《用于再生牙齿的组合物.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《用于再生牙齿的组合物.pdf（11页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、10申请公布号CN102335457A43申请公布日20120201CN102335457ACN102335457A21申请号201010238975X22申请日20100728A61L27/24200601A61L27/18200601A61L27/54200601A61K38/18200601A61K38/17200601A61K35/12200601A61K35/32200601A61K6/02200601A61K6/087200601A61P43/0020060171申请人郭山辉地址中国台湾台中市北区文心路四段200号13楼申请人洪满荣72发明人洪满荣74专利代理机构北京汇智英财专利代。
2、理事务所11301代理人陈践实54发明名称用于再生牙齿的组合物57摘要一种与脂肪干细胞并用以再生牙齿的组合物，其包含生长激素及人工及/或天然的聚合物；将该组合物连同脂肪干细胞植入齿槽中，可使牙齿再生。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图4页CN102335466A1/1页21一种与脂肪干细胞并用以再生牙齿的组合物，其特征在于所述组合物包含生长激素及人工及/或天然的聚合物。2如权利要求1的组合物，其特征在于该生长激素选自以下群组成骨蛋白BONEMORPHOGENETICPROTEIN，BMP、齿质基质蛋白DENTINMATRIXPROTEIN。
3、，DMP、生长分化因子GROWTH/DIFFERENTIATIONFACTOR，GDF或前述的组合。3如权利要求2的组合物，其特征在于该生长激素选自以下群组成骨蛋白2、成骨蛋白4、成骨蛋白7、成骨蛋白11、齿质基质蛋白1、生长分化因子11或前述的组合。4如权利要求3的组合物，其特征在于该生长激素为成骨蛋白2。5如权利要求1的组合物，其特征在于该聚合物选自以下群组胶原蛋白、聚麸胺酸POLYGLUTAMICACID，PGA、聚乳酸交酯乙醇酸POLYLACTIDEGLYCOLICACID，PLGA、聚磷酸钙CALCIUMPOLYPHOSPHATE、六氟异丙醇丝HEXAFLUOROISOPROPANO。
4、LSILK，HFIPSILK或前述聚合物的组合。6如权利要求5的组合物，其特征在于该聚合物为胶原蛋白。7如权利要求1至6中任一项的组合物，其特征在于该生长激素与该聚合物的重量比例约为11,200至1120,000。8如权利要求7的组合物，其特征在于该生长激素与该聚合物的重量比例约为16,000至160,000。9如权利要求8的组合物，其特征在于该生长激素与该聚合物的重量比例约为19,000至112,000。10一种用于再生牙齿的组合物，其特征在于所述组合物包含脂肪干细胞、生长激素及人工及/或天然的聚合物。11如权利要求10的组合物，其特征在于该生长激素选自以下群组成骨蛋白、齿质基质蛋白、生长分。
5、化因子或前述的组合。12如权利要求11的组合物，其特征在于该生长激素选自以下群组成骨蛋白2、成骨蛋白4、成骨蛋白7、成骨蛋白11、齿质基质蛋白1、生长分化因子11或前述的组合。13如权利要求12的组合物，其特征在于该生长激素为成骨蛋白2。14如权利要求10的组合物，其特征在于该聚合物选自以下群组胶原蛋白、聚麸胺酸、聚乳酸交酯乙醇酸、聚磷酸钙、六氟异丙醇丝或前述聚合物的组合。15如权利要求14的组合物，其特征在于该聚合物为胶原蛋白。16如权利要求10至15中任一项的组合物，其特征在于该生长激素与该聚合物的重量比例为约11,200至约1120,000，且脂肪干细胞的含量约为5102至5106个每奈。
6、克生长激素。17如权利要求16的组合物，其特征在于该生长激素与该聚合物的重量比例约为16,000至160,000，且脂肪干细胞的含量约为5103至5105个每奈克生长激素。18如权利要求17的组合物，其特征在于，该生长激素与该聚合物的重量比例为约19,000至约112,000，且脂肪干细胞的含量约为5104至1105个每奈克生长激素。权利要求书CN102335457ACN102335466A1/5页3用于再生牙齿的组合物技术领域0001本发明关于一种用于再生牙齿的组合物，尤其关于一种与脂肪干细胞并用以再生牙齿的组合物。背景技术0002于牙科治疗中，当牙齿因蛀牙、年龄增长、齿列矫正手术等因素而有。
7、缺损或经拔除时，一般会以补牙、植牙或假牙重建等方式进行治疗。不论是补牙、植牙或假牙重建，目前皆是使用人工材质来取代原本的牙齿成分，例如钛金属、瓷、或复合树脂等。然而，人体对于人工材质可能产生排异性，且人工材质易因不耐磨损而需要重复修补，甚至失去整颗牙齿。因此，若可使牙齿自然地再生，则可避免因使用人工材质治疗或重建牙齿而产生的各种问题。0003再生医学的技术包含使干细胞分化为特定的细胞种类，并结合组织工程，使其生长为新的组织或器官以取代损坏的组织或器官，从而发挥正常的生理功能。就牙齿再生医学而言，目前业已使用牙髓干细胞、牙周韧带干细胞及骨髓间质干细胞作为干细胞的来源以进行研究，其中，尽管牙髓干细。
8、胞及牙周韧带干细胞可作为牙齿再生的最直接的细胞来源，但是，因其于人体内的存在量稀少，故难以取得足够的量而进行治疗；而骨髓间质干细胞除具有可获得量稀少的缺点外，又易因年龄增长而老化，且须以抽取骨髓的方式获得，故于实际应用上多有局限。另一方面，除了干细胞来源外，如何选用合适的生长激素和细胞支架SCAFFOLD成分，以使干细胞分化、并进一步生长为结构健全且功能完整的牙齿，亦为牙齿再生医学的关键所在。因此，为了使再生医学可实际应用于临床的牙科治疗上，需要一种稳定、丰富且易于取得的干细胞来源。0004本发明即针对上述需求所为的研究，本案发明人发现使用脂肪干细胞ADIPOSESTEMCELL与生长激素及生。
9、医材料的组合物，可成功使牙齿再生，且再生的牙齿具有健全的结构与功能。发明内容0005本发明的一目的在于提供一种与脂肪干细胞并用以再生牙齿的组合物，其包含生长激素及人工及/或天然的聚合物。0006本发明的另一目的在于提供一种用于再生牙齿的组合物，其包含脂肪干细胞、生长激素及人工及/或天然的聚合物。0007本发明的详细技术及较佳实施方式，将描述于以下内容中，以供本发明所属技术领域具通常知识者据以明了本发明的特征。附图说明0008图1为本发明的用于再生牙齿的组合物的制备及移植的流程图；0009图2为兔子牙髓干细胞与兔子脂肪干细胞的光学显微镜图；0010图3A为兔子上门牙及下门牙的齿槽的X光摄影图；说。
10、明书CN102335457ACN102335466A2/5页40011图3B为兔子上门牙及下门牙的齿槽的解剖图；0012图4A至图4C为兔子新生牙齿组织与正常牙齿组织的HE组织染色图；以及0013图5A及图5B为兔子新生牙齿组织与正常牙齿组织的绿色免疫荧光组织染色图。具体实施方式0014如上述，目前补牙、植牙或假牙重建皆是使用人工材质作为自然牙齿成分的替代品，但是，其具有产生排异性或因磨损而须重复修补的缺点，而牙齿再生医学可解决此问题。然而，目前研究的牙髓干细胞、牙周韧带干细胞或骨髓间质干细胞并无法作为稳定且丰富的干细胞来源。0015脂肪干细胞属于成体干细胞ADULTSTEMCELL，具有不易。
11、老化的特性，且可利用一般抽脂手术而大量取得，故可作为稳定且丰富的干细胞来源。此外，脂肪干细胞的免疫排异性低，故可进行同种动物间的脂肪干细胞的异体移植，而不限于自体移植，因此，其具有高度的运用弹性。有鉴于此，本发明将脂肪干细胞运用于牙齿再生医学，而提供一种与脂肪干细胞并用以再生牙齿的组合物，且该组合物包含生长激素及人工及/或天然的聚合物。0016于本发明的组合物中，可使用选自以下群组的生长激素成骨蛋白BONEMORPHOGENETICPROTEIN，BMP、齿质基质蛋白DENTINMATRIXPROTEIN，DMP、生长分化因子GROWTH/DIFFERENTIATIONFACTOR，GDF或前。
12、述的组合。该生长激素作为一种信息分子，促使脂肪干细胞进行分化，并进而形成牙齿组织。0017成骨蛋白亦称为骨形态发生蛋白，目前已知有二十种不同的成骨蛋白，其为一种转化生长因子TRANSFORMINGGROWTHFACTOR，可诱导未分化的间质干细胞MESENCHYMALSTEMCELL分化成软骨细胞或成骨细胞并促使其增生，故成骨蛋白参与软骨及成骨的生长发育及修复重建过程。成骨蛋白除可促进软骨和成骨的形成，亦可调节组织或器官的胚胎细胞的发育与形态发生。齿质基质蛋白或称为牙本质基质蛋白，是一种参与骨骼及牙齿钙化过程的非胶原性蛋白质，其由骨细胞或齿质母细胞分泌至细胞外，以促进骨生成或齿质形成。生长分化。
13、因子则是细胞发育的重要生物信息分子，可促进软骨细胞增生及牙周组织形成。0018较佳地，本发明组合物可包含选自以下群组的生长激素成骨蛋白2BMP2、成骨蛋白4BMP4、成骨蛋白7BMP7、成骨蛋白11BMP11、齿质基质蛋白1DMP1、生长分化因子11GDF11及前述生长激素的组合。最佳地，该组合物包含成骨蛋白2。成骨蛋白2是一种分子量为约30千道尔顿KDA的双硫键同型二聚体蛋白质，其可自动物体内纯化而取得，或利用人工基因选殖的方式制得。然而，由于成骨蛋白2于动物体内的含量甚少，且不同个体来源的成骨蛋白2对于诱导干细胞分化的活性差异度甚大，故通常是使用人工基因选殖的成骨蛋白2。于本发明的一实施方。
14、式中，是使用基因重组的人类成骨蛋白2RECOMBINANTHUMANBMP2。0019于本发明的组合物中，包含一聚合物，以作为脂肪干细胞分化、并进而形成牙齿组织时的支架SCAFFOLD或骨干，使细胞形成并维持三维空间的结构。可于本发明组合物使用选自以下群组的聚合物胶原蛋白、聚麸胺酸POLYGLUTAMICACID，PGA、聚乳酸交酯乙醇酸POLYLACTIDEGLYCOLICACID，PLGA、聚磷酸钙CALCIUMPOLYPHOSPHATE、六氟异丙醇丝HEXAFLUOROISOPROPANOLSILK，HFIPSILK或前述的组合。较佳地，于本发明说明书CN102335457ACN1023。
15、35466A3/5页5组合物中使用胶原蛋白。0020胶原蛋白亦称为骨胶原，目前已知有二十九种不同的胶原蛋白，分别存在于动物体内各组织中。胶原蛋白具有特殊的三股螺旋缠绕结构，于三条相互独立的胶原蛋白胜肽链之间借助甘氨酸形成的氢键维持缠绕结构，此三股螺旋结构赋予胶原蛋白优异的机械强度与弹性。此外，胶原蛋白可经由交联作用而形成更稳固的结构。由于胶原蛋白具有优异的韧性与弹性，且具有高度生物相容性，故常运用于组织工程中。因此，于本发明中，较佳使用胶原蛋白作为细胞支架；而在所有胶原蛋白中，第一型TYPEI胶原蛋白与第二型TYPEII胶原蛋白牙齿与软骨组织中的主要成分。因此，于本发明中，更佳使用第一型或第二。
16、型胶原蛋白。0021本发明的组合物可呈一混合物的形式，或采各成分相互独立的形式。原则上，只要组合物中的生长激素与人工或天然聚合物不会产生不利地相互影响，则可呈混合物的形式如干粉混合物。举例言之，当组合物中包含成骨蛋白与胶原蛋白时，由于二者并不会相互影响，故该组合物可为一混合物，即，将成骨蛋白与胶原蛋白混合在一起。惟，鉴于生长激素与人工或天然聚合物可能需要不同的储存环境例如不同的PH值、防腐剂或含水量等，故本发明组合物亦可采用各成分相互独立的形式，以维持各成分的最佳活性或状态。0022另一方面，视选用的生长激素与人工或天然聚合物而定，本发明组合物可呈溶液、粉末、悬浮液或其他形式。由于生长激素主要。
17、为蛋白质，故为防止生长激素变性DENATURE，一般须将其置于含有盐分的缓冲溶液中，或者，可以低温冷冻干燥的方式将生长激素制成粉末，并置于4以下的低温储存。此外，若选用的聚合物为蛋白质例如胶原蛋白或聚麸胺酸，则其亦可依上述方式而呈溶液或粉末的形式。0023因此，本发明组合物中的各成分可相互混合或分离，且可同时为粉末、溶液、悬浮液或其他形式，或独立地各别为粉末、溶液、悬浮液或其他形式，或者，采一成分溶于另一成分的方式等，而无特别限制。另外，可于本发明组合物中添加防腐剂或干燥剂，以延长其保存期限。0024本发明所属技术领域具通常知识者，基于本文的教导，可于本发明组合物中，视选用的生长激素或聚合物的。
18、种类而调整其用量。较佳地，本发明组合物中的生长激素与聚合物的重量比例约为11,200至1120,000，更佳约为16,000至160,000，最佳约为19,000至112,000。0025可将本发明组合物连同脂肪干细胞移植入一牙齿缺损或经拔除的齿槽中，以进行牙齿再生。于此，可视需要调整脂肪干细胞的用量，举例言之，当将该组合物用于部分牙齿的修补或再生时，脂肪干细胞的用量可较低；而将该组合物用于全牙再生时，则可增加脂肪干细胞的用量。脂肪干细胞的用量一般为约5102至约5106个每奈克生长激素，较佳为约5103至约5105个，更佳为约5104至约1105个。此外，如上述，脂肪干细胞的免疫排异性低，故。
19、可进行同种动物间的脂肪干细胞的异体移植，因此，于本发明中，除可使用来自待移植的动物体的脂肪干细胞之外，亦可使用来自同种的其他动物体的脂肪干细胞。0026本发明亦提供另一种用于再生牙齿的组合物，其包含脂肪干细胞、生长激素及人工及/或天然的聚合物。其中，该生长激素及人工及/或天然的聚合物的种类、用量与形式，以及脂肪干细胞的来源与含量，皆如上文中所定义者。此外，鉴于脂肪干细胞的高敏感性，其须储存于严苛条件的环境中，才能维持生命力并防止污染，且为避免生长激素或聚合说明书CN102335457ACN102335466A4/5页6物影响脂肪干细胞，因此，于此组合物中，脂肪干细胞一般采单独存在的形式，而于移。
20、植前才与生长激素及聚合物混合。0027由于牙齿再生的关键为脂肪干细胞须成功地分化，并进而形成牙齿组织，故维持脂肪干细胞的生命力，以及保持生长激素与聚合物的活性或新鲜度，以于最佳条件下使牙齿再生为首要标准。为此，可于即将进行移植手术之前，才依适当比例混合脂肪干细胞、生长激素、及人工及/或天然聚合物以提供本发明再生牙齿的组合物，以于组合物中各成分为高活性且新鲜的状态下，进行牙齿再生。0028于本发明的一实施方式中，于移植手术即将进行前，才配制一包含脂肪干细胞、成骨蛋白2、及胶原蛋白的组合物，且成骨蛋白2与胶原蛋白的重量比例为约111,250，且脂肪干细胞的用量约为5104个每奈克生长激素，并将其移。
21、植入动物的齿槽内，以进行牙齿再生。0029鉴于本发明组合物可使牙齿再生，故其可运用于牙齿的修补、替换、及/或重建。0030兹以下列具体实施方式以进一步例示说明本发明。其中该些实施方式仅提供作为说明，而非用以限制本发明的范畴。0031制备例制备用于再生牙齿的组合物0032参考图1，依以下步骤及比例制备本发明的用于再生牙齿的组合物，并进行移植。0033A、配置135毫升的溶液A置于冰上，包含003457DMEMDULBECCOSMODIEDEAGLES培养基05毫升003542羟乙基1哌嗪乙磺酸HEPES，01摩尔浓度05毫升0036NAHCO325重量025毫升0037CACL2017摩尔浓度5。
22、0微升0038NAOH1当量浓度50微升0039B、配置365毫升的溶液B，包含0040DMEM含233重量胎牛血清215毫升0041第一型胶原蛋白375毫克/毫升15毫升0042C、培养兔子脂肪干细胞RABBITADIPOSETISSUEDERIVEDSTEMCELL，RADSCS或作为正对照组的兔子牙髓干细胞RABBITDENTALPULPSTEMCELLS，RDPSCS，如图2所示，其会呈现典型的间质干细胞的细胞形态。将培养的兔子脂肪干细胞或兔子牙髓干细胞以胰蛋白酶作用3分钟后，再将细胞悬浮液以1000转/分钟的转速离心5分钟，丢弃上清液，收集定量5106个细胞并置于365微升的溶液B中。
23、，以制成一细胞悬浮液。0043D、于步骤C制得的细胞悬浮液中加入100奈克/毫升的成骨蛋白2RDSYSTEMSCATALOGNUMBER355BEC。0044E、在冰上将135微升的溶液A及溶液B包含成骨蛋白2与脂肪干细胞或牙髓干细胞混合均匀后，立即加入至一48孔细胞培养盘中。0045F、将该细胞培养盘置于一37、含有5体积的CO2的细胞培养箱中作用2小时，待胶原蛋白聚合凝固成凝胶后，即可进行移植。0046实施例0047A移植用于再生牙齿的组合物0048首先，将纽西兰大白兔购自台湾，林国钧养兔厂，彰化县北斗镇四维路115号说明书CN102335457ACN102335466A5/5页7麻醉后，。
24、分别拔除其一颗上门牙及一颗下门牙，并等待接受移植。将实施例1中制得的组合物凝胶包含成骨蛋白2与脂肪干细胞或牙髓干细胞直接移植并置入于兔子经拔除下门牙的齿槽中，并以缝线缝合牙龈。另外，于经拔除上门牙的齿槽中植入含有成骨蛋白2、但不含任何干细胞的胶原蛋白凝胶，以作为对照组，并同样以缝线缝合牙龈，即完成移植步骤。0049BX光摄影及解剖分析0050于完成移植手术15周后，以X光摄影观察兔子经拔除上门牙及下门牙的齿槽，结果如图3A所示，可以观察到下门牙齿槽内的经移植处有牙齿新生，然而，于作为对照组的上门牙齿槽内并无牙齿新生图3A，箭头处。另外，以解剖方式进行观察，结果如图3B所示，显示经过包含脂肪干细。
25、胞或牙髓干细胞的组合物移植的齿槽内皆有牙齿新生，但于对照组的齿槽中则无牙齿新生图3B，白色箭头处。此试验结果说明，本发明的组合物可成功使牙齿再生。0051CHE组织染色分析0052以HE染色试剂包含苏木素MAYERSHEMALUMSOLUTION，购自MERCKTM及伊红EOSINYSOLUTIONALCOHOLIC，购自SIGMAALDRICHTM染色兔子的再生牙齿组织与正常牙齿组织，并进行分析比对，结果显示于图4A至图4C。0053如图4A所示，经过包含牙髓干细胞或脂肪干细胞的组合物移植的齿槽中皆能再生长出类似于正常牙齿的组织结构。此外，如图4B所示，再生新牙的细部结构与正常牙齿相同，都具。
26、有齿质DDENTIN、齿垩质CCEMENTUM、牙周韧带PDLPERIODONTALLIGAMENT，且于高倍率1000显微镜的观察下，可看见由牙周韧带延伸进入齿垩质的SHARPEY氏纤维图4B，白色箭头处。另外，如图4C所示，再生的牙齿组织皆具有牙髓的结构，代表再生牙齿具有自我更新的能力。0054D绿色免疫荧光染色分析0055以绿色免疫荧光染色试剂包含温韦伯氏因子VONWILLEBRANDFACTOR或BETA3微管素TUBULIN，ABCAMTM染色兔子的再生牙齿组织与正常牙齿组织，并进行分析比对，结果显示于图5A及图5B。0056如图5A所示，经过包含牙髓干细胞或脂肪干细胞的组合物移植所。
27、新生长出来的牙髓PULP及牙周韧带PDL中，皆有新生血管形成。另外，如图5B所示，兔子再生的牙髓及牙周韧带中皆有神经纤维支配图5B，白色箭头处。0057上述B至C的分析结果显示，本发明组合物可成功地使牙齿再生，且再生的新牙具有与正常牙齿相同的完整结构，故可进行正常的咀嚼功能。0058上述实施例仅用以例示说明本发明的原理及功效，而非用于限制本发明。任何熟于此项技艺的人士均可在不违背本发明的技术原理及精神的情况下，对上述实施例进行修改及变化。因此，本发明的权利保护范围应如权利要求书所限定的范围为准。说明书CN102335457ACN102335466A1/4页8图1图2说明书附图CN102335457ACN102335466A2/4页9图3A图3B说明书附图CN102335457ACN102335466A3/4页10图4A图4B说明书附图CN102335457ACN102335466A4/4页11图4C图5A图5B说明书附图CN102335457A。