合成 DNA 或 RNA 核苷酸进行。已有包含进行该测定所有必需试剂的多种试剂盒 ( 例 如 Applied Biosystems Inc.MeltDoctor 试剂盒 )。这些试剂盒包含合适的缓冲溶液， 缓 冲溶液包含一种双链 DNA(dsDNA) 结合染料 ( 例如 ABI HRM 染料、 SYBR Green、 SYTO 等 )。 dsDNA 染料的特征是他们在自由状态下几乎不发荧光， 但是在结合 dsDNA 时是高荧光性的。
     为了进行测定， 将 cDNA 或对应的寡核苷酸和分子以具体制造商方案规定的浓度 混合。将混合物加热到 95℃以便所有预先形成的 dsDNA 复合体解离， 然后缓慢冷却至室温 或试剂盒制造商规定的其它较低的温度以允许 DNA 分子退火。然后慢慢加热新形成的复合 体到 95℃， 同时连续收集由所述反应产生的荧光量数据。荧光强度与反应中存在的 dsDNA 的量成反比。 数据可用与试剂盒兼容的实时 PCR 仪器收集 ( 例如 ABI’ s STumor Suppressor genene Plus Real Time PCR System 或 LightTyper 仪器， Roche Diagnostics， Lewes， UK)。
     用适当的软件 ( 例如 LightTyper(Roche) 或 SDS Dissociation Curve， ABI) 对温 度 (-d( 荧光 )/dT)， y 轴 ) 相对于温度 (x 轴 ) 作负导数荧光图从而构建解链峰。分析数 据， 鉴定从 dsDNA 复合体到单链分子之间的快速转变的温度。该温度称为 Tm 并且与两个分 子之间的相互作用强度成正比例。通常 Tm 超过 40℃。
     实施例 2 ： 调节肿瘤抑制基因寡核苷酸基因表达
     用反义寡核苷酸处理 HEPG2 细胞
     得 自 ATCC 的 HepG2 细 胞 (cat#HB-8065) 于 37 ℃ 和 5 ％ CO2 条 件 下 生 长 于 生 长 培 养 基 (MEM/EBSS(Hyclone cat#SH30024，或 Mediatech cat#MT-10-010-CV)+10 ％ FBS(Mediatech cat#MT35-011-CV)+ 青霉素 / 链霉素 (Mediatech cat#MT30-002-CI))。试 验的前一天， 将细胞以 1.5×105/ml 的密度重新接种于 6 孔板中， 于 37℃和 5％ CO2 条件下 温育。试验当天将 6 孔板中的培养基换为新鲜的生长培养基。稀释所有的反义寡核苷酸到浓度 20μM。 2μl 该溶液与 400μl 的 Opti-MEM 培养基 (Gibco cat#31985-070) 和 4μl 的 Lipofectamine 2000(Invitrogen cat#11668019) 室温下温育 20 分钟， 然后加入有 HepG2 细胞的 6 孔板的每个孔中。包含 2μl 水代替寡核苷酸溶液的类似混合物用于模拟转染对 照。在 37 ℃和 5 ％ CO2 条件下温育 3-18 小时后， 培养基换为新鲜的生长培养基。在加入 反义寡核苷酸 48 小时后， 去掉培养基， 根据制造商的说明书， 用 SV Total RNA Isolation System(Promega， cat#Z3105) 或 RNeasy Total RNA Isolation kit(Qiagen， cat#74181) 从细胞中提取 RNA。利用 Verso cDNA 试剂盒 (Thermo Scientific， cat#AB1453B) 或 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(cat#4368813)， 根据制造商的方案， 在反转录 反应中加入 600ng RNA。利用 ABI Taqman gene Expression Mix(cat#4369510) 和 ABI 设 计的引物 / 探针， 由实时 PCR 利用反转录反应中得到的 cDNA 监测基因表达。采用的 PCR 循 环如下 ： 50℃ 2 分钟， 95℃ 10 分钟， 40 次循环 (95℃ 15 秒， 60℃ 1 分钟 )， 采用 StepOne Plus Real Time PCR Machine(Applied Biosystems Inc.) 或 Mx4000 热循环仪 (Stratagene)。
     根据处理和模拟转染样品之间 18S 标准化的 dCt 值的差异， 计算反义寡核苷酸处 理之后基因表达的倍数变化。
     p73 表达测定使用 (ABI cat#s)， 所有探针 MGB
     p73 ： Hs00232088_m1( 靶序列 ACCTCTGGAGCTCTCTGGAAC， 外显子 2SEQ ID No. ： 35)
     p73as ： Hs00215135_m1( 靶 序 列 TATGATGGAAAGGTGCGCATCCTTA， 外 显 子 7SEQ ID No. ： 36) 和 Hs00892470_g1
     结果 ：
     实时 PCR 结果显示， 用针对肿瘤抑制基因设计的 siRNA 中的两种处理 HepG2 细胞 48 小时后， 肿瘤抑制基因 mRNA 的水平显著增加 ( 肿瘤抑制基因 _1， P ＝ 0.02， 和肿瘤抑制 基因 _2， P ＝ 0.04， 图 1A)。用针对肿瘤抑制基因的 siRNA 处理同样的样品后， 肿瘤抑制基 因 RNA 的水平可能减少 ( 图 1B)。
     在图 1C 中， 实时 PCR 结果显示， 用针对肿瘤抑制基因反义 Hs.668503 设计的寡聚 体中的两种和针对肿瘤抑制基因反义 Hs.674463 设计的寡聚体中的一种处理 HepG2 细胞 48 小时后， 肿瘤抑制基因 mRNA 的水平显著增加。
     实时 PCR 结果显示， 用针对 PTEN 反义 hs.624903 设计的寡核苷酸中的一种处理 HepG2 细胞 48 小时后， PTEN mRNA 的水平显著增加 ( 图 3)。 ( 检测探针 ： Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay ： Hs02621230_s1)
     用反义寡核苷酸处理 TM4 细胞
     得自 ATCC 的 TM4 细胞 (cat#CRL-1715) 于 37℃和 5％ CO2 条件下生长于生长培养基 (MEM/EBSS(Hyclone cat#SH30024， 或 Mediatech cat#MT-10-010-CV)+10％ FBS(Mediatech cat#MT35-011-CV)+ 青霉素 / 链霉素 (Mediatech cat#MT30-002-CI))。 试验的前一天， 将细 5 胞以 1.5×10 /ml 的密度重新接种于 6 孔板中， 于 37℃和 5％ CO2 条件下温育。试验当天将 6 孔板中的培养基换为新鲜的生长培养基。稀释所有的反义寡核苷酸到浓度 20μM。2μl 该溶液与 400μl 的 Opti-MEM 培养基 (Gibco cat#31985-070) 和 4μl 的 Lipofectamine 2000(Invitrogen cat#11668019) 于室温下温育 20 分钟， 然后加入有 TM4 细胞的 6 孔板的 每个孔中。包含 2μl 水代替寡核苷酸溶液的类似混合物用于模拟转染对照。在于 37℃和 5％ CO2 条件下温育 3-18 小时后， 培养基换为新鲜的生长培养基。加入反义寡核苷酸 48 小时后， 去掉培养基， 根据制造商的说明书， 用 SV Total RNA Isolation System(Promega， cat#Z3105) 或 RNeasy Total RNA Isolation kit(Qiagen， cat#74181) 从细胞中提取 RNA。 利 用 Verso cDNA 试 剂 盒 (Thermo Scientific， cat#AB1453B) 或 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(cat#4368813)， 根据制造商的方案， 在反转录反应中加入 600ng 的 RNA。通过 ABI Taqman gene Expression Mix(cat#4369510) 和 ABI 设计的引物 / 探针 (Applied Biosystems Taqman gene Expression Assay ： Mm00660220_m1， 由 Applied Biosystems Inc.， Foster City CA 设计 )， 由实时 PCR 利用该反转录反应中得到的 cDNA 监 测基因表达。采用的 PCR 循环如下 ： 50℃ 2 分钟， 95℃ 10 分钟， 40 圈 (95℃ 15 秒， 60℃ 1 分 钟 )， 采用 StepOne Plus Real Time PCR Machine(Applied Biosystems)。
     根据处理和模拟转染样品之间 18S 标准化的 dCt 值的差异， 计算反义寡核苷酸处 理之后基因表达的倍数变化。
     结果 ：
     实时 PCR 结果显示， 各用一种针对肿瘤抑制基因反义 Hs.668503 设计的寡聚体中 的一种和肿瘤抑制基因反义 WDR8 设计的寡聚体中的一种处理小鼠 TM4 细胞 48 小时后， 肿 瘤抑制基因 mRNA 的水平显著增加 ( 图 1D)。
     用反义寡核苷酸处理 HUVEC 细胞
     得 自 ATCC 的 HUVEC 细 胞 (Promo Cell cat#C-12253) 于 37 ℃ 和 5 ％ CO2 条 件 下生长于上皮生长培养基 (Promo Cell cat#C-22010)。试验的前一天， 用 Promo Cell 5 Detach Kit(cat#C-41200) 将细胞以 1.5×10 /ml 的密度重新接种于 6 孔板中， 于 37 ℃ 和 5％ CO2 条件下温育。试验当天将 6 孔板中的培养基转变为新鲜的上皮生长培养基。稀 释所有反义寡核苷酸到浓度 20μM。2μl 该溶液与 400μl 的 Opti-MEM 培养基 (Gibco cat#31985-070) 和 4μl 的 Lipofectamine 2000(Invitrogen cat#11668019) 于 室 温 下 温育 20 分钟， 然后加入有 HUVEC 细胞的 6 孔板的每个孔中。包含 2μl 水代替寡核苷酸 溶液的类似混合物用于模拟转染对照。在于 37 ℃和 5 ％ CO2 条件下温育 3-18 小时后， 培 养基换为新鲜的生长培养基。加入反义寡核苷酸 48 小时后， 去掉培养基 ； 根据制造商的 说明书， 用 SV Total RNA Isolation System(Promega， cat#Z3105) 或 RNeasyTotal RNA Isolation kit(Qiagen， cat#74181) 从细胞中提取 RNA。利用 Verso cDNA 试剂盒 (Thermo Scientific， cat#AB1453B)， 根据制造商的方案， 在反转录反应中加入 600ng 的 RNA。通 过 ABI Taqman gene Expression Mix(cat#4369510) 和 ABI 设计的引物 / 探针 (Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assays ： Hs00153340_m1 和 Hs00216360_m1， 由 Applied Biosystems Inc.， Foster City CA 设计 )， 由实时 PCR 利用该反转录反应中得到的 cDNA 监测基因表达。所用的 PCR 循环如下 ： 50℃ 2 分钟， 95℃ 10 分钟， 40 次循环 (95℃ 15 秒， 60℃ 1 分钟 )， 采用 StepOne Plus Real Time PCR Machine(Applied Biosystems) 或 Mx4000 热循环仪 (Stratagene)。
     根据处理和模拟转染样品之间 18S 标准化的 dCt 值的差异， 计算反义寡核苷酸处 理之后基因表达的倍数变化。
     P53 表达测定使用 (ABI cat#s)， 所有的探针 FAM/MGB ： 18S ： 4319413E
     P53 ： Hs00153340_m1( 靶序列 CTTCCCTGGATTGGCAGCCAGACTG， SEQ ID No. ： 37)
     P53as ： Hs00216360_m1( 靶序列 ATATGCAGAAATGGTCCCTGTCCTT， SEQ ID No. ： 38)结果 ：
     实时 PCR 结果显示， 用针对 p53as 设计的所有 siRNA 处理 HUVEC 细胞 48 小时后， p53mRNA 的水平显著增加 ( 图 2)。
     虽然针对一种或多种实施方案对本发明进行了举例性说明和描述， 本领域技术人 员阅读和理解本说明书和附图后， 可对本发明进行等同性修改和修饰。 另外， 虽然本发明的 具体特征可能仅就若干实施方式中的一种进行了公开， 但是当对任何给定的或具体的应用 可能是理想的和有利时， 这种特征可以和其它实施方式中的一种或几种特征结合。
     本公开的摘要使读者可以快速确定本技术公开的性质。 应当理解的是其不能被用 为解释或限制权利要求的范围或意义。