树突状细胞联合细胞因子诱导杀伤细胞在肺癌治疗中的应 用 技术领域 本发明属于生物制药和免疫学领域 ； 更具体地， 本发明涉及树突状细胞联合细胞 因子诱导杀伤细胞在肺癌治疗中的应用。
背景技术 肺癌是一种严重威胁人类健康的疾病， 其中， 非小细胞肺癌的死亡率占据首位。 在 诊断时， 多数患者已经晚期 (IIIB-IV 期 )， 无法进行手术治疗。IIIB-IV 期的非小细胞肺癌 患者只能接受化疗为主的治疗方式。 化疗的毒副反应包括 ： 骨髓抑制， 胃肠道反应和感染性 疾病。鉴于化疗的局限性， 需要发展一种新颖的治疗模式。
在不同的治疗模式中， 免疫治疗因为其针对性地杀伤肿瘤细胞， 具有高效和低毒 的作用， 而日益受到广泛关注。 临床前期研究提示， 免疫治疗联合化疗能提供明显的益处。
然而， 至今没有数据显示化疗联合免疫治疗在晚期非细胞肺癌患者中的作用。因 此， 本领域非常有必要进一步研究 DC 联合 CIK 的免疫治疗联合化疗在晚期肺癌患者中的作 用。
发明内容
本发明的目的在于提供树突状细胞联合细胞因子诱导杀伤细胞在肺癌治疗中的 应用。
在本发明的第一方面， 提供一种用于缓解或治疗肺癌的细胞组合， 包括 ：
(a) 致敏的 DC 细胞 ； 该细胞如下制备 ： 获取肺癌患者自身单个核细胞 ( 较佳地， 为 黏附细胞 )， 在含有 GM-CSF 和 IL-4 的条件下培养， 用 SEQ ID NO ： 1 所示氨基酸序列的肽刺 激， 获得致敏的 DC 细胞 ； 和
(b)CIK 细胞 ； 该细胞如下制备 ： 获取肺癌患者自身单个核细胞 ( 较佳地， 为非黏附 细胞 )， 在含有 IFN-γ 的条件下培养， 之后加入抗人 CD3 抗体和 IL-2， 获 得 CIK 细胞。
在一个优选例中， (a) 中， 获取肺癌患者自身单个核细胞后， 所述的单个核细胞如 下处理 ： 将肺癌患者自身单个核细胞置于容器中， 静置使之形成两部分细胞， 一部分黏附在 容器壁上， 一部分为悬浮细胞 ； 分离其中的黏附细胞 ； 和/或
(b) 中， 获取肺癌患者自身单个核细胞后， 所述的单个核细胞如下处理 ： 将肺癌患 者自身单个核细胞置于容器中， 静置使之形成两部分细胞， 一部分黏附在容器壁上， 一部分 为悬浮细胞 ； 分离其中的非黏附细胞。
在 另 一 优 选 例 中， (a) 中， 单 个 核 细 胞 在 含 有 1000±200 单 位 /mL GM-CSF， 500±100 单位 /mL IL-4 的培养介质中培养。
在另一优选例中， 单个核细胞在含有 1000±100 单位 /mL GM-CSF， 500±50 单位 / mL IL-4 的培养介质中培养。
在另一优选例中， (a) 中， 细胞在含有 GM-CSF 和 IL-4 的条件下培养 6-10 天 ( 较佳地 8 天 ) 后， 与 SEQ ID NO ： 1 所示氨基酸序列的肽共孵育 12±2 小时 ( 较佳地， 12±1 小 时 )。
在另一优选例中， 共孵育时， 肽的浓度是 10±2ug/ml。
在另一优选例中， (b) 中， 单个核细胞在含有 1000±100 单位 /mL IFN-γ 的培养 介质中培养 24±5 小时 ( 较佳地 24±3 小时 )， 之后加入 50±10ng/mL( 较佳地 50±5ng/ mL) 的抗 CD3 抗体， 细胞每 3±1 天换液， 换液时补充 1000±200 单位 /mL IL-2， 培养 9±2 天 ( 较佳地 9±1 天 )。
在 另 一 优 选 例 中， 单 个 核 细 胞 在 含 有 IFN-γ 的 培 养 介 质 中 的 细 胞 浓 度 是 6 (1-10)×10 个细胞 /ml ； 较佳地， 为 3×106 个细胞 /ml。
在本发明的另一方面， 提供一种制备致敏的 DC 细胞的方法， 该方法包括 ： 获取肺 癌患者自身单个核细胞 ( 较佳地， 为黏附细胞 )， 在含有 GM-CSF 和 IL-4 的条件下培养， 用 SEQ ID NO ： 1 所示氨基酸序列的肽刺激， 获得致敏的 DC 细胞。
在本发明的另一方面， 提供一种制备 CIK 细胞的方法， 该方法包括 ： 获取肺癌患者 自身单个核细胞 ( 较佳地， 为非黏附细胞 )， 在含有 IFN-γ 的条件下培养， 之后加入抗 CD3 抗体和 IL-2， 获得 CIK 细胞。
在本发明的另一方面， 提供所述的细胞组合的用途， 用于制备缓解或治疗肺癌的组合物。 在另一优选例中， 所述的肺癌是非小细胞肺癌。
在本发明的另一方面， 提供一种用于缓解或治疗肺癌的药盒， 其中包括 ：
容器 1， 其中包括 ： 有效量的致敏的 DC 细胞， 以及与所述细胞相容的载体 ； 所述的 致敏的 DC 细胞如下制备 ： 获取肺癌患者自身单个核细胞 ( 较佳地， 为黏附细胞 )， 在含有 GM-CSF 和 IL-4 的条件下培养， 用 SEQ ID NO ： 1 所示氨基酸序列的肽刺激， 获得致敏的 DC 细 胞； 和/或
容器 2， 其中包括 ： 有效量的 CIK 细胞， 以及与所述细胞相容的载体 ； 所述的 CIK 细 胞如下制备 ： 获取肺癌患者自身单个核细胞 ( 较佳地， 为非黏附细胞 )， 在含有 IFN-γ 的条 件下培养， 之后加入抗 CD3 抗体和 IL-2， 获得 CIK 细胞。
在另一优选例中， 所述的药盒中还包括癌症化疗药物。
在另一优选例中， 所述的癌症化疗药物选自长春瑞滨和 / 或顺铂。
本发明的其它方面由于本文的公开内容， 对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
附图说明
图 1、 与化疗组相比， 免疫化疗组的生存期有显著延长。 在免疫化疗组， 中位无病生 存期为 6.9 个月 (95％ CI ： 5.0-8.8)(p ＝ 0.03)， 化疗组为 5.2 个月 (95％ CI ： 3.3-6.0)。
图 2、 免疫化疗组患者的 1、 2、 5 年生存率分别为 64.3％， 49.8％和 21.0％。 具体实施方式
本发明人经过深入的研究， 开辟了一种利用树突状细胞联合细胞因子诱导杀伤细 胞来缓解或治疗肺癌的方法， 所述方法可有效延长癌症患者的生存时间， 且毒副作用低。细胞
如本文所用， 所述的 “单个核细胞” 是指获自癌症患者外周血、 或癌症患 者的癌症 组织、 恶性腹水或恶性胸水中的一类具有免疫效应的细胞， 其可通过例如非连续密度梯度 离心法分离获得。该类具有免疫效应的细胞主要包括 ： 树突状细胞， 淋巴细胞等。DC 细胞 亦可从骨髓中的造血干细胞中获得。
本发明中， 利用树突状细胞 (DC) 实现抗肿瘤的细胞免疫。树突状细胞是强大的抗 原递呈细胞， 能有效地刺激抗肿瘤的细胞免疫。应用肿瘤相关抗原 (TAA) 致敏 DC 能诱导保 护性的免疫反应。一些证据显示， TAA 致敏 DC 能诱导杀伤性的 T 细胞 (CTL) 的产生。CEA 是 18 道尔顿的糖蛋白， 在肺癌患者中高表达。在本发明中， 本发明人经过广泛研究后发现， 应用 CEA 蛋白氨基酸序列第 605-613 的 9 肽 (HLA-A2 限制性的 ) 来致敏 DC， 获得的致敏 DC 细胞能够高效地诱导保护性免疫反应。
作为本发明的优选方式， 所述的致敏 DC 细胞如下制备 ： 获取肺癌患者自身单个核 细胞， 贴壁培养， 在贴壁细胞中加入细胞因子 GM-CSF 和 IL-4 使之成为 DC ； 在含有 GM-CSF 和 IL-4 的条件下培养， 用 SEQ ID NO ： 1 所示氨基酸序列的肽刺激， 获得致敏的 DC 细胞。利 用 GM-CSF 和 IL-4 来进行细胞的培养， 可以促进细胞的树指状突起， 避免形成巨噬细胞 ； 并 可以为细胞提供良好的生长环境，
细胞因子诱导的杀伤细胞 (CIK) 是体外应用抗 CD3 单抗刺激淋巴细胞产生的。 CIK 比之于淋巴细胞激活的杀伤细胞 (LAK) 具有更强的抗肿瘤作用。
作为本发明的优选方式， 所述的 CIK 细胞如下制备 ： 获取肺癌患者自身单个核细 胞， 单个核细胞铺成在培养皿上， 静置使之形成两部分细胞， 一部分为黏附在培养皿的， 一 部分为悬浮细胞 )， 悬浮的细胞在含有 IFN-γ 的条件下培养， 之后加入抗 CD3 抗体和 IL-2， 获得 CIK 细胞。IFN-γ 和 IL-2 的应用有利于获得 CIK 细胞。CIK 细胞可以在体外通过流 式细胞仪鉴定其表型， CD3+CD56+ 双阳性的 CIK 超过 50％才被认为具有杀伤活性。CIK 细 胞兼具 T 淋巴细胞强大的杀瘤活性和 NK 细胞的非 MHC 限制性。
DC 和 CIK 联合能互相改变彼此的细胞表面分子， 导致 IL-12 的分泌， 提高杀伤作 用。这样， DC 联合 CIK 在免疫治疗中具有理论依据。DC 联合 CIK 是一种天然免疫结合获得 性免疫的新颖免疫治疗方式。
本发明还提供了 DC 和 CIK 的用途， 两者联合应用于缓解或治疗肺癌。从患者外周 血中获取单个核细胞后， 分别制备致敏的 DC 以及 CIK， 回输给患者， 从而缓解或治疗肺癌。
本发明还提供了含有细胞的药物组合物， 它含有有效量的致敏 DC 或 CIK 细胞， 以 及与所述的细胞相容的载体。
通常， 可将所述的细胞配制于无毒的、 惰性的和与所述的细胞相容的介质中， 其中 pH 通常约为 5-8， 较佳地， pH 约为 6-8。
如本文所用， 术语 “含有” 表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物 中。
如本文所用， 术语 “有效量” 或 “有效剂量” 是指可对癌症患者产生功能或活性的 且可被癌症患者所接受的量。
如本文所用， “与所述细胞相容的” 的成分是适用于哺乳哺乳动物而无过度不良副 反应 ( 如毒性、 刺激和变态反应 ) 的， 即具有合理的效益 / 风险比的物质。 “与所述细胞相容的载体” 指用于治疗剂给药的载体， 包括各种赋形剂和稀释剂， 也即属于一种药学上可接受 的载体。 该术语指这样一些药剂载体 ： 它们本身并不是必要的活性成分， 且施用后没有过分 的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在 Remington’ s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.， N.J.1991) 中可找到关于与所述细胞相容的载体的充分说明。在 组合物中与所述细胞相容的载体可含有液体， 如水、 盐水、 甘油和乙醇。 另外， 这些载体中还 可能存在辅助性的物质， 如润滑剂、 助流剂、 润湿剂或乳化剂、 pH 缓冲物质等。
本发明的组合物含有安全有效量的所述的细胞以及与所述细胞相容的载体。 这类 载体包括 ( 但并不限于 ) ： 盐水、 缓冲液、 葡萄糖、 水、 甘油、 乙醇、 及其组合。通常药物制剂 应与给药方式相匹配， 本发明的组合物可以被制成针剂形式， 例如用生理盐水或含有葡萄 糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。 活性成分的给药量是治疗有效量。
在使用本发明的组合物时， 是将安全有效量的本发明的细胞施用于哺乳动物。当 然， 具体的给予剂量和给予次数还应考虑所施与的患者的体重、 年龄、 健康状况等因素， 这 些都是本领域熟练人员既能范围内的。
本发明的组合物可直接用于肺癌的缓解或治疗。此外， 还可同时与其它治疗剂或 辅剂联合使用。较佳地， 本发明的细胞联合化疗药物来治疗肺癌 ； 所述 的化疗药物是临床 上用于杀肺癌细胞的药物。 本发明还提供了一种用于缓解或治疗肺癌的药盒， 其中包括 ： 3 10
容器 1， 其中包括 ： 有效量 ( 如 10 ～ 10 个细胞 /mL ； 较佳地 104 ～ 109 个细胞 / mL ； 更佳地 105 ～ 108 个细胞 /mL) 的致敏的 DC 细胞， 以及药学上可接受的载体 ； 和/或 4 11 5 10
容器 2， 其中包括 ： 有效量 ( 如 10 ～ 10 个细胞 /mL ； 较佳地 10 ～ 10 个细胞 / 6 9 mL ； 更佳地 10 ～ 10 个细胞 /mL) 的 CIK 细胞， 以及药学上可接受的载体。
作为本发明的优选方式， 所述的药盒中还包括癌症化疗药物。所述的癌症化疗药 物例如但不限于长春瑞滨和 / 或顺铂。
作为本发明的优选方式， 所述的药盒中还包括使用说明书， 以指导本领域人员采 取适合的方法给药。
下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条 件如 J. 萨姆布鲁克等编著， 分子克隆实验指南， 科学出版社， 2002 中所述的条件， 或按照制 造厂商所建议的条件。除非另外说明， 否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义， 文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外， 任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所 述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例 1、 患者及给药方案
根据 WHO 标准， 患者具有组织学证实的非小细胞肺癌， 血清 CEA 水平 ( 其测定方法 采用常规化学发光法 ) 在 6-394ng/ml( 正常值 ： 5ng/ml)。 经流式细胞仪检测证实的 HLA-A2 阳性的患者， 抽取外周血， 分离单个核细胞。患者骨髓， 肝肾功能正常。患者无自身免疫性 疾病， 无脑转移， 无急性、 慢性感染性疾病。在 2004 年 8 月到 2005 年 10 月， 28 位 III B-IV 的非小细胞肺癌患者入组。随机进入化疗组或者免疫化疗组。患者每 4 周 CT 评价病灶大
小。化学发光法在每次治疗前后评价 CEA 值。毒性反应按照 NCI(2.0) 标准。本研究获得上 海市胸科医院伦理委员会的批准， 患者签署知情同意书。首先的评价指标是毒性反应， 其 次是无病生存率 (TTP) 和总生存率 (OS)。
28 个患者的基线水平见表 1。免疫治疗组中 6 男， 8 女， 中位年龄 50 岁。化疗组 7 男， 7 女， 中位年龄 48 岁。免疫化疗组最常见的病理类型是腺癌 (71.4％ )。化疗组也是腺 癌 (78.5％ )。两组中绝大多数是 IV 期 ( 分期标准为 WHO 标准 ) 患者 (71.4％ )。
表 1、 两组中患者特征
表中， T4 指肿瘤侵犯胸膜， 横膈， 心包， 食道， 气管等， N3 指淋巴结转移至胸腔以外。化疗组患者接受 4 个疗程 ( 每月一个疗程 ) 的长春瑞滨 (N) 联合顺铂 (P) 的 NP 化疗， 长春瑞滨为 25mg/m2( 人体表面积， 即身高加体重减 60/100， 如身高 170cm， 体重 60 公 斤， 即表面积为 (170+60-60)/100， 为 1.7 平方米 )， 第 1 天、 第 8 天应用。顺铂 75mg/m2( 每 平方米人体表面积应用 75 毫克 )， 第一天应用。
免疫治疗组的化疗方案和剂量同化疗组患者， 不同的是在每次化疗前， 抽取患者 自身的外周血， 培养 DC 细胞 /CIK 细胞， 化疗后一周以后， 回输给患者， 每月一次， 共四次。 每 月检查这些患者的血常规， 肝肾功能和影像学。
统计分析
CEA 水平用中位数 ± 标准差衡量。结果用配对 T 检验。临床特性和治疗相关的 毒副反应比较用 Fish 检验。无病生存期指从入组接受治疗开始到疾病进展或者死亡的时 间。生存期是指开始治疗的时间到死亡或者最后访视的时间。Kaplan-Meier 生存时间及 log-rank 检验来比较两组间的生存差异。P ＜ 0.05 表示差异显著。
实施例 2、 DC 的制备以及诱导 CIK 产生
DC 的制备
免疫治疗组中， 抽取患者自身外周血 100 毫升， 应用 Ficoll-Paque 密度分离法， 分 离单个核细胞层， 悬浮于含 1％ (v/v) 自体血清的 X-VIVO 培养液中， 放置于培养皿中， 调整 6 细胞浓度 5×10 个细胞 /ml， 培养于 37℃培养箱中。4 小时后， 黏附细胞 ( 贴壁细胞 ) 留用 为 DC 培养， 非黏附细胞留作 CIK 细胞的培养。黏附细胞用 X-VIVO 悬浮 ( 细胞浓度 2×106/ ml)， 加 入 1000 单 位 (U)/mL 的 GM-CSF( 购 自 Leukomax ； Novartis International AG， Basel， Switzerland)， 500 单位 /mL 的重组 IL-4( 购自 Strathmann Biotec AG， Hannover， Germany)) 培养 DC。
肽致敏 ： CEA 肽， 序列为 YLSGANLNL(CEA605-613)(SEQ ID NO ： 1)， 经内毒素检测无 毒。在 DC 培养的第 8 天， 调整 CEA 肽的浓度为 10ug/ml， 和 DC 一起共孵育 12 个小时。收获 6 DC， 重悬于生理盐水， 调整浓度为 1×10 个细胞 /ml， 经静脉注射。
诱导 CIK 产生
前述获得的非黏附细胞生长在含 1000 单位 /ml 人重组 IFN-γ( 购自 Boehringer， Mannheim， Germany) 的 X-VIVO 介质 ( 购自 Biowhittaker， Lonza， United states) 中。24 小时后， 50ng/mL 的抗 CD3 抗体 ( 购自 Orthoclone OKT 3 ； Cilag GmbH， Sulzbach， Germany) 6 加入， 细胞在培养箱中， 每 3 天换液， 按照 3×l0 个细胞 /ml 补充 1000U/ml 白介素 -2。第 9 天， CIK 细胞悬浮在生理盐水中， 用于回输 ( 静脉注射 ) 患者。
经测定， 上述制备的 CIK 细胞 CD3+CD56+ 双阳性的 CIK 细胞数大于 50％。
实施例 3、 给药特征
免疫化学组后患者特征见表 2。平均注射 DC 的量是 8.1±2.5(106)， CIK 的平均量 8 是 13.3±3.5(10 )( 单次注射量 )。血清 CEA 水平高于基线 25％时为增高。较基线值下降 25％时定义为下降。 否则， 视为稳定。 在免疫化疗组， CEA 水平在 3 个患者中下降 (21.4％ )。 9 个患者中稳定 (64.2％ )。1-3 级的皮肤毒性在 9 个患者中 (64.2％ )， 1-4 级非感染性发 热发生于 10 个患者 (71.4％ )。
表 2、 免疫化学组患者特征
其 中， 皮 肤 毒 性 的 分 级 按 照 National Cancer Institute common toxicity criteria v.2.0 grading system 标准。
非 感 染 性 发 热 的 分 级 按 照 National Cancer Institute common toxicity criteria v.2.0 grading system 标准。
免疫化疗组的副反应是轻微的， 可耐受的。皮疹， 粉刺， 红斑等副反应常出现在免 疫化疗组 (64.2％ )， 而化疗组少见 (7.1％ )(p ＝ 0.004)。非感染性发热经常出现在免疫 化疗组 (71.4％ )， 而化疗组少见 (21.4％ )(p ＝ 0.02)。3 级程度的乏力少见于免疫化疗组 (7.1％ )， 而多见于化疗组 (57.1％ )(p ＝ 0.01)。 实施例 4、 无病生存期和总生存期
所有的 28 个患者， 在随访时间内死亡 25 人。3 位存活。在免疫化疗组， 中位无病 生存期为 6.9 个月 (95％ CI ： 5.0-8.8)(p ＝ 0.03)， 化疗组为 5.2 个月 (95％ CI ： 3.3-6.0)， 如图 1。1， 2， 5 年生存率在免疫治疗组分别为 64.3％， 49.8％， 21％， 如图 2。因此， 树突状 细胞联合细胞因子诱导杀伤细胞能缓解化疗的副反应， 延长患者生存期。
讨论
很多证据显示免疫治疗带来提高生存的新希望。很多证据显示 CIK 细胞发挥作 用， 在于其释放 IFN-γ 和 TNF-α。
树突状细胞， 作为功能最强大的抗原递呈细胞， 在抗肿瘤的作用中受到普遍关注。 在以 DC 为基础的免疫治疗中， 何种抗原致敏 DC 尤为关键。
本发明人比较了 DC/CIK 联合化疗与传统的化疗比较疗效的 I/II 临床研究。本发 明评价了免疫化疗的安全性和有效性。本发明人的结论是免疫化疗的副反应小， 在传统化 疗中常见的副反应在免疫化疗中比较少见。皮疹和发热在免疫化疗中比较常见， 但都是中 等程度并且可以处理的。
为了进一步评价免疫治疗的有效性， 本发明人评价了无病生存期和总生存期。结 果发现免疫化疗可以将化疗组的无病生存期从 5.2 个月提高到 6.9 个月。 这证明了 DC/CIK 免疫治疗可以协同化疗延长肺癌患者的生命。有一些机制可 以解释这种现象 ： 化疗之后 细胞的死亡全面触发了免疫反应 ； 另外， 化疗去除了调节性的 T 细胞， 潜在的增强了免疫反 应。最后， 化疗改变了细胞因子网络， 从而使得 DC/CIK 更好的发挥抗肿瘤效应。在本发明 人的研究中， 副反应的降低可能提高机体抗肿瘤效应。
本发明人的结论再次证实 DC/CIK 免疫治疗配合化疗能延长非小细胞肺癌的生活 质量和无病生存期， 也提示了免疫化疗需要和其他诸如化疗配合在一起的综合治疗才能发 挥作用。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考， 就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
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