预防和治疗神经退行性疾病的组合物和方法.pdf

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摘要
申请专利号:

CN201080011343.8

申请日:

2010.03.09

公开号:

CN102348720A

公开日:

2012.02.08

当前法律状态:

撤回

有效性:

无权

法律详情:

发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):C07K 14/47申请公布日:20120208|||实质审查的生效IPC(主分类):C07K 14/47申请日:20100309|||公开

IPC分类号:

C07K14/47; A61K38/17; G01N33/68

主分类号:

C07K14/47

申请人:

雷蒙特亚特特拉维夫大学有限公司

发明人:

罗尼特·沙尔蒂尔-卡里奥; 埃胡德·加齐特

地址:

以色列特拉维夫

优先权:

2009.03.09 US 61/202,523

专利代理机构:

北京康信知识产权代理有限责任公司 11240

代理人:

李丙林;张英

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内容摘要

本发明提供了一种长度小于20个氨基酸的分离肽。该肽包含氨基酸序列GVLYVGSKTREGV(SEQ ID NO:12)、AAATGLVKREE(SEQ ID NO:13)或GVVAAAEKTKQG(SEQ ID NO:14)、其模拟物和/或片段,该肽能够抑制α-突触核蛋白聚集。还提供了包括上述物质的药物组合物及其用途。

权利要求书

1: 一种长度小于 20 个氨基酸的分离肽, 所述肽包含氨基酸序列 GVLYVGSKTREGV(SEQ ID NO : 12)、 AAATGLVKREE(SEQ ID NO : 13) 或 GVVAAAEKTKQG(SEQ ID NO : 14)、 它们的模拟物 和 / 或片段, 所述肽能够抑制 α- 突触核蛋白聚集。
2: 根据权利要求 1 所述的肽, 包含至少一个芳香族氨基酸。
3: 根据权利要求 1 所述的肽, 包含至少一个碱性氨基酸。
4: 根据权利要求 1 所述的肽, 包含至少一个 β- 断裂子氨基酸。
5: 根据权利要求 4 所述的肽, 其中, 所述 β- 断裂子氨基酸是合成氨基酸。
6: 根据权利要求 4 所述的肽, 其中, 所述 β- 断裂子氨基酸是天然存在的。
7: 根据权利要求 1 所述的肽, 其中, 所述氨基酸序列包含至少一个 D- 氨基酸残基。
8: 根据权利要求 1 所述的肽, 其具有末端帽修饰。
9: 根据权利要求 1 所述的肽, 其包含 KTR 或其模拟物。
10: 根据权利要求 1 所述的肽, 其包含 KTRE 或其模拟物。
11: 根据权利要求 1 所述的肽, 其包含 KTREG 或其模拟物。
12: 根据权利要求 9 所述的肽, 选自由 SEQ ID NO : 1、 SEQ ID NO : 2、 SEQ ID NO : 3、 SEQ ID NO : 4、 SEQ ID NO : 8、 SEQ ID NO : 9、 SEQ ID NO : 10、 SEQ ID NO : 12 和 SEQ ID NO : 13 组 成的组。
13: 根据权利要求 1 所述的肽, 其选自由 SEQ ID NO : 5 和 SEQ ID NO : 6 组成的组。
14: 根据权利要求 2 所述的肽, 其选自由 SEQ ID NO : 1、 SEQ ID NO : 2、 SEQ ID NO : 3和 SEQ ID NO : 4 组成的组。
15: 一种药物组合物, 包含作为活性成分的权利要求 1-14 中任一项所述的肽以及药学 上可接受的载体。
16: 一种抑制 α- 突触核蛋白聚集的方法, 所述方法包括使 α- 突触核蛋白与权利要求 1-14 中任一项所述的肽接触, 从而抑制 α- 突触核蛋白聚集。
17: 一种治疗或预防与 α- 突触核蛋白聚集有关的疾病的方法, 所述方法包括向对其 有需要的对象给予治疗有效量的权利要求 1-14 中任一项所述的肽, 从而治疗与 α- 突触核 蛋白聚集有关的疾病。
18: 根据权利要求 17 所述的方法, 其中, 所述疾病选自由帕金森氏病 (PD)、 阿尔茨海默 氏病 (AD)、 弥漫性路易体病、 混合性 AD-PD、 多系统萎缩和哈 - 斯二氏病组成的组。
19: 一种检测 α- 突触核蛋白单体的方法, 所述方法包括 : (a) 在允许所述单体和所述肽之间形成复合物的条件下, 使所选的怀疑包含所述 α- 突触核蛋白单体的生物样品与权利要求 1 所述的肽接触 ; 和 (b) 检测所述复合物的存在或水平, 从而检测 α- 突触核蛋白单体。

说明书


预防和治疗神经退行性疾病的组合物和方法

    技术领域和背景技术
     许多疾病是由蛋白和多肽结构的遗传性或获得性修饰引起的。当成分蛋白经历 大小变化或形状变动并伴随所引起的自缔合及组织沉积例如淀粉样纤维时, 就会发生构象 病。
     在神经退行性疾病中, 蛋白沉积在一大类病因不同的疾病中的作用越来越明显, 包括阿尔茨海默氏病、 亨廷顿舞蹈症、 帕金森氏病、 克 - 雅二氏病、 朊病毒病和二型糖尿病。 在每一种不同的疾病中, 不同的内源性蛋白自组装成高度有序的纤维状结构。虽然在与这 些疾病中的每一种相关的蛋白之间无特定的序列同源性, 但是认为它们都涉及蛋白质中的 重要构象变化, 通常产生具有聚集成水不溶性纤维聚合物的强烈倾向的 β- 片层结构。
     帕金森氏病 (PD) 是继阿尔茨海默氏病 (AD) 后的第二最常见的神经退行性疾病, 其是一种无法治愈的破坏性的神经系统疾病, 侵袭 1-2%的老年人口。 神经病理学标志的特 征为在存活神经元中称为路易体 (LB) 和营养缺陷型路易神经炎 (LN) 的嗜酸性包涵体、 胞 浆内包涵体、 蛋白质包涵体的存在下, 黑质致密部 (substantia nigra pars compacta) 中 含有多巴胺能神经元的神经黑素的进行性和严重损失。PD 的临床特征为运动障碍, 其涉及 休息性震颤、 运动迟缓、 姿势不稳、 以及伴有非运动性症状如自主的、 认知的和精神病学问 题的强直。这些病理特征的原因尚未完全弄清, 但认为环境因素以及遗传原因或两者的结 合会导致上述临床综合征。 目前已知小于 10%的 PD 病例具有严格的家族性病因, 而多数病 例是散发性的。 在与家族性 PD 有关的突变中, 已被普遍表征的是 α- 核突触蛋白 (α-syn) 基因中的被称为 A53T、 A30P 和 E46K 的三个错义突变 [Lotharius, J., 和 Brundin, P.(2002) Nat Rev Neurosci 3(12), 932-942]。
     α-syn 蛋白由 140 个氨基酸残基组成。其是一种小而高电荷的天然非折叠蛋白。 最初确定其为 LB 和 LN 的主要组分。α-syn 能够分为三个主要区域 : 包含序列 KTKEGV 的 若干不完整重复的氨基末端区域、 称为非淀粉样组分 (NAC) 区域的疏水中心结构域以及特 征为高度带负电荷氨基酸的羧基末端。其在中枢神经系统 (CNS) 神经元中显著表达, 其位 于突触前末梢, 与突触囊泡接近并可通过形成两亲性 α- 螺旋而与类脂膜联系。
     α-syn 与 β- 突触核蛋白 (β-syn) 和 γ- 突触核蛋白 (γ-syn) 是突触核蛋白的 家族成员。β-syn 和 γ-syn 最初在脑组织中发现, 其主要位于突触前神经末梢, 而 α-syn 最初在外周神经系统和视网膜中发现, 然而也发现其在某些肿瘤组织中高度表达, 包括乳 腺、 卵巢和膀胱组织。
     三种突触核蛋白的序列高度保守, 尤其是在它们的 N 末端结构域中。当比较 α-syn 和 β-syn 的序列时, 在疏水中心结构域具有主要差异 ; β-syn 为 134 个氨基酸的蛋 白, 其缺少 α-syn 的 NAC 区域, 因此在不同的应激条件下 ( 如自由基或浓度升高 ) 不会聚 集形成淀粉样纤维。
     在多种神经退行性疾病的病例中, 个体突触核蛋白之间定量比例的改变发生以达 到 α- 突触核蛋白的相对比例增加的程度。可在体外检测到 β- 突触核蛋白能够以剂量依 赖的方式抑制 α- 突触核蛋白的聚集 (Hashimoto 等, Neuron 32(2) : 213-23

    [2001] )。由
     α- 突触核蛋白过表达而引起正常细胞增殖和分化被破坏的细胞培养物的试验也显示了 β- 突触核蛋白在治疗意义上具有有利作用, 其使这些培养物中神经突的粘附、 存活和生长 进一步正常化。 α- 突触核蛋白转基因的小鼠显示该白蛋白的产生升高, 从而呈现出 α- 突 触核蛋白和 β- 突触核蛋白之间的数量比例被破坏。在衰老的过程中, 它们形成与路易体 相似的神经元内包涵体并且也表现出进行性运动障碍, 与帕金森氏病中的功能破坏相似。 如果将这些具有 α- 突触核蛋白的动物与具有 β- 突触核蛋白的转基因小鼠 ( 显示该白蛋 白的产生升高 ) 杂交, 显著升高的突触核蛋白总表达水平能够恢复稳态。因此, 包涵体数量 显著减少, 并且可完全防止特征神经元功能丧失。
     认为 α- 突触核蛋白在阿尔茨海默氏病的病理学中发挥了极其重要的作用。这由 这样的事实表明, 即该蛋白的一部分, NACP( 非淀粉样组分蛋白 ) 结构域, 显示为部分老年 斑 (Yoshimoto 等, Proc.Natl.Acad Sci 92, 9141-5

    [1995] 和 WO-9506407), 以及另外的事 实, 即在约 70%患有阿尔茨海默氏病的患者脑内的不同区域显示路易体, 还发现了 α- 突 触核蛋白 (Eizo 等, Neurosci.Lett.290(1), 41-4

    [2000] )。由
     α- 突触核蛋白过表达而引起正常细胞增殖和分化被破坏的细胞培养物的试验也显示了 β- 突触核蛋白在治疗意义上具有有利作用, 其使这些培养物中神经突的粘附、 存活和生长 进一步正常化。 α- 突触核蛋白转基因的小鼠显示该白蛋白的产生升高, 从而呈现出 α- 突 触核蛋白和 β- 突触核蛋白之间的数量比例被破坏。在衰老的过程中, 它们形成与路易体 相似的神经元内包涵体并且也表现出进行性运动障碍, 与帕金森氏病中的功能破坏相似。 如果将这些具有 α- 突触核蛋白的动物与具有 β- 突触核蛋白的转基因小鼠 ( 显示该白蛋 白的产生升高 ) 杂交, 显著升高的突触核蛋白总表达水平能够恢复稳态。因此, 包涵体数量 显著减少, 并且可完全防止特征神经元功能丧失。
     认为 α- 突触核蛋白在阿尔茨海默氏病的病理学中发挥了极其重要的作用。这由 这样的事实表明, 即该蛋白的一部分, NACP( 非淀粉样组分蛋白 ) 结构域, 显示为部分老年 斑 (Yoshimoto 等, Proc.Natl.Acad Sci 92, 9141-5[1995] 和 WO-9506407), 以及另外的事 实, 即在约 70%患有阿尔茨海默氏病的患者脑内的不同区域显示路易体, 还发现了 α- 突 触核蛋白 (Eizo 等, Neurosci.Lett.290(1), 41-4[2000])。在转基因小鼠模型中, β- 淀 粉样蛋白使 α- 突触核蛋白的聚集和神经毒性增加 (Masliah 等, Proc.Natl.Acad.Sci 98(21) : 12245-50[2001])。 已描述了 β- 突触核蛋白以及特别是由其衍生以破坏 α- 突触核蛋白聚集的肽。 参见, 例如, WO/02/04482 所述的八肽和 WO02/04625 中的三种另外的肽。WO002/0020 和 WO01/60794 描述了 β- 突触核蛋白作为完整分子的应用或增加其体内表达以治疗与 α- 突 触核蛋白相关的神经系统疾病的方法。特别是 WO-A-01/60794 还教导了使用相当于 β- 突 触核蛋白的 N 末端氨基酸 1 至 15 的肽, 以防止 α- 突触核蛋白和 β- 淀粉样蛋白聚集。同 样, US2006/0036073 和 US20080200397 教导了衍生自 β- 突触核蛋白的 N 末端氨基酸 1 至 15 的短肽片段, 以防止 α- 突触核蛋白和 β- 淀粉样蛋白的结合。U.S.20010047032 教导 了用于治疗淀粉样变性和 α- 突触核蛋白原纤维病的芳香族化合物。 Windisch 等教导了集 中于蛋白 N 末端氨基酸 1 至 15 的 β-syn 的缺失突变实验。他们创建了包含衍生自 β-syn 的该序列的氨基酸组合物不同变异的肽库, 其明确的目的是为了寻找能够立即用于治疗 性应用的或能够用作发展模拟肽小分子的基础的肽 (Windisch 等, 2004, J Mol Neurosci 24(1), 155-165)。
     发明内容 根据本发明的某些实施方式的一个方面, 提供了长度小于 20 个氨基酸的分离肽, 该肽包含氨基酸序列 GVLYVGSKTREGV(SEQ ID NO : 12)、 AAATGLVKREE(SEQ ID NO : 13) 或 GVVAAAEKTKQG(SEQ ID NO : 14)、 它们的模拟物和 / 或片段, 该肽能够抑制 α- 突触核蛋白聚 集。
     根据本发明的某些实施方式的一个方面, 提供了一种包含作为活性成分的如本发 明所述的肽以及药学上可接受的载体的药物组合物。
     根据本发明的某些实施方式的一个方面, 提供了一种抑制 α- 突触核蛋白聚集的 方法, 该方法包括使 α- 突触核蛋白与如本发明的肽接触, 从而抑制 α- 突触核蛋白聚集。
     根据本发明的某些实施方式的一个方面, 提供了一种治疗或预防与 α- 突触核蛋 白聚集有关的疾病的方法, 该方法包括向对其有需要的对象给予治疗有效量的本发明的
     肽, 从而治疗与 α- 突触核蛋白聚集有关的疾病。
     根据本发明的某些实施方式的一个方面, 提供了一种检测 α- 突触核蛋白单体的 方法, 该方法包括 :
     (a) 在允许单体和所述肽之间形成复合物的条件下, 使所选的怀疑包含 α- 突触 核蛋白单体的生物样品与本发明的肽接触 ; 和
     (b) 检测该复合物的存在或水平, 从而检测 α- 突触核蛋白单体。
     根据本发明的某些实施方式, 该肽包含至少一个芳香族氨基酸。
     根据本发明的某些实施方式, 该肽包含至少一个碱性氨基酸。
     根据本发明的某些实施方式, 该肽包含至少一个 β- 断裂子氨基酸 (β-breaker amino acid)。
     根据本发明的某些实施方式, 该 β- 断裂子氨基酸是合成氨基酸。
     根据本发明的某些实施方式, 该 β- 断裂子氨基酸是天然存在的。
     根据本发明的某些实施方式, 该氨基酸序列包含至少一个 D- 氨基酸残基。
     根据本发明的某些实施方式, 该肽具有末端帽修饰。
     根据本发明的某些实施方式, 该肽包含 KTR 或其模拟物。
     根据本发明的某些实施方式, 该肽包含 KTRE 或其模拟物。
     根据本发明的某些实施方式, 该肽包含 KTREG 或其模拟物。
     根据本发明的某些实施方式, 该肽选自由 SEQ ID NO : 1、 2、 3、 4、 8、 9、 10、 12 和 13 组 成的组。
     根据本发明的某些实施方式, 该肽选自由 SEQ ID NO : 5 和 6 组成的组。
     根据本发明的某些实施方式, 该肽选自由 SEQ ID NO : 1、 2、 3 和 4 组成的组。
     根据本发明的某些实施方式, 所述疾病选自由帕金森氏病 (PD)、 阿尔茨海默氏病 (AD)、 弥漫性路易体病、 混合性 AD-PD、 多系统萎缩和哈 - 斯二氏病组成的组。
     除非另有定义, 本文中使用的所有技术和 / 或科学术语与本发明涉及的本领域普 通技术人员所公知的术语具有相同的含义。 虽然与本文描述相似或等同的方法或材料可用 于实施或测试本发明的实施方式, 但在下文中叙述了示例性方法和 / 或材料。在发生冲突 的情况下, 以专利说明书 ( 包括定义 ) 为准。此外, 材料、 方法和实施例仅仅是描述性的, 并 非意图做必要的限制。 附图说明
     本文中仅以举例的方式参照附图对本发明进行描述。 本文中对附图的详细内容进 行具体参考, 是强调以实施例的方式显示详细内容并且仅意图对本发明的优选实施方式进 行描述性讨论, 并且是为了提供认为最有用和最容易理解的本发明的原理说明和概念层面 而提出的。 在这方面, 与基本理解本发明所必需的细节相比, 未试图更加详细地显示本发明 的结构细节, 结合附图进行的描述使得如何使本发明的几种形式在实施中体现对本领域技 术人员是显而易见的。
     在图中 :
     图 1A- 图 1D 是作为 α-syn 聚集抑制剂的 β 衍生肽的示意图。图 1A.β-syn 抑 制 α-syn 聚集的形成。图 1B. 使用肽阵列分析进行 β-syn 结合序列对 α-syn 的分子定位。图 1C. 潜在的基于肽的 α-syn 聚集抑制剂。图 1D. 肽阵列技术的示意图 (http:// worldwidewebdotjptdotcom/products/peptidearrays/pepspotsdothtm)。
     图 2A- 图 2B 是 β-syn 蛋白内的 α-syn 结合序列的筛选结果照片。图 2A : 在纤 维素膜上合成与 β-syn 的连续重叠序列相对应的十聚体肽, 并与 β-syn 孵化。α-syn 序 列中每个斑点的序列及其位置在斑点下方提及。在前十五个氨基酸中, 有一个氨基酸在该 十聚体肽内移位。余下的有五个氨基酸移位。图 2B. 使用严格条件进行了另一个筛选, 一 个氨基酸沿整条蛋白移位。此处将氨基酸序列提供如下。
     MDVFMKGLSM-SEQ ID NO : 23
     DVFMKGLSMA-SEQ ID NO : 24
     VFMKGLSMAK-SEQ ID NO : 25
     FMKGLSMAKE-SEQ ID NO : 26
     MKGLSMAKEG-SEQ ID NO : 27
     KGLSMAKEGV-SEQ ID NO : 28
     GLSMAKEGVV-SEQ ID NO : 29
     LSMAKEGVVA-SEQ ID NO : 30
     SMAKEGVVAA-SEQ MAKEGVVAAA-SEQ AKEGVVAAAE-SEQ KEGVVAAAEK-SEQ EGVVAAAEKT-SEQ GVVAAAEKTK-SEQ VVAAAEKTKQ-SEQ VAAAEKTKQG-SEQ KTKQGVTEAA-SEQ VTEAAEKTKE-SEQ EKTKEGVLYV-SEQ GVLYVGSKTR-SEQ GSKTREGVVQ-SEQ EGVVQGVASV-SEQ GVASVAEKTK-SEQ LGGAVFSGAG-SEQ FSGAGNIAAA-SEQ NIAAATGLVK-SEQ TGLVKREEFP-SEQ REEFPTDLKP-SEQ TDLKPEEVAQ-SEQ EEVAQEAAEE-SEQ EAAEEPLIEP-SEQ PLIEPLMEPE-SEQID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID IDNO : 31 NO : 32 NO : 33 NO : 34 NO : 35 NO : 8 NO : 9 NO : 10 NO : 36 NO : 37 NO : 38 NO : 1 NO : 40 NO : 41 NO : 7 NO : 11 NO : 42 NO : 43 N: 44 NO : 45 NO : 46 NO : 47 NO : 48 NO : 49LMEPEGESYE-SEQ ID NO : 50
     GESYEDPPQE-SEQ ID NO : 51
     DPPQEEYQEY-SEQ ID NO : 52
     EYQEYEPEA-SEQ ID NO : 53
     VLYVGSKTRE-SEQ ID NO : 2
     LYVGSKTREG-SEQ ID NO : 3
     YVGSKTREGV-SEQ ID NO : 4
     AAATGLVKRE-SEQ ID NO : 5
     AATGLVKREE-SEQ ID NO : 6
     图 3A- 图 3K 为描绘了 α-syn 纤维装配的体外抑制的照片和图表。图 3A. 筛选出 对 α-syn 聚集有抑制作用的 β-syn 肽 ( 摩尔比为 20 ∶ 1)。图 3B. 在肽 36 和 39(SEQ ID NO : 1 和 4) 的存在下, α-syn 聚集的动力学分析。对照为 ( ◆ ), 肽 β-syn 39 与 α-syn 为 ( ▲ ), 肽 β-syn 36 与 α-syn 为 ( ■ )。图 3C. 肽 β-syn 36 对 α-syn 聚集的剂量依 赖性抑制作用。图 3D- 图 3K. 具有若干肽的 α-syn 原纤维 TEM 图像 ; 仅有 α-syn、 β-syn 6 短肽、 36、 37、 38、 39、 77、 78。6 短肽、 37 和 38 条带= 500nM。余下的肽条带= 1μM。 图 4A- 图 4B 为抑制剂存在和不存在时, α-syn 聚集的生化分析结果的照片。图 4A. 随着时间推移的 α-syn 的聚集。37C 下摇动时形成可溶性寡聚体。使用蛋白印迹分析 进行检测。图 4B. 使用 β-syn 肽孵化 24 小时后对寡聚体装配的抑制作用。使用蛋白印迹 分析进行检测。
     图 5A- 图 5B 为描述 β-syn 修饰肽的分析的图表。图 5A. 使用 ThT 荧光试验检测 对 α-syn 纤维装配的抑制作用。 筛选三种对 α-syn 聚集有抑制作用的 β-syn 36 修饰肽。 仅有 α-syn 为黑色, β-syn 36 与 α-syn 为深灰色, 修饰肽和 α-syn 为浅灰和白色, 顺序 从左至右为 β-syn 36D、 逆反肽 (retro-inverso)、 酰胺化和乙酰化的逆反肽。α-syn : 肽 的摩尔比分别为 1 ∶ 20 和 1 ∶ 10。图 5B. 使用荧光各向异性法测定包含色氨酸而非酪氨 酸的 β-syn36 与 α-syn 单体的亲和力。Kd = 1μM。
     图 6A- 图 6C 为 HPLC 谱图, 其描绘了在小鼠脑提取物中肽的稳定性。对 WT ICR 小 白鼠的脑提取物进行提取, 并与肽 β-syn 36 和 β-syn 36 逆反肽孵化两小时, 并在 C18 色 谱柱上载样。图 6A. 小鼠脑提取物的图谱 ( 红色 )。图 6B.β-syn 36 肽 ( 蓝色 ) 和与脑提 取物孵化的 β-syn 36 肽 ( 红色 ) 的图谱。图 6C.β-syn 36 逆反肽 ( 蓝色 ) 和与脑提取 物孵化的 β-syn 36 逆反肽 ( 红色 ) 的图谱。
     图 7A- 图 7F 为随后的 NMR 分析的图表和图谱。结合了 α-syn 后的逆反肽的骨架 原子 Ha( 灰色 ) 和 HN( 黑色 ) 化学位移偏移 ( 图 7A) ; 结合后 ( 绿色 )β-syn 衍生的逆反肽 ( 红色 ) 和 α-syn( 蓝色 ) 的 TOCSY 图谱重叠的 Ha-HN 区域 ( 图 7B), 并且结合后显示偏离 的所有逆反肽峰发生扩张 ( 图 7C- 图 7E)。在 α-syn 36D 和缺少氨基酸 G、 V、 L 的 β-syn 36D 短肽存在和不存在时, α-syn 的 ThT 分析 ( 图 7F)。
     图 8A- 图 8E 为描绘了 β-syn 36 逆反肽进入细胞的内化作用的照片。使用 50μM 和 250μM 结合了 FITC 的 β-syn 36 逆反肽对过表达 WT α-syn 细胞的分化型 SHSY5Y 孵 化 0.5 小时、 2 小时和 4 小时。固定后, 检测细胞中 FITC 结合肽 ( 绿色 ) 的存在。使用 cy5 结合抗体 ( 紫色 ) 检测细胞 α-syn, 并用鬼笔环肽标记膜 ( 红色 )。( 图 8A)37℃下 30 分
     钟后, 没有肽染色 ( 绿色 )。( 图 8B- 图 8C) 孵化 2 小时后, 在细胞内未检测到或仅检测到 少量肽 ( 绿色 )。( 图 8D- 图 8E) 孵化 4 小时后, 在细胞内明确检测到肽。使用 LSM-510 蔡 司共聚焦显微镜使肽的内化可视化。
     图 9 为描绘了果蝇运动攀爬行为的分析结果的条形图。用攀爬试验对四种果蝇进 行分析, 每种包含五支试管, 每支试管十只果蝇。在常规培养基上生长并表达 α-syn A53T 的雌性后代为黑色。在含有 β-syn 逆反肽的培养基上生长并表达 α-syn A53T 的雌性后 代为灰色。在常规培养基上生长的对照雌性后代为条纹线。在含有 β-syn 逆反肽的培养 基上生长的对照雌性后代为白色。结果显示了沿试管攀爬 20 秒以上的果蝇百分比。
     图 10 为 β-syn 36 逆反肽的 NMR 归属图谱 : 在相同条件下 ( 根据该条件进行归 属 ) 采集的 TOCSY( 红色 ) 和 NOESY( 绿色 ) 谱的 HN-Ha 相互作用区域的重叠。 具体实施方式
     本发明的某些实施方式涉及用于治疗和预防神经退行性疾病的组合物及方法。
     在详细解释本发明的至少一个实施方式之前, 应理解本发明并非将其应用限于如 下说明书所陈述的或由实施例举例说明的细节。 本发明可有其他实施方式或以不同方式实 施或进行。 α- 突触核蛋白的细胞内寡聚化与帕金森氏病和其他神经退行性疾病有关, 因此 被认为是疾病的病情改善疗法的重要靶标。
     由于 β- 突触核蛋白已表现出以剂量依赖方式抑制 α- 突触核蛋白的聚集, 本发 明人将整条 β-syn 的序列进行系统性地定位以确定具有介导 β-syn 和 α-syn 的分子识 别事件潜力的所有结构域。使用常见的肽阵列技术并发现了若干相互作用区域 ( 图 2A)。 使用第二张膜以在严格条件下证实这些结果 ( 图 2B), 该严格条件可准确定位出现在两张 膜上的斑点。合成了与相互作用区域相对应的十聚体肽, 并且使用 ThT 和 TEM 试验测试了 其抑制 α-syn 聚集的能力。两种方法均显示相关的结果, 表明该肽对原纤维形成具有抑制 作用 ( 图 3A- 图 3K)。
     本发明人进一步示出了某些肽仅能够抑制一种类型的聚集, 而其他肽能够抑制蛋 白的可溶性和不溶性聚集 ( 图 4)。
     为了将分子识别模块发展成为药物候选物, 设计了最好的肽抑制剂的逆反类似 物。虽然该肽与天然肽相比显示出难以区分的活性, 但显示其在人血清中是稳定的 ( 图 6A- 图 6C) 并且可穿透过表达 α- 突触核蛋白的细胞 ( 图 8A- 图 8E)。 NMR 分析定位了 D- 氨 基酸肽和 α- 突触核蛋白间相互作用的交会处 ( 界面, interface)( 图 7A- 图 7F)。最后, 将该肽给予表达突变型 A53T α- 突触核蛋白的果蝇模型导致所处理的果蝇攀爬表型显著 改善 ( 图 9)。 本发明人提出根据本发明的教导而生成的改造肽能够作为发展新型治疗剂的 先导, 以治疗通常的神经退行性疾病, 特别是帕金森氏病。
     本 发 明 的 实 施 方 式 提 供 长 度 小 于 20 个 氨 基 酸 的 分 离 肽, 该 肽 包 含 β- 突 触 核 蛋 白 的 氨 基 酸 序 列 GVASVAEKTK(SEQ ID NO : 7)、 GVLYVGSKTREGV(SEQ ID NO : 12)、 AAATGLVKREE(SEQ ID NO : 13) 或 GVVAAAEKTKQG(SEQ ID NO : 14)、 它们的模拟物和 / 或片段, 该肽能够抑制 α- 突触核蛋白聚集。
     如本文中所使用的, “β- 突触核蛋白” 是指 SNCB 基因的蛋白产物, 该 SNCB 基因的
     GenBank 登陆号为 NP_001001502.1(SEQ ID NO : 15)、 NP_003076.1(SEQ ID NO : 16)。
     短语 “能够抑制 α- 突触核蛋白聚集” 是指使 α- 突触核蛋白聚集 ( 例如, 寡聚化 和 / 或纤维形成 ) 降低至少 10%, 更优选至少 20%, 更优选至少 30%, 更优选至少 40%, 更 优选至少 50%, 更优选至少 60%, 更优选至少 70%, 更优选至少 80%, 更优选至少 90%, 更 优选至少 100%的能力。 根据一个实施方式, 本发明这方面的肽能够抑制 α- 突触核蛋白聚 集。
     如本文中所使用的, 术语 “原纤维” 是指细线样的丝状结构, 在电子显微镜下通常 可见其由高度有序的聚集体构成。
     在实施例 3( 通过透射电子显微镜 (TEM) 分析 )、 实施例 4( 通过蛋白印迹分析 ) 和 实施例 6 中 (ThT 结合试验 ) 描述了监测本发明所述的肽下调 α- 突触核蛋白聚集的方法。 其他方法在美国专利第 6,184,351 号以及美国专利申请第 2002151464 号和第 20030027210 号中提供, 将其全部内容以引用方式并入本文。
     术语 “分离的” 是指从生理环境或分离或基本上没有其他生物材料。
     本文中所使用的术语 “肽”包 括 天 然 肽 ( 降 解 产 物、 以合成方法合成的肽或 重 组 肽 ) 和 模 拟 肽 ( 通 常 为 以 合 成 方 法 合 成 的 肽 ), 以 及 类 肽 (peptoid) 和 半 类 肽 (semipeptoid), 其为肽类似物, 可具有例如使肽在体内更稳定的修饰。这类修饰包括但 不限于 N 末端修饰, C 末端修饰, 肽键修饰, 包括但不限于 CH2-NH、 CH2-S、 CH2-S = O、 O= C-NH、 CH2-O、 CH2-CH2、 S = C-NH、 CH = CH 或 CF = CH, 骨架修饰, 和残基修饰。 制备模拟肽化 合物的方法是本领域公知的, 并且在例如 Quantitative Drug Design, C.A.Ramsden Gd., Chapter 17.2, F.Choplin Pergamon Press(1992) 中具体说明, 此处以引用方式并入本文, 如同本文完全阐述。这方面的进一步详细情况提供如下。其他修饰 ( 例如, 末端加帽 ) 进 一步描述如下。
     所述肽的长度可为 2-20、 2-15、 4-15、 5-15、 4-10 和 5-10 个氨基酸残基。因此, 该 肽可由 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19 或 20 个氨基酸残基构成。
     因此, 该肽可包含以下的示例性肽或由以下的示例性肽组成 :
     36-46.GVLYVGSKTR(SEQ ID NO : 1)
     37-47.VLYVGSKTRE(SEQ ID NO : 2)
     38-48.LYVGSKTREG(SEQ ID NO : 3)
     39-49.YVGSKTREGV(SEQ ID NO : 4)
     77-87.AAATGLVKRE(SEQ ID NO : 5)
     78-88.AATGLVKREE(SEQ ID NO : 6)
     51-61.GVASVAEKTK(SEQ ID NO : 7)
     14-24.GVVAAAEKTK(SEQ ID NO : 8)
     15-25.VVAAAEKTKQ(SEQ ID NO : 9)
     16-26.VAAAEKTKQG(SEQ ID NO : 10)
     根 据 示 例 性 的 实 施 方 式,该 肽 不 是 YVGSKTREGVV(SEQ ID NO : 17) ; VAAAEKTKQGV(SEQ ID NO : 18), LS(SEQ ID NO : 19), GL(SEQID NO : 20) 和 KEG(SEQ ID NO : 21), 尽管根据本教导, 这些肽中的至少一些能够用于治疗性应用中。
     根据另外的实施方式, 该肽包含氨基酸序列 KTR(SEQ ID NO : 58) 或由氨基酸序列KTR(SEQ ID NO : 58) 组成。
     根据另外的实施方式, 该肽包含氨基酸序列 KTRE(SEQ ID NO : 59) 或由氨基酸序列 KTRE(SEQ ID NO : 59) 组成。
     根据另外的实施方式, 该肽包含氨基酸序列 KTRG(SEQ ID NO : 60) 或由氨基酸序列 KTRG(SEQ ID NO : 60) 组成。
     肽内的肽键 (-CO-NH-) 可被以下键所代替, 例如 N- 甲基化键 (-N(CH3)-CO-)、 酯 键 (-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)、 酮 亚 甲 基 键 (-CO-CH2-)、 α- 氮 杂 键 (-NH-N(R)-CO-) 其中 R 为任意烷基例如甲基、 卡巴键 ( 碳胺键, carba bond)(-CH2-NH-)、 羟基亚乙基键 (-CH(OH)-CH2-)、 硫代酰胺键 (-CS-NH-)、 烯族双键 (-CH = CH-)、 逆酰胺键 (-NH-CO-)、 肽衍 生物 (-N(R)-CH2-CO-) 其中 R 是天然存在于碳原子上的 “正常” 侧链, 。
     这些修饰可在沿肽链的任意键上发生, 甚至同时在若干 (2-3 个 ) 个键上发生。
     芳香族氨基酸可以是任何天然存在的或合成的芳香族残基, 包括但不限于苯丙氨 酸、 酪氨酸、 色氨酸、 苯基甘氨酸或它们的修饰体、 前体或功能性芳香部分。如下的表 2 中提 供了能够形成本发明的肽的一部分的芳香族残基的实例。
     因此, 天然芳香族氨基酸 Trp、 Tyr 和 Phe 可被合成的非天然氨基酸置换, 如苯基甘 氨酸、 Tic, 萘基丙氨酸 (Nal)、 苯基异丝氨酸、 苏氨醇 (threoninol)、 Phe 的环状甲基化衍生 物、 Phe 的卤化衍生物或 o- 甲基 -Tyr。 除上述以外, 本发明的肽还可包括一个或多个修饰氨基酸或一个或多个非氨基酸 单体 ( 例如, 脂肪酸、 复杂碳水化合物, 等 )。
     如在本文说明书和权利要求书部分所使用的, 术语 ( 一种或多种 )“氨基酸” 应理 解为包括 20 种天然存在的氨基酸 ; 那些经常在体内翻译后修饰的氨基酸, 包括例如, 羟脯 氨酸、 磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸 ; 以及其他罕见的氨基酸, 包括但不限于 2- 氨基己二酸、 羟 基赖氨酸、 异锁链赖氨素、 正缬氨酸、 正亮氨酸和鸟氨酸。此外, 术语 “氨基酸” 包括 D- 和 L- 氨基酸。
     所述肽还可包含保守的氨基酸取代, 其可包括天然存在的保守取代或合成取代, 见于例如 Karlin, S. 和 Ghandour, G., (1985), Multiple alphabet amino acid sequence comparison of the immunoglobulin κchain constant domain.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.82, 8597-8601。
     氨基酸分类 :
     按化学性质 : 酸性 (DE)、 脂肪族 (AGILV)、 酰胺 (NQ)、 芳香族 (FWY)、 碱性 (RHK)、 羟 基 (ST)、 亚氨基 (imino)(P)、 硫 (CM) ;
     按功能 : 酸性、 碱性、 疏水性 (A、 I、 L、 M、 F、 P、 W、 V)、 极性 (N、 C、 Q、 G、 S、 T、 Y) ;
     按电荷 : 酸性、 碱性、 中性 ;
     按结构 : 不定的 (A、 C、 G、 P、 S、 T、 W、 Y)、 外部的 (R、 N、 D、 Q、 E、 H、 K)、 内部的 (I、 L、 M、 F、 V)。
     单个氨基酸编码提供如下。
     以下表 1 和表 2 列出了可用于本发明的天然存在的氨基酸 ( 表 1) 和非常规的或 修饰的氨基酸 ( 例如, 合成的, 表 2)。
     表1
     10102348720 A CN 102348739
     单字母符号 A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V X
     说明书氨基酸 丙氨酸 精氨酸 天冬酰胺 天冬氨酸 半胱氨酸 谷氨酰胺 谷氨酸 甘氨酸 组氨酸 异亮氨酸 亮氨酸 赖氨酸 甲硫氨酸 苯丙氨酸 脯氨酸 丝氨酸 苏氨酸 色氨酸 酪氨酸 缬氨酸 任意上述氨基酸9/28 页三字母缩写 Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His Iie Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val Xaa表2
     由于本发明的肽优选用于治疗或诊断, 需要肽为可溶性形式, 因此本发明所述的 肽可包括一个或多个非天然或天然极性氨基酸, 包括但不限于丝氨酸和苏氨酸, 由于它们
     的含羟基侧链从能够增加肽的溶解度。
     本发明的某些实施方式中所述的肽包含至少 1 个、 2 个、 3 个、 4 个或更多个碱性氨 基酸残基, 以增强与 α- 突触核蛋白的结合。根据示例性的实施方式, 碱性氨基酸位于肽的 末端 (C 和 / 或 N)。
     根据本发明某些实施方式的肽包括至少一个 β- 片层阻断子氨基酸残基, 其位于 如下所述的肽序列中。包括这样的 β- 片层阻断子氨基酸的肽保留了对 α- 突触核蛋白 多肽的识别但防止其聚集。根据本发明的一个实施方式, β- 片层阻断子氨基酸是天然存 在的氨基酸, 如脯氨酸, 其特征为约 -60 至 +25 度的有限 通常 β- 片层的 角而不是约 -120 至 -140 度的角, 从而破坏 α- 突触核蛋白纤维的 β- 片层结构。其他的 β- 片层阻断子氨基酸残基包括但不限于天冬氨酸、 谷氨酸、 甘氨酸、 赖氨酸和丝氨酸 ( 根据 Chou 和 Fasman(1978)Annu.Rev.Biochem.47, 258)。
     根据本发明的该方面的另一个实施方式, β- 片层阻断子氨基酸残基为合成氨 基 酸, 如 Cα- 甲 基 化 氨 基 酸, 其 构 象 约 束 受 到 限 制 [Balaram, (1999)J.Pept.Res.54, 195-199]。与天然氨基酸不同, Cα- 甲基化氨基酸具有与 Cα 连接的氢原子, 这在很大程度 上影响其与酰胺键的
     和 ψ 角相关的空间特性质, 并更加有效地介导其治疗效果。β- 片层阻断子氨基酸或芳香族氨基酸可以位于肽内的任意位置 (N 末端、 C 末端、 或 N 或 C 端位于其两侧的区域 )。
     根据本发明的示例性实施方式, 所述肽具有末端帽修饰。
     如本文中所使用的, 短语 “末端帽子修饰的肽” 是指在其 N-( 氨基 ) 末端和 / 或在 C-( 羧基 ) 末端处被过修饰的肽。末端帽修饰是指将化学部分连接于末端以形成帽结构。 在本文中, 这样的化学部分是指末端帽部分, 在本文及本领域中也通常可互换地指代肽保 护部分或基团。
     如本文中所使用的, 短语 “末端帽部分”是指当连接于肽的末端时修饰末端帽 的部分。末端帽修饰通常导致肽末端电荷的掩蔽, 和 / 或其化学特性的改变, 如疏水性、 亲水性、 反应性、 溶解性等。适合用于肽末端帽修饰的部分的实例可见于, 例如, Green 等, ″ Protective Groups in Organic Chemistry ″, (Wiley, 2.sup.nd ed.1991) 和 Harrison 等, ″ Compendium of Synthetic Organic Methods″, Vols.1-8(John Wiley 和 Sons, 1971-1996)。 N 末端的末端帽部分的代表性实例包括, 但不限于, 甲酰基、 乙酰基 ( 本文中也表 示为 “Ac” )、 三氟乙酰基、 苄基、 苄氧羰基 ( 本文中也表示为 “Cbz” )、 叔丁氧羰基 ( 本文中 也表示为 “Boc” )、 三甲基硅基 ( 也表示为 “TMS” )、 2- 三甲基硅基 - 乙烷磺酰基 ( 也表示 为 “SES” )、 三苯甲基和取代的三苯甲基、 烯丙基氧羰基、 9- 芴甲氧羰基 ( 本文中也表示为 “Fmoc” )、 以及硝基 - 藜芦基氧羰基 (“NVOC” )。
     C- 末端的末端帽部分的代表性实例通常为导致 C- 末端处的羧基酰化的部分包 括, 但不限于, 苄基和三苯基醚、 以及烷基醚、 四氢吡喃基醚、 三烷基硅基醚、 烯丙基醚、 单甲 氧基三苯甲基和二甲氧基三苯甲基。可替代地, C- 末端末端帽结构的 -COOH 基可被修饰成 酰胺基。
     肽的其他末端帽修饰包括用不同的部分代替氨基和 / 或羧基, 如羟基、 巯基、 卤
     素、 烷基、 芳基、 烷氧基、 芳氧基等, 如本文中所定义的术语。
     可进一步通过芳香性对末端帽部分进行分类。因此, 末端帽部分可以是芳香性或 非芳香性的。
     适合 N- 末端修饰的非芳香性末端帽部分的代表性实例包括, 但不限于, 甲酰基、 乙酰基、 三氟乙酰基、 叔丁氧羰基、 三甲基硅基、 和 2- 三甲基硅基 - 乙烷磺酰基。适合 C- 末 端修饰的非芳香性末端帽部分的代表性实例包括, 但不限于, 酰胺类、 烯丙基氧羰基、 三烷 基硅基醚和烯丙基醚。
     适合 N- 末端修饰的芳香性末端帽部分的代表性实例包括, 但不限于, 芴甲氧羰基 (Fmoc)。适合 C- 末端修饰的芳香性末端帽子部分的代表性实例包括, 但不限于, 苄基、 苄氧 羰基 (Cbz)、 三苯甲基和取代的三苯甲基。
     应理解, 由于在治疗中使用短肽的主要障碍之一是立体特异性细胞蛋白酶对 其进行蛋白水解降解, 本发明所述的肽能够由天然氨基酸的 D- 异构体合成 [ 即, 反肽 类 似 物, Tjernberg(1997)J.Biol.Chem.272 : 12601-5, Gazit(2002)Curr.Med.Chem.9 : 1667-1675]。
     另外, 本发明所述的肽包括其逆 (retro) 类似物、 反 (inverso) 类似物和逆反 (retro-inverso) 类似物。应理解, 通常发现激素的完整或扩充 (extended) 的部分逆反类 似物保留或增强了生物活性。也发现逆反作用 (retro-inversion) 可应用于合理设计酶抑 制剂的领域 ( 参见美国专利第 6,261,569 号 )。 如本文中所使用的, “逆肽” 是指由 L- 氨基酸残基构成的肽, 其按照与天然肽序列 相反的方向进行装配。
     天然存在多肽的逆反修饰涉及具有与相应的 L- 氨基酸立体化学相反的 α- 碳的 氨基酸的合成装配, 即, D- 或 D- 别 - 氨基酸 (D-allo-amino acid) 以与天然肽序列相反的 顺序装配。 因此, 逆反类似物具有反转的末端及方向相反的肽键, 而基本上保持侧链的拓扑 结构与天然肽序列相同。
     应进一步了解, 在本发明所述肽的 N 末端或 C 末端添加诸如胆酰基的有机基团能 够提高治疗肽的效力和生物利用度 ( 例如, 穿过血脑屏障 )[Findeis(1999)Biochemistry 38 : 6791-6800]。
     最近开发的用于穿过 BBB 的系统被称为受体介导的转运 (Receptor Mediated Transport, RMT)。 该 系 统 使 用 模 拟 肽 单 克 隆 抗 体 (Mab’ s) 以 帮 助 大 分 子 穿 过 BBB[Pardridge WM.Pharm Res 2007 ; 24(9) : 1733-44]。这些 Mab’ s 可与所关注的肽结合 或与所关注的肽融合, 然后使用内源性受体以穿过 BBB 进入。
     根据一个实施方式, 将本发明所述的肽连接于缓释增强剂。典型的缓释增强剂 包括, 但不限于透明质酸 (HA)、 褐藻酸 (AA)、 聚羟乙基丙烯酸甲酯 (Poly-HEMA)、 聚乙二醇 (PEG)、 甘醇二甲醚 (glyme) 和聚异丙基丙烯酰胺。
     本发明所述肽的氨基酸序列组分与其他非氨基酸物质的连接可通过共价键连接, 通过非共价复合, 例如与能够被降解或裂解而产生能够持续释放的化合物的疏水聚合物复 合; 通过将肽的氨基酸部分包埋在脂质体或胶束内以产生本发明所述的最终肽。可通过将 氨基酸序列包埋在其他组分 ( 脂质体, 胶束 ) 中或将氨基酸序列注入聚合物中来实现结合 以产生本发明所述的最终肽。
     本发明所述化合物可以是线性或环状的 ( 环化可提高稳定性 )。可通过本领域任 何已知手段进行环化。当化合物主要由氨基酸构成时, 环化可经由 N 末端至 C 末端、 N 末端 至侧链和 N 末端至骨架、 C 末端至侧链、 C 末端至骨架、 侧链至骨架和侧链至侧链、 以及骨架 至骨架环化。肽的环化也可通过肽中包括的非氨基酸有机部分进行。
     本发明所述的肽可生化合成, 例如通过使用标准固相技术。这些方法包括专有的 (exclusive) 固相合成法、 部分固相合成法、 片段缩合法、 经典溶液合成法。 固相多肽的合成 步骤是本领域公知的, 并且在 John Morrow Stewart 和 Janis Dillaha Young, Solid Phase Polypeptide Syntheses(2nd Ed., Pierce Chemical Company, 1984) 中进一步描述。
     合成的肽可通过制备性高效液相色谱进行纯化 [Creighton T.(1983)Proteins, structures and molecular principles.WH Freeman and Co.N.Y.], 其组成能够通过氨基 酸测序得到证实。
     重组技术也可用于生成本发明所述的肽。为了利用重组技术产生本发明的肽, 将 编码本发明所述肽的多聚核苷酸连接 (ligate) 至核酸表达载体中, 其包括在顺式调节序 列 ( 例如, 启动子序列 ) 的转录调控下的多聚核苷酸序列, 适合在宿主细胞中进行构成性 的、 组织特异性的或诱导性的本发明所述多肽的转录。
     除了可在宿主细胞中合成, 也可用体外表达系统合成本发明所述的多肽。这些方 法是本领域公知的, 并且该系统的组件是可商购获得的。
     本发明某些实施方式中的肽可用于治疗或预防与 α- 突触核蛋白相关的疾病 ( 即, 发病和进展与 α- 突触核蛋白的聚集相关的疾病 )。这样的疾病的实例包括但不限于 神经退行性疾病, 尤其是阿尔茨海默氏病、 阿尔茨海默氏病的路易体变异型、 帕金森氏病、 多系统萎缩、 路易体痴呆和亨廷顿舞蹈症。
     可将肽单独提供给个体, 或作为药物组合物与药学上可接受的载体混合后提供给 个体。
     如本文中所使用的, “药物组合物” 是指一种或多种本文中描述的活性成分与其他 化学成分如生理合适的载体和赋形剂形成的制剂。 药物组合物的目的是为了便于将化合物 给予有机体。
     本文中的术语 “活性成分” 是指肽制剂, 其是产生生物效应的原因。
     在下文中, 短语 “生理上可接受的载体” 和 “药学上可接受的载体” 可互换使用, 指 代不会引起对有机体的明显刺激并且不消除所给予化合物的生物活性和性质的载体或稀 释剂。佐剂包括在这些短语中。药学上可接受的载体中包括的成分之一可以是例如聚乙 二醇 (PEG), 其为生物相容性的聚合物, 在有机和水性介质中具有较大的溶解度 (Mutter 等 (1979))。
     本文中的术语 “赋形剂” 是指加入到药物组合物中以进一步便于活性成分的给予 的惰性物质。赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、 磷酸钙、 各种糖和各种类型的淀粉、 纤维 素衍生物、 明胶、 植物油和聚乙二醇。
     药物的配制和给予技术可参见 “Remington’ s Pharmaceutical Sciences” Mack Publishing Co., Easton, PA, 最新版, 此处以引用方式结合于本文。
     适合的给予途径可包括例如口服、 直肠、 经粘膜 ( 尤其是经鼻、 经肠 ) 或肠胃外递 送, 包括肌内、 皮下和髓内注射以及鞘内、 直接心室内、 静脉、 腹膜内、 鼻内或眼内注射。另外, 可局部而不是以系统方式给予制剂, 例如, 通过将制剂直接注射到脑部的特 定区域中。
     本发明所述的药物组合物可通过本领域公知的工艺来制造, 例如, 通过常规手段 如混合、 溶解、 制粒、 制糖衣、 水飞、 乳化、 胶囊化、 包埋或冻干工艺。
     根据本发明所述而应用的药物组合物可利用一种或多种生理上可接受的载体以 常规方式配制, 该生理上可接受的载体包含赋形剂和辅料, 以便于活性成分加工成药学上 可使用的制剂。合适的配方取决于所选择的给予途径。
     对于注射剂, 本发明的活性成分可配制成水性溶液, 优选生理学相容的缓冲溶液, 例如汉克氏溶液、 林格氏溶液、 或生理盐溶液。对于经粘膜给予, 在配方中使用适合透过屏 障的渗透剂。这样的渗透剂是本领域公知的。
     对于口服给予, 化合物可容易地通过将活性化合物与本领域公知的药学上可接受 的载体结合而配制。这样的载体能够将本发明所述化合物配制为片剂、 丸剂、 糖衣丸、 胶囊 剂、 液体、 凝胶剂、 糖浆剂、 膏剂、 混悬剂等以供患者口服摄入。供口服使用的药理制剂能够 使用固体赋形剂制备, 可选地研磨所产生的混合物, 并将混合物加工成小颗粒, 如果需要, 加入合适的辅料后, 可获得片剂或糖衣丸的核。 合适的赋形剂为, 特别是, 填充剂如糖, 包括 乳糖、 蔗糖、 甘露醇、 或山梨醇 ; 纤维素制剂如, 例如玉米淀粉、 小麦淀粉、 米淀粉、 马铃薯淀 粉、 明胶、 黄蓍胶、 甲基纤维素、 羟丙基甲基纤维素、 羧甲基纤维素钠 ; 和 / 或生理上可接受 的聚合物如聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)。如果需要, 可加入崩解剂, 如交联聚乙烯吡咯烷酮、 琼 脂、 或褐藻酸或其盐如海藻酸钠。
     提供具有合适包衣的糖衣丸核。 为此目的, 可使用浓缩的糖溶液, 其可选地含有阿 拉伯树胶、 滑石粉、 聚乙烯吡咯烷酮、 卡波普凝胶、 聚乙二醇、 二氧化钛、 涂膜溶液 (lacquer solution) 和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可在片剂或糖衣丸包衣中加入染料或色素以 用于识别或赋予活性化合物剂量的不同组合的特征。
     可用于口服的药物组合物包括由明胶制备的推入适配胶囊 (push-fit capsule), 以及由明胶和增塑剂如甘油和山梨醇制备的软密封胶囊。 推入适配胶囊可包含与填充剂如 乳糖, 黏合剂如淀粉, 润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁以及可选的稳定剂混合的活性成分。 在软 胶囊中, 可将活性成分溶解或悬浮在合适的液体中, 如脂肪油、 液体石蜡、 或液态聚乙二醇。 此外, 也可加入稳定剂。口服给予的所有配方的剂量应适合于所选择的给予途径。
     对于含服给予, 组合物可采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
     对于经鼻吸入给予, 根据本发明所应用的活性成分可以气雾剂的形式方便地递 送, 其通过使用合适的推进剂, 例如二氯二氟甲烷、 三氯氟甲烷、 二氯四氟乙烷或二氧化碳, 由加压的包装或喷雾器提供。对加压的气雾剂而言, 可通过提供阀门来递送经计量的量以 确定剂量单位。可配制在分配器中使用的例如明胶胶囊和筒, 以包含化合物和合适的粉基 ( 如乳糖或淀粉 ) 的混合粉末。
     可配制本文所述的制剂以用于肠胃外给予, 例如, 通过推注或持续输注。 用于注射 的配方可以单位剂型提供, 例如, 在安瓿中或在具有可选地添加防腐剂的多剂量容器中。 组 合物可以是在油性或水性溶媒中的混悬剂、 溶液或乳剂, 并且可以包含诸如悬浮剂、 稳定剂 和 / 或分散剂的配方剂 (formulatory agent)。
     用于肠胃外给予的药物组合物包括水溶性形式的活性制剂的水性溶液。此外, 活性成分的混悬剂可制备成基于合适的油或水的注射混悬剂。 合适的亲脂性溶剂或溶媒包括 脂肪油如芝麻油, 或合成脂肪酸酯如油酸乙酯、 甘油三酯或脂质体。 水性注射混悬剂可含有 能够增加混悬剂粘度的物质, 如羧甲基纤维素钠、 山梨糖醇或葡聚糖。可选地, 混悬剂也可 包含合适的稳定剂或增加活性成分的溶解度以使得能够制备高浓度溶液的试剂。
     可替代地, 活性成分可为粉末形式以在使用前溶于合适的溶媒, 例如, 基于无菌无 热原水的溶液。
     本发明所述制剂也可配制为直肠用组合物 ( 如栓剂 ) 或使用例如传统栓剂基质如 可可油或其他甘油酯进行保留灌肠。
     适用于本发明上下文的药物组合物包括组合物, 其中含有有效量的活性成分以达 到预期目的。 更具体而言, 治疗有效量意味着可有效防止、 减轻或缓解疾病症状或延长接受 治疗的对象的存活期的活性成分的量。
     治疗有效量的确定在本领域技术人员的能力范围内。
     对于用于本发明所述方法的任意制剂, 治疗有效量或剂量可通过体外试验初步 估算。初步估算确定后, 可配制剂量用于动物模型, 并且此信息可用于更准确地确定在人 类中的有用剂量。本发明人已表明, 可使用果蝇作为体内模型来分析本发明所述的肽的效 果 - 参见实施例 9 和 Crowther 等, Current Opinion in Pharmacology ; 2004, 4: 513-516, 本文中以引用方式并入。
     本文所述的活性成分的毒性和治疗功效可通过在体外、 细胞培养物或实验动物 中的标准药学程序来确定。从体外和细胞培养物试验和动物研究中获得的数据可用来配 制用于人类的一系列剂量。剂量根据所采用的剂型和所利用的给予途径而有所不同。准 确的配方、 给予途径和剂量可由医生个人参照患者病情进行选择 [ 参见, 例如 Fingl 等, (1975)″ The Pharmacological Basis of Therapeutics″, Ch.1 p.1]。
     根据所治疗疾病的严重性和应答性, 给药可以是单次或多次给予, 疗程持续数日 或数周或直至治愈或实现了疾病状态的减轻。
     当然, 所给予组合物的剂量会取决于所治疗的对象、 患病的严重性、 给予方式、 处 方医师的判断等。
     也可制备包括与相容性药学载体配制的本发明所述制剂的组合物, 放置于合适的 容器中, 并标记用于治疗所指示的疾病。
     如果需要, 本发明所述组合物可以包装容器或分配装置提供, 例如 FDA 批准的试 剂盒, 其可含有一种或多种包含活性成分的单位剂型。 包装容器可包括, 例如金属或塑料薄 膜, 如泡罩包装。包装容器或分配装置可以附有给予的使用说明书。也可通过由监管药品 生产、 使用或销售的政府机构规定的与容器有关的公告对包装容器或分配装置进行调整, 该公告反映了机构批准该组合物的形式或给予人类或动物。这样的公告可以为, 例如美国 食品和药品监督管理局批准标签用于处方药或作为已批准产品的说明书。
     除了治疗应用, 本发明的某些实施方式中的肽还可用于检测 α- 突触核蛋白单体 的存在或水平。这依赖于肽与单体 α- 突触核蛋白形式结合的能力。因此, 通过间接测定 蛋白的有害聚集形式的水平, 可用于诊断或监测治疗效果。
     应理解, 所述肽也可作为研究 α-syn 和 β-syn 之间相互作用的工具, 也可帮助理 解 β-syn 的作用和 / 或机制。因此, 可将所述肽连接至可识别的部分。
     可识别的部分可以是结合对的成员, 其通过与结合对的直接可视的另一成员和标 记的相互作用而被识别。在一个实例中, 该结合对的成员为通过相应的标记抗体识别的抗 原。在一个实例中, 标记为产生比色反应的荧光蛋白或酶。
     下表 3 提供了可识别部分的序列的实例。
     表3
     应理解, 可使用化学缀合或重组 DNA 技术产生这样的融合。将单体形式的水平与 对照样品相比较 ( 例如, 来自健康对象、 治疗前的相同对象等 )。 为了研究目的和药物开发, 例如, 在使用药物治疗后和可选的治疗前, 测定药物对 α- 突触核蛋白和单体形式水平的 影响, 其中药物可以是本发明所述的肽。
     术语 “包含” 、 “包括” 、 “含有” 、 “具有” 及其结合意味着 “包括但不限于” 。该术语包 括术语 “由……组成” 和 “基本上由……组成” 。
     短语 “基本上由……组成” 是指组合物或方法可包括其他成分和 / 或步骤, 但仅当 其他成分和 / 或步骤未实质上改变所要求的组合物或方法的基本性质和新颖性。
     如本文中所使用的, 除非上下文另有规定, 单数形式的 “一个” 、 “一种” 和 “该” 、 “所 述” 包括复数指代。例如, 术语 “化合物” 或 “至少一种化合物” 可包括复数种化合物, 包括 其混合物。
     在本申请全文中, 本发明的不同实施方式以范围的格式表示。 应理解, 以范围格式 描述仅仅是为了方便和简洁, 不应理解为对发明范围的僵化的限制。 因此, 应认为对范围的 描述已明确公开了所有可能的子范围以及在此范围内的单个数值。例如, 应认为对范围的 描述诸如 1 至 6 明确公开了子范围如 1 至 3、 1 至 4、 2 至 4、 2 至 6、 3 至 6 等, 以及在该范围 内的单个数值, 例如 1、 2、 3、 4、 5、 6。不论范围窄宽均适用。
     当本文中指出数值范围时, 其意图包括指定范围内的任意被引用的数字 ( 分数或 整数 )。短语 “在” 第一个指定数字和第二个指定数字 “之间的范围” 和 “从” 第一个指定数 字 “到” 第二个指定数字 “的范围” 可交替使用, 并且意图包括第一个和第二个指定数字以 及所有在其间的分数和整数。
     如本文中所使用的, 术语 “方法” 指代完成给定任务的方式、 手段、 技术和程序, 其
     包括但不限于化学、 药理、 生物、 生化和医疗领域的从业人员已知的, 或容易从已知的方式、 手段、 技术和程序开发的那些方式、 手段、 技术和程序。
     如本文中所使用的, 术语 “治疗” 包括去除, 基本上抑制、 减缓或逆转疾病进程, 基 本上改善疾病的临床或外部症状, 或基本上防止疾病的临床或外部症状的出现。
     本文中使用的词语 “典型的” 是指 “作为例子、 实例或例证” 。任何描述为 “典型的 ( 或示例性的 )” 实施方式并不能理解为比其他实施方式优选或有利的、 和 / 或排除来自其 他实施方式的特征的纳入。
     本文中所使用的词语 “可选地” 是指 “在某些实施方式中提供而在其他实施方式中 未提供” 。本发明任何特别的实施方式可包括多个 “可选的” 特征, 除非这些特征相抵触。
     应理解, 为清晰起见, 在独立实施方式的上下文处所描述的本发明的某些特征也 可与单独的实施方式以组合的方式提供。 反过来, 为简洁起见, 在单独实施方式的上下文处 所描述的不同的发明特征也可单独或以任意合适的子组合形式或相应的在任何本发明所 描述的实施方式中提供。 不应认为在不同的实施方式的上下文所描述的某些特征是那些实 施方式的必要特征, 除非该实施方式在没有这些元素时无法实施。
     如上所述及如下权利要求部分所要求的本发明的各种实施方式和方面可从如下 实施例中得到实验性支持。 实施例
     现参考以下实施例, 与以上说明书以非限制的方式共同描述本发明的某些实施方式。 现参考以下实施例, 与以上说明书以非限制的方式共同描述本发明。
     通常, 本文中使用的术语和本发明利用的实验程序包括分子、 生化、 微生物和重 组 DNA 技术。文献对这样的技术进行了充分说明。参见例如, “Molecular Cloning : A laboratory Manual” Sambrook 等, (1989) ; “Current Protocols in Molecular Biology” 卷 I-III Ausubel, R.M., ed.(1994) ; Ausubel 等, “Current Protocols in Molecular Biology” , John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland(1989) ; Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning” , John Wiley & Sons, New York(1988) ; Watson 等, “Recombinant DNA” , Scientific American Books, New York ; Birren 等 (eds)“Genome Analysis : A Laboratory Manual Series” , Vols.1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1998) ; 美国专利第 4,666,828 号 ; 第 4,683,202 号 ; 第 4,801,531 号 ; 第 5,192,659 号和第 5,272,057 号方法学解释 ; “Cell Biology : A Laboratory Handbook” , 卷 I-III Cellis, J.E., ed.(1994) ; “Current Protocols in Immunology” 卷 I-III Coligan J.E., ed.(1994) ; Stites 等 (eds), “Basic and Clinical Immunology” (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT(1994) ; Mishell 和 Shiigi(eds), “Selected Methods in Cellular Immunology” , W.H.Freeman and Co., New York(1980) ; 专利和科学文献对可用 的免疫测定法进行了广泛描述, 参见例如美国专利第 3,791,932 号 ; 第 3,839,153 号 ; 第 3,850,752 号 ; 第 3,850,578 号 ; 第 3,853,987 号 ; 第 3,867,517 号 ; 第 3,879,262 号 ; 第 3,901,654 号 ; 第 3,935,074 号 ; 第 3,984,533 号 ; 第 3,996,345 号 ; 第 4,034,074 号 ; 第 4,098,876 号 ; 第 4,879,219 号 ; 第 5,011,771 号 和 第 5,281,521 号 ; “Oligonucleotide
     Synthesis” Gait, M.J., ed.(1984) ; “Nucleic Acid Hybridization” Hames, B.D., 和 Higgins S.J., eds.(1985) ; “Transcription and Translation” Hames, B.D., 和 Higgins S.J., eds.(1984) ; “Animal Cell Culture” Freshney, R.I., ed.(1986) ; “Immobilized Cells and Enzymes”IRL Press ,(1986) ; “ A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984) 和 “Methods in Enzymology” Vol.1-317, Academic Press ; “PCR Protocols : A Guide To Methods And Applications” , Academic Press, San Diego, CA(1990) ; Marshak 等, “Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual” CSHL Press(1996) ; 将其所有以引用方式并入本文, 如同本文 完全阐述。在全文中提供了其他一般的参考。认为其中的程序是本领域公知的, 并为读者 提供便利。以参考方式将其中所包含的所有信息并入本文。
     一般材料和方法
     肽阵列 : 使用肽阵列技术对 β-syn 结合序列进行分子定位。 在纤维素膜基质上合 成与全长为 134 个氨基酸的 β-syn 蛋白的重叠序列相对应的十聚体肽。该肽共价结合于 C 末端氨基酸残基支持的 Whatman 50 纤维素。封闭后, 在 N 末端组氨酸标记的重组 α-syn 中, 然后在 HRP 标记的抗 His 单克隆抗体中孵化膜。进行了阴性对照。使用蛋白印迹分析 对纤维素膜上的免疫印迹进行显影。一旦确定了 β-syn 在 α-syn 上的结合位点, 就可合 成小型 β-syn 衍生肽。 α-syn 的表达和纯化 : 蛋白在 pT7-7BL21 细菌中表达。对于表达, 使用氨苄西林 (100mg/L) 将细菌培养物培养至对数阶段, 使用 IPTG(1mM) 诱导蛋白表达 3 小时。 细菌沉淀 物 (pellet) 在 TEN 缓冲液 (50mM Tris pH8.0, 10mM EDTA, 150mMNaCl) 中重悬, 并在 -80℃ 下冷冻直至纯化。
     使用如 Volles 和 Lansbury 所述的非色谱方法 (Volles 和 Lansbury, 2007, J Mol Biol 366(5), 1510-1522) 进行纯化。 简言之, 细菌煮沸并离心后, 将上清液移至新试管并加 入硫酸链霉素 (136μL 的 10%溶液 /mL 上清液 ) 和醋酸 ( 冰醋酸, 228μL/mL 上清液 ), 然 后再旋转 2 分钟。再次除去上清液, 然后用硫酸铵 (4℃下使用与上清液体积 : 体积为 1 ∶ 1 的饱和硫酸铵 ) 沉淀。通过离心收集沉淀的蛋白 ( 在此阶段观察到克隆未产生可纯化的蛋 白而未形成沉淀 ), 并用 1mL 硫酸铵溶液 (4℃; 饱和硫酸铵 (4℃ ) : 水为 1 ∶ 1 体积∶体积 ) 洗涤沉淀物一次。洗涤的沉淀物在 900μL 100mM 醋酸铵中重悬 ( 形成不透明溶液 ), 并通 过在室温下加入等体积的乙醇进行沉淀。重复一次乙醇沉淀, 接着在 100mM 醋酸铵中进行 最后一次重悬, 4℃下 O.N. 透析至水中, 在液氮中冷冻并冻干。
     为了进行比对, 随后使用色谱法通过另外的方法对蛋白进行纯化, 并使用相同的 肽测定聚集抑制。 简言之, 细菌沉淀物在 50mM Tris, 50mM KCl, 5mM MgAc, 0.1% NaN, pH 8.5 中重悬, 并辅以 300uM PMSF 抑制剂。然后超声处理并在 4C 下以 14000RPM 超离心 30 分钟。 然后在水浴中将上清液煮沸 15 分钟。为了从溶液中分离沉淀蛋白, 在 4℃以 7000RPM 的速 度离心 20 分钟。用 0.45μm 滤器对上清液进行过滤, 并保存以进一步纯化。
     将滤过的上清液施于 HiPrep 16/10QEF 阴离子交换柱。在 20mMTris, pH 8 下, α-syn 具有净负电荷, 因此能够与阴离子交换柱的正电荷部分 (NH+) 相互作用。使用 30-40%的 20mM Tris 和 1MNaCl 溶液 (pH8) 洗脱蛋白, 并施于 HiLoad 26/20superdex 200 尺寸排阻柱。用 50mMTris/HCl 和 150mM NaCl 缓冲液 (pH 7.5) 与阴离子交换部分上样, 用
     SDSPAGE 分析单体部分, 4℃下 O.N. 透析至水中, 在液氮中冷冻并冻干。
     ThT 荧光试验 : 将 α-syn 溶解至浓度为每 100mM Tris 缓冲液中 200μm(pH 7.4)。 为了获得单体部分, 用 100 kDa 的离心超滤管对蛋白进行过滤。 由于 α-syn 不是球形蛋白, 而是天然展开的, 因此仅单体和一些二聚体可通过滤器。立即将单体蛋白与不同 β-syn 衍 生肽以 1 ∶ 1 的比例混合或不与不同 β-syn 衍生肽混合至终浓度为 100μM。 样品在 37℃下 以 850RPM 搅拌孵化, 如 Tsigelny 等人所述 (Tsigelny 等, 2007Febs J 274(7), 1862-1877), 孵化后三天, 通过硫磺素 T(ThT) 荧光试验 ( 在 450nm 处激发, 2.5nm 狭缝, 并在 480nm 处发 射, 5nm 狭缝 ) 测定原纤维形成速率。将 ThT 加入稀释 500 倍的样品中, 并使用 Jobin Yvon Horiba Fluoromax3 荧光计进行测量。
     透射电子显微法 : 将 来 自 α-syn ThT 荧 光 试 验 ( 有 或 没 有 抑 制 剂 ) 的 样 品 (10μL) 置于覆盖有碳稳定的方华膜 ( 聚乙烯醇缩甲醛膜, Formvar film) 的 400 目铜网上 (SPI 提供, West Chester, PA)。1.5 分钟后, 除去多余的液体, 用 10μl 的 2%乙酸铀酰溶 液将网负染色 2 分钟。最后, 除去多余的液体, 并在 80kV 下运行的 JEOL 1200EX 电子显微 镜下观察样品。
     可溶性寡聚体形成的测定 : 将单体 α-syn 溶解至浓度为每 100mM Tris 缓冲液中 200μm(pH 7.4), 并立即与 β-syn 衍生肽以 1 ∶ 1 的比例混合或不与不同 β-syn 衍生肽混 合至终浓度为 100μM, 如上文所述的聚集试验中所述。37℃下将样品搅拌数日后, 将 10μl 的蛋白在 13000 RPM 下离心 10 分钟, 收集上清液并使用不含 β- 巯基乙醇且不煮沸的非变 性加样缓冲液在丙烯酰胺凝胶上进行电泳。 使用 ddH2O 洗涤凝胶 3 次, 将样品转移至硝酸纤 维素膜, 采用半干印迹技术, 施加 323mA 电流 30 分钟。使用 TBS(0.3%吐温 ) 稀释的 5%牛 奶封闭膜 1 小时, 并同时振摇。 用 TBS(0.3%吐温 ) 稀释的 5%牛奶以 1 ∶ 1000 对抗 α-syn 进行稀释 (Santa Cruz Biotechnology), 加到膜上孵化 2 小时, 并用 TBS(0.3%吐温 ) 洗涤 数次。用 TBS(0.3%吐温 ) 稀释的 5%牛奶以 1 ∶ 5000 对兔抗鼠 IgG(Fc 特异性 )-HRP 缀 合的抗体进行稀释并在 RT 下给予 1 小时, 同时振摇。根据生产商的指示, 用 TBS(0.3%吐 温 ) 彻底洗涤后使用增强化学发光系统 (Enhanced Chemiluminescence System, ECL) 使印 迹显影。
     荧光各向异性研究: 将 酪 氨 酸 被 色 氨 酸 代 替 的 β-syn 36(SEQ ID NO : 22-GVLWVGSKTR) 溶解至浓度为 54μM。立即将该溶液与 α-syn 单体储备液混合至不同的 终浓度。利用 ISS K2 荧光剂进行肽极化测量。在 280nm 处激发溶液并在 350nm 处监测发 射。对于每个单独的点, 至少收集五次测量值, 并且它们的平均值用于计算。使用超纯水进 行所有实验。
     NMR 分析 : 通过将冻干形式的肽溶解于含有 10%氧化氘的 20mM 磷酸盐缓冲液和含 有 50mM NaCl 的 DDW 溶液来制备样品。当使用 α-syn 时, 如上所述在 20mM 磷酸盐溶液中 制备样品, 加入 NaCl 和氧化氘已达到上述浓度, 以指定的摩尔比加入冻干肽。测量所有样 品的 pH。在 Shigemi 管中制备样品, 终体积为 260μL。
     在 Bruker Avance 600MHz DMX 光 谱 仪 上 进 行 NMR 实 验, 使用装备有自屏蔽 xyz- 梯度线圈的 5mm 选择性探头, 在 600.13MHz 的质子频率下运行。将发射器频率调制 到 HDO 信号上, 其根据温度进行校准 (4 ℃ -4.974ppm ; 10 ℃ -4.821ppm ; 15 ℃ -4.773ppm ; 37℃ -4.658ppm)。对每个温度和样品集进行 TOSCY(44) 和 NOESY(46) 实验。使用 TOPSPIN 软件 (Bruker Analytische Messtechnik GmbH) 对光谱进行处理和 分析。 在傅立叶变换前应用间接维度的零填充和两个维度上均具有位移平方正弦钟形窗函 数 (shifted squared sine bell window functions) 的数据切趾 (data apodization) 以 达到最佳分辨率。在具有二次多项式函数的直接维度上对基线进行进一步校正。
     根据 Wüthrich 基于在相同实验条件下测定的 TOCSY 和 NOESY 光谱而开发的序列 归属法进行共振归属。由精确校准的、 高分辨的、 强切趾覆盖的 2D 光谱来读取 HN-Hα 峰的 化学位移偏移。
     肽稳定性体外试验 : 将肽溶解以形成 50μM Tris 缓冲液 (pH = 7.6) 中的 1mM 溶液。将 120μl 的肽溶液在新采集的无小脑的小鼠脑匀浆 ( 在 1×Tris 缓冲液和 0.5% Triton X-100 中 ) 中稀释至 10%。含有 20%肽溶液和 80%小鼠脑匀浆的混合物在 37℃ 下孵化并轻微振摇 2 小时。通过加入 0.1MHCl 溶液终止酶反应, 接着用 CH3OH 使蛋白变性 并在 20℃下孵化 1 小时。4℃下将沉淀的蛋白以 29,000×g 离心 20 分钟, 含有肽的上清液 减压浓缩并用 C18HPLC 柱分离。将与完整肽相对应的峰面积 ( 在 280nm 处 UV 吸收 ) 与在 50μM Tris 缓冲液中孵化的等量样品进行比较。
     细胞系 : 在 100μM G-418, 37 ℃及 5 % CO2 的选择性条件下, 将 α-syn 野生型稳 定转染的 SH-SY5Y 细胞保持在含有 5%胎牛血清、 2mM L- 谷氨酰胺、 1000U/ml 青霉素 G 钠、 1mg/ml 硫酸链霉素和 1mM 丙酮酸钠的 DMEM : F121 ∶ 1 中。 细胞在含有 10μM 视黄酸 (Sigma) 的完全培养基中经历分化, 每两天更换培养基, 为期八天。
     肽内化至 SH-SY5Y 细胞中 : 肽内化至 SH-SY5Y 细胞可通过免疫细胞化学染色可视 化。将 104 个细胞接种于 24 孔板中涂覆有聚 -L- 赖氨酸 (0.1% ) 的盖玻片上并经历如上 所述的分化。在 37℃下, 分化的细胞在细胞培养基中与肽孵化 30 分钟至四个小时。室温下 用 PBS 洗涤细胞并用 4%多聚甲醛的 PBS 溶液固定 30 分钟, 然后用 PBS 洗涤两次并用 0.1% Triton 的 PBS 溶液透化 2 分钟。用 PBS 洗涤两次后, 用 10%正常羊血清的 3% BSA 溶液封 闭细胞, 并且用以 1 ∶ 1000 稀释的抗 α-syn 抗体 (Santa Cruz Biotechnology) 和鬼笔环 肽 4μg/ml(Sigma) 孵化一小时, 接着与 Cy5- 缀合的羊抗兔 IgG(Jackson ImmunoResearch) 再孵化一小时。用 PBS 彻底洗涤后, 使用 Prolong Antifade(Invitrogene) 封固细胞。使 用 LSM510 共聚焦显微镜 (Zeiss) 采集图像。
     果蝇的饲养 : 在标准角膜糖蜜培养基中饲养果蝇, 并保持在 25C。雄果蝇与分别在 25℃或 18℃孵化后 8 小时或 18 小时收集的未交配过的雌果蝇进行杂交。为了避免来自下 一代 (F2) 的后代, 在 25℃下开始孵化第 9 天后收集来自杂交的成年后代 (F1)。
     果蝇杂交 : 将 X 染色体上携带驱动子 elav-Gal4 的雄果蝇与携带位于 X 染色体 UAS 启动子下的 A53Tα-syn 转基因的雌果蝇进行杂交。这导致第一代 (F1) 雌性后代在其神经 系统中表达 A53Tα-syn, 作为 PD 果蝇模型。携带驱动子 elav-Gal4 的雄果蝇后代与 WT OR 雌性进行杂交作为对照。
     特殊果蝇饲养 : 将 β-syn 逆反肽以 0.75mg/ml 的浓度加入标准角膜糖蜜培养基 中。在 40℃下将肽完全混入培养基, 混合物等分至饲养瓶中。将瓶保持在 4℃下直至使用。 在普通果蝇培养基 ( 对照 ) 或添加了肽的培养基上进行杂交。从幼虫期开始在合适的培养 基上饲喂动物。孵化后, 每两天将后代转移至预滴入 0.75mg/ml 肽溶液的瓶中。
     运动 ( 攀爬 ) 试验 : 每支试管包含 10 只果蝇, 在桌上轻敲并直立 20 秒。然后根据时间计算从试管底部攀爬约一厘米的果蝇的百分比。 对每种的五个独立试管进行重复实 验。
     实施例 1
     α 和 β-syn 之间识别位点的确定
     结果
     为了确定两种蛋白间的相互作用位点, 使用交互肽阵列分析法 (reciprocal peptide-array analysis) 对两种蛋白进行系统性定位 ( 图 lA- 图 1D)。
     该试验背后的原理是为了确定具有促进分子识别事件而引起相互作用的潜力的 结构域。该结构域将是合成小衍生肽的基础, 以用于治疗性抑制 α-syn 聚集。
     使用肽阵列技术进行 α 和 β-syn 结合序列的分子定位。在纤维素膜基质上合成 与全长为 140 个氨基酸的 α-syn 蛋白和全长为 134 个氨基酸的 β-syn 蛋白的重叠序列相 对应的十聚体肽 ( 参见图 2A- 图 2B)。该肽共价结合于 C 末端氨基酸残基支持的 Whatman 50 纤维素上。
     封闭后, α 和 β-syn 纤维素膜分别在 N 末端组氨酸标记的重组 α-syn 和重组 β-syn 中, 然后在 HRP 缀合的抗组氨酸单克隆抗体中孵化。进行了阴性对照。使用蛋白印 迹分析对纤维素膜上的免疫印迹进行显影。一旦确定了 β-syn 在 α-syn 上的结合位点, 就可合成小型 β-syn 衍生肽。
     选择并合成若干十聚体肽以用于进一步分析。 根据其第一个氨基酸在膜上的位置 将这些肽称为 β-syn 6、 β-syn 14、 β-syn 36、 β-syn 37、 β-syn 38、 β-syn 39、 β-syn 77 和 β-syn 78( 表 4, 如下 )。一条七个氨基酸的肽 ( 称为 6 短肽 (6short)) 用作阳性对 照, 其由 Windisch 等 (Windisch 等, 2004(2004)J Mol Neurosci 24(1), 155-165) 选作良好 的抑制剂候选物 -SMAKEGV(SEQ ID NO : 39)。
     表4
     由 于 酪 氨 酸 的 存 在, 特 别 注 意 肽 36-39(SEQ ID NOs 1-4)。 已 确 定 芳 香 族 氨 基 酸 在 通 过 π- 堆 积 作 用 而 形 成 淀 粉 样 原 纤 维 中 起 关 键 作 用 [Azriel, R. 和 Gazit, E.(2001)J.Biol.Chem.(276) , 34156-34161 ; Gazit , E.(2002)Bioinformatics (18) , 880-883 ; Porat, Y., Kolusheva, S., Jelinek, R. 和 Gazit, E.(2003)Biochemistry (42), 10971-10977 ; Mazor, Y., Gilead, S., Benhar, I. 和 Gazit, E.(2002)J.Mol.Biol.(322), 1013-1024 ; Reches, M. 和 Gazit, E.(2003)Science (300), 625-627 ; Reches, M. 和 Gazit, E.(2004)Amyloid(11), 81-89]。因此, 抑制剂肽内存在酪氨酸可促进对淀粉样结构自组装 的干扰。
     实施例 2
     β-syn 衍生肽对淀粉样纤维形成的抑制
     为了检验肽对 α-syn 纤维形成的抑制作用, 进行了硫磺素 -T(ThT) 结合试验。该 方法提供了淀粉样纤维生长的定量信息。 在不同 β-syn 衍生肽存在或不存在时, 将 α-syn 在 37 ℃下孵化数日, 同时剧烈振摇以允许淀粉样纤维的形成。监测纤维化过程三天。图 3A 示出了在若干肽抑制剂的存在下, 淀粉样纤维的形成明显降低。对两种潜在的抑制剂 β-syn 36 和 β-syn 39 进行动力学分析, 因为这两种肽代表了在芳香区域内筛选的第一 个和最后一个肽 ( 图 3B)。β-syn 36 显示出更好的抑制作用, 并且剂量依赖性抑制试验显 示在 10 ∶ 1( 摩尔比 ) 过量时肽仍然有效, 但效率低于 5 ∶ 1 过量 ( 图 3C)。
     实施例 3
     α-syn 聚集的 TEM 分析
     在 β-syn 抑制剂存在和不存在时, 对 α-syn 样品进行透射电子显微镜 (TEM) 分 析。样品取自 ThT 实验 ( 显示在图 3A 中 )。由 α-syn 单独形成的纤维为大而宽的带状纤 维 ( 图 3D), 而 β-syn 存在时仅检测到短纤维或未检测到纤维。β-syn 36 几乎完全抑制 纤维的形成 ( 图 3F)。这些结果与 ThT 试验结果高度相关。
     实施例 4
     抑制寡聚体形成的筛选
     为了检验肽抑制早期聚集的能力, 与 β-syn 肽孵化后收集 α-syn 的可溶性部 分。使用 SDS-PAGE 分离反应混合物, 然后使用特异性抗 α-syn 抗体进行蛋白印迹分析 (Santa-Cruz)( 图 4A)。随时间推移的寡聚体形成的初步测试显示孵化约 20 小时后检测 到大量寡聚体 ; 因此在该时间段后收集样品。β-syn 6 短肽 ( 我们的阳性对照肽 ) 和肽 β-syn 37 肽抑制纤维形成但不抑制寡聚体的形成, 而肽 β-syn 78 抑制寡聚体形成而不 抑制纤维形成。β-syn 36 肽对两种聚集类型的形成几乎均完全抑制 ( 图 4B)。
     实施例 5
     β-syn 36 肽和 α-syn 之间的亲和力的鉴定
     为了检验 β-syn 36 和 α-syn 单体间相互作用的亲和力, 使用在 β-syn 的 39 位处包含色氨酸而非酪氨酸的肽, 在荧光各向异性试验中利用其固有荧光。发现该肽以类 似于 β-syn 36 的方式抑制 α-syn 聚集 ( 未示出数据 )。将增加量的 α-syn 单体滴加至 β-syn 36 肽的溶液中并测定各向异性 ( 图 5B)。用于计算的亲和常数约为 1μM。
     实施例 6
     β-syn 36 的修饰肽抑制 α-syn 的聚集并提高血清稳定性为了提高血清中肽的半衰期, 可能对其进行改变以降低组织和血清蛋白酶和肽酶 的降解。 β-syn 36 为包含天然 L- 氨基酸的十聚体肽。 由于该肽易受蛋白水解性降解, 本发 明人设计了更稳定的衍生物 ( 参见上表 1)。为此目的, 设计了三种修饰肽 ; 第一种由 D- 氨 基酸代替 L- 氨基酸构成, 称为 β-syn 36D, 第二种为具有逆反氨基酸序列的类似物, 称为 逆反肽。为了抵消逆反肽末端的负电荷和正电荷, 合成了第三种 N 末端乙酰化和 C 末端酰 胺化的肽, 其为具有酰胺化和乙酰化的逆反肽。 猜测这些肽的修饰改变了先导肽的效能, 但 要求恢复其生物活性。为此目的, 使用 ThT 结合试验以有利于肽的摩尔比 1 ∶ 20, 1 ∶ 10 来测定所有三种肽对 α-syn 纤维形成的抑制, 并显示出与 β-syn 36 相似的生物效应 ( 图 5A)。
     随后, 使用新鲜小鼠脑匀浆模拟血清降解 2 小时来比较肽 β-syn 36 和修饰的逆 反肽的稳定性。图 6A- 图 6C 中的结果表明修饰肽的稳定性提高。
     实施例 7
     NMR 分析
     通过结合后化学位移的以下改变来确定参与 α-syn 分子间相互作用的残基。通 过使用 β-syn 36 逆反肽 ( 均为 D 氨基酸 ; R45T44K43S42G41V40Y39L38V37G36) 与 α-syn 相互作用 克服两个相同分子间的明显重叠。对肽的所有残基进行了鉴定并归属 ( 图 10)。在酰胺区 域未见到 R45 和 T44, 但在脂肪族区域被识别出。 在许多条件下测定了单独的肽以及与 α-syn 相互作用时的波谱 : 肽与蛋白的摩尔比为 1 ∶ 1 和 1 ∶ 5 ; 肽浓度为 160 和 400μM ; 温度为 4℃、 10℃、 20℃、 25℃和 37℃; 以及使用 Y39Wβ-syn 36 逆反类似物。在所有样品中, 某些 N 末端区域的酰胺信号在 R45 和 G41 之间丢失, 然而所有样品均显示在 β-syn 36 逆反肽与 α-syn 摩尔比为 1 ∶ 1, 160μM, 4℃, pH 的样品中得到的一般趋势 ( 以上图 7A 和图 7B- 图 7E 和表 4)。在残基 K43、 V40、 L38 和 G36 中化学位移显示强烈的偏移。为进一步突出 L38 和 G36 的重要性, 合成了缺少前三个氨基酸 G、 V 和 L 的 β-syn 36D 肽, 并通过 ThT 试验显示对 α-syn 聚集无抑制作用 ( 图 7F)。
     实施例 8
     哺乳动物细胞的肽内化
     为了获得 PD 的细胞模型, 首先对过表达野生型 α-syn 的 SH-SY5Y5 细胞进行视黄 酸处理, 以诱导细胞分化 (Lev 等, (2006)Neurosci Lett399(1-2), 27-32)。处理 8 天后, 在 新鲜生长培养中培养细胞 0.5-4 小时, 随后用 FITC 缀合的 β-syn 36 逆反肽 ( 绿色荧光 ) 孵化。孵化后, 对细胞进行洗涤、 固定和透化。使用 cy5 缀合的羊抗兔抗体 ( 紫色荧光 ) 检 测野生型 α-syn 的过表达, 并用鬼笔环肽试剂 ( 红色荧光 ) 标记细胞膜。使用 LSM-510 蔡 司共聚焦显微镜对荧光标记进行可视化 ( 图 8A- 图 8E)。检测了两种不同浓度的肽 -50μM 和 250μM, 显示相似的结果。孵化 30 分钟后, 肽未进入细胞。然而, 未检测到细胞粘附。孵 化 2 小时后检测到肽几乎都在细胞表面。浓度为 250μM 时, 在细胞内检测到少量。孵化 4 小时后, 明显注意到细胞内有肽存在。
     实施例 9
     β-syn 36 逆反肽对体内转基因果蝇系统的影响
     为了评估肽对存活有机体中 α-syn 的影响, 使用了 PD 的果蝇模型。 转基因果蝇通 过 Gal4-UAS 系统在其神经系统中过表达突变的 A53Pα-syn。这些果蝇的通常表型为运动缺陷 ; 正常果蝇往往会沿试管向上攀爬, 而这些果蝇则留在底部 (Ueda 等, (1993)Proc Natl Acad Sci U S A 90(23), 11282-11286)。 携带泛神经 elav-Gal4 驱动子 ( 在其 X 染色体上 ) 的雄果蝇与携带 UAS 调控的 A53T α-syn 转基因的雌果蝇杂交导致雌性后代在其神经系统 中表达 A53T α-syn。 在普通果蝇培养基或添加了 0.75mg/mLβ-syn 36 逆反肽的培养基中 进行杂交。监测果蝇的攀爬能力 27 天, 显示在第 27 天未处理的 PD 果蝇有 37%进行攀爬, 而处理的果蝇则有 66%进行攀爬, 与未处理组相比增加了 30%。肽对对照果蝇的运动没有 显著影响。这些结果表明使用 β-syn 36 逆反肽引起 A53T α-syn 果蝇的显著表型恢复。
     参考文献
     ( 其他参考文献引用在本文中 )
     1.Sipe, J.D.(1992)Annu Rev Biochem 61, 947-975
     2.Wetzel, R.(1994)Trends Biotechnol 12(5), 193-198
     3.Harrison, R.S., Sharpe, P.C., Singn, Y., and Fairlie, D.P.(2007)Rev Physiol Biochem Pharmacol(159), 1-77
     4.Sipe, J.D., and Cohen, A.S.(2000)J.Struct.Biol.(130), 88-98
     5.Rochet, J.C., Conway, K.A., and Lansbury, P.T., Jr.(2000)Biochemistry 39(35), 10619-10626
     6.Serpell, L.C.(2000)Biochim.Biophys.Acta(1502), 16-30
     7.Dobson, C.M.(2001)Philos.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci.(356), 133-144
     8.Gazit, E.(2002)Faseb J 16(1), 77-83
     9.Sacchettini, J.C., and Kelly, J.W.(2002)Nat Rev Drug Discov.(1), 267-275
     10.Kaytor, M.D., and Warren, S.T.(1999)J Biol Chem 274(53), 37507-37510
     11.Ferrone, F.(1999)Methods Enzymol 309, 256-274
     12.Bertoncini, C.W., Rasia, R.M., Lamberto, G.R., Binolfi, A., Zweckstetter, M., Griesinger, C., and Fernandez, C.O.(2007)J Mol Biol 372(3), 708-722
     13.Hsia, A.Y., Masliah, E., McConlogue, L., Yu, G.Q., Tatsuno, G., Hu, K., Kholodenko, D., Malenka, R.C., Nicoll, R.A., and Mucke, L.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci. U S A(96), 3228-3233
     14.Mucke, L., Masliah, E., Yu, G.Q., Mallory, M., Rockenstein, E.M., Tatsuno, G., Hu, K., Kholodenko, D., Johnson-Wood, K., and McConlogue, L.(2000)J.Neurosci. (20), 4050-4058
     15.Ashe, K.H.(2001)Learn.Mem.(8), 301-308
     16.Klein, W.L., Krafft, G.A., and Fincn, C.E.(2001)Trends Neurosci.(24), 219-224
     17.Westerman , M.A. , Cooper-Blacketer , D. , Mariash , A. , Kotilinek , L. , Kawarabayashi, T., Younkin, L.H., Carlson, G.A., Younkin, S.G., and Ashe, K.H.(2002) J Neurosci(22), 1858-1867
     18.Lesne, S., Koh, M., T., Kotilinek, L., Kayed, R., Glabe, C., G., Yang, A., Gallagher, M., and Ashe, K.H.(2006)Nature(440), 352-357
     19.Forno, L.S.(1996)J Neuropathol Exp Neurol 55(3), 259-27220.Thomas, B., and Beal, M.F.(2007)Hum Mol Genet 16 Spec No.2, R183-194
     21.Lotharius, J., and Brundin, P.(2002)Nat Rev Neurosci 3(12), 932-942
     22.Spillantini, M.G., Schmidt, M.L., Lee, V.M., Trojanowski, J.Q., Jakes, R., and Goedert, M.(1997)Nature 388(6645), 839-840
     23.Polymeropoulos, M.H., Lavedan, C., Leroy, E., Ide, S.E., Dehejia, A., Dutra, A., Pike, B., Root, H., Rubenstein, J., Boyer, R., Stenroos, E.S., Chandrasekharappa, S., Athanassiadou, A., Papapetropoulos, T., Johnson, W.G., Lazzarini, A.M., Duvoisin, R.C. , Di Iorio , G. , Golbe , L.I. , and Nussbaum , R.L.(1997)Science 276(5321) , 2045-2047
     24.Waxman, E.A., and Giasson, B.I.(2008)Biochim Biophys Acta
     25.Davidson, W.S., Jonas, A., Clayton, D.F., and George, J.M.(1998)J Biol Chem273(16), 9443-9449
     26.Weinreb, P.H., Zhen, W., Poon, A.W., Conway, K.A., and Lansbury, P.T., Jr.(1996)Biochemistry 35(43), 13709-13715
     27.El-Agnaf, O.M., Paleologou, K.E., Greer, B., Abogrein, A.M., King, J.E., Salem, S.A., Fullwood, N.J., Benson, F.E., Hewitt, R., Ford, K.J., Martin, F.L., Harriott, P., Cookson, M.R., and Allsop, D.(2004)Faseb J 18(11), 1315-1317
     28.Biere, A.L., Wood, S.J., Wypych, J., Steavenson, S., Jiang, Y., Anafi, D., Jacobsen, F.W., Jarosinski, M.A., Wu, G.M., Louis, J.C., Martin, F., Narhi, L.O., and Citron, M.(2000)J Biol Chem 275(44), 34574-34579
     29.Hashimoto, M., Hsu, L.J., Xia, Y., Takeda, A., Sisk, A., Sundsmo, M., and Masliah, E.(1999)Neuroreport 10(4), 717-721
     30.Jensen, P.H., Sorensen, E.S., Petersen, T.E., Gliemann, J., and Rasmussen, L.K.(1995)Biochem J310(Pt 1), 91-94
     31.Uversky, V.N., Li, J., Souillac, P., Millett, I.S., Doniach, S., Jakes, R., Goedert, M., and Fink, A.L.(2002)J Biol Chem 277(14), 11970-11978
     32.Windisch, M., Hutter-Paie r, B., Schreiner, E., and Wronski, R.(2004)J Mol Neurosci24(1), 155-165
     33.Volles, M.J., and Lansbury, P.T., Jr.(2007)J Mol Biol 366(5), 1510-1522
     34.Tsigelny, I.F., Bar-On, P., Sharikov, Y., Crews, L., Hashimoto, M., Miller, M.A., Keller, S.H, Platoshyn, O., Yuan, J.X., and Masliah, E.(2007)Febs J 274(7), 1862-1877
     35.Azriel, R., and Gazit, E.(2001)J.Biol.Chem.(276), 34156-34161
     36.Gazit, E.(2002)Bioinformatics(18), 880-883
     3 7 . P o r a t ,Y . ,K o l u s h e v a ,S . ,J e l i n e k ,R . ,a n d G a z i t ,E . ( 2 0 0 3 ) Biochemistry(42), 10971-10977
     38.Mazor, Y., Gilead, S., Benhar, I., and Gazit, E.(2002)J.Mol.Biol.(322), 1013-1024
     39.Reches, M., and Gazit, E.(2003)Science(300), 625-62740.Reches, M., and Gazit, E.(2004)Amyloid(11), 81-89
     41.Lev, N., Melamed, E., and Offen, D.(2006)Neurosci Lett 399(1-2), 27-32
     42.Feany, M.B., and Bender, W.W.(2000)Nature 404(6776), 394-398
     43.Ueda, K., Fukushima, H., Masliah, E., Xia, Y., Iwai, A., Yoshimoto, M., Otero, D.A., Kondo, J., Ihara, Y., and Saitoh, T.(1993)Proc Natl Acad Sci U S A 90(23), 11282-11286
     44.Kessler, J.C., Rochet, J.C., and Lansbury, P.T., Jr(2003)Biochemistry 42(3), 672-678
     45.Lee, H.J., Patel, S., and Lee, S.J.(2005)J Neurosci 25(25), 6016-6024
     46.Lee, H.J., Suk, J.E., Bae, E.J., Lee, J.H., Paik, S.R., and Lee, S.J.(2008) Int J Biochem Cell Biol 40(9), 1835-1849
     虽然结合具体实施方式对本发明进行描述, 但显然各种替代、 修改和变化对本领 域技术人员而言是显而易见的。因此, 其意图包括落入所附权利要求的精神和较宽范围中 的所有这样的替代、 修改和变化。
     许多疾病是由蛋白和多肽结构的遗传性或获得性修饰引起的。当成分蛋白经历 大小变化或形状变动并伴随所引起的自缔合及组织沉积例如淀粉样纤维时, 就会发生构象 病。
     在神经退行性疾病中, 蛋白沉积在一大类病因不同的疾病中的作用越来越明显, 包括阿尔茨海默氏病、 亨廷顿舞蹈症、 帕金森氏病、 克 - 雅二氏病、 朊病毒病和二型糖尿病。 在每一种不同的疾病中, 不同的内源性蛋白自组装成高度有序的纤维状结构。虽然在与这 些疾病中的每一种相关的蛋白之间无特定的序列同源性, 但是认为它们都涉及蛋白质中的 重要构象变化, 通常产生具有聚集成水不溶性纤维聚合物的强烈倾向的 β- 片层结构。
     帕金森氏病 (PD) 是继阿尔茨海默氏病 (AD) 后的第二最常见的神经退行性疾病, 其是一种无法治愈的破坏性的神经系统疾病, 侵袭 1-2%的老年人口。 神经病理学标志的特 征为在存活神经元中称为路易体 (LB) 和营养缺陷型路易神经炎 (LN) 的嗜酸性包涵体、 胞 浆内包涵体、 蛋白质包涵体的存在下, 黑质致密部 (substantia nigra pars compacta) 中 含有多巴胺能神经元的神经黑素的进行性和严重损失。PD 的临床特征为运动障碍, 其涉及 休息性震颤、 运动迟缓、 姿势不稳、 以及伴有非运动性症状如自主的、 认知的和精神病学问 题的强直。这些病理特征的原因尚未完全弄清, 但认为环境因素以及遗传原因或两者的结 合会导致上述临床综合征。 目前已知小于 10%的 PD 病例具有严格的家族性病因, 而多数病 例是散发性的。 在与家族性 PD 有关的突变中, 已被普遍表征的是 α- 核突触蛋白 (α-syn) 基因中的被称为 A53T、 A30P 和 E46K 的三个错义突变 [Lotharius, J., 和 Brundin, P.(2002) Nat Rev Neurosci 3(12), 932-942]。
     α-syn 蛋白由 140 个氨基酸残基组成。其是一种小而高电荷的天然非折叠蛋白。 最初确定其为 LB 和 LN 的主要组分。α-syn 能够分为三个主要区域 : 包含序列 KTKEGV 的 若干不完整重复的氨基末端区域、 称为非淀粉样组分 (NAC) 区域的疏水中心结构域以及特 征为高度带负电荷氨基酸的羧基末端。其在中枢神经系统 (CNS) 神经元中显著表达, 其位 于突触前末梢, 与突触囊泡接近并可通过形成两亲性 α- 螺旋而与类脂膜联系。
     α-syn 与 β- 突触核蛋白 (β-syn) 和 γ- 突触核蛋白 (γ-syn) 是突触核蛋白的 家族成员。β-syn 和 γ-syn 最初在脑组织中发现, 其主要位于突触前神经末梢, 而 α-syn 最初在外周神经系统和视网膜中发现, 然而也发现其在某些肿瘤组织中高度表达, 包括乳 腺、 卵巢和膀胱组织。
     三种突触核蛋白的序列高度保守, 尤其是在它们的 N 末端结构域中。当比较 α-syn 和 β-syn 的序列时, 在疏水中心结构域具有主要差异 ; β-syn 为 134 个氨基酸的蛋 白, 其缺少 α-syn 的 NAC 区域, 因此在不同的应激条件下 ( 如自由基或浓度升高 ) 不会聚 集形成淀粉样纤维。
     在多种神经退行性疾病的病例中, 个体突触核蛋白之间定量比例的改变发生以达 到 α- 突触核蛋白的相对比例增加的程度。可在体外检测到 β- 突触核蛋白能够以剂量依 赖的方式抑制 α- 突触核蛋白的聚集 (Hashimoto 等, Neuron 32(2) : 213-23[2001])。由
     α- 突触核蛋白过表达而引起正常细胞增殖和分化被破坏的细胞培养物的试验也显示了 β- 突触核蛋白在治疗意义上具有有利作用, 其使这些培养物中神经突的粘附、 存活和生长 进一步正常化。 α- 突触核蛋白转基因的小鼠显示该白蛋白的产生升高, 从而呈现出 α- 突 触核蛋白和 β- 突触核蛋白之间的数量比例被破坏。在衰老的过程中, 它们形成与路易体 相似的神经元内包涵体并且也表现出进行性运动障碍, 与帕金森氏病中的功能破坏相似。 如果将这些具有 α- 突触核蛋白的动物与具有 β- 突触核蛋白的转基因小鼠 ( 显示该白蛋 白的产生升高 ) 杂交, 显著升高的突触核蛋白总表达水平能够恢复稳态。因此, 包涵体数量 显著减少, 并且可完全防止特征神经元功能丧失。
     认为 α- 突触核蛋白在阿尔茨海默氏病的病理学中发挥了极其重要的作用。这由 这样的事实表明, 即该蛋白的一部分, NACP( 非淀粉样组分蛋白 ) 结构域, 显示为部分老年 斑 (Yoshimoto 等, Proc.Natl.Acad Sci 92, 9141-5[1995] 和 WO-9506407), 以及另外的事 实, 即在约 70%患有阿尔茨海默氏病的患者脑内的不同区域显示路易体, 还发现了 α- 突 触核蛋白 (Eizo 等, Neurosci.Lett.290(1), 41-4[2000])。在转基因小鼠模型中, β- 淀 粉样蛋白使 α- 突触核蛋白的聚集和神经毒性增加 (Masliah 等, Proc.Natl.Acad.Sci 98(21) : 12245-50[2001])。 已描述了 β- 突触核蛋白以及特别是由其衍生以破坏 α- 突触核蛋白聚集的肽。 参见, 例如, WO/02/04482 所述的八肽和 WO02/04625 中的三种另外的肽。WO002/0020 和 WO01/60794 描述了 β- 突触核蛋白作为完整分子的应用或增加其体内表达以治疗与 α- 突 触核蛋白相关的神经系统疾病的方法。特别是 WO-A-01/60794 还教导了使用相当于 β- 突 触核蛋白的 N 末端氨基酸 1 至 15 的肽, 以防止 α- 突触核蛋白和 β- 淀粉样蛋白聚集。同 样, US2006/0036073 和 US20080200397 教导了衍生自 β- 突触核蛋白的 N 末端氨基酸 1 至 15 的短肽片段, 以防止 α- 突触核蛋白和 β- 淀粉样蛋白的结合。U.S.20010047032 教导 了用于治疗淀粉样变性和 α- 突触核蛋白原纤维病的芳香族化合物。 Windisch 等教导了集 中于蛋白 N 末端氨基酸 1 至 15 的 β-syn 的缺失突变实验。他们创建了包含衍生自 β-syn 的该序列的氨基酸组合物不同变异的肽库, 其明确的目的是为了寻找能够立即用于治疗 性应用的或能够用作发展模拟肽小分子的基础的肽 (Windisch 等, 2004, J Mol Neurosci 24(1), 155-165)。
     发明内容 根据本发明的某些实施方式的一个方面, 提供了长度小于 20 个氨基酸的分离肽, 该肽包含氨基酸序列 GVLYVGSKTREGV(SEQ ID NO : 12)、 AAATGLVKREE(SEQ ID NO : 13) 或 GVVAAAEKTKQG(SEQ ID NO : 14)、 它们的模拟物和 / 或片段, 该肽能够抑制 α- 突触核蛋白聚 集。
     根据本发明的某些实施方式的一个方面, 提供了一种包含作为活性成分的如本发 明所述的肽以及药学上可接受的载体的药物组合物。
     根据本发明的某些实施方式的一个方面, 提供了一种抑制 α- 突触核蛋白聚集的 方法, 该方法包括使 α- 突触核蛋白与如本发明的肽接触, 从而抑制 α- 突触核蛋白聚集。
     根据本发明的某些实施方式的一个方面, 提供了一种治疗或预防与 α- 突触核蛋 白聚集有关的疾病的方法, 该方法包括向对其有需要的对象给予治疗有效量的本发明的
     根据本发明的某些实施方式的一个方面, 提供了一种包含作为活性成分的如本发 明所述的肽以及药学上可接受的载体的药物组合物。
     根据本发明的某些实施方式的一个方面, 提供了一种抑制 α- 突触核蛋白聚集的 方法, 该方法包括使 α- 突触核蛋白与如本发明的肽接触, 从而抑制 α- 突触核蛋白聚集。
     根据本发明的某些实施方式的一个方面, 提供了一种治疗或预防与 α- 突触核蛋 白聚集有关的疾病的方法, 该方法包括向对其有需要的对象给予治疗有效量的本发明的
     肽, 从而治疗与 α- 突触核蛋白聚集有关的疾病。
     根据本发明的某些实施方式的一个方面, 提供了一种检测 α- 突触核蛋白单体的 方法, 该方法包括 :
     (a) 在允许单体和所述肽之间形成复合物的条件下, 使所选的怀疑包含 α- 突触 核蛋白单体的生物样品与本发明的肽接触 ; 和
     (b) 检测该复合物的存在或水平, 从而检测 α- 突触核蛋白单体。
     根据本发明的某些实施方式, 该肽包含至少一个芳香族氨基酸。
     根据本发明的某些实施方式, 该肽包含至少一个碱性氨基酸。
     根据本发明的某些实施方式, 该肽包含至少一个 β- 断裂子氨基酸 (β-breaker amino acid)。
     根据本发明的某些实施方式, 该 β- 断裂子氨基酸是合成氨基酸。
     根据本发明的某些实施方式, 该 β- 断裂子氨基酸是天然存在的。
     根据本发明的某些实施方式, 该氨基酸序列包含至少一个 D- 氨基酸残基。
     根据本发明的某些实施方式, 该肽具有末端帽修饰。
     根据本发明的某些实施方式, 该肽包含 KTR 或其模拟物。
     根据本发明的某些实施方式, 该肽包含 KTRE 或其模拟物。
     根据本发明的某些实施方式, 该肽包含 KTREG 或其模拟物。
     根据本发明的某些实施方式, 该肽选自由 SEQ ID NO : 1、 2、 3、 4、 8、 9、 10、 12 和 13 组 成的组。
     根据本发明的某些实施方式, 该肽选自由 SEQ ID NO : 5 和 6 组成的组。
     根据本发明的某些实施方式, 该肽选自由 SEQ ID NO : 1、 2、 3 和 4 组成的组。
     根据本发明的某些实施方式, 所述疾病选自由帕金森氏病 (PD)、 阿尔茨海默氏病 (AD)、 弥漫性路易体病、 混合性 AD-PD、 多系统萎缩和哈 - 斯二氏病组成的组。
     除非另有定义, 本文中使用的所有技术和 / 或科学术语与本发明涉及的本领域普 通技术人员所公知的术语具有相同的含义。 虽然与本文描述相似或等同的方法或材料可用 于实施或测试本发明的实施方式, 但在下文中叙述了示例性方法和 / 或材料。在发生冲突 的情况下, 以专利说明书 ( 包括定义 ) 为准。此外, 材料、 方法和实施例仅仅是描述性的, 并 非意图做必要的限制。 附图说明
     本文中仅以举例的方式参照附图对本发明进行描述。 本文中对附图的详细内容进 行具体参考, 是强调以实施例的方式显示详细内容并且仅意图对本发明的优选实施方式进 行描述性讨论, 并且是为了提供认为最有用和最容易理解的本发明的原理说明和概念层面 而提出的。 在这方面, 与基本理解本发明所必需的细节相比, 未试图更加详细地显示本发明 的结构细节, 结合附图进行的描述使得如何使本发明的几种形式在实施中体现对本领域技 术人员是显而易见的。
     在图中 :
     图 1A- 图 1D 是作为 α-syn 聚集抑制剂的 β 衍生肽的示意图。图 1A.β-syn 抑 制 α-syn 聚集的形成。图 1B. 使用肽阵列分析进行 β-syn 结合序列对 α-syn 的分子定位。图 1C. 潜在的基于肽的 α-syn 聚集抑制剂。图 1D. 肽阵列技术的示意图 (http:// worldwidewebdotjptdotcom/products/peptidearrays/pepspotsdothtm)。
     图 2A- 图 2B 是 β-syn 蛋白内的 α-syn 结合序列的筛选结果照片。图 2A : 在纤 维素膜上合成与 β-syn 的连续重叠序列相对应的十聚体肽, 并与 β-syn 孵化。α-syn 序 列中每个斑点的序列及其位置在斑点下方提及。在前十五个氨基酸中, 有一个氨基酸在该 十聚体肽内移位。余下的有五个氨基酸移位。图 2B. 使用严格条件进行了另一个筛选, 一 个氨基酸沿整条蛋白移位。此处将氨基酸序列提供如下。
     MDVFMKGLSM-SEQ ID NO : 23
     DVFMKGLSMA-SEQ ID NO : 24
     VFMKGLSMAK-SEQ ID NO : 25
     FMKGLSMAKE-SEQ ID NO : 26
     MKGLSMAKEG-SEQ ID NO : 27
     KGLSMAKEGV-SEQ ID NO : 28
     GLSMAKEGVV-SEQ ID NO : 29
     LSMAKEGVVA-SEQ ID NO : 30
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    SMAKEGVVAA-SEQ MAKEGVVAAA-SEQ AKEGVVAAAE-SEQ KEGVVAAAEK-SEQ EGVVAAAEKT-SEQ GVVAAAEKTK-SEQ VVAAAEKTKQ-SEQ VAAAEKTKQG-SEQ KTKQGVTEAA-SEQ VTEAAEKTKE-SEQ EKTKEGVLYV-SEQ GVLYVGSKTR-SEQ GSKTREGVVQ-SEQ EGVVQGVASV-SEQ GVASVAEKTK-SEQ LGGAVFSGAG-SEQ FSGAGNIAAA-SEQ NIAAATGLVK-SEQ TGLVKREEFP-SEQ REEFPTDLKP-SEQ TDLKPEEVAQ-SEQ EEVAQEAAEE-SEQ EAAEEPLIEP-SEQ PLIEPLMEPE-SEQID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID IDNO : 31 NO : 32 NO : 33 NO : 34 NO : 35 NO : 8 NO : 9 NO : 10 NO : 36 NO : 37 NO : 38 NO : 1 NO : 40 NO : 41 NO : 7 NO : 11 NO : 42 NO : 43 N: 44 NO : 45 NO : 46 NO : 47 NO : 48 NO : 49LMEPEGESYE-SEQ ID NO : 50
     GESYEDPPQE-SEQ ID NO : 51
     DPPQEEYQEY-SEQ ID NO : 52
     EYQEYEPEA-SEQ ID NO : 53
     VLYVGSKTRE-SEQ ID NO : 2
     LYVGSKTREG-SEQ ID NO : 3
     YVGSKTREGV-SEQ ID NO : 4
     AAATGLVKRE-SEQ ID NO : 5
     AATGLVKREE-SEQ ID NO : 6
     图 3A- 图 3K 为描绘了 α-syn 纤维装配的体外抑制的照片和图表。图 3A. 筛选出 对 α-syn 聚集有抑制作用的 β-syn 肽 ( 摩尔比为 20 ∶ 1)。图 3B. 在肽 36 和 39(SEQ ID NO : 1 和 4) 的存在下, α-syn 聚集的动力学分析。对照为 ( ◆ ), 肽 β-syn 39 与 α-syn 为 ( ▲ ), 肽 β-syn 36 与 α-syn 为 ( ■ )。图 3C. 肽 β-syn 36 对 α-syn 聚集的剂量依 赖性抑制作用。图 3D- 图 3K. 具有若干肽的 α-syn 原纤维 TEM 图像 ; 仅有 α-syn、 β-syn 6 短肽、 36、 37、 38、 39、 77、 78。6 短肽、 37 和 38 条带= 500nM。余下的肽条带= 1μM。 图 4A- 图 4B 为抑制剂存在和不存在时, α-syn 聚集的生化分析结果的照片。图 4A. 随着时间推移的 α-syn 的聚集。37C 下摇动时形成可溶性寡聚体。使用蛋白印迹分析 进行检测。图 4B. 使用 β-syn 肽孵化 24 小时后对寡聚体装配的抑制作用。使用蛋白印迹 分析进行检测。
     图 5A- 图 5B 为描述 β-syn 修饰肽的分析的图表。图 5A. 使用 ThT 荧光试验检测 对 α-syn 纤维装配的抑制作用。 筛选三种对 α-syn 聚集有抑制作用的 β-syn 36 修饰肽。 仅有 α-syn 为黑色, β-syn 36 与 α-syn 为深灰色, 修饰肽和 α-syn 为浅灰和白色, 顺序 从左至右为 β-syn 36D、 逆反肽 (retro-inverso)、 酰胺化和乙酰化的逆反肽。α-syn : 肽 的摩尔比分别为 1 ∶ 20 和 1 ∶ 10。图 5B. 使用荧光各向异性法测定包含色氨酸而非酪氨 酸的 β-syn36 与 α-syn 单体的亲和力。Kd = 1μM。
     图 6A- 图 6C 为 HPLC 谱图, 其描绘了在小鼠脑提取物中肽的稳定性。对 WT ICR 小 白鼠的脑提取物进行提取, 并与肽 β-syn 36 和 β-syn 36 逆反肽孵化两小时, 并在 C18 色 谱柱上载样。图 6A. 小鼠脑提取物的图谱 ( 红色 )。图 6B.β-syn 36 肽 ( 蓝色 ) 和与脑提 取物孵化的 β-syn 36 肽 ( 红色 ) 的图谱。图 6C.β-syn 36 逆反肽 ( 蓝色 ) 和与脑提取 物孵化的 β-syn 36 逆反肽 ( 红色 ) 的图谱。
     图 7A- 图 7F 为随后的 NMR 分析的图表和图谱。结合了 α-syn 后的逆反肽的骨架 原子 Ha( 灰色 ) 和 HN( 黑色 ) 化学位移偏移 ( 图 7A) ; 结合后 ( 绿色 )β-syn 衍生的逆反肽 ( 红色 ) 和 α-syn( 蓝色 ) 的 TOCSY 图谱重叠的 Ha-HN 区域 ( 图 7B), 并且结合后显示偏离 的所有逆反肽峰发生扩张 ( 图 7C- 图 7E)。在 α-syn 36D 和缺少氨基酸 G、 V、 L 的 β-syn 36D 短肽存在和不存在时, α-syn 的 ThT 分析 ( 图 7F)。
     图 8A- 图 8E 为描绘了 β-syn 36 逆反肽进入细胞的内化作用的照片。使用 50μM 和 250μM 结合了 FITC 的 β-syn 36 逆反肽对过表达 WT α-syn 细胞的分化型 SHSY5Y 孵 化 0.5 小时、 2 小时和 4 小时。固定后, 检测细胞中 FITC 结合肽 ( 绿色 ) 的存在。使用 cy5 结合抗体 ( 紫色 ) 检测细胞 α-syn, 并用鬼笔环肽标记膜 ( 红色 )。( 图 8A)37℃下 30 分
     钟后, 没有肽染色 ( 绿色 )。( 图 8B- 图 8C) 孵化 2 小时后, 在细胞内未检测到或仅检测到 少量肽 ( 绿色 )。( 图 8D- 图 8E) 孵化 4 小时后, 在细胞内明确检测到肽。使用 LSM-510 蔡 司共聚焦显微镜使肽的内化可视化。
     图 9 为描绘了果蝇运动攀爬行为的分析结果的条形图。用攀爬试验对四种果蝇进 行分析, 每种包含五支试管, 每支试管十只果蝇。在常规培养基上生长并表达 α-syn A53T 的雌性后代为黑色。在含有 β-syn 逆反肽的培养基上生长并表达 α-syn A53T 的雌性后 代为灰色。在常规培养基上生长的对照雌性后代为条纹线。在含有 β-syn 逆反肽的培养 基上生长的对照雌性后代为白色。结果显示了沿试管攀爬 20 秒以上的果蝇百分比。
     图 10 为 β-syn 36 逆反肽的 NMR 归属图谱 : 在相同条件下 ( 根据该条件进行归 属 ) 采集的 TOCSY( 红色 ) 和 NOESY( 绿色 ) 谱的 HN-Ha 相互作用区域的重叠。 具体实施方式
     本发明的某些实施方式涉及用于治疗和预防神经退行性疾病的组合物及方法。
     在详细解释本发明的至少一个实施方式之前, 应理解本发明并非将其应用限于如 下说明书所陈述的或由实施例举例说明的细节。 本发明可有其他实施方式或以不同方式实 施或进行。 α- 突触核蛋白的细胞内寡聚化与帕金森氏病和其他神经退行性疾病有关, 因此 被认为是疾病的病情改善疗法的重要靶标。
     由于 β- 突触核蛋白已表现出以剂量依赖方式抑制 α- 突触核蛋白的聚集, 本发 明人将整条 β-syn 的序列进行系统性地定位以确定具有介导 β-syn 和 α-syn 的分子识 别事件潜力的所有结构域。使用常见的肽阵列技术并发现了若干相互作用区域 ( 图 2A)。 使用第二张膜以在严格条件下证实这些结果 ( 图 2B), 该严格条件可准确定位出现在两张 膜上的斑点。合成了与相互作用区域相对应的十聚体肽, 并且使用 ThT 和 TEM 试验测试了 其抑制 α-syn 聚集的能力。两种方法均显示相关的结果, 表明该肽对原纤维形成具有抑制 作用 ( 图 3A- 图 3K)。
     本发明人进一步示出了某些肽仅能够抑制一种类型的聚集, 而其他肽能够抑制蛋 白的可溶性和不溶性聚集 ( 图 4)。
     为了将分子识别模块发展成为药物候选物, 设计了最好的肽抑制剂的逆反类似 物。虽然该肽与天然肽相比显示出难以区分的活性, 但显示其在人血清中是稳定的 ( 图 6A- 图 6C) 并且可穿透过表达 α- 突触核蛋白的细胞 ( 图 8A- 图 8E)。 NMR 分析定位了 D- 氨 基酸肽和 α- 突触核蛋白间相互作用的交会处 ( 界面, interface)( 图 7A- 图 7F)。最后, 将该肽给予表达突变型 A53T α- 突触核蛋白的果蝇模型导致所处理的果蝇攀爬表型显著 改善 ( 图 9)。 本发明人提出根据本发明的教导而生成的改造肽能够作为发展新型治疗剂的 先导, 以治疗通常的神经退行性疾病, 特别是帕金森氏病。
     本 发 明 的 实 施 方 式 提 供 长 度 小 于 20 个 氨 基 酸 的 分 离 肽, 该 肽 包 含 β- 突 触 核 蛋 白 的 氨 基 酸 序 列 GVASVAEKTK(SEQ ID NO : 7)、 GVLYVGSKTREGV(SEQ ID NO : 12)、 AAATGLVKREE(SEQ ID NO : 13) 或 GVVAAAEKTKQG(SEQ ID NO : 14)、 它们的模拟物和 / 或片段, 该肽能够抑制 α- 突触核蛋白聚集。
     如本文中所使用的, “β- 突触核蛋白” 是指 SNCB 基因的蛋白产物, 该 SNCB 基因的
     GenBank 登陆号为 NP_001001502.1(SEQ ID NO : 15)、 NP_003076.1(SEQ ID NO : 16)。
     短语 “能够抑制 α- 突触核蛋白聚集” 是指使 α- 突触核蛋白聚集 ( 例如, 寡聚化 和 / 或纤维形成 ) 降低至少 10%, 更优选至少 20%, 更优选至少 30%, 更优选至少 40%, 更 优选至少 50%, 更优选至少 60%, 更优选至少 70%, 更优选至少 80%, 更优选至少 90%, 更 优选至少 100%的能力。 根据一个实施方式, 本发明这方面的肽能够抑制 α- 突触核蛋白聚 集。
     如本文中所使用的, 术语 “原纤维” 是指细线样的丝状结构, 在电子显微镜下通常 可见其由高度有序的聚集体构成。
     在实施例 3( 通过透射电子显微镜 (TEM) 分析 )、 实施例 4( 通过蛋白印迹分析 ) 和 实施例 6 中 (ThT 结合试验 ) 描述了监测本发明所述的肽下调 α- 突触核蛋白聚集的方法。 其他方法在美国专利第 6,184,351 号以及美国专利申请第 2002151464 号和第 20030027210 号中提供, 将其全部内容以引用方式并入本文。
     术语 “分离的” 是指从生理环境或分离或基本上没有其他生物材料。
     本文中所使用的术语 “肽”包 括 天 然 肽 ( 降 解 产 物、 以合成方法合成的肽或 重 组 肽 ) 和 模 拟 肽 ( 通 常 为 以 合 成 方 法 合 成 的 肽 ), 以 及 类 肽 (peptoid) 和 半 类 肽 (semipeptoid), 其为肽类似物, 可具有例如使肽在体内更稳定的修饰。这类修饰包括但 不限于 N 末端修饰, C 末端修饰, 肽键修饰, 包括但不限于 CH2-NH、 CH2-S、 CH2-S = O、 O= C-NH、 CH2-O、 CH2-CH2、 S = C-NH、 CH = CH 或 CF = CH, 骨架修饰, 和残基修饰。 制备模拟肽化 合物的方法是本领域公知的, 并且在例如 Quantitative Drug Design, C.A.Ramsden Gd., Chapter 17.2, F.Choplin Pergamon Press(1992) 中具体说明, 此处以引用方式并入本文, 如同本文完全阐述。这方面的进一步详细情况提供如下。其他修饰 ( 例如, 末端加帽 ) 进 一步描述如下。
     所述肽的长度可为 2-20、 2-15、 4-15、 5-15、 4-10 和 5-10 个氨基酸残基。因此, 该 肽可由 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19 或 20 个氨基酸残基构成。
     因此, 该肽可包含以下的示例性肽或由以下的示例性肽组成 :
     36-46.GVLYVGSKTR(SEQ ID NO : 1)
     37-47.VLYVGSKTRE(SEQ ID NO : 2)
     38-48.LYVGSKTREG(SEQ ID NO : 3)
     39-49.YVGSKTREGV(SEQ ID NO : 4)
     77-87.AAATGLVKRE(SEQ ID NO : 5)
     78-88.AATGLVKREE(SEQ ID NO : 6)
     51-61.GVASVAEKTK(SEQ ID NO : 7)
     14-24.GVVAAAEKTK(SEQ ID NO : 8)
     15-25.VVAAAEKTKQ(SEQ ID NO : 9)
     16-26.VAAAEKTKQG(SEQ ID NO : 10)
     根 据 示 例 性 的 实 施 方 式,该 肽 不 是 YVGSKTREGVV(SEQ ID NO : 17) ; VAAAEKTKQGV(SEQ ID NO : 18), LS(SEQ ID NO : 19), GL(SEQID NO : 20) 和 KEG(SEQ ID NO : 21), 尽管根据本教导, 这些肽中的至少一些能够用于治疗性应用中。
     根据另外的实施方式, 该肽包含氨基酸序列 KTR(SEQ ID NO : 58) 或由氨基酸序列KTR(SEQ ID NO : 58) 组成。
     根据另外的实施方式, 该肽包含氨基酸序列 KTRE(SEQ ID NO : 59) 或由氨基酸序列 KTRE(SEQ ID NO : 59) 组成。
     根据另外的实施方式, 该肽包含氨基酸序列 KTRG(SEQ ID NO : 60) 或由氨基酸序列 KTRG(SEQ ID NO : 60) 组成。
     肽内的肽键 (-CO-NH-) 可被以下键所代替, 例如 N- 甲基化键 (-N(CH3)-CO-)、 酯 键 (-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)、 酮 亚 甲 基 键 (-CO-CH2-)、 α- 氮 杂 键 (-NH-N(R)-CO-) 其中 R 为任意烷基例如甲基、 卡巴键 ( 碳胺键, carba bond)(-CH2-NH-)、 羟基亚乙基键 (-CH(OH)-CH2-)、 硫代酰胺键 (-CS-NH-)、 烯族双键 (-CH = CH-)、 逆酰胺键 (-NH-CO-)、 肽衍 生物 (-N(R)-CH2-CO-) 其中 R 是天然存在于碳原子上的 “正常” 侧链, 。
     这些修饰可在沿肽链的任意键上发生, 甚至同时在若干 (2-3 个 ) 个键上发生。
     芳香族氨基酸可以是任何天然存在的或合成的芳香族残基, 包括但不限于苯丙氨 酸、 酪氨酸、 色氨酸、 苯基甘氨酸或它们的修饰体、 前体或功能性芳香部分。如下的表 2 中提 供了能够形成本发明的肽的一部分的芳香族残基的实例。
     因此, 天然芳香族氨基酸 Trp、 Tyr 和 Phe 可被合成的非天然氨基酸置换, 如苯基甘 氨酸、 Tic, 萘基丙氨酸 (Nal)、 苯基异丝氨酸、 苏氨醇 (threoninol)、 Phe 的环状甲基化衍生 物、 Phe 的卤化衍生物或 o- 甲基 -Tyr。 除上述以外, 本发明的肽还可包括一个或多个修饰氨基酸或一个或多个非氨基酸 单体 ( 例如, 脂肪酸、 复杂碳水化合物, 等 )。
     如在本文说明书和权利要求书部分所使用的, 术语 ( 一种或多种 )“氨基酸” 应理 解为包括 20 种天然存在的氨基酸 ; 那些经常在体内翻译后修饰的氨基酸, 包括例如, 羟脯 氨酸、 磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸 ; 以及其他罕见的氨基酸, 包括但不限于 2- 氨基己二酸、 羟 基赖氨酸、 异锁链赖氨素、 正缬氨酸、 正亮氨酸和鸟氨酸。此外, 术语 “氨基酸” 包括 D- 和 L- 氨基酸。
     所述肽还可包含保守的氨基酸取代, 其可包括天然存在的保守取代或合成取代, 见于例如 Karlin, S. 和 Ghandour, G., (1985), Multiple alphabet amino acid sequence comparison of the immunoglobulin κchain constant domain.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.82, 8597-8601。
     氨基酸分类 :
     按化学性质 : 酸性 (DE)、 脂肪族 (AGILV)、 酰胺 (NQ)、 芳香族 (FWY)、 碱性 (RHK)、 羟 基 (ST)、 亚氨基 (imino)(P)、 硫 (CM) ;
     按功能 : 酸性、 碱性、 疏水性 (A、 I、 L、 M、 F、 P、 W、 V)、 极性 (N、 C、 Q、 G、 S、 T、 Y) ;
     按电荷 : 酸性、 碱性、 中性 ;
     按结构 : 不定的 (A、 C、 G、 P、 S、 T、 W、 Y)、 外部的 (R、 N、 D、 Q、 E、 H、 K)、 内部的 (I、 L、 M、 F、 V)。
     单个氨基酸编码提供如下。
     以下表 1 和表 2 列出了可用于本发明的天然存在的氨基酸 ( 表 1) 和非常规的或 修饰的氨基酸 ( 例如, 合成的, 表 2)。
     表1
     10102348720 A CN 102348739
     单字母符号 A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V X
    
    
    说明书氨基酸 丙氨酸 精氨酸 天冬酰胺 天冬氨酸 半胱氨酸 谷氨酰胺 谷氨酸 甘氨酸 组氨酸 异亮氨酸 亮氨酸 赖氨酸 甲硫氨酸 苯丙氨酸 脯氨酸 丝氨酸 苏氨酸 色氨酸 酪氨酸 缬氨酸 任意上述氨基酸9/28 页三字母缩写 Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His Iie Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val Xaa表2
    由于本发明的肽优选用于治疗或诊断, 需要肽为可溶性形式, 因此本发明所述的 肽可包括一个或多个非天然或天然极性氨基酸, 包括但不限于丝氨酸和苏氨酸, 由于它们
     的含羟基侧链从能够增加肽的溶解度。
     本发明的某些实施方式中所述的肽包含至少 1 个、 2 个、 3 个、 4 个或更多个碱性氨 基酸残基, 以增强与 α- 突触核蛋白的结合。根据示例性的实施方式, 碱性氨基酸位于肽的 末端 (C 和 / 或 N)。
     根据本发明某些实施方式的肽包括至少一个 β- 片层阻断子氨基酸残基, 其位于 如下所述的肽序列中。包括这样的 β- 片层阻断子氨基酸的肽保留了对 α- 突触核蛋白 多肽的识别但防止其聚集。根据本发明的一个实施方式, β- 片层阻断子氨基酸是天然存 在的氨基酸, 如脯氨酸, 其特征为约 -60 至 +25 度的有限 通常 β- 片层的 角而不是约 -120 至 -140 度的角, 从而破坏 α- 突触核蛋白纤维的 β- 片层结构。其他的 β- 片层阻断子氨基酸残基包括但不限于天冬氨酸、 谷氨酸、 甘氨酸、 赖氨酸和丝氨酸 ( 根据 Chou 和 Fasman(1978)Annu.Rev.Biochem.47, 258)。
     根据本发明的该方面的另一个实施方式, β- 片层阻断子氨基酸残基为合成氨 基 酸, 如 Cα- 甲 基 化 氨 基 酸, 其 构 象 约 束 受 到 限 制 [Balaram, (1999)J.Pept.Res.54, 195-199]。与天然氨基酸不同, Cα- 甲基化氨基酸具有与 Cα 连接的氢原子, 这在很大程度 上影响其与酰胺键的
    和 ψ 角相关的空间特性质, 并更加有效地介导其治疗效果。β- 片层阻断子氨基酸或芳香族氨基酸可以位于肽内的任意位置 (N 末端、 C 末端、 或 N 或 C 端位于其两侧的区域 )。
     根据本发明的示例性实施方式, 所述肽具有末端帽修饰。
     如本文中所使用的, 短语 “末端帽子修饰的肽” 是指在其 N-( 氨基 ) 末端和 / 或在 C-( 羧基 ) 末端处被过修饰的肽。末端帽修饰是指将化学部分连接于末端以形成帽结构。 在本文中, 这样的化学部分是指末端帽部分, 在本文及本领域中也通常可互换地指代肽保 护部分或基团。
     如本文中所使用的, 短语 “末端帽部分”是指当连接于肽的末端时修饰末端帽 的部分。末端帽修饰通常导致肽末端电荷的掩蔽, 和 / 或其化学特性的改变, 如疏水性、 亲水性、 反应性、 溶解性等。适合用于肽末端帽修饰的部分的实例可见于, 例如, Green 等, ″ Protective Groups in Organic Chemistry ″, (Wiley, 2.sup.nd ed.1991) 和 Harrison 等, ″ Compendium of Synthetic Organic Methods″, Vols.1-8(John Wiley 和 Sons, 1971-1996)。 N 末端的末端帽部分的代表性实例包括, 但不限于, 甲酰基、 乙酰基 ( 本文中也表 示为 “Ac” )、 三氟乙酰基、 苄基、 苄氧羰基 ( 本文中也表示为 “Cbz” )、 叔丁氧羰基 ( 本文中 也表示为 “Boc” )、 三甲基硅基 ( 也表示为 “TMS” )、 2- 三甲基硅基 - 乙烷磺酰基 ( 也表示 为 “SES” )、 三苯甲基和取代的三苯甲基、 烯丙基氧羰基、 9- 芴甲氧羰基 ( 本文中也表示为 “Fmoc” )、 以及硝基 - 藜芦基氧羰基 (“NVOC” )。
     C- 末端的末端帽部分的代表性实例通常为导致 C- 末端处的羧基酰化的部分包 括, 但不限于, 苄基和三苯基醚、 以及烷基醚、 四氢吡喃基醚、 三烷基硅基醚、 烯丙基醚、 单甲 氧基三苯甲基和二甲氧基三苯甲基。可替代地, C- 末端末端帽结构的 -COOH 基可被修饰成 酰胺基。
     肽的其他末端帽修饰包括用不同的部分代替氨基和 / 或羧基, 如羟基、 巯基、 卤
     素、 烷基、 芳基、 烷氧基、 芳氧基等, 如本文中所定义的术语。
     可进一步通过芳香性对末端帽部分进行分类。因此, 末端帽部分可以是芳香性或 非芳香性的。
     适合 N- 末端修饰的非芳香性末端帽部分的代表性实例包括, 但不限于, 甲酰基、 乙酰基、 三氟乙酰基、 叔丁氧羰基、 三甲基硅基、 和 2- 三甲基硅基 - 乙烷磺酰基。适合 C- 末 端修饰的非芳香性末端帽部分的代表性实例包括, 但不限于, 酰胺类、 烯丙基氧羰基、 三烷 基硅基醚和烯丙基醚。
     适合 N- 末端修饰的芳香性末端帽部分的代表性实例包括, 但不限于, 芴甲氧羰基 (Fmoc)。适合 C- 末端修饰的芳香性末端帽子部分的代表性实例包括, 但不限于, 苄基、 苄氧 羰基 (Cbz)、 三苯甲基和取代的三苯甲基。
     应理解, 由于在治疗中使用短肽的主要障碍之一是立体特异性细胞蛋白酶对 其进行蛋白水解降解, 本发明所述的肽能够由天然氨基酸的 D- 异构体合成 [ 即, 反肽 类 似 物, Tjernberg(1997)J.Biol.Chem.272 : 12601-5, Gazit(2002)Curr.Med.Chem.9 : 1667-1675]。
     另外, 本发明所述的肽包括其逆 (retro) 类似物、 反 (inverso) 类似物和逆反 (retro-inverso) 类似物。应理解, 通常发现激素的完整或扩充 (extended) 的部分逆反类 似物保留或增强了生物活性。也发现逆反作用 (retro-inversion) 可应用于合理设计酶抑 制剂的领域 ( 参见美国专利第 6,261,569 号 )。 如本文中所使用的, “逆肽” 是指由 L- 氨基酸残基构成的肽, 其按照与天然肽序列 相反的方向进行装配。
     天然存在多肽的逆反修饰涉及具有与相应的 L- 氨基酸立体化学相反的 α- 碳的 氨基酸的合成装配, 即, D- 或 D- 别 - 氨基酸 (D-allo-amino acid) 以与天然肽序列相反的 顺序装配。 因此, 逆反类似物具有反转的末端及方向相反的肽键, 而基本上保持侧链的拓扑 结构与天然肽序列相同。
     应进一步了解, 在本发明所述肽的 N 末端或 C 末端添加诸如胆酰基的有机基团能 够提高治疗肽的效力和生物利用度 ( 例如, 穿过血脑屏障 )[Findeis(1999)Biochemistry 38 : 6791-6800]。
     最近开发的用于穿过 BBB 的系统被称为受体介导的转运 (Receptor Mediated Transport, RMT)。 该 系 统 使 用 模 拟 肽 单 克 隆 抗 体 (Mab’ s) 以 帮 助 大 分 子 穿 过 BBB[Pardridge WM.Pharm Res 2007 ; 24(9) : 1733-44]。这些 Mab’ s 可与所关注的肽结合 或与所关注的肽融合, 然后使用内源性受体以穿过 BBB 进入。
     根据一个实施方式, 将本发明所述的肽连接于缓释增强剂。典型的缓释增强剂 包括, 但不限于透明质酸 (HA)、 褐藻酸 (AA)、 聚羟乙基丙烯酸甲酯 (Poly-HEMA)、 聚乙二醇 (PEG)、 甘醇二甲醚 (glyme) 和聚异丙基丙烯酰胺。
     本发明所述肽的氨基酸序列组分与其他非氨基酸物质的连接可通过共价键连接, 通过非共价复合, 例如与能够被降解或裂解而产生能够持续释放的化合物的疏水聚合物复 合; 通过将肽的氨基酸部分包埋在脂质体或胶束内以产生本发明所述的最终肽。可通过将 氨基酸序列包埋在其他组分 ( 脂质体, 胶束 ) 中或将氨基酸序列注入聚合物中来实现结合 以产生本发明所述的最终肽。
     本发明所述化合物可以是线性或环状的 ( 环化可提高稳定性 )。可通过本领域任 何已知手段进行环化。当化合物主要由氨基酸构成时, 环化可经由 N 末端至 C 末端、 N 末端 至侧链和 N 末端至骨架、 C 末端至侧链、 C 末端至骨架、 侧链至骨架和侧链至侧链、 以及骨架 至骨架环化。肽的环化也可通过肽中包括的非氨基酸有机部分进行。
     本发明所述的肽可生化合成, 例如通过使用标准固相技术。这些方法包括专有的 (exclusive) 固相合成法、 部分固相合成法、 片段缩合法、 经典溶液合成法。 固相多肽的合成 步骤是本领域公知的, 并且在 John Morrow Stewart 和 Janis Dillaha Young, Solid Phase Polypeptide Syntheses(2nd Ed., Pierce Chemical Company, 1984) 中进一步描述。
     合成的肽可通过制备性高效液相色谱进行纯化 [Creighton T.(1983)Proteins, structures and molecular principles.WH Freeman and Co.N.Y.], 其组成能够通过氨基 酸测序得到证实。
     重组技术也可用于生成本发明所述的肽。为了利用重组技术产生本发明的肽, 将 编码本发明所述肽的多聚核苷酸连接 (ligate) 至核酸表达载体中, 其包括在顺式调节序 列 ( 例如, 启动子序列 ) 的转录调控下的多聚核苷酸序列, 适合在宿主细胞中进行构成性 的、 组织特异性的或诱导性的本发明所述多肽的转录。
     除了可在宿主细胞中合成, 也可用体外表达系统合成本发明所述的多肽。这些方 法是本领域公知的, 并且该系统的组件是可商购获得的。
     本发明某些实施方式中的肽可用于治疗或预防与 α- 突触核蛋白相关的疾病 ( 即, 发病和进展与 α- 突触核蛋白的聚集相关的疾病 )。这样的疾病的实例包括但不限于 神经退行性疾病, 尤其是阿尔茨海默氏病、 阿尔茨海默氏病的路易体变异型、 帕金森氏病、 多系统萎缩、 路易体痴呆和亨廷顿舞蹈症。
     可将肽单独提供给个体, 或作为药物组合物与药学上可接受的载体混合后提供给 个体。
     如本文中所使用的, “药物组合物” 是指一种或多种本文中描述的活性成分与其他 化学成分如生理合适的载体和赋形剂形成的制剂。 药物组合物的目的是为了便于将化合物 给予有机体。
     本文中的术语 “活性成分” 是指肽制剂, 其是产生生物效应的原因。
     在下文中, 短语 “生理上可接受的载体” 和 “药学上可接受的载体” 可互换使用, 指 代不会引起对有机体的明显刺激并且不消除所给予化合物的生物活性和性质的载体或稀 释剂。佐剂包括在这些短语中。药学上可接受的载体中包括的成分之一可以是例如聚乙 二醇 (PEG), 其为生物相容性的聚合物, 在有机和水性介质中具有较大的溶解度 (Mutter 等 (1979))。
     本文中的术语 “赋形剂” 是指加入到药物组合物中以进一步便于活性成分的给予 的惰性物质。赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、 磷酸钙、 各种糖和各种类型的淀粉、 纤维 素衍生物、 明胶、 植物油和聚乙二醇。
     药物的配制和给予技术可参见 “Remington’ s Pharmaceutical Sciences” Mack Publishing Co., Easton, PA, 最新版, 此处以引用方式结合于本文。
     适合的给予途径可包括例如口服、 直肠、 经粘膜 ( 尤其是经鼻、 经肠 ) 或肠胃外递 送, 包括肌内、 皮下和髓内注射以及鞘内、 直接心室内、 静脉、 腹膜内、 鼻内或眼内注射。另外, 可局部而不是以系统方式给予制剂, 例如, 通过将制剂直接注射到脑部的特 定区域中。
     本发明所述的药物组合物可通过本领域公知的工艺来制造, 例如, 通过常规手段 如混合、 溶解、 制粒、 制糖衣、 水飞、 乳化、 胶囊化、 包埋或冻干工艺。
     根据本发明所述而应用的药物组合物可利用一种或多种生理上可接受的载体以 常规方式配制, 该生理上可接受的载体包含赋形剂和辅料, 以便于活性成分加工成药学上 可使用的制剂。合适的配方取决于所选择的给予途径。
     对于注射剂, 本发明的活性成分可配制成水性溶液, 优选生理学相容的缓冲溶液, 例如汉克氏溶液、 林格氏溶液、 或生理盐溶液。对于经粘膜给予, 在配方中使用适合透过屏 障的渗透剂。这样的渗透剂是本领域公知的。
     对于口服给予, 化合物可容易地通过将活性化合物与本领域公知的药学上可接受 的载体结合而配制。这样的载体能够将本发明所述化合物配制为片剂、 丸剂、 糖衣丸、 胶囊 剂、 液体、 凝胶剂、 糖浆剂、 膏剂、 混悬剂等以供患者口服摄入。供口服使用的药理制剂能够 使用固体赋形剂制备, 可选地研磨所产生的混合物, 并将混合物加工成小颗粒, 如果需要, 加入合适的辅料后, 可获得片剂或糖衣丸的核。 合适的赋形剂为, 特别是, 填充剂如糖, 包括 乳糖、 蔗糖、 甘露醇、 或山梨醇 ; 纤维素制剂如, 例如玉米淀粉、 小麦淀粉、 米淀粉、 马铃薯淀 粉、 明胶、 黄蓍胶、 甲基纤维素、 羟丙基甲基纤维素、 羧甲基纤维素钠 ; 和 / 或生理上可接受 的聚合物如聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)。如果需要, 可加入崩解剂, 如交联聚乙烯吡咯烷酮、 琼 脂、 或褐藻酸或其盐如海藻酸钠。
     提供具有合适包衣的糖衣丸核。 为此目的, 可使用浓缩的糖溶液, 其可选地含有阿 拉伯树胶、 滑石粉、 聚乙烯吡咯烷酮、 卡波普凝胶、 聚乙二醇、 二氧化钛、 涂膜溶液 (lacquer solution) 和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可在片剂或糖衣丸包衣中加入染料或色素以 用于识别或赋予活性化合物剂量的不同组合的特征。
     可用于口服的药物组合物包括由明胶制备的推入适配胶囊 (push-fit capsule), 以及由明胶和增塑剂如甘油和山梨醇制备的软密封胶囊。 推入适配胶囊可包含与填充剂如 乳糖, 黏合剂如淀粉, 润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁以及可选的稳定剂混合的活性成分。 在软 胶囊中, 可将活性成分溶解或悬浮在合适的液体中, 如脂肪油、 液体石蜡、 或液态聚乙二醇。 此外, 也可加入稳定剂。口服给予的所有配方的剂量应适合于所选择的给予途径。
     对于含服给予, 组合物可采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
     对于经鼻吸入给予, 根据本发明所应用的活性成分可以气雾剂的形式方便地递 送, 其通过使用合适的推进剂, 例如二氯二氟甲烷、 三氯氟甲烷、 二氯四氟乙烷或二氧化碳, 由加压的包装或喷雾器提供。对加压的气雾剂而言, 可通过提供阀门来递送经计量的量以 确定剂量单位。可配制在分配器中使用的例如明胶胶囊和筒, 以包含化合物和合适的粉基 ( 如乳糖或淀粉 ) 的混合粉末。
     可配制本文所述的制剂以用于肠胃外给予, 例如, 通过推注或持续输注。 用于注射 的配方可以单位剂型提供, 例如, 在安瓿中或在具有可选地添加防腐剂的多剂量容器中。 组 合物可以是在油性或水性溶媒中的混悬剂、 溶液或乳剂, 并且可以包含诸如悬浮剂、 稳定剂 和 / 或分散剂的配方剂 (formulatory agent)。
     用于肠胃外给予的药物组合物包括水溶性形式的活性制剂的水性溶液。此外, 活性成分的混悬剂可制备成基于合适的油或水的注射混悬剂。 合适的亲脂性溶剂或溶媒包括 脂肪油如芝麻油, 或合成脂肪酸酯如油酸乙酯、 甘油三酯或脂质体。 水性注射混悬剂可含有 能够增加混悬剂粘度的物质, 如羧甲基纤维素钠、 山梨糖醇或葡聚糖。可选地, 混悬剂也可 包含合适的稳定剂或增加活性成分的溶解度以使得能够制备高浓度溶液的试剂。
     可替代地, 活性成分可为粉末形式以在使用前溶于合适的溶媒, 例如, 基于无菌无 热原水的溶液。
     本发明所述制剂也可配制为直肠用组合物 ( 如栓剂 ) 或使用例如传统栓剂基质如 可可油或其他甘油酯进行保留灌肠。
     适用于本发明上下文的药物组合物包括组合物, 其中含有有效量的活性成分以达 到预期目的。 更具体而言, 治疗有效量意味着可有效防止、 减轻或缓解疾病症状或延长接受 治疗的对象的存活期的活性成分的量。
     治疗有效量的确定在本领域技术人员的能力范围内。
     对于用于本发明所述方法的任意制剂, 治疗有效量或剂量可通过体外试验初步 估算。初步估算确定后, 可配制剂量用于动物模型, 并且此信息可用于更准确地确定在人 类中的有用剂量。本发明人已表明, 可使用果蝇作为体内模型来分析本发明所述的肽的效 果 - 参见实施例 9 和 Crowther 等, Current Opinion in Pharmacology ; 2004, 4: 513-516, 本文中以引用方式并入。
     本文所述的活性成分的毒性和治疗功效可通过在体外、 细胞培养物或实验动物 中的标准药学程序来确定。从体外和细胞培养物试验和动物研究中获得的数据可用来配 制用于人类的一系列剂量。剂量根据所采用的剂型和所利用的给予途径而有所不同。准 确的配方、 给予途径和剂量可由医生个人参照患者病情进行选择 [ 参见, 例如 Fingl 等, (1975)″ The Pharmacological Basis of Therapeutics″, Ch.1 p.1]。
     根据所治疗疾病的严重性和应答性, 给药可以是单次或多次给予, 疗程持续数日 或数周或直至治愈或实现了疾病状态的减轻。
     当然, 所给予组合物的剂量会取决于所治疗的对象、 患病的严重性、 给予方式、 处 方医师的判断等。
     也可制备包括与相容性药学载体配制的本发明所述制剂的组合物, 放置于合适的 容器中, 并标记用于治疗所指示的疾病。
     如果需要, 本发明所述组合物可以包装容器或分配装置提供, 例如 FDA 批准的试 剂盒, 其可含有一种或多种包含活性成分的单位剂型。 包装容器可包括, 例如金属或塑料薄 膜, 如泡罩包装。包装容器或分配装置可以附有给予的使用说明书。也可通过由监管药品 生产、 使用或销售的政府机构规定的与容器有关的公告对包装容器或分配装置进行调整, 该公告反映了机构批准该组合物的形式或给予人类或动物。这样的公告可以为, 例如美国 食品和药品监督管理局批准标签用于处方药或作为已批准产品的说明书。
     除了治疗应用, 本发明的某些实施方式中的肽还可用于检测 α- 突触核蛋白单体 的存在或水平。这依赖于肽与单体 α- 突触核蛋白形式结合的能力。因此, 通过间接测定 蛋白的有害聚集形式的水平, 可用于诊断或监测治疗效果。
     应理解, 所述肽也可作为研究 α-syn 和 β-syn 之间相互作用的工具, 也可帮助理 解 β-syn 的作用和 / 或机制。因此, 可将所述肽连接至可识别的部分。
     可识别的部分可以是结合对的成员, 其通过与结合对的直接可视的另一成员和标 记的相互作用而被识别。在一个实例中, 该结合对的成员为通过相应的标记抗体识别的抗 原。在一个实例中, 标记为产生比色反应的荧光蛋白或酶。
     下表 3 提供了可识别部分的序列的实例。
     表3
    应理解, 可使用化学缀合或重组 DNA 技术产生这样的融合。将单体形式的水平与 对照样品相比较 ( 例如, 来自健康对象、 治疗前的相同对象等 )。 为了研究目的和药物开发, 例如, 在使用药物治疗后和可选的治疗前, 测定药物对 α- 突触核蛋白和单体形式水平的 影响, 其中药物可以是本发明所述的肽。
     术语 “包含” 、 “包括” 、 “含有” 、 “具有” 及其结合意味着 “包括但不限于” 。该术语包 括术语 “由……组成” 和 “基本上由……组成” 。
     短语 “基本上由……组成” 是指组合物或方法可包括其他成分和 / 或步骤, 但仅当 其他成分和 / 或步骤未实质上改变所要求的组合物或方法的基本性质和新颖性。
     如本文中所使用的, 除非上下文另有规定, 单数形式的 “一个” 、 “一种” 和 “该” 、 “所 述” 包括复数指代。例如, 术语 “化合物” 或 “至少一种化合物” 可包括复数种化合物, 包括 其混合物。
     在本申请全文中, 本发明的不同实施方式以范围的格式表示。 应理解, 以范围格式 描述仅仅是为了方便和简洁, 不应理解为对发明范围的僵化的限制。 因此, 应认为对范围的 描述已明确公开了所有可能的子范围以及在此范围内的单个数值。例如, 应认为对范围的 描述诸如 1 至 6 明确公开了子范围如 1 至 3、 1 至 4、 2 至 4、 2 至 6、 3 至 6 等, 以及在该范围 内的单个数值, 例如 1、 2、 3、 4、 5、 6。不论范围窄宽均适用。
     当本文中指出数值范围时, 其意图包括指定范围内的任意被引用的数字 ( 分数或 整数 )。短语 “在” 第一个指定数字和第二个指定数字 “之间的范围” 和 “从” 第一个指定数 字 “到” 第二个指定数字 “的范围” 可交替使用, 并且意图包括第一个和第二个指定数字以 及所有在其间的分数和整数。
     如本文中所使用的, 术语 “方法” 指代完成给定任务的方式、 手段、 技术和程序, 其
     包括但不限于化学、 药理、 生物、 生化和医疗领域的从业人员已知的, 或容易从已知的方式、 手段、 技术和程序开发的那些方式、 手段、 技术和程序。
     如本文中所使用的, 术语 “治疗” 包括去除, 基本上抑制、 减缓或逆转疾病进程, 基 本上改善疾病的临床或外部症状, 或基本上防止疾病的临床或外部症状的出现。
     本文中使用的词语 “典型的” 是指 “作为例子、 实例或例证” 。任何描述为 “典型的 ( 或示例性的 )” 实施方式并不能理解为比其他实施方式优选或有利的、 和 / 或排除来自其 他实施方式的特征的纳入。
     本文中所使用的词语 “可选地” 是指 “在某些实施方式中提供而在其他实施方式中 未提供” 。本发明任何特别的实施方式可包括多个 “可选的” 特征, 除非这些特征相抵触。
     应理解, 为清晰起见, 在独立实施方式的上下文处所描述的本发明的某些特征也 可与单独的实施方式以组合的方式提供。 反过来, 为简洁起见, 在单独实施方式的上下文处 所描述的不同的发明特征也可单独或以任意合适的子组合形式或相应的在任何本发明所 描述的实施方式中提供。 不应认为在不同的实施方式的上下文所描述的某些特征是那些实 施方式的必要特征, 除非该实施方式在没有这些元素时无法实施。
     如上所述及如下权利要求部分所要求的本发明的各种实施方式和方面可从如下 实施例中得到实验性支持。 实施例
    现参考以下实施例, 与以上说明书以非限制的方式共同描述本发明的某些实施方式。 现参考以下实施例, 与以上说明书以非限制的方式共同描述本发明。
     通常, 本文中使用的术语和本发明利用的实验程序包括分子、 生化、 微生物和重 组 DNA 技术。文献对这样的技术进行了充分说明。参见例如, “Molecular Cloning : A laboratory Manual” Sambrook 等, (1989) ; “Current Protocols in Molecular Biology” 卷 I-III Ausubel, R.M., ed.(1994) ; Ausubel 等, “Current Protocols in Molecular Biology” , John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland(1989) ; Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning” , John Wiley & Sons, New York(1988) ; Watson 等, “Recombinant DNA” , Scientific American Books, New York ; Birren 等 (eds)“Genome Analysis : A Laboratory Manual Series” , Vols.1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1998) ; 美国专利第 4,666,828 号 ; 第 4,683,202 号 ; 第 4,801,531 号 ; 第 5,192,659 号和第 5,272,057 号方法学解释 ; “Cell Biology : A Laboratory Handbook” , 卷 I-III Cellis, J.E., ed.(1994) ; “Current Protocols in Immunology” 卷 I-III Coligan J.E., ed.(1994) ; Stites 等 (eds), “Basic and Clinical Immunology” (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT(1994) ; Mishell 和 Shiigi(eds), “Selected Methods in Cellular Immunology” , W.H.Freeman and Co., New York(1980) ; 专利和科学文献对可用 的免疫测定法进行了广泛描述, 参见例如美国专利第 3,791,932 号 ; 第 3,839,153 号 ; 第 3,850,752 号 ; 第 3,850,578 号 ; 第 3,853,987 号 ; 第 3,867,517 号 ; 第 3,879,262 号 ; 第 3,901,654 号 ; 第 3,935,074 号 ; 第 3,984,533 号 ; 第 3,996,345 号 ; 第 4,034,074 号 ; 第 4,098,876 号 ; 第 4,879,219 号 ; 第 5,011,771 号 和 第 5,281,521 号 ; “Oligonucleotide
     Synthesis” Gait, M.J., ed.(1984) ; “Nucleic Acid Hybridization” Hames, B.D., 和 Higgins S.J., eds.(1985) ; “Transcription and Translation” Hames, B.D., 和 Higgins S.J., eds.(1984) ; “Animal Cell Culture” Freshney, R.I., ed.(1986) ; “Immobilized Cells and Enzymes”IRL Press ,(1986) ; “ A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984) 和 “Methods in Enzymology” Vol.1-317, Academic Press ; “PCR Protocols : A Guide To Methods And Applications” , Academic Press, San Diego, CA(1990) ; Marshak 等, “Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual” CSHL Press(1996) ; 将其所有以引用方式并入本文, 如同本文 完全阐述。在全文中提供了其他一般的参考。认为其中的程序是本领域公知的, 并为读者 提供便利。以参考方式将其中所包含的所有信息并入本文。
     一般材料和方法
     肽阵列 : 使用肽阵列技术对 β-syn 结合序列进行分子定位。 在纤维素膜基质上合 成与全长为 134 个氨基酸的 β-syn 蛋白的重叠序列相对应的十聚体肽。该肽共价结合于 C 末端氨基酸残基支持的 Whatman 50 纤维素。封闭后, 在 N 末端组氨酸标记的重组 α-syn 中, 然后在 HRP 标记的抗 His 单克隆抗体中孵化膜。进行了阴性对照。使用蛋白印迹分析 对纤维素膜上的免疫印迹进行显影。一旦确定了 β-syn 在 α-syn 上的结合位点, 就可合 成小型 β-syn 衍生肽。 α-syn 的表达和纯化 : 蛋白在 pT7-7BL21 细菌中表达。对于表达, 使用氨苄西林 (100mg/L) 将细菌培养物培养至对数阶段, 使用 IPTG(1mM) 诱导蛋白表达 3 小时。 细菌沉淀 物 (pellet) 在 TEN 缓冲液 (50mM Tris pH8.0, 10mM EDTA, 150mMNaCl) 中重悬, 并在 -80℃ 下冷冻直至纯化。
     使用如 Volles 和 Lansbury 所述的非色谱方法 (Volles 和 Lansbury, 2007, J Mol Biol 366(5), 1510-1522) 进行纯化。 简言之, 细菌煮沸并离心后, 将上清液移至新试管并加 入硫酸链霉素 (136μL 的 10%溶液 /mL 上清液 ) 和醋酸 ( 冰醋酸, 228μL/mL 上清液 ), 然 后再旋转 2 分钟。再次除去上清液, 然后用硫酸铵 (4℃下使用与上清液体积 : 体积为 1 ∶ 1 的饱和硫酸铵 ) 沉淀。通过离心收集沉淀的蛋白 ( 在此阶段观察到克隆未产生可纯化的蛋 白而未形成沉淀 ), 并用 1mL 硫酸铵溶液 (4℃; 饱和硫酸铵 (4℃ ) : 水为 1 ∶ 1 体积∶体积 ) 洗涤沉淀物一次。洗涤的沉淀物在 900μL 100mM 醋酸铵中重悬 ( 形成不透明溶液 ), 并通 过在室温下加入等体积的乙醇进行沉淀。重复一次乙醇沉淀, 接着在 100mM 醋酸铵中进行 最后一次重悬, 4℃下 O.N. 透析至水中, 在液氮中冷冻并冻干。
     为了进行比对, 随后使用色谱法通过另外的方法对蛋白进行纯化, 并使用相同的 肽测定聚集抑制。 简言之, 细菌沉淀物在 50mM Tris, 50mM KCl, 5mM MgAc, 0.1% NaN, pH 8.5 中重悬, 并辅以 300uM PMSF 抑制剂。然后超声处理并在 4C 下以 14000RPM 超离心 30 分钟。 然后在水浴中将上清液煮沸 15 分钟。为了从溶液中分离沉淀蛋白, 在 4℃以 7000RPM 的速 度离心 20 分钟。用 0.45μm 滤器对上清液进行过滤, 并保存以进一步纯化。
     将滤过的上清液施于 HiPrep 16/10QEF 阴离子交换柱。在 20mMTris, pH 8 下, α-syn 具有净负电荷, 因此能够与阴离子交换柱的正电荷部分 (NH+) 相互作用。使用 30-40%的 20mM Tris 和 1MNaCl 溶液 (pH8) 洗脱蛋白, 并施于 HiLoad 26/20superdex 200 尺寸排阻柱。用 50mMTris/HCl 和 150mM NaCl 缓冲液 (pH 7.5) 与阴离子交换部分上样, 用
     SDSPAGE 分析单体部分, 4℃下 O.N. 透析至水中, 在液氮中冷冻并冻干。
     ThT 荧光试验 : 将 α-syn 溶解至浓度为每 100mM Tris 缓冲液中 200μm(pH 7.4)。 为了获得单体部分, 用 100 kDa 的离心超滤管对蛋白进行过滤。 由于 α-syn 不是球形蛋白, 而是天然展开的, 因此仅单体和一些二聚体可通过滤器。立即将单体蛋白与不同 β-syn 衍 生肽以 1 ∶ 1 的比例混合或不与不同 β-syn 衍生肽混合至终浓度为 100μM。 样品在 37℃下 以 850RPM 搅拌孵化, 如 Tsigelny 等人所述 (Tsigelny 等, 2007Febs J 274(7), 1862-1877), 孵化后三天, 通过硫磺素 T(ThT) 荧光试验 ( 在 450nm 处激发, 2.5nm 狭缝, 并在 480nm 处发 射, 5nm 狭缝 ) 测定原纤维形成速率。将 ThT 加入稀释 500 倍的样品中, 并使用 Jobin Yvon Horiba Fluoromax3 荧光计进行测量。
     透射电子显微法 : 将 来 自 α-syn ThT 荧 光 试 验 ( 有 或 没 有 抑 制 剂 ) 的 样 品 (10μL) 置于覆盖有碳稳定的方华膜 ( 聚乙烯醇缩甲醛膜, Formvar film) 的 400 目铜网上 (SPI 提供, West Chester, PA)。1.5 分钟后, 除去多余的液体, 用 10μl 的 2%乙酸铀酰溶 液将网负染色 2 分钟。最后, 除去多余的液体, 并在 80kV 下运行的 JEOL 1200EX 电子显微 镜下观察样品。
     可溶性寡聚体形成的测定 : 将单体 α-syn 溶解至浓度为每 100mM Tris 缓冲液中 200μm(pH 7.4), 并立即与 β-syn 衍生肽以 1 ∶ 1 的比例混合或不与不同 β-syn 衍生肽混 合至终浓度为 100μM, 如上文所述的聚集试验中所述。37℃下将样品搅拌数日后, 将 10μl 的蛋白在 13000 RPM 下离心 10 分钟, 收集上清液并使用不含 β- 巯基乙醇且不煮沸的非变 性加样缓冲液在丙烯酰胺凝胶上进行电泳。 使用 ddH2O 洗涤凝胶 3 次, 将样品转移至硝酸纤 维素膜, 采用半干印迹技术, 施加 323mA 电流 30 分钟。使用 TBS(0.3%吐温 ) 稀释的 5%牛 奶封闭膜 1 小时, 并同时振摇。 用 TBS(0.3%吐温 ) 稀释的 5%牛奶以 1 ∶ 1000 对抗 α-syn 进行稀释 (Santa Cruz Biotechnology), 加到膜上孵化 2 小时, 并用 TBS(0.3%吐温 ) 洗涤 数次。用 TBS(0.3%吐温 ) 稀释的 5%牛奶以 1 ∶ 5000 对兔抗鼠 IgG(Fc 特异性 )-HRP 缀 合的抗体进行稀释并在 RT 下给予 1 小时, 同时振摇。根据生产商的指示, 用 TBS(0.3%吐 温 ) 彻底洗涤后使用增强化学发光系统 (Enhanced Chemiluminescence System, ECL) 使印 迹显影。
     荧光各向异性研究: 将 酪 氨 酸 被 色 氨 酸 代 替 的 β-syn 36(SEQ ID NO : 22-GVLWVGSKTR) 溶解至浓度为 54μM。立即将该溶液与 α-syn 单体储备液混合至不同的 终浓度。利用 ISS K2 荧光剂进行肽极化测量。在 280nm 处激发溶液并在 350nm 处监测发 射。对于每个单独的点, 至少收集五次测量值, 并且它们的平均值用于计算。使用超纯水进 行所有实验。
     NMR 分析 : 通过将冻干形式的肽溶解于含有 10%氧化氘的 20mM 磷酸盐缓冲液和含 有 50mM NaCl 的 DDW 溶液来制备样品。当使用 α-syn 时, 如上所述在 20mM 磷酸盐溶液中 制备样品, 加入 NaCl 和氧化氘已达到上述浓度, 以指定的摩尔比加入冻干肽。测量所有样 品的 pH。在 Shigemi 管中制备样品, 终体积为 260μL。
     在 Bruker Avance 600MHz DMX 光 谱 仪 上 进 行 NMR 实 验, 使用装备有自屏蔽 xyz- 梯度线圈的 5mm 选择性探头, 在 600.13MHz 的质子频率下运行。将发射器频率调制 到 HDO 信号上, 其根据温度进行校准 (4 ℃ -4.974ppm ; 10 ℃ -4.821ppm ; 15 ℃ -4.773ppm ; 37℃ -4.658ppm)。对每个温度和样品集进行 TOSCY(44) 和 NOESY(46) 实验。使用 TOPSPIN 软件 (Bruker Analytische Messtechnik GmbH) 对光谱进行处理和 分析。 在傅立叶变换前应用间接维度的零填充和两个维度上均具有位移平方正弦钟形窗函 数 (shifted squared sine bell window functions) 的数据切趾 (data apodization) 以 达到最佳分辨率。在具有二次多项式函数的直接维度上对基线进行进一步校正。
     根据 Wüthrich 基于在相同实验条件下测定的 TOCSY 和 NOESY 光谱而开发的序列 归属法进行共振归属。由精确校准的、 高分辨的、 强切趾覆盖的 2D 光谱来读取 HN-Hα 峰的 化学位移偏移。
     肽稳定性体外试验 : 将肽溶解以形成 50μM Tris 缓冲液 (pH = 7.6) 中的 1mM 溶液。将 120μl 的肽溶液在新采集的无小脑的小鼠脑匀浆 ( 在 1×Tris 缓冲液和 0.5% Triton X-100 中 ) 中稀释至 10%。含有 20%肽溶液和 80%小鼠脑匀浆的混合物在 37℃ 下孵化并轻微振摇 2 小时。通过加入 0.1MHCl 溶液终止酶反应, 接着用 CH3OH 使蛋白变性 并在 20℃下孵化 1 小时。4℃下将沉淀的蛋白以 29,000×g 离心 20 分钟, 含有肽的上清液 减压浓缩并用 C18HPLC 柱分离。将与完整肽相对应的峰面积 ( 在 280nm 处 UV 吸收 ) 与在 50μM Tris 缓冲液中孵化的等量样品进行比较。
     细胞系 : 在 100μM G-418, 37 ℃及 5 % CO2 的选择性条件下, 将 α-syn 野生型稳 定转染的 SH-SY5Y 细胞保持在含有 5%胎牛血清、 2mM L- 谷氨酰胺、 1000U/ml 青霉素 G 钠、 1mg/ml 硫酸链霉素和 1mM 丙酮酸钠的 DMEM : F121 ∶ 1 中。 细胞在含有 10μM 视黄酸 (Sigma) 的完全培养基中经历分化, 每两天更换培养基, 为期八天。
     肽内化至 SH-SY5Y 细胞中 : 肽内化至 SH-SY5Y 细胞可通过免疫细胞化学染色可视 化。将 104 个细胞接种于 24 孔板中涂覆有聚 -L- 赖氨酸 (0.1% ) 的盖玻片上并经历如上 所述的分化。在 37℃下, 分化的细胞在细胞培养基中与肽孵化 30 分钟至四个小时。室温下 用 PBS 洗涤细胞并用 4%多聚甲醛的 PBS 溶液固定 30 分钟, 然后用 PBS 洗涤两次并用 0.1% Triton 的 PBS 溶液透化 2 分钟。用 PBS 洗涤两次后, 用 10%正常羊血清的 3% BSA 溶液封 闭细胞, 并且用以 1 ∶ 1000 稀释的抗 α-syn 抗体 (Santa Cruz Biotechnology) 和鬼笔环 肽 4μg/ml(Sigma) 孵化一小时, 接着与 Cy5- 缀合的羊抗兔 IgG(Jackson ImmunoResearch) 再孵化一小时。用 PBS 彻底洗涤后, 使用 Prolong Antifade(Invitrogene) 封固细胞。使 用 LSM510 共聚焦显微镜 (Zeiss) 采集图像。
     果蝇的饲养 : 在标准角膜糖蜜培养基中饲养果蝇, 并保持在 25C。雄果蝇与分别在 25℃或 18℃孵化后 8 小时或 18 小时收集的未交配过的雌果蝇进行杂交。为了避免来自下 一代 (F2) 的后代, 在 25℃下开始孵化第 9 天后收集来自杂交的成年后代 (F1)。
     果蝇杂交 : 将 X 染色体上携带驱动子 elav-Gal4 的雄果蝇与携带位于 X 染色体 UAS 启动子下的 A53Tα-syn 转基因的雌果蝇进行杂交。这导致第一代 (F1) 雌性后代在其神经 系统中表达 A53Tα-syn, 作为 PD 果蝇模型。携带驱动子 elav-Gal4 的雄果蝇后代与 WT OR 雌性进行杂交作为对照。
     特殊果蝇饲养 : 将 β-syn 逆反肽以 0.75mg/ml 的浓度加入标准角膜糖蜜培养基 中。在 40℃下将肽完全混入培养基, 混合物等分至饲养瓶中。将瓶保持在 4℃下直至使用。 在普通果蝇培养基 ( 对照 ) 或添加了肽的培养基上进行杂交。从幼虫期开始在合适的培养 基上饲喂动物。孵化后, 每两天将后代转移至预滴入 0.75mg/ml 肽溶液的瓶中。
     运动 ( 攀爬 ) 试验 : 每支试管包含 10 只果蝇, 在桌上轻敲并直立 20 秒。然后根据时间计算从试管底部攀爬约一厘米的果蝇的百分比。 对每种的五个独立试管进行重复实 验。
     实施例 1
     α 和 β-syn 之间识别位点的确定
     结果
     为了确定两种蛋白间的相互作用位点, 使用交互肽阵列分析法 (reciprocal peptide-array analysis) 对两种蛋白进行系统性定位 ( 图 lA- 图 1D)。
     该试验背后的原理是为了确定具有促进分子识别事件而引起相互作用的潜力的 结构域。该结构域将是合成小衍生肽的基础, 以用于治疗性抑制 α-syn 聚集。
     使用肽阵列技术进行 α 和 β-syn 结合序列的分子定位。在纤维素膜基质上合成 与全长为 140 个氨基酸的 α-syn 蛋白和全长为 134 个氨基酸的 β-syn 蛋白的重叠序列相 对应的十聚体肽 ( 参见图 2A- 图 2B)。该肽共价结合于 C 末端氨基酸残基支持的 Whatman 50 纤维素上。
     封闭后, α 和 β-syn 纤维素膜分别在 N 末端组氨酸标记的重组 α-syn 和重组 β-syn 中, 然后在 HRP 缀合的抗组氨酸单克隆抗体中孵化。进行了阴性对照。使用蛋白印 迹分析对纤维素膜上的免疫印迹进行显影。一旦确定了 β-syn 在 α-syn 上的结合位点, 就可合成小型 β-syn 衍生肽。
     选择并合成若干十聚体肽以用于进一步分析。 根据其第一个氨基酸在膜上的位置 将这些肽称为 β-syn 6、 β-syn 14、 β-syn 36、 β-syn 37、 β-syn 38、 β-syn 39、 β-syn 77 和 β-syn 78( 表 4, 如下 )。一条七个氨基酸的肽 ( 称为 6 短肽 (6short)) 用作阳性对 照, 其由 Windisch 等 (Windisch 等, 2004(2004)J Mol Neurosci 24(1), 155-165) 选作良好 的抑制剂候选物 -SMAKEGV(SEQ ID NO : 39)。
     表4
    由 于 酪 氨 酸 的 存 在, 特 别 注 意 肽 36-39(SEQ ID NOs 1-4)。 已 确 定 芳 香 族 氨 基 酸 在 通 过 π- 堆 积 作 用 而 形 成 淀 粉 样 原 纤 维 中 起 关 键 作 用 [Azriel, R. 和 Gazit, E.(2001)J.Biol.Chem.(276) , 34156-34161 ; Gazit , E.(2002)Bioinformatics (18) , 880-883 ; Porat, Y., Kolusheva, S., Jelinek, R. 和 Gazit, E.(2003)Biochemistry (42), 10971-10977 ; Mazor, Y., Gilead, S., Benhar, I. 和 Gazit, E.(2002)J.Mol.Biol.(322), 1013-1024 ; Reches, M. 和 Gazit, E.(2003)Science (300), 625-627 ; Reches, M. 和 Gazit, E.(2004)Amyloid(11), 81-89]。因此, 抑制剂肽内存在酪氨酸可促进对淀粉样结构自组装 的干扰。
     实施例 2
     β-syn 衍生肽对淀粉样纤维形成的抑制
     为了检验肽对 α-syn 纤维形成的抑制作用, 进行了硫磺素 -T(ThT) 结合试验。该 方法提供了淀粉样纤维生长的定量信息。 在不同 β-syn 衍生肽存在或不存在时, 将 α-syn 在 37 ℃下孵化数日, 同时剧烈振摇以允许淀粉样纤维的形成。监测纤维化过程三天。图 3A 示出了在若干肽抑制剂的存在下, 淀粉样纤维的形成明显降低。对两种潜在的抑制剂 β-syn 36 和 β-syn 39 进行动力学分析, 因为这两种肽代表了在芳香区域内筛选的第一 个和最后一个肽 ( 图 3B)。β-syn 36 显示出更好的抑制作用, 并且剂量依赖性抑制试验显 示在 10 ∶ 1( 摩尔比 ) 过量时肽仍然有效, 但效率低于 5 ∶ 1 过量 ( 图 3C)。
     实施例 3
     α-syn 聚集的 TEM 分析
     在 β-syn 抑制剂存在和不存在时, 对 α-syn 样品进行透射电子显微镜 (TEM) 分 析。样品取自 ThT 实验 ( 显示在图 3A 中 )。由 α-syn 单独形成的纤维为大而宽的带状纤 维 ( 图 3D), 而 β-syn 存在时仅检测到短纤维或未检测到纤维。β-syn 36 几乎完全抑制 纤维的形成 ( 图 3F)。这些结果与 ThT 试验结果高度相关。
     实施例 4
     抑制寡聚体形成的筛选
     为了检验肽抑制早期聚集的能力, 与 β-syn 肽孵化后收集 α-syn 的可溶性部 分。使用 SDS-PAGE 分离反应混合物, 然后使用特异性抗 α-syn 抗体进行蛋白印迹分析 (Santa-Cruz)( 图 4A)。随时间推移的寡聚体形成的初步测试显示孵化约 20 小时后检测 到大量寡聚体 ; 因此在该时间段后收集样品。β-syn 6 短肽 ( 我们的阳性对照肽 ) 和肽 β-syn 37 肽抑制纤维形成但不抑制寡聚体的形成, 而肽 β-syn 78 抑制寡聚体形成而不 抑制纤维形成。β-syn 36 肽对两种聚集类型的形成几乎均完全抑制 ( 图 4B)。
     实施例 5
     β-syn 36 肽和 α-syn 之间的亲和力的鉴定
     为了检验 β-syn 36 和 α-syn 单体间相互作用的亲和力, 使用在 β-syn 的 39 位处包含色氨酸而非酪氨酸的肽, 在荧光各向异性试验中利用其固有荧光。发现该肽以类 似于 β-syn 36 的方式抑制 α-syn 聚集 ( 未示出数据 )。将增加量的 α-syn 单体滴加至 β-syn 36 肽的溶液中并测定各向异性 ( 图 5B)。用于计算的亲和常数约为 1μM。
     实施例 6
     β-syn 36 的修饰肽抑制 α-syn 的聚集并提高血清稳定性为了提高血清中肽的半衰期, 可能对其进行改变以降低组织和血清蛋白酶和肽酶 的降解。 β-syn 36 为包含天然 L- 氨基酸的十聚体肽。 由于该肽易受蛋白水解性降解, 本发 明人设计了更稳定的衍生物 ( 参见上表 1)。为此目的, 设计了三种修饰肽 ; 第一种由 D- 氨 基酸代替 L- 氨基酸构成, 称为 β-syn 36D, 第二种为具有逆反氨基酸序列的类似物, 称为 逆反肽。为了抵消逆反肽末端的负电荷和正电荷, 合成了第三种 N 末端乙酰化和 C 末端酰 胺化的肽, 其为具有酰胺化和乙酰化的逆反肽。 猜测这些肽的修饰改变了先导肽的效能, 但 要求恢复其生物活性。为此目的, 使用 ThT 结合试验以有利于肽的摩尔比 1 ∶ 20, 1 ∶ 10 来测定所有三种肽对 α-syn 纤维形成的抑制, 并显示出与 β-syn 36 相似的生物效应 ( 图 5A)。
     随后, 使用新鲜小鼠脑匀浆模拟血清降解 2 小时来比较肽 β-syn 36 和修饰的逆 反肽的稳定性。图 6A- 图 6C 中的结果表明修饰肽的稳定性提高。
     实施例 7
     NMR 分析
     通过结合后化学位移的以下改变来确定参与 α-syn 分子间相互作用的残基。通 过使用 β-syn 36 逆反肽 ( 均为 D 氨基酸 ; R45T44K43S42G41V40Y39L38V37G36) 与 α-syn 相互作用 克服两个相同分子间的明显重叠。对肽的所有残基进行了鉴定并归属 ( 图 10)。在酰胺区 域未见到 R45 和 T44, 但在脂肪族区域被识别出。 在许多条件下测定了单独的肽以及与 α-syn 相互作用时的波谱 : 肽与蛋白的摩尔比为 1 ∶ 1 和 1 ∶ 5 ; 肽浓度为 160 和 400μM ; 温度为 4℃、 10℃、 20℃、 25℃和 37℃; 以及使用 Y39Wβ-syn 36 逆反类似物。在所有样品中, 某些 N 末端区域的酰胺信号在 R45 和 G41 之间丢失, 然而所有样品均显示在 β-syn 36 逆反肽与 α-syn 摩尔比为 1 ∶ 1, 160μM, 4℃, pH 的样品中得到的一般趋势 ( 以上图 7A 和图 7B- 图 7E 和表 4)。在残基 K43、 V40、 L38 和 G36 中化学位移显示强烈的偏移。为进一步突出 L38 和 G36 的重要性, 合成了缺少前三个氨基酸 G、 V 和 L 的 β-syn 36D 肽, 并通过 ThT 试验显示对 α-syn 聚集无抑制作用 ( 图 7F)。
     实施例 8
     哺乳动物细胞的肽内化
     为了获得 PD 的细胞模型, 首先对过表达野生型 α-syn 的 SH-SY5Y5 细胞进行视黄 酸处理, 以诱导细胞分化 (Lev 等, (2006)Neurosci Lett399(1-2), 27-32)。处理 8 天后, 在 新鲜生长培养中培养细胞 0.5-4 小时, 随后用 FITC 缀合的 β-syn 36 逆反肽 ( 绿色荧光 ) 孵化。孵化后, 对细胞进行洗涤、 固定和透化。使用 cy5 缀合的羊抗兔抗体 ( 紫色荧光 ) 检 测野生型 α-syn 的过表达, 并用鬼笔环肽试剂 ( 红色荧光 ) 标记细胞膜。使用 LSM-510 蔡 司共聚焦显微镜对荧光标记进行可视化 ( 图 8A- 图 8E)。检测了两种不同浓度的肽 -50μM 和 250μM, 显示相似的结果。孵化 30 分钟后, 肽未进入细胞。然而, 未检测到细胞粘附。孵 化 2 小时后检测到肽几乎都在细胞表面。浓度为 250μM 时, 在细胞内检测到少量。孵化 4 小时后, 明显注意到细胞内有肽存在。
     实施例 9
     β-syn 36 逆反肽对体内转基因果蝇系统的影响
     为了评估肽对存活有机体中 α-syn 的影响, 使用了 PD 的果蝇模型。 转基因果蝇通 过 Gal4-UAS 系统在其神经系统中过表达突变的 A53Pα-syn。这些果蝇的通常表型为运动缺陷 ; 正常果蝇往往会沿试管向上攀爬, 而这些果蝇则留在底部 (Ueda 等, (1993)Proc Natl Acad Sci U S A 90(23), 11282-11286)。 携带泛神经 elav-Gal4 驱动子 ( 在其 X 染色体上 ) 的雄果蝇与携带 UAS 调控的 A53T α-syn 转基因的雌果蝇杂交导致雌性后代在其神经系统 中表达 A53T α-syn。 在普通果蝇培养基或添加了 0.75mg/mLβ-syn 36 逆反肽的培养基中 进行杂交。监测果蝇的攀爬能力 27 天, 显示在第 27 天未处理的 PD 果蝇有 37%进行攀爬, 而处理的果蝇则有 66%进行攀爬, 与未处理组相比增加了 30%。肽对对照果蝇的运动没有 显著影响。这些结果表明使用 β-syn 36 逆反肽引起 A53T α-syn 果蝇的显著表型恢复。
     参考文献
     ( 其他参考文献引用在本文中 )
     1.Sipe, J.D.(1992)Annu Rev Biochem 61, 947-975
     2.Wetzel, R.(1994)Trends Biotechnol 12(5), 193-198
     3.Harrison, R.S., Sharpe, P.C., Singn, Y., and Fairlie, D.P.(2007)Rev Physiol Biochem Pharmacol(159), 1-77
     4.Sipe, J.D., and Cohen, A.S.(2000)J.Struct.Biol.(130), 88-98
     5.Rochet, J.C., Conway, K.A., and Lansbury, P.T., Jr.(2000)Biochemistry 39(35), 10619-10626
     6.Serpell, L.C.(2000)Biochim.Biophys.Acta(1502), 16-30
     7.Dobson, C.M.(2001)Philos.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci.(356), 133-144
     8.Gazit, E.(2002)Faseb J 16(1), 77-83
     9.Sacchettini, J.C., and Kelly, J.W.(2002)Nat Rev Drug Discov.(1), 267-275
     10.Kaytor, M.D., and Warren, S.T.(1999)J Biol Chem 274(53), 37507-37510
     11.Ferrone, F.(1999)Methods Enzymol 309, 256-274
     12.Bertoncini, C.W., Rasia, R.M., Lamberto, G.R., Binolfi, A., Zweckstetter, M., Griesinger, C., and Fernandez, C.O.(2007)J Mol Biol 372(3), 708-722
     13.Hsia, A.Y., Masliah, E., McConlogue, L., Yu, G.Q., Tatsuno, G., Hu, K., Kholodenko, D., Malenka, R.C., Nicoll, R.A., and Mucke, L.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci. U S A(96), 3228-3233
     14.Mucke, L., Masliah, E., Yu, G.Q., Mallory, M., Rockenstein, E.M., Tatsuno, G., Hu, K., Kholodenko, D., Johnson-Wood, K., and McConlogue, L.(2000)J.Neurosci. (20), 4050-4058
     15.Ashe, K.H.(2001)Learn.Mem.(8), 301-308
     16.Klein, W.L., Krafft, G.A., and Fincn, C.E.(2001)Trends Neurosci.(24), 219-224
     17.Westerman , M.A. , Cooper-Blacketer , D. , Mariash , A. , Kotilinek , L. , Kawarabayashi, T., Younkin, L.H., Carlson, G.A., Younkin, S.G., and Ashe, K.H.(2002) J Neurosci(22), 1858-1867
     18.Lesne, S., Koh, M., T., Kotilinek, L., Kayed, R., Glabe, C., G., Yang, A., Gallagher, M., and Ashe, K.H.(2006)Nature(440), 352-357
     19.Forno, L.S.(1996)J Neuropathol Exp Neurol 55(3), 259-27220.Thomas, B., and Beal, M.F.(2007)Hum Mol Genet 16 Spec No.2, R183-194
     21.Lotharius, J., and Brundin, P.(2002)Nat Rev Neurosci 3(12), 932-942
     22.Spillantini, M.G., Schmidt, M.L., Lee, V.M., Trojanowski, J.Q., Jakes, R., and Goedert, M.(1997)Nature 388(6645), 839-840
     23.Polymeropoulos, M.H., Lavedan, C., Leroy, E., Ide, S.E., Dehejia, A., Dutra, A., Pike, B., Root, H., Rubenstein, J., Boyer, R., Stenroos, E.S., Chandrasekharappa, S., Athanassiadou, A., Papapetropoulos, T., Johnson, W.G., Lazzarini, A.M., Duvoisin, R.C. , Di Iorio , G. , Golbe , L.I. , and Nussbaum , R.L.(1997)Science 276(5321) , 2045-2047
     24.Waxman, E.A., and Giasson, B.I.(2008)Biochim Biophys Acta
     25.Davidson, W.S., Jonas, A., Clayton, D.F., and George, J.M.(1998)J Biol Chem273(16), 9443-9449
     26.Weinreb, P.H., Zhen, W., Poon, A.W., Conway, K.A., and Lansbury, P.T., Jr.(1996)Biochemistry 35(43), 13709-13715
     27.El-Agnaf, O.M., Paleologou, K.E., Greer, B., Abogrein, A.M., King, J.E., Salem, S.A., Fullwood, N.J., Benson, F.E., Hewitt, R., Ford, K.J., Martin, F.L., Harriott, P., Cookson, M.R., and Allsop, D.(2004)Faseb J 18(11), 1315-1317
     28.Biere, A.L., Wood, S.J., Wypych, J., Steavenson, S., Jiang, Y., Anafi, D., Jacobsen, F.W., Jarosinski, M.A., Wu, G.M., Louis, J.C., Martin, F., Narhi, L.O., and Citron, M.(2000)J Biol Chem 275(44), 34574-34579
     29.Hashimoto, M., Hsu, L.J., Xia, Y., Takeda, A., Sisk, A., Sundsmo, M., and Masliah, E.(1999)Neuroreport 10(4), 717-721
     30.Jensen, P.H., Sorensen, E.S., Petersen, T.E., Gliemann, J., and Rasmussen, L.K.(1995)Biochem J310(Pt 1), 91-94
     31.Uversky, V.N., Li, J., Souillac, P., Millett, I.S., Doniach, S., Jakes, R., Goedert, M., and Fink, A.L.(2002)J Biol Chem 277(14), 11970-11978
     32.Windisch, M., Hutter-Paie r, B., Schreiner, E., and Wronski, R.(2004)J Mol Neurosci24(1), 155-165
     33.Volles, M.J., and Lansbury, P.T., Jr.(2007)J Mol Biol 366(5), 1510-1522
     34.Tsigelny, I.F., Bar-On, P., Sharikov, Y., Crews, L., Hashimoto, M., Miller, M.A., Keller, S.H, Platoshyn, O., Yuan, J.X., and Masliah, E.(2007)Febs J 274(7), 1862-1877
     35.Azriel, R., and Gazit, E.(2001)J.Biol.Chem.(276), 34156-34161
     36.Gazit, E.(2002)Bioinformatics(18), 880-883
     3 7 . P o r a t ,Y . ,K o l u s h e v a ,S . ,J e l i n e k ,R . ,a n d G a z i t ,E . ( 2 0 0 3 ) Biochemistry(42), 10971-10977
     38.Mazor, Y., Gilead, S., Benhar, I., and Gazit, E.(2002)J.Mol.Biol.(322), 1013-1024
     39.Reches, M., and Gazit, E.(2003)Science(300), 625-62740.Reches, M., and Gazit, E.(2004)Amyloid(11), 81-89
     41.Lev, N., Melamed, E., and Offen, D.(2006)Neurosci Lett 399(1-2), 27-32
     42.Feany, M.B., and Bender, W.W.(2000)Nature 404(6776), 394-398
     43.Ueda, K., Fukushima, H., Masliah, E., Xia, Y., Iwai, A., Yoshimoto, M., Otero, D.A., Kondo, J., Ihara, Y., and Saitoh, T.(1993)Proc Natl Acad Sci U S A 90(23), 11282-11286
     44.Kessler, J.C., Rochet, J.C., and Lansbury, P.T., Jr(2003)Biochemistry 42(3), 672-678
     45.Lee, H.J., Patel, S., and Lee, S.J.(2005)J Neurosci 25(25), 6016-6024
     46.Lee, H.J., Suk, J.E., Bae, E.J., Lee, J.H., Paik, S.R., and Lee, S.J.(2008) Int J Biochem Cell Biol 40(9), 1835-1849
     虽然结合具体实施方式对本发明进行描述, 但显然各种替代、 修改和变化对本领 域技术人员而言是显而易见的。因此, 其意图包括落入所附权利要求的精神和较宽范围中 的所有这样的替代、 修改和变化。
     在本说明书中提及的所有公开文本、 专利和专利申请均以全文引用方式并入本说 明书中, 其引用程度就如同将每个独立的公开文本、 专利或专利申请特定且个别地以引用 方式并入。此外, 任何参考文献的引用及证明不应解释为承认该参考文献是作为本发明的 现有技术而提供的。所使用的段落标题程度也不应被解释为必要的限制。30102348720 A CN 102348739
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1、10申请公布号CN102348720A43申请公布日20120208CN102348720ACN102348720A21申请号201080011343822申请日2010030961/202,52320090309USC07K14/47200601A61K38/17200601G01N33/6820060171申请人雷蒙特亚特特拉维夫大学有限公司地址以色列特拉维夫72发明人罗尼特沙尔蒂尔卡里奥埃胡德加齐特74专利代理机构北京康信知识产权代理有限责任公司11240代理人李丙林张英54发明名称预防和治疗神经退行性疾病的组合物和方法57摘要本发明提供了一种长度小于20个氨基酸的分离肽。该肽包含氨基酸。

2、序列GVLYVGSKTREGVSEQIDNO12、AAATGLVKREESEQIDNO13或GVVAAAEKTKQGSEQIDNO14、其模拟物和/或片段,该肽能够抑制突触核蛋白聚集。还提供了包括上述物质的药物组合物及其用途。30优先权数据85PCT申请进入国家阶段日2011090986PCT申请的申请数据PCT/IL2010/0001932010030987PCT申请的公布数据WO2010/103515EN2010091651INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书28页序列表13页附图10页CN102348739A1/1页21一种长度小于20个氨基酸的。

3、分离肽,所述肽包含氨基酸序列GVLYVGSKTREGVSEQIDNO12、AAATGLVKREESEQIDNO13或GVVAAAEKTKQGSEQIDNO14、它们的模拟物和/或片段,所述肽能够抑制突触核蛋白聚集。2根据权利要求1所述的肽,包含至少一个芳香族氨基酸。3根据权利要求1所述的肽,包含至少一个碱性氨基酸。4根据权利要求1所述的肽,包含至少一个断裂子氨基酸。5根据权利要求4所述的肽,其中,所述断裂子氨基酸是合成氨基酸。6根据权利要求4所述的肽,其中,所述断裂子氨基酸是天然存在的。7根据权利要求1所述的肽,其中,所述氨基酸序列包含至少一个D氨基酸残基。8根据权利要求1所述的肽,其具有末端。

4、帽修饰。9根据权利要求1所述的肽,其包含KTR或其模拟物。10根据权利要求1所述的肽,其包含KTRE或其模拟物。11根据权利要求1所述的肽,其包含KTREG或其模拟物。12根据权利要求9所述的肽,选自由SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO8、SEQIDNO9、SEQIDNO10、SEQIDNO12和SEQIDNO13组成的组。13根据权利要求1所述的肽,其选自由SEQIDNO5和SEQIDNO6组成的组。14根据权利要求2所述的肽,其选自由SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3和SEQIDNO4组成的组。15一种药物组合物,包含作。

5、为活性成分的权利要求114中任一项所述的肽以及药学上可接受的载体。16一种抑制突触核蛋白聚集的方法,所述方法包括使突触核蛋白与权利要求114中任一项所述的肽接触,从而抑制突触核蛋白聚集。17一种治疗或预防与突触核蛋白聚集有关的疾病的方法,所述方法包括向对其有需要的对象给予治疗有效量的权利要求114中任一项所述的肽,从而治疗与突触核蛋白聚集有关的疾病。18根据权利要求17所述的方法,其中,所述疾病选自由帕金森氏病PD、阿尔茨海默氏病AD、弥漫性路易体病、混合性ADPD、多系统萎缩和哈斯二氏病组成的组。19一种检测突触核蛋白单体的方法,所述方法包括A在允许所述单体和所述肽之间形成复合物的条件下,使。

6、所选的怀疑包含所述突触核蛋白单体的生物样品与权利要求1所述的肽接触;和B检测所述复合物的存在或水平,从而检测突触核蛋白单体。权利要求书CN102348720ACN102348739A1/28页3预防和治疗神经退行性疾病的组合物和方法0001技术领域和背景技术0002许多疾病是由蛋白和多肽结构的遗传性或获得性修饰引起的。当成分蛋白经历大小变化或形状变动并伴随所引起的自缔合及组织沉积例如淀粉样纤维时,就会发生构象病。0003在神经退行性疾病中,蛋白沉积在一大类病因不同的疾病中的作用越来越明显,包括阿尔茨海默氏病、亨廷顿舞蹈症、帕金森氏病、克雅二氏病、朊病毒病和二型糖尿病。在每一种不同的疾病中,不同。

7、的内源性蛋白自组装成高度有序的纤维状结构。虽然在与这些疾病中的每一种相关的蛋白之间无特定的序列同源性,但是认为它们都涉及蛋白质中的重要构象变化,通常产生具有聚集成水不溶性纤维聚合物的强烈倾向的片层结构。0004帕金森氏病PD是继阿尔茨海默氏病AD后的第二最常见的神经退行性疾病,其是一种无法治愈的破坏性的神经系统疾病,侵袭12的老年人口。神经病理学标志的特征为在存活神经元中称为路易体LB和营养缺陷型路易神经炎LN的嗜酸性包涵体、胞浆内包涵体、蛋白质包涵体的存在下,黑质致密部SUBSTANTIANIGRAPARSCOMPACTA中含有多巴胺能神经元的神经黑素的进行性和严重损失。PD的临床特征为运动。

8、障碍,其涉及休息性震颤、运动迟缓、姿势不稳、以及伴有非运动性症状如自主的、认知的和精神病学问题的强直。这些病理特征的原因尚未完全弄清,但认为环境因素以及遗传原因或两者的结合会导致上述临床综合征。目前已知小于10的PD病例具有严格的家族性病因,而多数病例是散发性的。在与家族性PD有关的突变中,已被普遍表征的是核突触蛋白SYN基因中的被称为A53T、A30P和E46K的三个错义突变LOTHARIUS,J,和BRUNDIN,P2002NATREVNEUROSCI312,932942。0005SYN蛋白由140个氨基酸残基组成。其是一种小而高电荷的天然非折叠蛋白。最初确定其为LB和LN的主要组分。SY。

9、N能够分为三个主要区域包含序列KTKEGV的若干不完整重复的氨基末端区域、称为非淀粉样组分NAC区域的疏水中心结构域以及特征为高度带负电荷氨基酸的羧基末端。其在中枢神经系统CNS神经元中显著表达,其位于突触前末梢,与突触囊泡接近并可通过形成两亲性螺旋而与类脂膜联系。0006SYN与突触核蛋白SYN和突触核蛋白SYN是突触核蛋白的家族成员。SYN和SYN最初在脑组织中发现,其主要位于突触前神经末梢,而SYN最初在外周神经系统和视网膜中发现,然而也发现其在某些肿瘤组织中高度表达,包括乳腺、卵巢和膀胱组织。0007三种突触核蛋白的序列高度保守,尤其是在它们的N末端结构域中。当比较SYN和SYN的序列。

10、时,在疏水中心结构域具有主要差异;SYN为134个氨基酸的蛋白,其缺少SYN的NAC区域,因此在不同的应激条件下如自由基或浓度升高不会聚集形成淀粉样纤维。0008在多种神经退行性疾病的病例中,个体突触核蛋白之间定量比例的改变发生以达到突触核蛋白的相对比例增加的程度。可在体外检测到突触核蛋白能够以剂量依赖的方式抑制突触核蛋白的聚集HASHIMOTO等,NEURON322213232001。由说明书CN102348720ACN102348739A2/28页4突触核蛋白过表达而引起正常细胞增殖和分化被破坏的细胞培养物的试验也显示了突触核蛋白在治疗意义上具有有利作用,其使这些培养物中神经突的粘附、存活。

11、和生长进一步正常化。突触核蛋白转基因的小鼠显示该白蛋白的产生升高,从而呈现出突触核蛋白和突触核蛋白之间的数量比例被破坏。在衰老的过程中,它们形成与路易体相似的神经元内包涵体并且也表现出进行性运动障碍,与帕金森氏病中的功能破坏相似。如果将这些具有突触核蛋白的动物与具有突触核蛋白的转基因小鼠显示该白蛋白的产生升高杂交,显著升高的突触核蛋白总表达水平能够恢复稳态。因此,包涵体数量显著减少,并且可完全防止特征神经元功能丧失。0009认为突触核蛋白在阿尔茨海默氏病的病理学中发挥了极其重要的作用。这由这样的事实表明,即该蛋白的一部分,NACP非淀粉样组分蛋白结构域,显示为部分老年斑YOSHIMOTO等,P。

12、ROCNATLACADSCI92,914151995和WO9506407,以及另外的事实,即在约70患有阿尔茨海默氏病的患者脑内的不同区域显示路易体,还发现了突触核蛋白EIZO等,NEUROSCILETT2901,4142000。在转基因小鼠模型中,淀粉样蛋白使突触核蛋白的聚集和神经毒性增加MASLIAH等,PROCNATLACADSCI982112245502001。0010已描述了突触核蛋白以及特别是由其衍生以破坏突触核蛋白聚集的肽。参见,例如,WO/02/04482所述的八肽和WO02/04625中的三种另外的肽。WO002/0020和WO01/60794描述了突触核蛋白作为完整分子的应。

13、用或增加其体内表达以治疗与突触核蛋白相关的神经系统疾病的方法。特别是WOA01/60794还教导了使用相当于突触核蛋白的N末端氨基酸1至15的肽,以防止突触核蛋白和淀粉样蛋白聚集。同样,US2006/0036073和US20080200397教导了衍生自突触核蛋白的N末端氨基酸1至15的短肽片段,以防止突触核蛋白和淀粉样蛋白的结合。US20010047032教导了用于治疗淀粉样变性和突触核蛋白原纤维病的芳香族化合物。WINDISCH等教导了集中于蛋白N末端氨基酸1至15的SYN的缺失突变实验。他们创建了包含衍生自SYN的该序列的氨基酸组合物不同变异的肽库,其明确的目的是为了寻找能够立即用于治疗。

14、性应用的或能够用作发展模拟肽小分子的基础的肽WINDISCH等,2004,JMOLNEUROSCI241,155165。发明内容0011根据本发明的某些实施方式的一个方面,提供了长度小于20个氨基酸的分离肽,该肽包含氨基酸序列GVLYVGSKTREGVSEQIDNO12、AAATGLVKREESEQIDNO13或GVVAAAEKTKQGSEQIDNO14、它们的模拟物和/或片段,该肽能够抑制突触核蛋白聚集。0012根据本发明的某些实施方式的一个方面,提供了一种包含作为活性成分的如本发明所述的肽以及药学上可接受的载体的药物组合物。0013根据本发明的某些实施方式的一个方面,提供了一种抑制突触核蛋。

15、白聚集的方法,该方法包括使突触核蛋白与如本发明的肽接触,从而抑制突触核蛋白聚集。0014根据本发明的某些实施方式的一个方面,提供了一种治疗或预防与突触核蛋白聚集有关的疾病的方法,该方法包括向对其有需要的对象给予治疗有效量的本发明的说明书CN102348720ACN102348739A3/28页5肽,从而治疗与突触核蛋白聚集有关的疾病。0015根据本发明的某些实施方式的一个方面,提供了一种检测突触核蛋白单体的方法,该方法包括0016A在允许单体和所述肽之间形成复合物的条件下,使所选的怀疑包含突触核蛋白单体的生物样品与本发明的肽接触;和0017B检测该复合物的存在或水平,从而检测突触核蛋白单体。0。

16、018根据本发明的某些实施方式,该肽包含至少一个芳香族氨基酸。0019根据本发明的某些实施方式,该肽包含至少一个碱性氨基酸。0020根据本发明的某些实施方式,该肽包含至少一个断裂子氨基酸BREAKERAMINOACID。0021根据本发明的某些实施方式,该断裂子氨基酸是合成氨基酸。0022根据本发明的某些实施方式,该断裂子氨基酸是天然存在的。0023根据本发明的某些实施方式,该氨基酸序列包含至少一个D氨基酸残基。0024根据本发明的某些实施方式,该肽具有末端帽修饰。0025根据本发明的某些实施方式,该肽包含KTR或其模拟物。0026根据本发明的某些实施方式,该肽包含KTRE或其模拟物。0027。

17、根据本发明的某些实施方式,该肽包含KTREG或其模拟物。0028根据本发明的某些实施方式,该肽选自由SEQIDNO1、2、3、4、8、9、10、12和13组成的组。0029根据本发明的某些实施方式,该肽选自由SEQIDNO5和6组成的组。0030根据本发明的某些实施方式,该肽选自由SEQIDNO1、2、3和4组成的组。0031根据本发明的某些实施方式,所述疾病选自由帕金森氏病PD、阿尔茨海默氏病AD、弥漫性路易体病、混合性ADPD、多系统萎缩和哈斯二氏病组成的组。0032除非另有定义,本文中使用的所有技术和/或科学术语与本发明涉及的本领域普通技术人员所公知的术语具有相同的含义。虽然与本文描述相。

18、似或等同的方法或材料可用于实施或测试本发明的实施方式,但在下文中叙述了示例性方法和/或材料。在发生冲突的情况下,以专利说明书包括定义为准。此外,材料、方法和实施例仅仅是描述性的,并非意图做必要的限制。附图说明0033本文中仅以举例的方式参照附图对本发明进行描述。本文中对附图的详细内容进行具体参考,是强调以实施例的方式显示详细内容并且仅意图对本发明的优选实施方式进行描述性讨论,并且是为了提供认为最有用和最容易理解的本发明的原理说明和概念层面而提出的。在这方面,与基本理解本发明所必需的细节相比,未试图更加详细地显示本发明的结构细节,结合附图进行的描述使得如何使本发明的几种形式在实施中体现对本领域技。

19、术人员是显而易见的。0034在图中0035图1A图1D是作为SYN聚集抑制剂的衍生肽的示意图。图1ASYN抑制SYN聚集的形成。图1B使用肽阵列分析进行SYN结合序列对SYN的分子定说明书CN102348720ACN102348739A4/28页6位。图1C潜在的基于肽的SYN聚集抑制剂。图1D肽阵列技术的示意图HTTP/WORLDWIDEWEBDOTJPTDOTCOM/PRODUCTS/PEPTIDEARRAYS/PEPSPOTSDOTHTM。0036图2A图2B是SYN蛋白内的SYN结合序列的筛选结果照片。图2A在纤维素膜上合成与SYN的连续重叠序列相对应的十聚体肽,并与SYN孵化。SYN。

20、序列中每个斑点的序列及其位置在斑点下方提及。在前十五个氨基酸中,有一个氨基酸在该十聚体肽内移位。余下的有五个氨基酸移位。图2B使用严格条件进行了另一个筛选,一个氨基酸沿整条蛋白移位。此处将氨基酸序列提供如下。0037MDVFMKGLSMSEQIDNO230038DVFMKGLSMASEQIDNO240039VFMKGLSMAKSEQIDNO250040FMKGLSMAKESEQIDNO260041MKGLSMAKEGSEQIDNO270042KGLSMAKEGVSEQIDNO280043GLSMAKEGVVSEQIDNO290044LSMAKEGVVASEQIDNO300045SMAKEGVV。

21、AASEQIDNO310046MAKEGVVAAASEQIDNO320047AKEGVVAAAESEQIDNO330048KEGVVAAAEKSEQIDNO340049EGVVAAAEKTSEQIDNO350050GVVAAAEKTKSEQIDNO80051VVAAAEKTKQSEQIDNO90052VAAAEKTKQGSEQIDNO100053KTKQGVTEAASEQIDNO360054VTEAAEKTKESEQIDNO370055EKTKEGVLYVSEQIDNO380056GVLYVGSKTRSEQIDNO10057GSKTREGVVQSEQIDNO400058EGVVQGVASVSE。

22、QIDNO410059GVASVAEKTKSEQIDNO70060LGGAVFSGAGSEQIDNO110061FSGAGNIAAASEQIDNO420062NIAAATGLVKSEQIDNO430063TGLVKREEFPSEQIDN440064REEFPTDLKPSEQIDNO450065TDLKPEEVAQSEQIDNO460066EEVAQEAAEESEQIDNO470067EAAEEPLIEPSEQIDNO480068PLIEPLMEPESEQIDNO49说明书CN102348720ACN102348739A5/28页70069LMEPEGESYESEQIDNO500070GESYE。

23、DPPQESEQIDNO510071DPPQEEYQEYSEQIDNO520072EYQEYEPEASEQIDNO530073VLYVGSKTRESEQIDNO20074LYVGSKTREGSEQIDNO30075YVGSKTREGVSEQIDNO40076AAATGLVKRESEQIDNO50077AATGLVKREESEQIDNO60078图3A图3K为描绘了SYN纤维装配的体外抑制的照片和图表。图3A筛选出对SYN聚集有抑制作用的SYN肽摩尔比为201。图3B在肽36和39SEQIDNO1和4的存在下,SYN聚集的动力学分析。对照为,肽SYN39与SYN为,肽SYN36与SYN为。图3C。

24、肽SYN36对SYN聚集的剂量依赖性抑制作用。图3D图3K具有若干肽的SYN原纤维TEM图像;仅有SYN、SYN6短肽、36、37、38、39、77、78。6短肽、37和38条带500NM。余下的肽条带1M。0079图4A图4B为抑制剂存在和不存在时,SYN聚集的生化分析结果的照片。图4A随着时间推移的SYN的聚集。37C下摇动时形成可溶性寡聚体。使用蛋白印迹分析进行检测。图4B使用SYN肽孵化24小时后对寡聚体装配的抑制作用。使用蛋白印迹分析进行检测。0080图5A图5B为描述SYN修饰肽的分析的图表。图5A使用THT荧光试验检测对SYN纤维装配的抑制作用。筛选三种对SYN聚集有抑制作用的S。

25、YN36修饰肽。仅有SYN为黑色,SYN36与SYN为深灰色,修饰肽和SYN为浅灰和白色,顺序从左至右为SYN36D、逆反肽RETROINVERSO、酰胺化和乙酰化的逆反肽。SYN肽的摩尔比分别为120和110。图5B使用荧光各向异性法测定包含色氨酸而非酪氨酸的SYN36与SYN单体的亲和力。KD1M。0081图6A图6C为HPLC谱图,其描绘了在小鼠脑提取物中肽的稳定性。对WTICR小白鼠的脑提取物进行提取,并与肽SYN36和SYN36逆反肽孵化两小时,并在C18色谱柱上载样。图6A小鼠脑提取物的图谱红色。图6BSYN36肽蓝色和与脑提取物孵化的SYN36肽红色的图谱。图6CSYN36逆反肽。

26、蓝色和与脑提取物孵化的SYN36逆反肽红色的图谱。0082图7A图7F为随后的NMR分析的图表和图谱。结合了SYN后的逆反肽的骨架原子HA灰色和HN黑色化学位移偏移图7A;结合后绿色SYN衍生的逆反肽红色和SYN蓝色的TOCSY图谱重叠的HAHN区域图7B,并且结合后显示偏离的所有逆反肽峰发生扩张图7C图7E。在SYN36D和缺少氨基酸G、V、L的SYN36D短肽存在和不存在时,SYN的THT分析图7F。0083图8A图8E为描绘了SYN36逆反肽进入细胞的内化作用的照片。使用50M和250M结合了FITC的SYN36逆反肽对过表达WTSYN细胞的分化型SHSY5Y孵化05小时、2小时和4小时。

27、。固定后,检测细胞中FITC结合肽绿色的存在。使用CY5结合抗体紫色检测细胞SYN,并用鬼笔环肽标记膜红色。图8A37下30分说明书CN102348720ACN102348739A6/28页8钟后,没有肽染色绿色。图8B图8C孵化2小时后,在细胞内未检测到或仅检测到少量肽绿色。图8D图8E孵化4小时后,在细胞内明确检测到肽。使用LSM510蔡司共聚焦显微镜使肽的内化可视化。0084图9为描绘了果蝇运动攀爬行为的分析结果的条形图。用攀爬试验对四种果蝇进行分析,每种包含五支试管,每支试管十只果蝇。在常规培养基上生长并表达SYNA53T的雌性后代为黑色。在含有SYN逆反肽的培养基上生长并表达SYNA。

28、53T的雌性后代为灰色。在常规培养基上生长的对照雌性后代为条纹线。在含有SYN逆反肽的培养基上生长的对照雌性后代为白色。结果显示了沿试管攀爬20秒以上的果蝇百分比。0085图10为SYN36逆反肽的NMR归属图谱在相同条件下根据该条件进行归属采集的TOCSY红色和NOESY绿色谱的HNHA相互作用区域的重叠。具体实施方式0086本发明的某些实施方式涉及用于治疗和预防神经退行性疾病的组合物及方法。0087在详细解释本发明的至少一个实施方式之前,应理解本发明并非将其应用限于如下说明书所陈述的或由实施例举例说明的细节。本发明可有其他实施方式或以不同方式实施或进行。0088突触核蛋白的细胞内寡聚化与帕。

29、金森氏病和其他神经退行性疾病有关,因此被认为是疾病的病情改善疗法的重要靶标。0089由于突触核蛋白已表现出以剂量依赖方式抑制突触核蛋白的聚集,本发明人将整条SYN的序列进行系统性地定位以确定具有介导SYN和SYN的分子识别事件潜力的所有结构域。使用常见的肽阵列技术并发现了若干相互作用区域图2A。使用第二张膜以在严格条件下证实这些结果图2B,该严格条件可准确定位出现在两张膜上的斑点。合成了与相互作用区域相对应的十聚体肽,并且使用THT和TEM试验测试了其抑制SYN聚集的能力。两种方法均显示相关的结果,表明该肽对原纤维形成具有抑制作用图3A图3K。0090本发明人进一步示出了某些肽仅能够抑制一种类。

30、型的聚集,而其他肽能够抑制蛋白的可溶性和不溶性聚集图4。0091为了将分子识别模块发展成为药物候选物,设计了最好的肽抑制剂的逆反类似物。虽然该肽与天然肽相比显示出难以区分的活性,但显示其在人血清中是稳定的图6A图6C并且可穿透过表达突触核蛋白的细胞图8A图8E。NMR分析定位了D氨基酸肽和突触核蛋白间相互作用的交会处界面,INTERFACE图7A图7F。最后,将该肽给予表达突变型A53T突触核蛋白的果蝇模型导致所处理的果蝇攀爬表型显著改善图9。本发明人提出根据本发明的教导而生成的改造肽能够作为发展新型治疗剂的先导,以治疗通常的神经退行性疾病,特别是帕金森氏病。0092本发明的实施方式提供长度小。

31、于20个氨基酸的分离肽,该肽包含突触核蛋白的氨基酸序列GVASVAEKTKSEQIDNO7、GVLYVGSKTREGVSEQIDNO12、AAATGLVKREESEQIDNO13或GVVAAAEKTKQGSEQIDNO14、它们的模拟物和/或片段,该肽能够抑制突触核蛋白聚集。0093如本文中所使用的,“突触核蛋白”是指SNCB基因的蛋白产物,该SNCB基因的说明书CN102348720ACN102348739A7/28页9GENBANK登陆号为NP_0010015021SEQIDNO15、NP_0030761SEQIDNO16。0094短语“能够抑制突触核蛋白聚集”是指使突触核蛋白聚集例如,寡。

32、聚化和/或纤维形成降低至少10,更优选至少20,更优选至少30,更优选至少40,更优选至少50,更优选至少60,更优选至少70,更优选至少80,更优选至少90,更优选至少100的能力。根据一个实施方式,本发明这方面的肽能够抑制突触核蛋白聚集。0095如本文中所使用的,术语“原纤维”是指细线样的丝状结构,在电子显微镜下通常可见其由高度有序的聚集体构成。0096在实施例3通过透射电子显微镜TEM分析、实施例4通过蛋白印迹分析和实施例6中THT结合试验描述了监测本发明所述的肽下调突触核蛋白聚集的方法。其他方法在美国专利第6,184,351号以及美国专利申请第2002151464号和第20030027。

33、210号中提供,将其全部内容以引用方式并入本文。0097术语“分离的”是指从生理环境或分离或基本上没有其他生物材料。0098本文中所使用的术语“肽”包括天然肽降解产物、以合成方法合成的肽或重组肽和模拟肽通常为以合成方法合成的肽,以及类肽PEPTOID和半类肽SEMIPEPTOID,其为肽类似物,可具有例如使肽在体内更稳定的修饰。这类修饰包括但不限于N末端修饰,C末端修饰,肽键修饰,包括但不限于CH2NH、CH2S、CH2SO、OCNH、CH2O、CH2CH2、SCNH、CHCH或CFCH,骨架修饰,和残基修饰。制备模拟肽化合物的方法是本领域公知的,并且在例如QUANTITATIVEDRUGDE。

34、SIGN,CARAMSDENGD,CHAPTER172,FCHOPLINPERGAMONPRESS1992中具体说明,此处以引用方式并入本文,如同本文完全阐述。这方面的进一步详细情况提供如下。其他修饰例如,末端加帽进一步描述如下。0099所述肽的长度可为220、215、415、515、410和510个氨基酸残基。因此,该肽可由2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸残基构成。0100因此,该肽可包含以下的示例性肽或由以下的示例性肽组成01013646GVLYVGSKTRSEQIDNO101023747VLYVGSKTRESEQID。

35、NO201033848LYVGSKTREGSEQIDNO301043949YVGSKTREGVSEQIDNO401057787AAATGLVKRESEQIDNO501067888AATGLVKREESEQIDNO601075161GVASVAEKTKSEQIDNO701081424GVVAAAEKTKSEQIDNO801091525VVAAAEKTKQSEQIDNO901101626VAAAEKTKQGSEQIDNO100111根据示例性的实施方式,该肽不是YVGSKTREGVVSEQIDNO17;VAAAEKTKQGVSEQIDNO18,LSSEQIDNO19,GLSEQIDNO20和KEG。

36、SEQIDNO21,尽管根据本教导,这些肽中的至少一些能够用于治疗性应用中。0112根据另外的实施方式,该肽包含氨基酸序列KTRSEQIDNO58或由氨基酸序列说明书CN102348720ACN102348739A8/28页10KTRSEQIDNO58组成。0113根据另外的实施方式,该肽包含氨基酸序列KTRESEQIDNO59或由氨基酸序列KTRESEQIDNO59组成。0114根据另外的实施方式,该肽包含氨基酸序列KTRGSEQIDNO60或由氨基酸序列KTRGSEQIDNO60组成。0115肽内的肽键CONH可被以下键所代替,例如N甲基化键NCH3CO、酯键CRHCOOCRN、酮亚甲基键。

37、COCH2、氮杂键NHNRCO其中R为任意烷基例如甲基、卡巴键碳胺键,CARBABONDCH2NH、羟基亚乙基键CHOHCH2、硫代酰胺键CSNH、烯族双键CHCH、逆酰胺键NHCO、肽衍生物NRCH2CO其中R是天然存在于碳原子上的“正常”侧链,。0116这些修饰可在沿肽链的任意键上发生,甚至同时在若干23个个键上发生。0117芳香族氨基酸可以是任何天然存在的或合成的芳香族残基,包括但不限于苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯基甘氨酸或它们的修饰体、前体或功能性芳香部分。如下的表2中提供了能够形成本发明的肽的一部分的芳香族残基的实例。0118因此,天然芳香族氨基酸TRP、TYR和PHE可被合成的非天。

38、然氨基酸置换,如苯基甘氨酸、TIC,萘基丙氨酸NAL、苯基异丝氨酸、苏氨醇THREONINOL、PHE的环状甲基化衍生物、PHE的卤化衍生物或O甲基TYR。0119除上述以外,本发明的肽还可包括一个或多个修饰氨基酸或一个或多个非氨基酸单体例如,脂肪酸、复杂碳水化合物,等。0120如在本文说明书和权利要求书部分所使用的,术语一种或多种“氨基酸”应理解为包括20种天然存在的氨基酸;那些经常在体内翻译后修饰的氨基酸,包括例如,羟脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸;以及其他罕见的氨基酸,包括但不限于2氨基己二酸、羟基赖氨酸、异锁链赖氨素、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。此外,术语“氨基酸”包括D和L氨基酸。0。

39、121所述肽还可包含保守的氨基酸取代,其可包括天然存在的保守取代或合成取代,见于例如KARLIN,S和GHANDOUR,G,1985,MULTIPLEALPHABETAMINOACIDSEQUENCECOMPARISONOFTHEIMMUNOGLOBULINCHAINCONSTANTDOMAINPROCEEDINGSOFTHENATIONALACADEMYOFSCIENCESOFTHEUNITEDSTATESOFAMERICA82,85978601。0122氨基酸分类0123按化学性质酸性DE、脂肪族AGILV、酰胺NQ、芳香族FWY、碱性RHK、羟基ST、亚氨基IMINOP、硫CM;0124。

40、按功能酸性、碱性、疏水性A、I、L、M、F、P、W、V、极性N、C、Q、G、S、T、Y;0125按电荷酸性、碱性、中性;0126按结构不定的A、C、G、P、S、T、W、Y、外部的R、N、D、Q、E、H、K、内部的I、L、M、F、V。0127单个氨基酸编码提供如下。0128以下表1和表2列出了可用于本发明的天然存在的氨基酸表1和非常规的或修饰的氨基酸例如,合成的,表2。0129表1说明书CN102348720ACN102348739A9/28页110130单字母符号三字母缩写氨基酸AALA丙氨酸RARG精氨酸NASN天冬酰胺DASP天冬氨酸CCYS半胱氨酸QGLN谷氨酰胺EGLU谷氨酸GGLY甘。

41、氨酸HHIS组氨酸IIIE异亮氨酸LLEU亮氨酸KLYS赖氨酸MMET甲硫氨酸FPHE苯丙氨酸PPRO脯氨酸SSER丝氨酸TTHR苏氨酸WTRP色氨酸YTYR酪氨酸VVAL缬氨酸XXAA任意上述氨基酸01310132表20133说明书CN102348720ACN102348739A10/28页120134说明书CN102348720ACN102348739A11/28页130135说明书CN102348720ACN102348739A12/28页140136由于本发明的肽优选用于治疗或诊断,需要肽为可溶性形式,因此本发明所述的肽可包括一个或多个非天然或天然极性氨基酸,包括但不限于丝氨酸和苏氨酸。

42、,由于它们说明书CN102348720ACN102348739A13/28页15的含羟基侧链从能够增加肽的溶解度。0137本发明的某些实施方式中所述的肽包含至少1个、2个、3个、4个或更多个碱性氨基酸残基,以增强与突触核蛋白的结合。根据示例性的实施方式,碱性氨基酸位于肽的末端C和/或N。0138根据本发明某些实施方式的肽包括至少一个片层阻断子氨基酸残基,其位于如下所述的肽序列中。包括这样的片层阻断子氨基酸的肽保留了对突触核蛋白多肽的识别但防止其聚集。根据本发明的一个实施方式,片层阻断子氨基酸是天然存在的氨基酸,如脯氨酸,其特征为约60至25度的有限角而不是约120至140度的通常片层的角,从而。

43、破坏突触核蛋白纤维的片层结构。其他的片层阻断子氨基酸残基包括但不限于天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸和丝氨酸根据CHOU和FASMAN1978ANNUREVBIOCHEM47,258。0139根据本发明的该方面的另一个实施方式,片层阻断子氨基酸残基为合成氨基酸,如C甲基化氨基酸,其构象约束受到限制BALARAM,1999JPEPTRES54,195199。与天然氨基酸不同,C甲基化氨基酸具有与C连接的氢原子,这在很大程度上影响其与酰胺键的和角相关的空间特性质,并更加有效地介导其治疗效果。0140片层阻断子氨基酸或芳香族氨基酸可以位于肽内的任意位置N末端、C末端、或N或C端位于其两侧的区域。01。

44、41根据本发明的示例性实施方式,所述肽具有末端帽修饰。0142如本文中所使用的,短语“末端帽子修饰的肽”是指在其N氨基末端和/或在C羧基末端处被过修饰的肽。末端帽修饰是指将化学部分连接于末端以形成帽结构。在本文中,这样的化学部分是指末端帽部分,在本文及本领域中也通常可互换地指代肽保护部分或基团。0143如本文中所使用的,短语“末端帽部分”是指当连接于肽的末端时修饰末端帽的部分。末端帽修饰通常导致肽末端电荷的掩蔽,和/或其化学特性的改变,如疏水性、亲水性、反应性、溶解性等。适合用于肽末端帽修饰的部分的实例可见于,例如,GREEN等,PROTECTIVEGROUPSINORGANICCHEMIST。

45、RY,WILEY,2SUPNDED1991和HARRISON等,COMPENDIUMOFSYNTHETICORGANICMETHODS,VOLS18JOHNWILEY和SONS,19711996。0144N末端的末端帽部分的代表性实例包括,但不限于,甲酰基、乙酰基本文中也表示为“AC”、三氟乙酰基、苄基、苄氧羰基本文中也表示为“CBZ”、叔丁氧羰基本文中也表示为“BOC”、三甲基硅基也表示为“TMS”、2三甲基硅基乙烷磺酰基也表示为“SES”、三苯甲基和取代的三苯甲基、烯丙基氧羰基、9芴甲氧羰基本文中也表示为“FMOC”、以及硝基藜芦基氧羰基“NVOC”。0145C末端的末端帽部分的代表性实例。

46、通常为导致C末端处的羧基酰化的部分包括,但不限于,苄基和三苯基醚、以及烷基醚、四氢吡喃基醚、三烷基硅基醚、烯丙基醚、单甲氧基三苯甲基和二甲氧基三苯甲基。可替代地,C末端末端帽结构的COOH基可被修饰成酰胺基。0146肽的其他末端帽修饰包括用不同的部分代替氨基和/或羧基,如羟基、巯基、卤说明书CN102348720ACN102348739A14/28页16素、烷基、芳基、烷氧基、芳氧基等,如本文中所定义的术语。0147可进一步通过芳香性对末端帽部分进行分类。因此,末端帽部分可以是芳香性或非芳香性的。0148适合N末端修饰的非芳香性末端帽部分的代表性实例包括,但不限于,甲酰基、乙酰基、三氟乙酰基、。

47、叔丁氧羰基、三甲基硅基、和2三甲基硅基乙烷磺酰基。适合C末端修饰的非芳香性末端帽部分的代表性实例包括,但不限于,酰胺类、烯丙基氧羰基、三烷基硅基醚和烯丙基醚。0149适合N末端修饰的芳香性末端帽部分的代表性实例包括,但不限于,芴甲氧羰基FMOC。适合C末端修饰的芳香性末端帽子部分的代表性实例包括,但不限于,苄基、苄氧羰基CBZ、三苯甲基和取代的三苯甲基。0150应理解,由于在治疗中使用短肽的主要障碍之一是立体特异性细胞蛋白酶对其进行蛋白水解降解,本发明所述的肽能够由天然氨基酸的D异构体合成即,反肽类似物,TJERNBERG1997JBIOLCHEM272126015,GAZIT2002CURR。

48、MEDCHEM916671675。0151另外,本发明所述的肽包括其逆RETRO类似物、反INVERSO类似物和逆反RETROINVERSO类似物。应理解,通常发现激素的完整或扩充EXTENDED的部分逆反类似物保留或增强了生物活性。也发现逆反作用RETROINVERSION可应用于合理设计酶抑制剂的领域参见美国专利第6,261,569号。0152如本文中所使用的,“逆肽”是指由L氨基酸残基构成的肽,其按照与天然肽序列相反的方向进行装配。0153天然存在多肽的逆反修饰涉及具有与相应的L氨基酸立体化学相反的碳的氨基酸的合成装配,即,D或D别氨基酸DALLOAMINOACID以与天然肽序列相反的顺。

49、序装配。因此,逆反类似物具有反转的末端及方向相反的肽键,而基本上保持侧链的拓扑结构与天然肽序列相同。0154应进一步了解,在本发明所述肽的N末端或C末端添加诸如胆酰基的有机基团能够提高治疗肽的效力和生物利用度例如,穿过血脑屏障FINDEIS1999BIOCHEMISTRY3867916800。0155最近开发的用于穿过BBB的系统被称为受体介导的转运RECEPTORMEDIATEDTRANSPORT,RMT。该系统使用模拟肽单克隆抗体MABS以帮助大分子穿过BBBPARDRIDGEWMPHARMRES2007;249173344。这些MABS可与所关注的肽结合或与所关注的肽融合,然后使用内源性受体以穿过BBB进入。0156根据一个实施方式,将本发明所述的肽连接于缓释增强剂。典型的缓释增强剂包括,但不限于透明质酸HA、褐藻酸AA、聚羟乙基丙烯酸甲酯POLYHEMA、聚乙二醇PE。

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