采用免疫细胞源性的微小RNA评估生殖障碍患者的方法与组合物.pdf

本发明涉及方法和组合物，所述方法和组合物用于在介入之前或之后收集免疫细胞(优选外周血单核细胞(PBMC))，从所述细胞提取含微小RNA的RNA，对所提取的RNA中的微小RNA定量，测定在统计学足够数量的患者样品中显示双峰性反应的一种或多种微小RNA。然后，优选将患者根据其反应分为不同组。

1.  一种基于微小RNA的表达来鉴定患者群中至少两种特征性的组的方法，所述方法包括如下步骤：
a)收集免疫细胞；
b)从所述免疫细胞提取含微小RNA的RNA；
c)定量所述提取的RNA中的至少一种微小RNA；和
d)基于所述至少一种微小RNA的表达将所述患者群划分成不同组。

2.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述收集免疫细胞的步骤包括收集外周血单核细胞。

3.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述划分所述患者群的步骤包括：将相对高水平表达所述至少一种微小RNA的患者分配至第一组，并将相对低水平表达所述至少一种微小RNA的患者分配至第二组。

4.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述收集免疫细胞的步骤包括在免疫疗法治疗之前收集所述细胞。

5.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述收集免疫细胞的步骤包括在免疫疗法治疗之后收集所述细胞。

6.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述收集免疫细胞的步骤包括：在免疫疗法治疗之前和之后收集所述细胞，并且其中所述划分所述患者群的步骤包括：测定所述免疫疗法治疗之后所述至少一种微小RNA的表达水平的变化。

7.  如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述划分所述患者群的步骤包括：将表达水平显示第一变化的患者分配至第一组，并将表达水平显示第二变化的患者分配至第二组。

8.  如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第一变化是表达水平的相对大的变化，而所述第二变化是表达水平的相对小的变化。

9.  如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第一变化是表达水平的正向变化，而所述第二变化是表达水平的负向变化。

10.  如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第一组中所述至少一种微小RNA表达水平变化的平均值的绝对值除以标准偏差大于或等于1。

11.  如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤：鉴定已知微小RNA的组中的微小RNA亚组，其在所述第一组中显示表达水平变化以 致所述表达水平变化的平均值的绝对值除以标准偏差大于或等于1。

12.  如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤：鉴定已知微小RNA组中的微小RNA，其在所述第一组中显示表达水平的最大变化。

13.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤：
a)从其它患者收集免疫细胞；
b)从所述其它患者的免疫细胞提取含微小RNA的RNA；
c)定量从所述其它患者提取的RNA中的至少一种微小RNA；和
d)基于所述至少一种微小RNA的表达将所述其它患者鉴定为属于划分的不同组之一。

14.  如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤：基于所述鉴定对所述其它患者给予治疗。

15.  如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述给予治疗的步骤包括给予IVIG。

16.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤：基于所属划分组诊断患者患有病症。

17.  如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述病症是生殖疾病。

18.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤：监测对属于所述划分的组之一的患者的治疗，所述监测通过收集免疫细胞、提取至少一种微小RNA并在此后定量所述至少一种微小RNA来进行。

19.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种微小RNA选自下组：hsa-let-7e、hsa-mir-1181、hsa-miR-1183、hsa-miR-1224-5p、hsa-miR-127-3p、hsa-mir-1296、hsa-mir-132、hsa-mir-136、hsa-miR-139-3p、hsa-mir-141、hsa-miR-142-3p、hsa-mir-142-5p、hsa-mir-144、hsa-mir-153、hsa-mir-1537、hsa-miR-154、hsa-miR-191、hsa-mir-193a-3p、hsa-miR-19a、hsa-mir-219-5p、hsa-mir-29b、hsa-mir-301a、hsa-miR-301b、hsa-miR-30e、hsa-mir-32、hsa-mir-33a、hsa-miR-340、hsa-miR-362-3p、hsa-miR-371-5p、hsa-377、hsa-miR-423-3p、hsa-miR-432、hsa-mir-513a-5p、hsa-mir-545、hsa-miR-548a-5p、hsa-miR-574-5p、hsa-mir-582-3p、hsa-mir-590-5p、hsa-mir-15a、hsa-mir-548c-5p、hsa-mir-1225-3p、hsa-mir-29b、hsa-mir-21、hsa-mir-1237、hsa-mir-101、hsa-mir-1539、hsa-mir-557、hsa-mir-125a-3p和hsa-mir-423-5p。

20.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种微小RNA选自下 组：hsa-mir-136、hsa-mir-141、hsa-mir-142-5p、hsa-mir-144、hsa-mir-153、hsa-mir-1537、hsa-mir-193a-3p、hsa-mir-219-5p、hsa-mir-29b、hsa-mir-301a、hsa-mir-32、hsa-mir-33a、hsa-mir-545、hsa-mir-582-3p、hsa-mir-590-5p、hsa-mir-1181、hsa-mir-513a-5p、hsa-mir-132和hsa-mir-1296。

21.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种微小RNA选自下组：hsa-miR-144、hsa-miR-582-5p、hsa-miR-30e-3p、hsa-miR-340-5p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-210、hsa-miR-221-5p、hsa-miR-33a-5p、hsa-miR-575、hsa-miR-7-5p、hsa-miR-1229、hsa-miR-1267、hsa-miR-671-3p、hsa-miR-1244、hsa-miR-1和hsa-miR-133b。

22.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种微小RNA选自下组：hsa-miR-1229和hsa-miR-671-3p。

23.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：利用选自下组的至少四种微小RNA进行定量和分组：miR-7-5p、miR-1229、miR-1267、miR-671-3p、miR-340-5p、hsa-miR-1、hsa-miR-133b和hsa-miR-33a-5p。

采用免疫细胞源性的微小RNA评估生殖障碍患者的方法与组合物
发明领域
本公开一般涉及免疫学，更具体地涉及采用一种或多种微小RNA序列的表达模式来表征个体或个体的组的方法和组合物。
发明背景
医师面临着诊断和治疗决定。需要将患者归入诊断和治疗组来做出这些决定。医师可利用多种手段做出此类决定。然而，没有哪种单一门类的方法有普遍成功性。对用于将患者分为诊断类和治疗类的新方法存在持续需求。
已发现称作微小RNA的一类调节性RNA短分子对于mRNA后续翻译成基因产物具有显著影响。真核细胞中发现的核糖核酸的短单链聚合物具有转录后作用，与信使RNA转录本上的基本互补序列结合。调节作用通常通过翻译阻遏(translational repression)、mRNA降解和基因沉默。Morozova N.,Zinovyev A.,Nonne N.,Pritchard L.-L.,Gorban A.N.和Harel-Bellan A.(2012年9月)."Kinetic signatures of microRNA modes of action(微小RNA作用模式的动态签名)".RNA18(9):1635–1655)。与多细胞动物中的靶mRNA的互补性是不完全的，但通常涵盖包含碱基2-7的序列，“种子序列”。这导致的低严谨性需求使miRNA能够靶向多于单一的mRNA。可在整个基因组的多个优选位点找到初级miRNA(Pri-miRNA)序列。部分地，它们的定位指导其选择性转录。发现其多在基因间区域或与相邻调控基因(neighboring-regulated gene)反义。("Kinetic signatures of microRNA modes of action(微小RNA作用模式的动态签名)".RNA18(9):1635–1655。Lee Y,Kim M,Han J,Yeom KH,Lee S,Baek SH,Kim VN(2004年10月)."MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II(微小RNA基因由RNA聚合酶II转录)".EMBO J.23(20):4051–60.)。
微小RNA还可与靶mRNA一同转录从而允许所述微小RNA和所述靶蛋白编码基因的联合调控。Mraz,M.；Dolezalova,D.；Plevova,K.；Stano Kozubik,K.； Mayerova,V.；Cerna,K.；Musilova,K.；Tichy,B.等.(2012)."MicroRNA-650expression is influenced by immunoglobulin gene rearrangement and affects the biology of chronic lymphocytic leukemia(微小RNA-650表达受免疫球蛋白基因重排的影响并影响慢性淋巴细胞性白血病生物学)".Blood119(9):2110–2113.)。其大部分位于内含子序列内、蛋白质编码转录本和非蛋白质编码转录本内，以及非蛋白质编码转录本的外显子内。(Rodriguez A,Griffiths-Jones S,Ashurst JL,Bradley A(2004年10月)."Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units(哺乳动物微小RNA宿主基因和转录单元的鉴定)".Genome Res.14(10A):1902–10.)。协同调节也可通过通用启动子序列的应用来施行(coordinate regulation)。(Lee Y,Kim M,Han J,Yeom KH,Lee S,Baek SH,Kim VN(2004年10月)."MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II(微小RNA基因由RNA聚合酶II转录)".EMBO J.23(20):4051–60.)。(Altuvia Y,Landgraf P,Lithwick G,Elefant N,Pfeffer S,Aravin A,Brownstein MJ,Tuschl T,Margalit H(2005)."Clustering and conservation patterns of human microRNAs(人微小RNA的成簇和保守模式)".Nucleic Acids Res.33(8):2697–706.)。
微小RNA的表达可以是生物体范围(organism-wide)的基因调节或器官局限性的(organ-limited)基因调节。基于血浆或血清的试验已成为吸引人的研究领域。一个示例是微小RNA以多种不同的抗RNA酶形式释放进入血浆，这些抗RNA酶形式允许通过外周血采集物来对其进行检测。(Mitchell等,Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection(循环微小RNA作为稳定的基于血液的标志物供于癌症检测),PNAS(2008)105(30):10513-10518。Vishnu Swarup,M.R.Rajeswari,Circulating(cell-free)nucleic acids–A promising,non-invasive tool for early detection of several human diseases(循环(无细胞)核酸－供于数种人类疾病的早期检测的有前景的非侵入性手段),FEBS Letters581(2007)795–799.)。胎盘微小RNA表达可用作示例来说明对于器官局限性的基因调节的活跃研究的领域。(Chim SSC,Detection and Characterization of Placental MicroRNAs in Maternal Plasma(母方血浆中胎盘微小RNA的检测与表征),Clinical Chemistry,(2008)54(3):482-490.)。研究者希望对妊娠相关疾病的“胎盘相关的”微小RNA进行表征和定量。(Gilad S,Meiri E,Yogev Y,Benjamin S,Lebanony D等.(2008)Serum MicroRNAs Are Promising Novel Biomarkers(血清微小RNA是有前景的新型生物标志物).PLoS  ONE3(9):e3148.doi:10.1371/journal.pone.0003148。Miura K,Identification of Pregnancy-Associated MicroRNAs in Maternal Plasma(母方血浆中妊娠相关微小RNA的鉴定),Clinical Chemistry(2010)56(11):1767-1771.)。
尽管血清和血浆包含释放的器官特异性和组织特异性微小RNA，血液中循环细胞中存在的微小RNA仍组成并彻底分隔并可检测地汇集。此类细胞物质组成免疫系统的部分。检测血源性细胞的微小RNA组成提供对免疫功能的了解。血源性细胞组成物如淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞或其它不同群体的分离允许进一步了解这些不同组成物的行为及相关生物学。基于表面和其它区别性标志物对血源性细胞组成物(具体但不限于淋巴细胞)的进一步分离允许进一步表征。
探究血源性细胞的微小RNA表达的实用性在对不同种类炎症相关的以及对治疗的响应程度或缺乏响应相关的微小RNA模式化量变的鉴定中得以清楚展示。Tang等对外周血单核细胞(PBMC)检测了微小RNA-146a。他们发现红斑狼疮(SLE)患者的PBMC中该微小RNA表达不足。(Tang Y等,MicroRNA-146a Contributes to Abnormal Activation of the Type I Interferon Pathway in Human Lupus by Targeting the Key Signaling Proteins(微小RNA-146a通过靶向关键信号转导蛋白质导致人类狼疮中I型干扰素通路的异常活性),Arthritis and Rheumatism,(2009)60(4):1065-1075.)。已显示Mir-146a是先天免疫功能的重要调节物，I型干扰素(IFN I)的负调节物。(Taganov KD,Boldin MP,Chang KJ,Baltimore D.NF-’B-dependent induction of microRNA miR-146,an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune responses(靶向先天免疫应答的信号转导蛋白的抑制剂，微小RNA miR-146的NF-'B-依赖性诱导).Proc Natl Acad Sci U S A2006；103:12481–6.)。因此，对血液细胞的检测，尤其是对PBMC的检测提供的信息不同于对血清或血浆的相应检测。
血浆/血清或细胞组成物中的血液标志物在临床实践中的应用已充分确立。临床医师必须根据合适的分级应答来响应患者护理问题，可以是预防型或者是病理型。临床医师必须得出临床问题并确定最合适的诊断和治疗方法。若认为某一具体治疗是必需的，则必须预计所选疗法的功效并就进一步评估以及最终对预后做出合适的判断。公认治疗可能会是高成本、不方便、不适且具有风险的。此外，缺乏治疗可能涉及成本、不适和风险。因此，在治疗性介入之前必须进行合适水平的评估。介入本身被评估为应答的组成部分，其 可进一步容许诊断评估和预后。
对免疫系统优选外周血中细胞内所选微小RNA的定量具有优于传统诊断形式的某些优势。通过选择已表征的微小RNA标志物，能够评估通过其它临床可用手段不易确定或无法实际确定的病理学机制。此类技术目前正在研究中。
目前理解微小RNA对于mRNA翻译成其最终蛋白质产物具有重要调节作用。靶向特定mRNA的微小RNA的表达提高使该mRNA向由其编码的多核苷酸的翻译减少。对于多细胞动物物种，有大约22个碱基的微小RNA序列与mRNA中的靶区通常不完全互补。并且，完全互补性局限于所述微小RNA链的碱基2至碱基7的短序列。该低保真度允许靶向多种mRNA。因此，单一微小RNA的表达可对一群mRNA具有广泛的调节作用。优势使包含此类靶序列的mRNA序列的进化累积增加。所述方案的示例涉及miR-144。NRF2是抗氧化反应的中心调节物。NRF2是转录因子，其结合某些物质的mRNA中表达的抗氧化反应元件(ARE)，所述物质例如：过氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、II期解毒酶NAD(P)H:醌氧化还原酶(NQO1)和谷胱甘肽(GSH)合成酶。NRF2调节这些含ARE基因的表达。miR-144调节NRF2，miR-144表达增加导致NRF2表达减少且抗氧化基因表达减少。(Carolyn Sangokoya,Marilyn J.Telen 和Jen-Tsan Chi,microRNA miR-144modulates oxidative stress tolerance and associates with anemia severity in sickle cell disease(微小RNA miR-144调节氧化胁迫耐受并与镰状细胞疾病的贫血严重性相关联),Blood2010年11月18日，第116卷，第20号4338-4348.)。
对于考虑采用免疫治疗的患者的鉴定是重要的。除生殖障碍以外，已显现或在研或未来可能研究的大量其它病症可能会获益于免疫治疗。类似地，可应用本发明来评估对于这些病症的免疫治疗的疗法选择、给药和功效。这些病症的示例有：认为炎症部分对发病机理起一定作用的疾病。就不同病症而言，通常提供免疫治疗，优选IVIg。例如，这些包括同种异基因骨髓移植、慢性淋巴细胞性白血病、普通变异型免疫缺陷病(CVID)(大约150例原发性免疫缺陷(PID)的组，其共有一组特征(包括血丙种球蛋白过少)，但其具有不同基础病因)、特发性血小板减少性紫癜、儿科HIV、原发性免疫缺陷、川崎病、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病(CIDP)高抗体受者或ABO不相容供者的肾移植、阿尔兹海默病、孤独症、毛细血管渗漏综合征、慢性疲劳综合征、艰难 梭菌结肠炎、皮肌炎与多肌炎、革氏眼病、格林-巴利综合征、肌肉萎缩症、包涵体肌炎、不育症、兰伯特-伊顿综合征、红斑狼疮、多灶性运动神经病、多发性硬化症、重症肌无力、新生儿同种免疫血小板减少症、细小病毒B19、天疱疮、输血后紫癜、肾移植排斥反应、自发性流产/流产、干燥综合征、僵人综合征、眼阵挛肌阵挛、严重脓毒症和危重症成人的败血性休克[14]、毒性表皮坏死溶离，在慢性淋巴细胞性白血病和多发性骨髓瘤以及各种免疫球蛋白合成非常见缺陷(例如，X-连锁无丙种球蛋白血症)中，给予IVIG以维持足够的免疫球蛋白水平以防感染。设想本发明可用于以与就生殖疾病而言所述相似的方式来处理此类病症。
介入的治疗性试验可揭示通过传统诊断测试无法辨别的疾病、宿主和介入间复杂相互作用的特征。试验中已发现静脉内给予汇集的供者γ球蛋白(IVIg)在广谱免疫病症的治疗中有效。也已对其作用提出相对宽范围的机制。这些包括抗独特型抗体介导的自身抗体中和、单核噬细胞系统阻滞、唾酸-Fc受体介导的与树突细胞的相互作用，其为解释IVIg给予的多种治疗作用所提出的少许机制中的一些。其在试验发现有响应的多种病症中的功效可能不归结于单一机制。可能无法从所述疾病进展的临床表现或实验室表征预测响应。差异且可区分的患者特点可能就对介入的患者特异性响应的成型而言具有重要性。对这些治疗特异性响应的鉴定可改进患者的选择与治疗的定制。
不育症与妊娠障碍是欲养育家庭的夫妻所面临的苦恼问题。15％的妊娠发生自发性流产。反复自发性流产定义为至少三次连续妊娠在孕期24周内流产，这在3-4％女性中发生。此外，被认为不育的夫妻可能经历未被识别的极早期流产，此时还未经诊断测试证实短时妊娠状态的存在。还有另一些女性患有妊娠并发症，例如先兆子痫、胎儿宫内发育迟缓(IUGR)、早产、胎膜早破(PROM)和死产。根据近期文献，已将儿童病症例如气喘、孤独症、注意缺陷多动障碍(ADHD)、糖尿病、精神分裂症和妥瑞氏综合征与妊娠相关疾病和妊娠相关疾病的迟发并发症相关联。
现有众多文献将多种此类病症与免疫功能异常相关联。已显示免疫介入提高患有免疫病症的女性的生殖成功性，所述免疫病症例如通过体外试验测定的调节性T细胞低水平、自然杀伤细胞增多和高TNF-α/Il-10辅助性T细胞比例。还已显示免疫治疗性介入有助于那些患者的特定亚组。例如，已采用静脉内给予免疫球蛋白(IVIg)来减少女性亚组的自然杀伤细胞的数量，经体外检测所 述女性中免疫功能有提高。已显示该免疫治疗性介入提高这些女性的生殖成功性。JAMA(1995)273:1933-36Hum Reprod(1998)13(9):2620-3,Am J Reprod Immunol(2002)38(5):312-18,Ann NY Acad Sci(2005)1051:743-78。还显示肝素能降低抗磷脂抗体水平提高的那些人的流产率(Salmon JE,Girardi G.Antiphospholipid antibodies and pregnancy loss:an inflammatory disorder(抗磷脂抗体与妊娠丢失：一种炎性疾病).Reprod Immunol.2008年1月；77(1):51-6.电子公开2007年月5日.综述.)。先前被认为是“不明的”多种生殖病症可能由免疫学因素所引起。
在包括淋巴细胞、单核细胞(包括其衍生的巨噬细胞和树突细胞)的免疫细胞中，多种淋巴亚群(或称作亚组)介导并调节免疫细胞毒性。这些细胞可包括NK细胞、NKT细胞、CD8T细胞、CD4T细胞、γδT细胞调节性T细胞和Th17细胞。已表明此类亚组的活性可能对鉴定患有或有风险患上生殖障碍而可受益于免疫治疗的女性群体而言具有特殊重要性。此外，对此类细胞的数量和活性进行定量的试验已有助于监测所述免疫治疗。在临床环境中，从外周血部分收集上述免疫细胞并评估。
例如，临床上感兴趣的一个领域是T辅助淋巴细胞(CD3+/CD4+)。可根据体外刺激之后的细胞因子谱将这些细胞分类为不同亚群，如T辅助1(Th1)细胞或T辅助2(Th2)细胞。T辅助细胞选择性分泌特定细胞因子簇。例如，Th2细胞产生白介素，IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13，进而参与针对胞外病原体的体液免疫的发展，但抑制吞噬细胞的若干功能。或者，Th1细胞，产生干扰素-γ(IFN-γ)、IL-2和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。这些细胞因子参与细胞介导的免疫和吞噬细胞依赖性炎症(Mosmann和Coffman,1989；Romagnani,2000)。
及时用抗凝剂介入能防止这些损失中的许多。临床上感兴趣的另一个领域是补体介导的妊娠丢失。(Cohen D,Buurma A,Goemaere NN,Girardi G,le Cessie S,Scherjon S,Bloemenkamp KW,de Heer E,Bruijn JA,Bajema IM.Classical complement activation as a footprint for murine and human antiphospholipid antibody-induced fetal loss(典型补体活化作为鼠与人抗磷脂抗体诱导的胎儿损失的标记).(J Pathol.(2011):502–511.Yu G,Sun Y,Foerster K,Manuel J,Molina H,Levy GA,Gorczynski RM,Clark DA.LPS-induced murine abortions require C5but not C3,and are prevented by  upregulating expression of the CD200tolerance signaling molecule(LPS诱导的鼠流产需要C5而不是C3，其由上调CD200耐受信号转导分子的表达来阻止).Am J Reprod Immunol.2008年8月；60(2):135-40.)。
Raghupathy观察到相较于不明反复妊娠丢失，正常妊娠中的Th2细胞因子、IL-6和IL-10的血清水平显著较高。并且，相较于正常妊娠而言，在反复妊娠丢失的女性中存在的Th1细胞因子、IFN-γ的血清水平显著较高(Raghupathy等,1999)。总之，这些观察结果表明，正常妊娠的女性中存在Th2偏向，而许多女性例如有上述的反复妊娠丢失史、不明不育史和妊娠并发症史的女性中存在Th1偏向。
Alan Beer解释说，具有Th1偏向的女性向Th2偏向靠拢的Th1/Th2比例的再平衡可能会帮助其获得更高的生殖成功性。他提出采用抗TNFα试剂治疗此类女性可能导致使Th1/Th2平衡移向Th2偏向。
为鉴定进行抗TNFα治疗的候选者，Beer提出可对CD4表达型T细胞分化为产Th1或Th2分组细胞因子的比例进行体外评估。若患者患有生殖疾病，尤其是具有不明不育和反复不明流产问题，并且证明其Th1/Th2比例比正常对照患者高，则该患者被认为是抗TNFα治疗的候选者。Beer提出对接受治疗的患者的Th1/Th2比例进行反复评估以评估治疗功效。他解释道，有效治疗应导致Th1/Th2比例移向Th2偏向。Winger、Reed等人已显示，预想Th1/Th2比例升高的女性在用抗TNFα治疗时确实相比未接受该治疗的女性显示生殖成功性有提高。此外，即使疗程在着床之前结束，发现所述疗程仍有效。(参考文献1:Edward E.Winger,Jane L.Reed,Treatment with Tumor Necrosis Factor Inhibitors and Intravenous Immunoglobulin Improves Live Birth Rates in Women with Recurrent Spontaneous Abortion(用肿瘤坏死因子抑制剂和静脉内给予免疫球蛋白的治疗提高反复自发性流产女性的活产率),60(1),8-16,电子公开:2008年6月28日。参考文献2:Edward E.Winger,Jane L.Reed,Sherif Ashoush,Sapna Ahuja,Tarek El-Toukhy,Mohamed Taranissi,Treatment with Adalimumab (Humira and Intravenous Immunoglobulin Improves Pregnancy Rates in Women Undergoing IVF(采用阿达木单抗(Humira)和静脉内给予免疫球蛋白的治疗提高IVF女性的妊娠率),American Journal of Reproductive Immunology61(2009)113–120))。
Beer的方法收到大量批评意见。Chaouat给出了一种评论，其注意到胚胎 着床入子宫内膜是炎性事件。(Gérard Chaouat,Natalie Ledée-Bataille,Sylvie Dubanchet,Sandrine Zourbas,Olivier Sandra,Jacques Marta,Th1/Th2Paradigm in Pregnancy:Paradigm Lost？,Cytokines in Pregnancy/Early Abortion:Reexamining the Th1/Th2Paradigm(妊娠中的Th1/Th2范式：范式流产？妊娠/早期流产中的细胞因子：重检Th1/Th2范式),Int Arch Allergy Immunol2004；134:93-119)着床时和着床处的Th1细胞因子主导是该过程的基础，由此指出Th1/Th2假说中的缺陷。此外，如Kwak Kim等(USPTO#20040105858)的专利申请所述，抗TNFα治疗可使生殖有效性降低。并且，着床位点的Th1/Th2比例的确定可能无法从分离自外周血的淋巴细胞的分析来有效确定。Moffett等提出的另一评论是针对分析外周血细胞的尝试。他们质疑外周血白细胞的检查对胎盘内细胞事件不具代表性。(Ashley Moffett,Lesley Regan,Peter Braude,Natural killer cells,miscarriage,and infertility(自然杀伤细胞、流产与不育),BMJ2004；329:1283–5.)他们总结出：1)“子宫NK细胞不同于外周血中循环的那些细胞”，2)“检测外周血中NK细胞的测试不给出关于子宫NK细胞的有用信息”和3)“很遗憾，针对生殖障碍女性中自然杀伤细胞的新治疗的兴趣没有科学支持”。)
对抗磷脂抗体相关的反复流产的抗凝剂治疗也收到批评意见。抗磷脂抗体测试被批评为不可靠并且缺乏标准。(Lakos G,Favaloro EJ,Harris EN,Meroni PL,Tincani A,Wong RC,Pierangeli SS.International consensus guidelines on anticardiolipin and anti-glycoproteinI testing:A report from the APL task force at the13(th)international congress on antiphospholipid antibodies(关于抗心磷脂和抗糖蛋白I测试的国际共识指南：来自APL任务组第13次国际会议上关于抗磷脂抗体的报告).Arthritis Rheum.2011年9月27日.doi:10.1002/art.33349.综述.)。此外，已表明与抗磷脂抗体综合征相关的流产的实际原因是补体活性增高而非血栓形成活性增高(Salmon JE,Girardi G.Theodore E.Woodward Award:antiphospholipid syndrome revisited:a disorder initiated by inflammation (重探抗磷脂综合征：由炎症起始的疾病).Trans Am Clin Climatol Assoc.2007；118:99-114.)(Lynch AM,Salmon JE.Dysregulated complement activation as a common pathway of injury in preeclampsia and other pregnancy complications(调节异常的补体活化是先兆子痫和其它妊娠并发症中损伤的共同通路).Placenta.2010年7月；31(7):561-7.电子公开2010年4月27日.综述.)。微小RNA标志物可更好地鉴定对抗凝剂治疗充分相应的基础炎性标志物。
此外，对胎儿半异体移植(hemiallograft)的母方耐受机制引起被称为调节性T细胞的另一CD4T细胞组的相互作用。Jasper等.(Molecular Human Reproduction第12卷,第5期301–308页,2006)对不明不育女性和自然女性的分泌中期子宫内膜组织中调节性T细胞分化的主要调节子FoxP3mRNA水平进行了定量。他们发现，受影响的女性相较于对照而言FoxP3mRNA的水平下降。Winger和Reed发现经历反复流产的女性的外周血淋巴细胞中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的水平下降(Edward E.Winger,Jane L.Reed,低水平循环CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞预测具有妊娠障碍史的刚怀孕妇女的流产风险,Am J Reprod Immunol.2011年10月；66(4):320-8)。
目前认为Th17细胞在妊娠的免疫中起作用(Shigeru Saito,Akitoshi Nakashima,Tomoko Shima,Mika Ito,Th1/Th2/Th17and Regulatory T-Cell Paradigm in Pregnancy(妊娠中的Th1/Th2/Th17和调节T细胞范式),American Journal of Reproductive Immunology63(2010)601–610)。与调节性T细胞一道，它们似乎协同作用，其影响平衡的方式与所提出的Th1和Th2细胞影响妊娠成功性的方式大致相同。
近期，描述了影响婴儿出生的各种情况，其中母亲在妊娠中或妊娠前后表现有免疫异常。例如，妊娠期间的免疫异常被认为是孤独症的原因。认为孤独症是一种谱系障碍，其病原学仍然未知。然而，已提出早期妊娠过程中的免疫学因素。已在受影响儿童中鉴定出Th1/Th2细胞因子谱改变、淋巴细胞数量变化和T细胞有丝分裂原反应的减少。作者表示可能涉及早期妊娠过程中的免疫异常(Paul Ashwood,Sharifia Wills和Judy Van de Water,The immune response in autism:a new frontier for autism research(孤独症中的免疫应答：孤独症研究的新领域),Journal of Leukocyte Biology.2006；80:1-15)。
关于Th1/Th2假说的争论还涉及测试与治疗的时间。如上所述，Chaouat称该假说有缺陷并且Th偏向在着床过程中可能并不保持不变。Winger,Reed等显示在受孕前期评估为Th1/Th2细胞比例升高的患者在用抗TNFα治疗时获得显著较好的妊娠结果。(Winger EE,Reed JL,Ashoush S,El-Toukhy T,Ahuja S,Taranissi M.Degree of TNF-α/IL-10cytokine elevation correlates with IVF success rates in women undergoing treatment with Adalimumab(Humira)and IVIG(TNF-α/IL-10细胞因子增多程度与接受阿达木单抗(Humira)和IVIG治疗的女性的IVF成功率相关).Am J Reprod Immunol.2011年6月；65(6):610-8)Winger和 Reed还证明在着床过程中评估调节性T细胞也预示妊娠结果。(Winger EE,Reed JL.Low Circulating CD4(+)CD25(+)Foxp3(+)T Regulatory Cell Levels Predict Miscarriage Risk in Newly Pregnant Women with a History of Failure(低水平循环CD4(+)CD25(+)Foxp3(+)调节性T细胞预示具有妊娠障碍史的刚怀孕女性的流产风险).Am J Reprod Immunol.2011年10月；66(4):320-8.)所用的实验室参数的性质和时间似乎十分显著。
此外，Winger和Reed鉴定出一个患者亚组，所述比例的表现不同于预期。治疗后Th1/Th2比例偶有升高，而治疗功效似乎完好。(Winger EE,Reed JL,Ashoush S,El-Toukhy T,Ahuja S,Taranissi M.Degree of TNF-α/IL-10cytokine elevation correlates with IVF success rates in women undergoing treatment with Adalimumab(Humira)and IVIG(TNF-α/IL-10细胞因子增多程度与接受阿达木单抗(Humira)和IVIG治疗的女性的IVF成功率相关).Am J Reprod Immunol.2011年6月；65(6):610-8.)。
此外，用于测定Th1/Th2比例的技术需要从外周血分离有活力的单核细胞(PBMC)，在阻断细胞因子分泌之后对其体外刺激，这一步骤对细胞有些毒性。因此，可能会削弱胞内细胞因子表达的成功诱导，从而测试结果理论上准确性较低。并且，尽管Th1细胞的定量似乎相对可靠，Th2定量受限于其在CD4阳性T细胞中的低普遍性。目前采用的细胞分选可能有些主观导致不准确结果。因此试验结果可能会因轻微分选偏差而有变化。因为这些原因和其它原因，需要评估Th1和Th2数量的改进技术。
此外，目前用以评估妊娠风险因素的不同试验的预测能力对于检测所有受影响个体而言并不足够灵敏。极其需要额外的免疫细胞测试参数。例如，目前采用的对自然杀伤细胞的测试有两种。第一种是对NK细胞定量的表型试验。表达CD56但不表达CD3的淋巴细胞被定义为是NK细胞并且可通过流式细胞术计数。第二种测试评估NK细胞功能，由此将单核细胞与已知会被NK细胞破坏的经标记细胞一同孵育或共同孵育“靶细胞”，随后通过流式细胞术检测并定量。这两种测试均可用于评估患者的生殖障碍风险，其具有一定成功度。然而，自然杀伤细胞结果正常的一些患者仍持续遭受免疫学基础的妊娠障碍。
如前所述，调节性T细胞(Treg)是新型且重要的细胞类型，其可协助对许多这些病例进行诊断和评估。已将外周血中这些细胞数量的减少与妊娠丢失尤 其在受孕后短时期中的妊娠丢失相关联。Jasper等对不明不育女性和未受影响女性的分泌中期子宫内膜组织中调节性T细胞分化的主要调节子FoxP3 mRNA水平进行了定量(Molecular Human Reproduction第12卷,第5期301–308页,2006)。他们发现，受影响的女性相较于对照而言FoxP3 mRNA的水平下降。Winger和Reed发现在发展出早期妊娠损失的妊娠女性中外周血淋巴细胞中的调节性T细胞水平降低，所述细胞由CD4、CD25和FoxP3的同时表达来定义。Winger EE,Reed JL.Low Circulating CD4(+)/CD25(+)/Foxp3(+)T Regulatory Cell Levels Predict Miscarriage Risk in Newly Pregnant Women with a History of Failure(低水平循环CD4(+)/CD25(+)/Foxp3(+)调节性T细胞预示具有妊娠障碍史的刚怀孕女性的流产风险).Am J Reprod Immunol.2011年10月；66(4):320-8.)。
目前采用多种标志物对调节性T细胞定量，但是，没有能方便地功能性评估T调节活性的相应试验。极其需要这种试验。
除了由现有生殖免疫测定显示的缺乏灵敏度以外，其还可能受样品收集运输条件的影响。NK细胞毒性试验特别易受影响。在所述试验中，测试效应细胞活性。预计对于效应细胞的任何胁迫均可减损所测细胞毒活性。经受不住这些影响，靶细胞因其易受细胞毒影响而经受显著变化。因此，该试验系统的变异性相当大。也极其需要不受功能试验变异性影响的试验系统。
现有功能性试验进一步受限于其无法检测功能细胞中间物(intermediary)。调节性T细胞通过许多中间物来发挥其调节活性。现有的对调节性T细胞的数目计数的试验不对任何中间物进行鉴定或定量。允许对已知中间物进行识别和定量的试验系统将提供极大改进。
新近，已将CD4表达型T细胞按其细胞因子分泌谱分入另一个亚组。除Th1和Th2细胞类型以外，已定义调节性T细胞、Th3细胞和Th17细胞。并且，已描述Th9细胞和滤泡辅助性T细胞(T_FH)。Jasper等评估了黄体期子宫内膜中FoxP3mRNA的相对量，并且显示具有反复妊娠丢失史的患者与正常患者相比具有显著模式差异。相似地，对转录调节物的mRNA的定量和将其与对照患者相比较能够提供信息来支持将患者分类为可进行免疫型治疗及随后的介入治疗监测的候选者。
除功能与表型免疫测试的前述缺陷以外，已知其特异度和灵敏度也有限。允许评估多种不同参数以一同提供患者的PBMC状态的概况或特征的试验系统可能会克服单一测试所见的缺陷。现有的测试方法评估患者免疫系统的单一 特征。一起评估多种不同参数的组合方法可能会提高灵敏度和特异度，并且改进对于各自以相同方式影响单一免疫参数的不同形式免疫功能异常的辨别。一种比评估PBMC免疫状态更宽的方法可对妊娠疾病的诊断和状态提供更好的信息。理想上，所述方法会区分导致免疫或其它参数共同异常的不同机制。
个体化药物，如同理解的那样，利用测试(尤其是DNA或RNA水平的测试)来确定用于个体的最适治疗介入，而不是对有特定疾患的全部患者施用单一治疗介入。理想上，诊断方案将患者分成不同类别，其中鉴定出有可能响应治疗介入的患者。理想上，所述测试方案将鉴定出可能不受益于治疗方案的患者，由此免于对不太可能有积极治疗响应的那些患者施用高成本治疗或具有潜在风险的治疗。由于前述缺陷，为目前临床实践中实施的免疫学测试鉴定出更可靠和稳定的替代标志物以及鉴定出炎症和凝结标志物的替代标志物将会是有利的。
此外，需要这样的新型测试：所述测试能够鉴定出尽管采用传统测试诊断为疾病阳性但不会获益于治疗的患者。
并且，需要这样的新型测试：所述测试能够预测哪些患者将经历免疫治疗的不良副作用。
微小RNA是小型内源性的，大约22个核苷酸碱基的非蛋白质编码RNA序列，其主要负性调节基因表达。已鉴定了人类的数百条这种序列(Lee等,PLoS Comput Biol3:e67(2007)；O'Driscoll,Anticancer Res26:4271(2006)；Kusenda等,Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub150:205(2006))。初级转录本或“初级微小RNA(pri-microRNA)”包含一种或多种微小RNA前体，所述前体各自包含在发卡结构中。这些序列最常见于其宿主基因的内含子中(Lee等,PLoS Comput Biol3:e67(2007))。发现其还可存在于外显子和外显子-内含子的边界处(Kusenda等,Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub150:205(2006))。已知这些序列靶向全部人基因中的至少30％，调整这些基因的表达。最终的短序列通过两种酶(Drosha酶和Dicer酶)参与的一系列切割由相对较长的RNA初级RNA序列产生。所述最终切割形式纳入称为RISC(RNA诱导的沉默复合体)的复合体中，所述RISC复合体包含催化蛋白如Argonaut蛋白(具体是Ago-2)。Jeker和Bluestone(Journal of Clinical Immunology(2010),30:347-357)猜测微小RNA作用以稳定细胞表型，锐化基因表达，协助设定阈值及其它调节功能。微小RNA似乎是细胞生长、分化和凋亡 的重要调节物(Lee等,PLoS Comput Biol3:e67(2007))。微小RNA在癌症病理学中已有广泛研究，因为已知其对细胞分化、生长和凋亡具有影响，而在癌症发展中，细胞分化、生长和凋亡各自均是重要细胞事件(Esau和Monia,Adv Drug Deliv.Rev.59:101-114(2007)；Hammond,Nat Genet39:582(2007))。癌细胞中的微小RNA谱已是热门研究领域。获得的信息提供关于个体细胞的功能状态的信息。
研究者已发现，癌症分类中微小RNA的全表达似乎比mRNA表达更有用(Eis等.Proc Natl Acad Sci USA102:3627(2005))。新近，多项研究证明微小RNA对于体内稳态和B淋巴细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞、树突细胞和心脏的免疫系统功能的重要性(That等,Science316:604(2007)；Rodriguez等,Science316:608(2007)；O'Connell等,Proc Natl Acad Sci USA104:1604(2007)；Care等,Nat Med13:613(2007)；Taganov等,Proc Natl Acad Sci USA I(2006))。
微小RNA155(mir-155)是微小RNA作用于免疫系统功能以及免疫细胞分化的示例。本文公开的微小RNA均为人源性，mir-155作用以使调节性T细胞中FoxP3的表达稳定。(Foxp3-Dependent MicroRNA155Confers Competitive Fitness to Regulatory T Cells by Targeting SOCS1Protein Immunity(Foxp3依赖性微小RNA155通过靶向SOCS1蛋白免疫来赋予调节性T细胞以竞争能力),第30卷,第1期,80-91页L.Lu,T.Thai,D.Calado,A.Chaudhry,M.Kubo,K.Tanaka,G.Loeb,H.Lee,A.Yoshimura,K.Rajewsky)。调节性T细胞对于预防自体免疫和建立外来组织耐受而言极其重要。此外，That等显示mir-155在调节辅助T细胞分化和生发中心反应中起作用，所述生发中心反应调节T细胞依赖性的抗体反应(That等,Science316:604(2007)；Rodriguez等,Science316:608(2007)。此外，微小RNA-155-缺陷型CD4+T细胞的转录组(transcriptosome)分析显示广谱的受mir-155调节基因，包括细胞因子、趋化因子和转录因子(That等,Science316:604(2007)；Rodriguez等,Science316:608(2007)。
mir-155是微小RNA多向性(pleitropism)的示例。到目前为止的证据显示mir-155涉及许多生物过程。这些生物过程包括造血作用、炎症和免疫。其还涉及对血管紧张素II受体的调节。已将mir-155的失调与某种癌症、心血管疾病以及病毒感染相关联。调节性T细胞发育以及对FoxP3作用的介导可能均涉及mir-155(Susan Kohlhaas,Oliver A.Garden,Cheryl Scudamore,Martin Turner,Klaus Okkenhaug,Elena Vigorito,Cutting Edge:The Foxp3Target  mir-155Contributes to the Development of Regulatory T Cells(Foxp3靶标mir-155导致调节性T细胞的发育),The Journal of Immunology(2009)182:2578-2582)。令人吃惊的是，这些研究者发现尽管Treg发育可能不能缺少bic/mir-155(初级微小RNA)，但其对Treg的外周增殖和存活而言并不是必需的。尽管Treg数量较少，其在体外的抑制剂功能保持完整。此类预料之外的作用是微小RNA的特点。微小RNA可在细胞发育及其后续功能活化的不同时间点发挥作用。尽管微小RNA可单独作用，其也能在多种微小RNA对单一靶mRNA的协同作用中发挥作用。个体微小RNA也可作用于多种不同靶mRNA，这为微小RNA作用添加了复杂性。总之，这些复杂性使得对其在不同环境下作用的预测很繁琐。迄今为止，仅经验主义方法定义了个体和多种微小RNA在特定疾病情况下的作用。
其它微小RNA与免疫应答显著相关。例如，TNFα和IL-1β还受另一种微小RNA，mir-146a的调节。(K.D.Taganov,M.P.Boldin,K.J.Chang和D.Baltimore,NF-B-dependent induction of the microRNA mir-146,an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune responses(靶向先天免疫应答的信号转导蛋白的抑制剂，微小RNA miR-146的NF-B-依赖性诱导),Proc Natl Acad Sci U S A103(2006),第12481–12486页，M.M.Perry,S.A.Moschos,A.E.Williams,N.J.Shepherd,H.M.Larner-Svensson和M.A.Lindsay,Rapid changes in microRNA-146a expression negatively regulate the IL-1beta-induced inflammatory response in human lung alveolar epithelial cells(微小RNA-146a表达的快速变化负向调节IL-1β诱导的人肺泡上皮细胞中的炎性反应),J Immunol180(2008),第5689–5698页)。对这些微小RNA的定量提供对调节状态的进一步理解。此外，对类风湿性关节炎患者的研究显示其PBMC中存在有趣的微小RNA谱。(Kaleb M Pauley,Minoru Satoh,Annie L Chan,Michael R Bubb,Westley H Reeves和Edward KL Chan,Upregulated mir-146a expression in PBMCs from rheumatoid arthritis patients(类风湿性关节炎患者的PBMC中mir-146a表达上调),Arthritis Research&Therapy2008,10:R101(doi:10.1186/ar2493)。该文章的网址:http://arthritis-research.com/content/10/4/R101)。他们观察到mir-146a、mir-155、mir-132、mir-16、mir-let-7a的相对表达显著高于正常对照，以及活跃和无活跃临床状态之间具有显著差异。Hunter等.(Hunter MP,Ismail N,Zhang X,Aguda BD,Lee EJ等.(2008)人外周血微泡中微小RNA表达的检测.PLoS ONE3(11): e3694.doi:10.1371/journal.pone.0003694)发现外周血中微小RNA周转于若干区室(compartments)、血浆微泡、血小板和PBMC中。其表明位于不同区室的微小RNA的作用不同。位于PBMC内的微小RNA与CD4表达型T细胞亚族特性和稳定表达最紧密相关。对位于PBMC群内的微小RNA的研究最可能提供关于CD4表达型T细胞的信息。此外，单核细胞系和树突细胞的细胞及单核细胞，所述两种外周血单核群之一，调节T细胞尤其是CD4表达型T细胞的功能状态和活性。重要的是，单核细胞参与在其表面凝结表达组织因子的起始。Mir-19b和mir-20a看来调节狼疮患者中的组织因子表达(Raúl Teruel,Carlos Pérez-Sánchez,Javier Corral,María Teresa Herranz,Virginia Pérez-Andreu,Encarnación Saiz,Nuria García-Barberá,Irene Martínez-Martínez,Vanessa Roldán,Vicente Vicente,López-Pedrera,Constantino Martínez,Identification of microRNAs as potential modulators of tissue factor expression in patients with systemic lupus erythematosus and antiphospholipid syndrome(作为系统性红斑狼疮和抗磷脂综合征患者中组织因子表达的潜在调节剂的微小RNA的鉴定),Journal of Thrombosis and Haemostasis,在编)。因此，对PBMC中微小RNA的整体研究提供关于免疫平衡和循环单核细胞稳定性的重要信息。
对单核细胞亚组的选择性研究可获得额外信息。例如，从分离的PBMC移出单核细胞允许对淋巴细胞进行选择性微小RNA研究。相反，可直接研究单核细胞的微小RNA。此外，可在选择性分离单核细胞亚群之后对其自身进行单独研究，所述选择性分离采用的技术例如：在与荧光标记的单克隆抗体组合相互反应之后进行流式细胞术分选，所述单克隆抗体组合能够清楚表征不同个体亚族。例如，可使调节性T细胞在选择性结合条件下接触荧光标记的抗CD3、CD4、CD25和CD127，并通过其CD3、CD4、CD25的表达和CD127的不表达或低表达来选择调节性T细胞。
微小RNA提供的信息不同于对淋巴细胞亚组、其功能或这些亚组的标志物定量所提供的信息，其中所述标志物可以是这些亚组的替代物，例如FoxP3mRNA可以作为替代物来定量调节性T细胞。微小RNA可在多种不同细胞类型中发现，并且在不同细胞类型中显示不同功能或可显示由细胞类型或功能状态定量无法揭示的活性状态或其它特征(例如细胞毒性)。疾病与疾病之间的微小RNA表达的变化不同。类风湿性关节炎中所见微小RNA的变化与狼疮中观察到的那些不同。(Pauley KM,Satoh M,Chan AL,Bubb MR,Reeves WH, Chan EK.Upregulated mir-146a expression in PBMCs from rheumatoid arthritis patients(类风湿性关节炎患者的PBMC中mir-146a表达上调).Arthritis Res Ther.2008；10(4):R101,Gastroenterol Hepatol(N Y).2010年11月；6(11):714–722.MicroRNA(microRNA)Expression in Ulcerative Colitis(UC)and Crohn's Disease(CD)(溃疡性结肠炎(UC)与克罗恩氏病(CD)中微小RNA(microRNA)的表达)，以及Dai Y,Huang YS,Tang M,Lv TY,Hu CX,Tan YH,Xu ZM,Yin YB.Microarray analysis of microRNA expression in peripheral blood cells of systemic lupus erythematosus patients(系统性红斑狼疮的外周血细胞中微小RNA表达的微阵列分析).Lupus.2007；16(12):939-46.,Raúl Teruel,Carlos Pérez-Sánchez,Javier Corral,María Teresa Herranz,Virginia Pérez-Andreu,Encarnación Saiz,Nuria García-Barberá,Irene Martínez-Martínez,Vanessa Roldán,Vicente Vicente,§hary López-Pedrera,Constantino Martínez,Identification of microRNAs as potential modulators of tissue factor expression in patients with systemic lupus erythematosus and antiphospholipid syndrome(作为系统性红斑狼疮和抗磷脂综合征患者中组织因子表达的可能调节剂的微小RNA的鉴定),Journal of Thrombosis and Haemostasis,在编)。
免疫疾病的多个方面均暗示微小RNA表达的变化。微小RNA对于免疫学功能调节和对自体免疫的预防具有显著作用(Kaleb M.Pauley,Seunghee Cha和Edward K.L.Chan,MicroRNA in autoimmunity and autoimmune diseases(自体免疫和自体免疫疾病中的微小RNA),J Autoimmun.(2009)32(3-4):189–194)。抗磷脂抗体综合征是自体免疫病症的示例，其与生育力下降、反复不明流产和妊娠并发症以及自体免疫风险增加、心血管疾病和血栓形成疾病相关联。某些微小RNA(mir-19b和20a)的表达减少可能鉴定患者的妊娠并发症风险增高，所述妊娠并发症可通过抗凝治疗来治疗(例如，阿司匹林和/或肝素)(Raúl Teruel,Carlos Pérez-Sánchez,Javier Corral,María Teresa Herranz,Virginia Pérez-Andreu,Encarnación Saiz,Nuria García-Barberá,Irene Martínez-Martínez,Vanessa Roldán,Vicente Vicente,§hary López-Pedrera,Constantino Martínez,Identification of microRNAs as potential modulators of tissue factor expression in patients with systemic lupus erythematosus and antiphospholipid syndrome(作为系统性红斑狼疮和抗磷脂综合征患者中组织因子表达的可能调节剂的微小RNA的鉴定),Journal of Thrombosis and Haemostasis,在编))。
对生殖疾病患者的功能异常状态的替代检测法的鉴定，值得一提的是妊娠构成了这样一种免疫学悖论：在对组织(如组织/器官移植物)产生排斥性的典型同种免疫应答情况下，健康妊娠中对于同种异体抗原的耐受则成功防止对半同种抗原胚胎的排斥。描述了似乎保留同种异体耐受性(allo-tolerance)的多种且看似多余的机制。这些机制的存在将对于胎儿的同种异体应答(allo-response)和自体免疫区分开来。因此，预计在生殖疾病患者中鉴定的微小RNA谱不太可能与自体免疫患者中鉴定的那些相似。此外，似乎还没有用微小RNA直接替代现用的免疫、凝结测试，这归因为其在不同细胞类型中广泛且多样的存在。Mishra(美国专利申请20100216142A1,Mishra；Nilamadhab,microRNA Biomarkers in Lupus(狼疮中的微小RNA生物标志物))鉴定了在狼疮中失调的多种微小RNA。狼疮情况中所见免疫异常中包含针对各种磷酯的抗体和炎性标志物(如组织因子)水平的升高。Ceribelli的近期研究鉴定了针对Ago2的抗体，Ago2是微小RNA产生所需的RISC部分的组成部分(Angela Ceribelli,Angela Tincani,Franco Franceschini,Roberto Cattaneo,Brad A.Pauley,Jason Y.F.Chan,Edward K.L.Chan,Anti-argonaute2(Ago2/Su)and-Ro antibodies identified by immunoprecipitation in primary anti-phospholipid syndrome(PAPS)(原发性抗磷脂综合征(PAPS)中通过免疫沉淀法鉴定的抗Argonaute蛋白2(Ago2/Su)和抗Ro抗体)，2010年8月9日电子公开(doi:10.3109/08916934.2010.499886))。静脉内免疫球蛋白(IVIG)治疗是用于降低具有免疫学反复自发性流产史的女性中流产发生率的免疫治疗的一个示例。Winger和Reed已证明IVIG对反复自发性流产史女性组的功效(相较于未接受IVIG治疗的女性组而言)。(Winger EE,Reed JL,Ashoush S,El-Toukhy T,Ahuja S,Taranissi M.Elevated Preconception CD56(+)16(+)and/or Th1:Th2Levels Predict Benefit from IVIG Therapy in Subfertile Women Undergoing IVF(高水平孕前CD56(+)16(+)和/或Th1:Th2预示IVIG治疗对经历IVF的低生育力女性的益处).Am J Reprod Immunol.2011年5月30日.)。此外，该研究中若将有抗磷脂抗体的患者从患者集中排除，则在治疗组和未治疗组之间不再发现显著差异(未公开数据)。因此，当，鉴定有抗磷脂抗体相关标志物的患者的能力可能在决定谁可受益于免疫学治疗时特别有用。
对PBMC及其组成选定亚组中微小RNA的检测为临床医师提供额外手段，将生殖免疫相关疾病患者或有患生殖免疫相关疾病风险的患者表征为失衡介导的疾病组，例如，免疫细胞活性、炎症或凝结的失衡。Taylor和Gercel-Taylor 提出了对于患有妊娠疾病的女性的微小RNA的检测(Taylor和Gercel-Taylor，于美国专利申请20100151480A1)。他们提出用于诊断对象的癌症和不良妊娠结果的方法，所述方法通过检测分离自受影响个体的生物样品的外来体中存在的一种或多种RNA的量来进行。他们提出的方法可与本发明内容区分开。他们提出，他们研究的微小RNA直接源自胎盘组织，因而显示该器官的病理生理状态。本公开内容提出用于确定受影响个体的全身性和/或局部免疫状态的方法，由此为评估可能受其生殖健康状况的负面影响的个体的免疫状态提供替代性和补充性方法。此类参数的添加应会提高诊断组的灵敏度。例如，已显示mir-155对稳定FoxP3的表达很重要，并且对调节性T细胞的效应物功能也重要，部分是通过调节CTLA-4表达(Lu等.Immunity30,80-91(2009))。假设了在不同时间点诱导母方耐受状态的许多且冗余的机制，所述时间点包括卵子发育(卵子发生)期、孕前、受精、着床直至妊娠剩余时期，以及分娩后。卵子质量也可受免疫学事件的影响。卵子发生涉及细胞因子、激素、生长因子的复杂相互影响，其牵涉免疫细胞相互作用。对免疫细胞中微小RNA的定量可对正常过程进行概况分析并可与生殖疾病或其它免疫相关疾病患者的过程区分开。
微小RNA定量还提供其它益处。若鉴定出对免疫治疗的反应模式，其可用于预测按微小RNA谱所鉴定的患者亚组中的反应模式。若鉴定出特定微小RNA或微小RNA的组，则它们在治疗后的响应可用对分或多分患者组，可根据对治疗的反应评估如此分组的患者并用于更准确地预测如此分组的个体患者的反应。
将患者分成两组或更多组的能力是重要的。赫赛汀(Herceptin)在治疗乳腺癌中的应用在用于临床上其它方面相似的乳腺癌时可能不显示成效。赫赛汀(曲妥单抗(trastuzumab))靶向HER2/neu受体。在早期乳腺癌中，该受体的存在与否在临床上不显见。然而，当由乳腺癌表达时，其指示一类后期表现更具侵袭性的肿瘤。可采用分子技术来评估肿瘤的HER2/neu状态。临床研究显示，若该药物仅用于其肿瘤为HER2/neu表达阳性的那些患者，则该药物显示有效。对于包含一种或多种个体微小RNA进行微小RNA谱的鉴定可能在将患者分成不同组(这些组在其它方面无法区分)中具有相似重要性，可对这些患者进行评估以确定具有相似药物反应的个体的组。
本发明实现了这些以及其它目标。
发明概述
根据上述需求以及下文中将被提及和将变得明显的那些需求，本公开涉及一种基于微小RNA表达来从患者群鉴定至少两个特征组的方法，所述方法包括如下步骤：收集免疫细胞、从所述免疫细胞提取包含微小RNA的RNA、对提取RNA中的至少一种微小RNA定量，以及基于所述至少一种微小RNA的表达将所述患者群分成不同组。优选地，所述收集免疫细胞的步骤包括收集外周血单核细胞。
一方面，所述对患者群分组的步骤包括将相对高水平表达所述至少一种微小RNA的患者分配至第一组，并将相对低水平表达所述至少一种微小RNA的患者分配至第二组。免疫细胞的收集可包括在免疫疗法治疗之前或之后收集细胞。另一个方面涉及在免疫疗法治疗之前和之后收集细胞，从而对患者群的分组包括测定免疫疗法治疗之后所述至少一种微小RNA的表达水平变化。优选地，对所述患者群分组包括：将所述表达水平显示第一变化的患者分配至第一组，并且将所述表达水平显示第二变化的患者分配至第二组。所述第一变化可以是表达水平的相对较大变化，而所述第二变化可以是表达水平的相对较小变化。或者，所述第一变化可以是表达水平的正向变化，而所述第二变化可以是表达水平的负向变化。
优选地，所述第一组中的所述至少一种微小RNA的表达水平变化的平均值的绝对值除以标准偏差大于或等于1。此外，一个实施方式涉及额外步骤：在所述第一组中鉴定已知微小RNA组内显示表达水平变化的微小RNA亚组，使所述表达水平变化的平均值的绝对值除以标准偏差大于或等于1。此外，所述方法还可包括如下步骤：在所述第一组中鉴定已知微小RNA组内显示表达水平最大变化的微小RNA。
本发明的另一个实施方式涉及如下额外步骤：从其它患者收集免疫细胞，从所述其它患者的免疫细胞提取包含微小RNA的RNA，对提取自所述其它患者的RNA中的至少一种微小RNA定量，以及基于所述至少一种微小RNA的表达鉴定所述其它患者属于所分组中的一组。优选地，这还包括基于所述鉴定结果对所述其它患者给予治疗(例如IVIG)。
另一方面中，本发明方法还包括基于所分组中的成员从属关系诊断患者患有某种病症。一个实施方式涉及诊断患有生殖疾病的患者。
而本发明的另一个方面包括如下额外步骤：监测对属于所述分组之一的患者的治疗，所述监测通过收集免疫细胞、提取至少一种微小RNA并随后对所述至少一种微小RNA定量来进行。
可用于本公开内容的合适微小RNA的示例包括但不限于：hsa-miR-582-3p MIMAT0004797(SEQ ID NO:1)；hsa-miR-7-1-3p MIMAT0004553(SEQ ID NO:2)；hsa-miR-340-5p MIMAT0004692(SEQ ID NO:3)；hsa-miR-199b-3p MIMAT0004563(SEQ ID NO:4)；hsa-miR-199a-3p MIMAT0000232(SEQ ID NO:5)；hsa-miR-30e-5p MIMAT0000692(SEQ ID NO:6)；hsa-miR-575MIMAT0003240(SEQ ID NO:7)；hsa-miR-7-5p MIMAT0000252(SEQ ID NO:8)；hsa-miR-33a-3p MIMAT0004506(SEQ ID NO:9)；hsa-miR-7-2-3p MIMAT0004554(SEQ ID NO:10)；hsa-miR-199b-5p MIMAT0000263(SEQ ID NO:11)；hsa-miR-144-5p MIMAT0004600(SEQ ID NO:12)；hsa-miR-30e-3p MIMAT0000693(SEQ ID NO:13)；hsa-miR-424-3p MIMAT0004749(SEQ ID NO:14)；hsa-miR-33a-5p MIMAT0000091(SEQ ID NO:15)；hsa-miR-671-3p MIMAT0004819(SEQ ID NO:16)；hsa-miR-340-3p MIMAT0000750(SEQ ID NO:17)；hsa-miR-1267MIMAT0005921(SEQ ID NO:18)；hsa-miR-1229-3p MIMAT0005584(SEQ ID NO:19)；hsa-miR-424-5p MIMAT0001341(SEQ ID NO:20)；hsa-miR-221-3p MIMAT0000278(SEQ ID NO:21)；hsa-miR-1MIMAT0000416(SEQ ID NO:22)；hsa-miR-133b MIMAT0000770(SEQ ID NO:23)；hsa-miR-221-5p MIMAT0004568(SEQ ID NO:24)；hsa-miR-210MIMAT0000267(SEQ ID NO:25)；hsa-miR-1229-5p MIMAT0022942(SEQ ID NO:26)；hsa-miR-671-5p MIMAT0003880(SEQ ID NO:27)；hsa-miR-582-5p MIMAT0003247(SEQ ID NO:28)；hsa-miR-199a-5p MIMAT0000231(SEQ ID NO:29)；hsa-miR-144-3p MIMAT0000436(SEQ ID NO:30)；hsa-miR-376a-5p MIMAT0003386(SEQ ID NO:31)；hsa-miR-193a-3p MIMAT0000459(SEQ ID NO:32)；hsa-miR-557MIMAT0003221(SEQ ID NO:33)；hsa-miR-34a-3p MIMAT0004557(SEQ ID NO:34)；hsa-miR-584-5p MIMAT0003249(SEQ ID NO:35)；hsa-miR-1244MIMAT0005896(SEQ ID NO:36)；hsa-miR-125b-1-3p MIMAT0004592(SEQ ID NO:37)；hsa-miR-32-3p MIMAT0004505(SEQ ID NO:38)；hsa-miR-933MIMAT0004976(SEQ ID NO:39)；hsa-miR-373-5p MIMAT0000725(SEQ ID NO:40)；hsa-let-7b-5p MIMAT0000063(SEQ ID NO: 41)；hsa-miR-376a-3p MIMAT0000729(SEQ ID NO:42)；hsa-miR-129-2-3p MIMAT0004605(SEQ ID NO:43)；hsa-miR-548am-3p MIMAT0019076(SEQ ID NO:44)；hsa-let-7f-5p MIMAT0000067(SEQ ID NO:45)；hsa-miR-876-3p MIMAT0004925(SEQ ID NO:46)；hsa-miR-371a-5p MIMAT0004687(SEQ ID NO:47)；hsa-miR-423-5p MIMAT0004748(SEQ ID NO:48)；hsa-miR-373-3p MIMAT0000726(SEQ ID NO:49)；hsa-miR-152MIMAT0000438(SEQ ID NO:50)；hsa-miR-34a-5p MIMAT0000255(SEQ ID NO:51)；hsa-miR-335-5p MIMAT0000765(SEQ ID NO:52)；hsa-miR-181c-5p MIMAT0000258(SEQ ID NO:53)；hsa-miR-125b-2-3p MIMAT0004603(SEQ ID NO:54)；hsa-miR-548am-5p MIMAT0022740(SEQ ID NO:55)；hsa-miR-338-3p MIMAT0000763(SEQ ID NO:56)；hsa-miR-1225-5p MIMAT0005572(SEQ ID NO:57)；hsa-miR-362-3p MIMAT0004683(SEQ ID NO:58)；hsa-miR-767-5p MIMAT0003882(SEQ ID NO:59)；hsa-miR-136-3p MIMAT0004606(SEQ ID NO:60)；hsa-miR-29b-1-5p MIMAT0004514(SEQ ID NO:61)；hsa-miR-29a-3p MIMAT0000086(SEQ ID NO:62)；hsa-miR-92b-3p MIMAT0003218(SEQ ID NO:63)；hsa-miR-362-5p MIMAT0000705(SEQ ID NO:64)；hsa-miR-223-5p MIMAT0004570(SEQ ID NO:65)；hsa-miR-505-3p MIMAT0002876(SEQ ID NO:66)；hsa-miR-634MIMAT0003304(SEQ ID NO:67)；hsa-miR-371a-3p MIMAT0000723(SEQ ID NO:68)；hsa-miR-129-1-3p MIMAT0004548(SEQ ID NO:69)；hsa-miR-1238-5p MIMAT0022947(SEQ ID NO:70)；hsa-miR-876-5p MIMAT0004924(SEQ ID NO:71)；hsa-miR-181c-3p MIMAT0004559(SEQ ID NO:72)；hsa-miR-338-5p MIMAT0004701(SEQ ID NO:73)；hsa-miR-505-5p MIMAT0004776(SEQ ID NO:74)；hsa-miR-335-3p MIMAT0004703(SEQ ID NO:75)；hsa-miR-543MIMAT0004954(SEQ ID NO:76)；hsa-miR-223-3p MIMAT0000280(SEQ ID NO:77)；hsa-miR-125b-5p MIMAT0000423(SEQ ID NO:78)；hsa-miR-1238-3p MIMAT0005593(SEQ ID NO:79)；hsa-miR-377-5p MIMAT0004689(SEQ ID NO:80)；hsa-miR-584-3p MIMAT0022708(SEQ ID NO:81)；hsa-miR-22-5p MIMAT0004495(SEQ ID NO:82)；hsa-miR-376a-2-5p MIMAT0022928(SEQ ID NO:83)；hsa-miR-301a-5p MIMAT0022696(SEQ ID NO:84)；hsa-miR-548m MIMAT0005917(SEQ ID NO:85)；hsa-miR-29b-3p MIMAT0000100(SEQ ID NO:86)；hsa-miR-99a-3p MIMAT0004511(SEQ ID NO: 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ID NO:191)。
本发明的实施方式可包括选自下组的至少一种微小RNA的应用：hsa-let-7e、mir-1、hsa-mir-1181、hsa-miR-1183、hsa-miR-1224-5p、hsa-miR-127-3p、hsa-mir-1296、hsa-mir-132、hsa-mir-136、hsa-miR-139-3p、hsa-mir-141、hsa-miR-142-3p、hsa-mir-142-5p、hsa-mir-144、hsa-mir-153、hsa-mir-1537、hsa-miR-154、hsa-miR-191、hsa-mir-193a-3p、hsa-miR-19a、hsa-mir-219-5p、hsa-mir-29b、hsa-mir-301a、hsa-miR-301b、hsa-miR-30e、hsa-mir-32、hsa-mir-33a、hsa-miR-340、hsa-miR-362-3p、hsa-miR-371-5p、hsa-377、hsa-miR-423-3p、hsa-miR-432、hsa-mir-513a-5p、hsa-mir-545、hsa-miR-548a-5p、hsa-miR-574-5p、hsa-mir-582-3p、hsa-mir-590-5p、hsa-mir-15a、hsa-mir-548c-5p、hsa-mir-1225-3p、hsa-mir-29b、hsa-mir-21、hsa-mir-1237、hsa-mir-101、hsa-mir-1539、hsa-mir-557、hsa-mir-125a-3p和hsa-mir-423-5p。在另一方面，所述微小RNA选自hsa-mir-136、hsa-mir-141、hsa-mir-142-5p、hsa-mir-144、hsa-mir-153、hsa-mir-1537、hsa-mir-193a-3p、hsa-mir-219-5p、hsa-mir-29b、hsa-mir-301a、hsa-mir-32、hsa-mir-33a、hsa-mir-545、hsa-mir-582-3p、hsa-mir-590-5p、hsa-mir-1181、hsa-mir-513a-5p、hsa-mir-132和hsa-mir-1296。在另一方面，所述微小RNA选自hsa-miR-144、hsa-miR-582-5p、hsa-miR-30e-3p、hsa-miR-340-5p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-210、hsa-miR-221-5p、hsa-miR-33a-5p、hsa-miR-575、hsa-miR-7-5p、hsa-miR-1229、hsa-miR-1267、hsa-miR-671-3p、hsa-miR-1244、hsa-miR-1和hsa-miR-133b。在另一方面，所述至少一种微小RNA可以是mir-1229或mir-671-3p。在又另一个方面，定量和分组可包括采用选自下组的至少四种微小RNA：miR-7-5p、miR-1229、miR-1267、miR-671-3p、miR-340-5p、hsa-miR-1、hsa-miR-133b和hsa-miR-33a-5p。
附图简要说明
其它特征和优势将由下文和对本发明优选实施方式的更具体描述(如相应附图所示)而显见，并且其中类似的所引字符贯穿视图通指相同部分或元件，并且附图中：
图1显示本发明实施方式中，具有高起始微小RNA表达的患者在IVIG治疗之 前和之后的CT水平；
图2显示本发明实施方式中，具有低起始微小RNA表达的患者在IVIG治疗之前和之后的CT水平；
图3显示根据本发明的一个实施方式用于评估所选微小RNA的评分系统；
图4a-4g显示根据本发明实施方式，有关患者结果的最前100种和最末100种微小RNA。
图5a-b显示根据本发明的一个实施方式，图4a-g的最前25种和最末25种微小RNA的表达差异。
发明详述
首先应理解，本公开不限于具体举例的材料、体系、常规、方法或结构，因为这些当然是可变化的。因此，虽然本文描述一些优选的材料与方法，但与本文所述那些相似或等同的众多选择均可用于实践本公开的实施方式。
也应当理解本文所使用的术语仅为了描述本公开特定的实施方式而不是限制。
这里概述性地列出本公开主题内容的若干实施方式。然而，应理解存在这些实施方式的变化形式和置换形式。这一概述意在示例性说明可能的实施方式。
本文所用术语“免疫细胞”应指淋巴细胞、单核细胞和粒细胞，其前体和成熟衍生物。这些应包括，例如，血浆细胞、树突细胞、肥大细胞、粒细胞和巨噬细胞。应理解免疫细胞参与广泛活性。这些包括免疫监控和介入(例如清除恶性细胞和清除感染性物质)。此外，免疫系统的细胞，尤其是巨噬细胞及其衍生物参与凝结。此外，应理解，炎症是免疫系统细胞活性的表现。
本文中所用术语“免疫治疗”、“免疫治疗的”或“免疫疗法”应包括旨在免疫系统细胞的活性改变的治疗性介入，由此设想影响免疫细胞的作用，其中所述细胞影响凝结和炎症。
本文中，可通过前缀mir-和标识符来指明特定微小RNA，例如如下情况：mir-155。RNA转录本中被miRNA靶向的序列可位于该转录本中的任何位置。然而，最常见的是3'未翻译区域中的序列。微小RNA命名法包括三字母前缀“mir”后跟数字，所述数字通常按微小RNA的描述顺序分配。在一种惯例中，在“R”为小写体时，该序列指微小RNA前体，而采用大写体(miR)时，指 示成熟形式。序列有一个或两个碱基不同时变体可由字母“a”和“b”指定。有时，位于基因组不同区域中的微小RNA前体导致相同的成熟微小RNA。这些微小RNA由数字后缀区分(“miR-123-1”和“miR-123-2”)。当两种微小RNA源自相同微小RNA前体的相对臂时，根据所用的是3'链还是5'链来采用后缀-3p或-5p对其指定。如本文中所用，数字编码，例如“mir-123”应包括其变体诸如mir-123-1、mir123-2，以及-3p和-5p变体。如本文所用，术语“初级-miRNA”应指由Drosha酶-Pasha酶复合物靶向的RNA。如本文所用，术语“miRNA前体”应指由Drosha酶-Pasha酶复合物切割的产物。如本文所用，对亲本命名(如mir-123)和任何更具选择性的序列(如mir-123-5p)的序列之间除了由文字描述的以外应不作区分。
特定微小RNA缩写还可包括确定起源物种的额外前缀，例如hsa为智人。尽管本文所述的主要实施方式涉及人，本领域技术人员应理解本公开的技术可应用于其它物种。
如本文所用的术语“对照个体”具有特殊含义。“对照个体”应指具有可比特点(如年龄和性别)的未患生殖疾病且未知有发展生殖疾病风险的个体。本文所用术语“对照样品”应指来自相同来源(如外周血)，并在相同或相当条件下收集的生物样品，如包含收集自对照个体的免疫细胞的试验对象样品，该试验对象样品用与对患者样品相同的方式处理并分析。
还应理解如本文所用的术语“对照样品”可以代表来自对照个体的多个样品的数学平均水平，其中收集本领域技术人员认为足够数量的样品。可源自所述样品的其它统计学参数有例如平均值的标准偏差。所述其它统计学参数可用于比较患者测试结果和对照样品，以评估所述患者测试结果表示异常结果的可能性，并且由此指示该患者患有生殖疾病或具有生殖疾病风险。出于简洁目的，该术语还可以另一种方式使用，其中收集并分析来自单一个体的多个相当的，时间上分离的样品，并彼此进行比较，使得第一样品或特定后续样品按前者是后者的对照来比较，这允许评估条件变化与临床状态，或妊娠阶段或治疗性介入结果的可能函数关系。
如本文所用，术语“生殖免疫功能异常”或“生殖疾病”应包括疑似具有免疫成分的那些生殖系统疾病。这些应包括但不限于：不育和受孕后障碍，如可能未经识别并由此诊断为不育的着床失败；流产；不导致流产但有损最佳妊娠结果的病症，如宫内生长迟缓、PROM(胎膜早破)、先兆子痫、早产、胎 盘早剥和死产；已知造成不育、妊娠并发症和早期着床失败的那些病症，如子宫内膜异位和自体免疫性甲状腺炎以及抗磷脂抗体综合征、在妊娠中有损最佳胎儿生长、成熟和发育的那些妊娠疾病和/或分娩后有损潜在儿童发育的那些妊娠疾病、在母方生殖寿命期间有损其长期生殖潜力的那些生殖疾病。本文所用的术语“免疫疾病”应包括由不论体液、细胞介导的或两者介导的和/或免疫组成(如炎症、补体或凝结介导的组成)相关的异常所致的疾病。
本文所用的术语“差异表达的”或“不同表达”应指患者生物样品与对照群的相应平均值之间特定微小RNA的量上通过所选检测手段可检测的差异，其中所述差异在统计学显著性生殖疾病患者群和未患该疾病或没有该疾病风险的相应对照群之间确定。在多种个体微小RNA的定量形成的模式能与对照中鉴定的相应模式相区分的情况下也可使用该术语。生殖疾病患者和/或具有生殖疾病风险的患者与对照个体之间的一种或多种微小RNA的差异表达优选以筛选一组微小RNA的方式确定(例如SA生物科学公司(SABiosciences)提供的那些(产品编号MAH-104A))。患者与对照值之间的差异表达的微小RNA可通过不同方式测定。各方法需要包括来自各组的最小数量的样品，从而可确定两组间表达上的显著差异。确定患者和对照之间的差异表达的微小RNA的优选实施方式利用微小RNA人类免疫病理学相关的微小RNA阵列(SuperArray技术，马里兰州弗雷德里克的SA生物科学公司(SABiosciences)，产品编号MAH-104A，用于司查塔基公司(Stratagene)Mx3005p)。用来自生殖疾病患者或有生殖疾病风险的患者的三份或多份RNA提取物和三份或更多份对照样品按照生产商说明来进行。按照生产商说明在Stratagene3005p实时热循环仪上运行定量PCR。就各组三重测定或更多重测定而言，确定各微小RNA的平均值并用于计算水平差异。当患者值与对照值之间的差异的p值≤0.05时，该微小RNA的值被确定为差异表达。可选择其它p值，这由本领域技术人员决定。应理解，生殖免疫疾病或该疾病的风险可包括不同差异表达模式。此外，患者接受测试的时间也可导致微小RNA表达模式不同，并且，模式可根据正在进行的治疗而不同。例如，调节性T细胞在受孕后有生理性增加。可预计微小RNA例如密切参与调节FoxP3(参与T调节功能的转录调节子)的mir-155会在受孕前后被差异调节。
术语“双峰”或“双峰分布”具有如统计学领域普通技术人员所通常理解的含义。包含两个峰的数据直方图被称为“双峰”而具有单个峰的那些被称 为“单峰”。维也纳大学的Erhard Reschenhofer在Journal of Statistics Education,9(1)(2001)http://www.amstat.org/publications/jse/v9n1/reschenhofer.html)10-24-2011下载)正式定义了“双峰性”并提供了确定双峰性的统计学测试。很明显，并非全部具有两个峰尤其是重叠峰的分布均属于双峰。它们必需可清楚分离。双峰性可通过观察数据直方图来较不正式地评估。若两个峰按平均值和标准偏差确定的范围有显著重叠，则不能称为具有双峰性。
本文所述的实施方式主要根据双峰性进行讨论，从而存在二个分组。然而，应理解，若采用本公开技术可区分多个患者组，则所述原理同样适用。
本文所用术语“探索法的”应指基于经验解决问题的技术。更具体地，其应包括设计来基于经验如包括在数据库中的那些来解决问题的技术。此外，所述技术可涉及持续的改进处理，其中基于数据库中新数据的增加对问题解决模型进行持续更新。可将这些计入纳入计算机算法。
本文所用术语“做出诊断”或本文所用的等同术语应指由个体，优选由生殖医学领域技术医师采用的方法的集合，应指通过检测一种或多种微小RNA水平或由包含于患者的一个或多个生物样品的免疫细胞所得概况以及与合适对照的比较来预测治疗或不治疗的临床结果、选择治疗或监控治疗。还应理解，所述诊断可涉及随所述微小RNA定量评估伴有对其它临床发现的评估。
除非另有说明，本说明书和权利要求书所用的表示各成分含量、反应条件等等的所有数值应理解为在所有情况下均被术语“约”修饰。因此，除非另有说明，否则，在本说明书中所用的数值参数是约数，可根据本公开内容希望实现的理想性质而变化。
本文中所用的术语“约”在涉及值或涉及质量、重量、时间、体积、浓度或百分数的量时，旨在涵盖与具体量相比的变化，在一些实施方式中涵盖±20％的变化、在一些实施方式中涵盖±10％的变化、在一些实施方式中涵盖±5％的变化、在一些实施方式中涵盖±1％的变化、在一些实施方式中涵盖±0.5％的变化和在一些实施方式中涵盖±0.1％的变化，因为这些变化适于施行本文公开的方法。不论是形式上在文章中引用的还是以互联网链接形式给出地址的所有专利和参考文献均通过引用全文纳入本文。除非另有具体定义，本文中所用的所有技术术语和科学术语均具有本文公开领域普通技术人员所通常理解的含义。按照长久存在的专利法习惯，术语“一个”、“一种”和“所述”用于本申请(包括权利要求)时指“一个或多个/一种或多种”。因此，例如，提及“一种 肽”包括多个此类肽，等等。
如上所述，仍存在未满足的需求。临床医师可被认为免疫治疗对其有用的患者引见。已成熟确立的观点是，合适选择患者来进行免疫治疗是有效治疗性介入的关键(参见Winger和Reed)。作者通过采用不同PBMC体外标志物来鉴定进行所述介入的合适患者。在本发明中，Winger和Reed在免疫治疗介入之前和之后的不同时间点对PBMC中不同微小RNA和微小RNA变化模式进行了定量。这些微小RNA“特征(signatures)”通过鉴定进行一种或多种特定治疗介入的候选者以及鉴定不同疾病(例如，妊娠相关疾病)患者的结果的预后来支持临床诊断。此外，设想本发明的诊断方法可应用于不同临床条件和不同免疫治疗介入。其应用能将复杂的诊断方案简化成一步法并且提供迄今为止无法获得的信息。
尽管本文所述的初始研究和示例基本关于妊娠和女性生殖系统疾病，但这些研究应视为本发明更广泛应用于涉及其它器官系统的其它疾病状态的一个示例。并且，尽管一些描述涉及所选介入之前或之后的一种或多种微小RNA的表达变化，应理解本发明可应用于在单一时间点进行的检测，该时间点可在所想介入之前或之后。
本发明的一个新方面在于，通过所选免疫治疗介入之后的单一或多种微小RNA的特征变化来将患者分成可区分的组。对属于微小RNA应答组的患者的鉴定与改善功效、预后和一种或多种特定免疫治疗介入的利用相关联。并且，某些微小RNA的定量水平和微小RNA的变化模式可预测一个或多个患者应答组，而治疗后水平还可具有其它预测价值。应用响应治疗介入的微小RNA模式或其预测对管理提供的有用了解无法通过鉴定与病理过程直接相关的标志物获得。
DNA相互作用蛋白质的存在与否或水平是这些自然DNA相互作用的效果的主要调节物。关于纯化，很明显此类相互作用仅可以DNA的天然、未纯化形式发生，其中与辅助相互作用蛋白的额外相互作用影响所述相互作用的结果。细胞的“状态”，例如增殖、受胁迫、分化，不包含在此类序列中而是包含在DNA与所述相互作用蛋白的联合相互作用中。通过变性处理(包括热变性或化学变性)或通过侵入性多核苷酸探针(锁DNA、PNA等)的相互作用进行原位分离或破坏的DNA分离破坏这些相互作用。就RNA而言，这些作用甚至更加明显。已充分确立RNA分子形成非典型相互作用，这导致预料之外的活性(如 在核糖酶中发现的那样)。此时需要与特定二价阳离子的基本相互作用来呈现催化构象。微小RNA需要与蛋白质的相互作用，所述蛋白质必需以合适形式可得。
所涉及的发现过程是转化性步骤。用于发现本发明的微小RNA的方法涉及两个测试点：在设计以干扰系统的介入之前和之后各一个。鉴定在所述干扰介入之后呈现显著不同表现的微小RNA。本发明的介入是转化性的，这导致不同临床亚组之间的所选微小RNA的可区分反应。而且，在介入之前进行的单一测试显示，多种微小RNA，主要是显示临床亚组之间的差异变化的那些相同微小RNA，可用于预测在各临床亚组中的成员从属关系。
对微小RNA的定量提供对生理和病例过程的深入理解，其中它们的水平与“稳态”相比存在可测差异。据信遗传和环境因素之间的相互作用导致表现的表型，该表型无法仅通过遗传因素预测。近几年，微小RNA水水平上的与环境因素的相互作用已变得明显。已知微小RNA在生物过程中起至关重要的作用，所述生物过程包括细胞生长、增殖、分化、发育、凋亡、胁迫、炎症和癌发生。(Esquela-Kerscher A.,Slack F.J.Oncomirs-microRNAs with a role in cancer(Oncomir－微小RNA在癌症中的作用).Nat.Rev.Cancer2006；6:259-269,Catania A.S.,等Vitamins and minerals with antioxidant properties and cardiometabolic risk:controversies and perspectives(具有抗氧化剂性质和心血管代谢风险的维生素和矿物质：争论与观点).Arq.Bras.Endocrinol.Metabol.2009；53:550-559,Chow W.H.等Epidemiology and risk factors for kidney cancer(肾癌的流行病学与风险因子).Nat.Rev.Urol.2010；7:245-257,Das U.N.Obesity:genes,brain,gut,and environment(肥胖：基因、脑、肠与环境).Nutrition2010；26:459-473.)。不同微小RNA的功能异常已与各种疾病过程相关联(Lu M.等,An analysis of human microRNA and disease associations(人微小RNA与疾病关系的分析).PLoS One2008；3:e3420.)。对病理情况的治疗可导致将改变的微小RNA表达模式的修复成与未受影响个体的微小RNA表达模式相似。或者，治疗可造成一种或多种特定介入或一种或多种介入类型所致的微小RNA表达模式。通过应用检测和受影响与未受影响对象之间比较来鉴定生理或病理过程中受影响的微小RNA可能不明显。差异表达可通过应用干扰事件(如治疗性介入)来揭示。举例来说，当静止的水平滑地覆盖着接近表面的不可见物体时，向该物体附近的水域扔石头所激起的常规波纹图案会因所述表面下物体而扭 曲，这揭示其存在。同样地，治疗性介入的微小RNA模式可能会改变，这揭示其表达的一种或多种不同模式。在本文报告的研究中，我们证明IVIG治疗介入后变化的mir-132表达模式。IVIG治疗后的mir-132表达的重要特征是其两分性质。该差异微小RNA表达预料之外地揭示了两个响应患者组。将已知微小RNA的微阵列分析基于其对IVIG的mir-132反应分成两组时，揭示显著不同的微小RNA反应模式。在患者通过临床结果被分组(健康的、先兆子痫和流产)的后续分析中，在不同组之间也鉴定出微小RNA对IVIG反应的不同模式。已研究出对微小RNA表达有影响的环境影响，其中所述环境影响包括药物介入(Yang Q,Qiu C,Yang J,Wu Q,and Cui Q*.miREnvironment Database:providing a bridge for microRNAs,environmental factors,and phenotypes(miR环境数据库：提供微小RNA、环境因素和表型之间的桥梁).Bioinformatics201127:3329-3330,Qiu C,Chen G和Cui Q*.Towards the understanding of microRNA and environmental factor interactions and their relationships to human diseases(对于微小RNA和环境因素的相互作用及其与人类疾病关系的理解).Scientific Reports2012,2:318.)已由相同作者开发出在线的可搜索数据库(http://202.38.126.151/hmdd/tools/miren.html,10/21/2012下载)。
多种不同微小RNA可协调调节个体mRNA，从而任何特定mRNA的表达均是这些个体微小RNA的多重调节作用的产物。微小RNA表达本身可由其它上游微小RNA以相似方式调节。因此，发展出涉及微小RNA的复杂网络。许多研究提供了对特定微小RNA及其mRNA靶标的相互作用的深入理解。然而，对这些特定相互作用的结果的预测受限于其内部相关相互作用的复杂性。因此，令人吃惊的是，特定微小RNA的表达变化使得能够通过特定微小RNA表达的变化将患者反应二分化或分成多个介入治疗分组。初始实验允许通过miR-132的表达模式将患者分成两个可区分的组。在一组中，miR-132的低表达保持在低水平或在采用静脉内给予汇集的免疫球蛋白(IVIg)处理之后变得更低一些。另一组显示相对高浓度的miR-132但在IVIg治疗后其水平显著下降。在用该单一区分参数，在IVIg治疗之前和之后对来自各组四个成员的样品在微阵列上研究全部已知人类微小RNA：http://www.chem.agilent.com/Library/usermanuals/Public/G4170-90011_miRNA_c omplete_2.4.pdf
结果见表(4-21)。其显示在IVIg治疗之前或之后比较检测值有不同表达 水平的微小RNA集合。此外，在介入之前或之后的单一检测中，这些微小RNA中的许多以及其它微小RNA于两组之间显示不同的绝对水平。为了排除这些结果可能是所测大量微小RNA中随机检测到的结果的可能性，对所述两组的成员再分类，使第一组的两个成员的结果与第二组的两个成员的结果合并，并且同样合并所述两组的剩余成员，以形成两个假组(sham group)。当检测IVIg治疗之前和之后数据的相似差异表达变化以及数据的绝对单一值时，无法鉴定出如前文所述的差异表达。
收集其它患者样品并以刚刚描述的相同方式通过微阵列分析进行检测，其中临床结果已知如下：1)健康妊娠、2)流产，和3)先兆子痫。将结果与来自上述患者的相似结果数据合并。
本公开内容包括一种用于诊断生殖免疫疾病患者的方法。应理解，这些疾病还可有炎性与凝结方面。所述方法包括：提供生物样品，其中所述样品包含免疫系统的细胞，分离所述细胞并从所述细胞分离微小RNA，然后对所述细胞中包含的一种或多种微小RNA的量定量，并将所述一种或多种微小RNA的量与一种或多种微小RNA对照水平作比较。若所述一种或多种微小RNA的量为差异表达，则诊断该对象患有生殖免疫疾病。
本发明的另一个方面是微小RNA在区分可能响应治疗介入的患者与不太可能响应的那些患者中的应用。具体而言，特定的微小RNA可将可能响应静脉内免疫球蛋白治疗(IVIG)的患者与不太可能响应的那些患者鉴定开。应理解，这种患者鉴定延伸至未患生殖疾病的患者，而包括设想进行IVIG治疗的全部患者。微小RNA监测可延伸为监测IVIG在针对其它病症的IVIG治疗的那些候选患者中的功效。此外，可以相同方式应用本发明来测定其它免疫治疗剂的适用性，所述其它免疫治疗剂例如TNFα阻断剂，如休米拉(Humira)以及类固醇、英脱利匹特(intralipid)、淋巴细胞免疫剂和IL-1阻断剂(阿那白滞素(Anakinra))、药物。其它系统与免疫系统相互作用，其中药物适度地影响免疫系统，炎症和凝结。这些包括，例如，影响肾素-血管紧张素系统，例如，血管紧张素转化酶抑制剂(“ACE-I”)、血管紧张素受体阻断剂(“ARB”)、肾素抑制剂、血管紧张素受体II型激动剂(例如“C21”)和影响甲羟戊酸合成的药物例如HMGCoA还原酶抑制剂(“他汀类药物(statin)”)。如本文所用，这些治疗形式应各自视为“免疫治疗性介入”。
所述方法组成对一种或多种微小RNA的定量的评估，其中所述微小RNA的 定量与生物样品内免疫系统细胞中存在的微小RNA有临床关联。因此，当生物样品是全血且微小RNA提取自全血时，只要个体微小RNA的定量与免疫系统细胞中的微小RNA有临床关联，就认为其是对微小RNA的定量，其中微小RNA分离自从全血分离的免疫系统细胞。来自免疫系统细胞的微小RNA的定量可能需要对某一标准如管家基因(housekeeping gene)进行标准化。本文所述的定量设想到内部标准的应用。
在本文公开内容的一个实施方式中，公开了一种用于诊断患有生殖疾病的妇女的方法，其中研究已知在受生殖疾病影响的患者中差异表达的单一微小RNA。所述方法涉及：从分离自生物样品的免疫细胞分离微小RNA，并鉴定包含在所述细胞内已知在生殖疾病患者中差异表达的微小RNA，并且将该对象的微小RNA与微小RNA对照相比较。若所述微小RNA差异表达，则诊断该对象患有生殖疾病。
在本文公开内容的一个实施方式中，公开了一种用于诊断妇女患有生殖疾病的方法，其中研究已知在受生殖疾病影响的患者中差异表达的多种微小RNA。所述方法包括：提供鉴定患生殖疾病或具有患生殖疾病风险的特定微小RNA谱。所述方法涉及：从所述细胞分离微小RNA并鉴定所述细胞中包含的微小RNA谱，然后将所述对象的微小RNA谱与微小RNA对照谱相比较。若显示存在前述微小RNA谱，则诊断该对象患有生殖疾病。
在本公开内容的一个实施方式中，公开了一种用于诊断妇女患有生殖疾病的方法，其中研究一种或多种选自下组的微小RNA标志物：mir-155、mir-146a、mir-16-1、mir16-2、let7a-1、let7a-2、let7a-3、let7e、let7g、mir-132、mir-9、mir-142-3b、mir-17-92、mir-223、mir-181a。所述方法包括：提供鉴定患生殖疾病或具有患生殖疾病风险的特定微小RNA谱。所述方法涉及：从所述细胞分离微小RNA并鉴定所述细胞中包含的微小RNA谱，然后将所述对象的微小RNA谱与微小RNA对照谱相比较。若显示存在前述微小RNA谱，则诊断该对象患有生殖疾病。
在本公开内容的另一个实施方式中，公开了一种用于评价治疗功效和/或生殖疾病发展的方法。所述方法包括：在一段时间内提供多个生物样品，其中所述样品包含免疫系统的细胞，分离所述细胞并从所述细胞分离微小RNA，然后对所述细胞中包含的多种微小RNA的种类和量进行定量，然后将该微小RNA谱与一种或多种微小RNA对照谱作比较以确定这些谱的差异表达，由此允许评 估所述病症的发展或治疗功效。
对象可以是人或其它动物。“生殖疾病”包括一种或多种选自下组但不限于下组的疾病：胎膜早破、先兆子痫、早产、宫内发育迟缓和复发性流产以及抗磷脂抗体综合征。
免疫功能异常包括由不论体液介导、细胞介导或两者介导的异常免疫机制引起的和/或与免疫相关机制有关(例如炎性、补体或凝结相关病症)免疫疾病。
免疫功能异常可增加孕育的儿童后来发展病症的风险，例如，气喘、孤独症、注意缺陷多动障碍(ADHD)、妥瑞氏综合征、糖尿病和精神分裂症，其中所述免疫功能异常涵盖在生殖和/或免疫疾病的概念内。本发明还设想包括妊娠之前一年或之后一年的围妊娠期。然而，卵子发生有关时期也包括在本发明的范围内。该时期可能在妊娠前一年外。如Winger和Reed所述，妊娠前的时期可能会形成对妊娠结果不利的免疫状态(Winger EE,Reed JL,Ashoush S,Sapna A,El-Toukhy T,Taranissi M:"Treatment with adalimumab(Humira)and intravenous immunoglobulin(IVIG)improves pregnancy rates in women undergoing IVF(采用阿达木单抗(Humira)和静脉内给予免疫球蛋白(IVIG)治疗提高IVF女性妊娠率).American Journal of Reproductive Immunology,2009；61:113-120)。同样地，妊娠后的时期可能会受例如自体免疫疾病如类风湿性关节炎(已知在妊娠后发作的疾病)的影响。处理来自疑似患有生殖疾病的对象的包含免疫系统细胞的生物样品，其中所述细胞通过本领域技术人员已知的各种方法分离。在一个优选实施方式中，所述生物样品是全血。在一个更优选实施方式中，来自全血的细胞通过泛影葡胺(Ficoll-hypaque)密度梯度离心法分离，所述方法在如下文献中有指导(Boyum A1983.Isolation of human blood monocytes with Nycodenz,a new non-ionic iodinated gradient medium(用Nycodenz分离人血单核细胞，一种新型非离子碘化梯度介质).Scand J Immunol17:429-436)。采用适于提取短RNA序列的方法来提取RNA。优选所述方法采用最适用于回收微小RNA序列的试剂盒，例如mirNeasy Mini试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，目录号217004)，按照生产商提供的说明进行所述提取。可根据本领域技术人员已知的多种技术确定对微小RNA的定量。在一个优选实施方式中，个体微小RNA通过实时聚合酶链式反应(PCR)定量。在一个更优选的实施方式中，由SA生物科学公司提供的试剂盒(www.SABioscies.com)为已知人免疫病理学病症涉及的个体微小RNA提供试剂和方法以使所述定量针对 特定实时热循环仪(例如Stratagene Mx3005p，目录号MAH-104A)最优化。Stratagene Mx3005p的操作说明书由生产商提供。其中包含用于对回收的RNA进行分光光度定量的说明、关于RNA和PCR主混物输入量的推荐。定量可与对“管家基因”(这种基因在细胞中相对保守地表达，由此被研究以供相对定量)的定量同时进行。管家基因可选自，例如，β-肌动蛋白、甘油醛-3P-脱氢酶(GAPDH)、膜联蛋白A2(ANXA2)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT1)、泛素(UBQ甘油醛-3P-脱氢酶(GAPDH)、膜联蛋白A2(ANXA2)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT1)、泛素(UBQ)、18s RNA。所得比例包含独立于测定系统内RNA输入量的相对量。这允许以分析物信号和选定管家基因的比例的形式与采用相似方式定量的对照样品进行比较。
已知参与免疫病理学病症的感兴趣的微小RNA包括但不限于：mir146a、1mir-46b、mir-155、mir-605、mir-623、mir-583、mir-26a、mir-519d、1mir-26、1mir-6、3mir-69-3、Let-7a and125b mir-126、mir-155、mir-21、Let-7a、let-7c、let-7d、let-7e、let-7g、mir-214、mir-409-3p、mir-451、mir-103、mir-105、mir-106a、mir-125a-5p、mir-125b、mir-126、mir-128、mir-130a、mir-132、mir-134、mir-135a、mir-135b、mir-138、mir-142-3p、mir-142-5p、mir-143、mir-145、mir-147、mir-148a、mir-149、mir-150、mir-15a、mir-15b、mir-16、mir-181a、mir-183、mir-184、mir-185、mir-187、mir-18a、mir-191、mir-195、mir-196a、mir-198、mir-19a、mir-19b、mir-200a、mir-203、mir-205、mir-206、mir-20a、mir-20b、mir-21、mir-214、mir-223、mir-23b、mir-26a、mir-26a,mir-26b、mir-27a、mir-27b、mir-298、mir-299-3p、mir-29b、mir-29c、mir-302a、mir-302c、mir-30b、mir-30c、mir-30e、mir-31、mir-325、mir-335、mir-34a、mir-369-3、mir-370、mir-379、mir-383、mir-409-3p、mir-46b、mir-493、mir-519d、mir-574-3p、mir-577、mir-583、mir-605、mir-623、mir-9、mir-98、mir-99b。
在一个优选实施方式中，采用已知相较于对照样品值而言差异表达的一种或多种微小RNA。同样优选地，将多种微小RNA鉴定为指示差异表达的微小RNA的模式或特征。可通过如下方式来确定所述单一或多种微小RNA：在微小RNA组内对生殖疾病患者或有患生殖疾病风险的患者中的微小RNA水平进行定量并将由患者水平的生物样品确定的微小RNA与源自对照样品的那些相比较。
在一个优选实施方式中，将患者样品分组。各组可通过其临床概况以其他方式定义。作为替代方式，例如并如本文所用，一种或多种微小RNA在患者间具有可区分的水平，或可以不同方式响应免疫治疗性介入。例如并如本文所用，各组可通过其对IVIg治疗的响应，通过其不同mir-132反应来区分。基于其对IVIg的不同mir-132反应，可将其分为两组(“A”和“B”)。可对样品的微小RNA的差异绝对表达或其对免疫治疗性介入的差异微小RNA反应进行后续研究。这些方法可用于确定通过上述方法建立的组之间的微小RNA反应模式。
本发明可用于提出生殖和/或免疫疾病患者对可能减轻所述疾病的特定免疫治疗的适合性，还可用于评估患者发展此类疾病的风险。此外，本发明可用于通过提供一系列试验和结果比较来监测疾病治疗的发展或监测疾病风险的降低。系列研究可在妊娠过程中、妊娠前、妊娠后以及疗程期间进行并比较，以确定所提供治疗的成功性和充分性。
对来自PBMC的微小RNA进行定量允许研究者或临床医师将所得结果与合适对照作比较，其中鉴定出表达差异。例如，若生殖疾病患者或有患此类疾病(例如反复性流产)风险的患者中的某一微小RNA(如mir-155)相较于由未经历反复性流产的个体形成的对照而言差异表达，则可诊断该患者患有生殖疾病且该患者是例如采用TNFα阻断剂进行免疫介入的候选者。被如此诊断的患者可按Winger和Reed对定义为患有相似疾病的患者所述的方式治疗(Edward E.Winger,Jane L.Reed,Treatment with Tumor Necrosis Factor Inhibitors and Intravenous Immunoglobulin Improves Live Birth Rates in Women with Recurrent Spontaneous Abortion(用肿瘤坏死因子抑制剂和静脉内给予免疫球蛋白的治疗提高反复自发性流产女性的活产率),60(1),8-16,电子公开:2008年6月28日。Edward E.Winger,Jane L.Reed,Sherif Ashoush,Sapna Ahuja,Tarek El-Toukhy,Mohamed Taranissi,Treatment with Adalimumab(Humira and Intravenous Immunoglobulin Improves Pregnancy Rates in Women Undergoing IVF(采用阿达木单抗(Humira)和静脉内给予免疫球蛋白的治疗提高IVF女性的妊娠率),American Journal of Reproductive Immunology61(2009)113–120))。
在一些实施方式中，用于提取RNA的细胞应该是PBMC细胞，而在其它情况中，细胞应该是源自身体组织的免疫细胞，所述身体组织例如子宫内膜、蜕膜、胎儿和胎盘组织，以及次级淋巴器官例如淋巴结。单核细胞还可通过多 种技术选择，例如用标志物标记所述细胞之后通过流式细胞术分选，所述标志物例如允许其分离成不同免疫细胞亚型的单克隆抗体。例如，调节性T细胞可在用单克隆抗体标记后进行选择，所述单克隆抗体例如CD4、CD127和CD25(添加或不加CD3)，根据BD公司(Becton Dickinson Co.)(采用来自该公司的试剂和仪器如下进行：http://www.bdbiosciences.com/research/tcell/regulatorytcells/workflow/identifyingtregs.jsp10年4月28日下载)。可从通过所述方式选择分离的细胞提取的RNA可通过按生产商说明提取来制备(凯杰公司(Qiagen)目录号763134)。微小RNA，例如mir-155，可按Chen等人所述的方法通过PCR(聚合酶链式反应)来检测并定量(http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_marketing/documents/generaldocuments/cms_040548.pdf，5/11/10下载)。可从产品介绍中描述的那些来选择用于个体微小RNA的引物和试剂(http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_marketing/documents/generaldocuments/cms_068884.pdf，5/11/10下载)。该文件提供指导对个体微小RNA进行检测和定量的信息。
所述方法包括：提供来自具有生殖和/或免疫疾病史或有患此类疾病风险的对象的生物样品，所述样品源自免疫细胞，例如，源自外周血，然后如Boyum指导分离单核细胞(Boyum A1983.Isolation of human blood monocytes with Nycodenz,a new non-ionic iodinated gradient medium(用Nycodenz分离人血液单核细胞，一种新型非离子碘化梯度介质).Scand J Immunol17:429-436)，然后测定非编码RNA(例如优选为一种或多种微小RNA)的量并将该样品中对应RNA的量与来自对照个体的经相似处理的生物样品中对应RNA的量作比较。此外，所述方法可包括对来自所述生物样品的多种个体微小RNA进行定量，并对这些个体微小RNA进行定量，然后将微小RNA的量与对应微小RNA对照水平作比较。然后，若来自所述样品的一种或多种RNA的量相较于对应RNA对照水平而言是差异表达的，则将该对象诊断为患有生殖和/或免疫疾病或具有发展此类疾病的风险。在一些实施方式中，所述方法还包括基于所测定的一种或多种RNA的量来选择治疗或改变治疗。该测定可基于对于特定个体微小RNA或微小RNA的组合的评估。
在本公开内容的其它实施方式中，提供了一种用于对生殖或免疫疾病患者和/或对象内有发展生殖疾病风险的试验对象评价治疗功效和/或进展的方法。在一些实施方式中，所述方法包括在一段时间内提供来自对象的一系列生物样 品，如上所述分离RNA(包含来自该系列生物样品的RNA)，测定来自该系列的各生物样品中的一种或多种微小RNA的量，并且测定来自该系列的各生物样品中的一种或多种微小RNA的量中的任何可检测的变化，以允许检测对于对象内生殖疾病或生殖疾病风险的治疗功效和/或进展。
在本公开内容的另外其它实施方式中，提供一种用于表征对象内生殖疾病的方法。在一些实施方式中，所述方法包括提供来自对象的生物样品，从所述生物样品分离包含微小RNA的RNA，测定一种或多种所述RNA的量，以及将所述一种或多种微小RNA的量与对应的微小RNA对照水平作比较。然后，基于来自所述样品的所述一种或多种微小RNA的量相较于一种或多种微小RNA对照水平而言的差异表达来表征所述生殖疾病。在一些实施方式中，在与患有已知生殖疾病的充分表征的个体相比较时表征所述生殖疾病。
在这些方法的一些中，对微小RNA的定量包括采用实时聚合酶链式反应。SA生物科学公司为已知涉及人免疫病理学病症的个体微小RNA提供试剂和方法，以使所述定量针对特定实时热循环仪(例如Stratagene Mx3005p(产品编号MAH-104A))最优化(www.SABioscies.com)。定量可与对“管家基因”(经研究以允许标准化的在细胞物质中相对保守地表达的基因)的定量同时进行。此外，在这些方法的一些实施方式中，所述mirRNA是一种或多种微小RNA。其中定量的微小RNA包括但不限于此。
已证明微小RNA，其在miRNA前体中或在靶位点中的侧接区域影响生理学和病理学过程。微小RNA及其侧接区域和靶mRNA中的单核苷酸多态性(SNP)可改变靶标特异性，使野生型与含SNP的对应物之间造成作用丧失或减小。此外，此类多态性可产生新mRNA靶标相互作用。(Gong J,Tong Y,Zhang HM,Wang K,Hu T,Shan G,Sun J,Guo AY,Genome-wide identification of SNPs in microRNA genes and the SNP effects on microRNA target binding and biogenesis Human Mutation(基因组范围鉴定微小RNA中的SNP以及SNP对微小RNA靶标结合和生物生成人类突变的影响)(2012)33(1):254-63.doi:10.1002/humu.21641.电子公开2011年11月23日)。这些多态性可导致微小RNA对靶mRNA调节的功效发生变化。(Jazdzewski K,Murray EL,Franssila K,Jarzab B,Schoenberg DR,de la Chapelle A.Common SNP in pre-mir-146a decreases mature mir-expression and predisposes to papillary thyroid carcinoma(mir-146a前体中的常见SNP减少成熟mir表达并倾向乳头状甲状腺癌).Proc Natl Acad Sci U S A 2008；105:7269–74.)。此外，可能会潜在影响微小RNA所介导对细胞调节的多态性其可存在于微小RNA靶基因的3'-UTR中。其它多态性也可存在于参与微小RNA生物发生以及初级微小RNA序列、前体微小RNA序列和成熟微小RNA序列的基因中。经加工的微小RNA中的此类多态性的结果可对靶基因多样性表达具有很大影响并且具有严重后果，而在微小RNA靶位点中的多态性，在靶mRNA的3'-UTR中，可更具靶标和/或通路特异性(Prasun J Mishra和Joseph R Bertino,MicroRNA polymorphisms:the future of pharmacogenomics,molecular epidemiology and individualized medicine(微小RNA多态性：药物基因组学、分子流行病学和个体化医学的未来),Pharmacogenomics.2009年3月；10(3):399–416.doi:10.2217/14622416.10.3.399)。
例如，通过例如实时等位基因区别的技术对此类多态性进行的检测也在本发明范围内。可在Mx3000P指导手册中找到方法(www.bio.davidson.edu/courses/Bio343/Mx3000P_Manual.pdf10/24/10下载))。已登入有野生和含SNP靶标的等位基因相互作用的识别。例如，参见http://www.bioguo.org/miRNASNP/index.php,(10/21-2012下载)。本发明特别良好适用于个性化医疗。利用核酸表征和定量来评估特定治疗干预的成功可能性。个性化医疗的目标是鉴定出可能或相反不太可能响应候选治疗的患者。成本、副作用和改善的治疗反应是争取将核酸测试作为选择治疗的手段以及跟踪疗程的公认原因。对微小RNA的定量不仅可有助于鉴定患有生殖疾病的患者，此类定量还将在实质上无限种疾病中相应地协助选择并指示治疗选择并监测其效果。
通过对患者对于介入(例如免疫治疗如IVIG)的反应将其分成两组或更多组的能力允许更具体地预测对于特定介入的治疗反应并也可允许预测对于其它介入的反应。所述区分的另一个方面是更好地预测并判断其它疾病(例如自体免疫疾病)的易患病性。若鉴定患者组间的某一微小RNA的反应模式是双峰性的，则可根据其反应将患者分成所述组。
本发明包括在介入(优选免疫治疗性介入，例如IVIG)之前和之后收集免疫细胞(优选PBMC)，从所述细胞提取含微小RNA的RNA，对所提取的RNA中的微小RNA定量，测定一种或多种定量的微小RNA是否在统计学足够数量的患者样品间显示双峰性反应。若一种或多种微小RNA中显示双峰性反应模式，则可根据其反应将患者分成不同组。
本文所用的“反应”定义为第一样品结果与第二样品结果之间的差异，其中之前已有介入性介入或有介入的介入性作用。其可以是变化的缺失或者增加、减少。本文所用术语“双峰”或“双峰性”指反应的非正态分布，其中数据特征为两个不同模式。数据可以图表形式在直方图中展现，并通过观察评估双峰性。已开发统计学方法来辨别双峰性。第一步将结果簇识别为两个群。尽管通常通过观察检验数据直方图来识别两个群之间的区分点，可由统计学领域普通技术人员施用统计学方法。计算两个簇的平均值和标准偏差。在双峰性的一个优选定义中，若两个簇的平均值等于或远离所述两个簇的标准偏差之和，则认为数据具有双峰性(Schilling,Watkins和Watkins,“Is Human Height Bimodal？(人类身高具有双峰性吗？)”,The American Statistician(2002),56(3):223-229)。
在测试组的一种或多种微小RNA反应之间呈现双峰性分布时，认为群体就微小RNA反应而言具有两分性。应理解，并非所有患者组就其在任何给予的介入之后的个体微小RNA反应而言都具有两分性。若发现一种或多种微小RNA具有双峰性反应，则认为该患者群具有两分性。
在一个优选实施方式中，本领域普通技术人员个体采用人类微小RNA阵列(来自安捷伦技术公司(Agilant Technologies))(例如产品编号G4471A-029297)并按照生产商的指导)根据微阵列生产商的指导在提取自PBMC的样品RNA上对所有已知人类微小RNA定量。收集的血液放入肝素管中并在室温下保持优选约24小时，然后分离PBMC。RNA制样与提取：将PBMC或分选的细胞群(<1x10^7活细胞)收集在1ml TRIzol(英杰公司(Invitrogen))中并储存在-80c备用)。根据TRIzol方案(英杰公司)或Rneasy小抽试剂盒(凯杰公司(Qiagen))分离总RNA。就Rneasy小抽试剂盒的使用而言，整个过程在室温下采用QIAcube自动化机器人(凯杰公司)进行。总RNA产量采用Thermo Scientific NanoDrop1000微体积分光光度计来评估(260nm处的吸光度和260/280及260/230比例)。RNA完整性采用安捷伦的Bioanalyzer NANO芯片实验室(Lab-on-Chip)仪器(安捷伦)评估。微小RNA微阵列处理。微小RNA微阵列数据通过采用安捷伦的GeneSpring GX v11.5.1进行标准化(见链接)(http://www.chem.agilent.com/en-US/Products-Services/Software-Informatics/Gen eSpring-GX/pages/default.aspx)10/7/2012下载。测试在样品上进行，所述样品优选在治疗介入之前1～3周或更短时间内以及治疗介入之后1～3周或更短时 间内采得。在一个优选实施方式中，选择有统计学意义数量的患者，这些患者具有相似人口统计学和临床特点(例如年龄、性别和临床状况(例如反复性妊娠损失))。分析这些数据的目标是将患者分成两组或更多组。在一个更优选实施方式中，目标是将患者二分化为两组，各组具有独特的微小RNA谱。
有多种方法适于测定定义各组的独特微小RNA谱。在第一步中，计算在治疗前和治疗后取样的各微小RNA之间的差异。计算不同“之前和之后”样品亚组之间的各个差异的平均值和标准偏差并这些微小RNA以统计学显著性排序。选择微小RNA的平均值和SD最具统计学显著性差异的亚组(Graphpad软件t检验)。通过研究，鉴定结果呈二分性分布的微小RNA。然后根据测定将患者结果分成两组，各组含选定的微小RNA结果。
如下讨论，在一组17个患者间显示双峰性hsa-mir-132反应。随后，来自所述两组(由hsa-mir-132双峰性分布确定)各组的患者的之前和之后样品的RNA在含全部“已知”或疑似的人类微小RNA的微阵列中评估。如此，鉴定出hsa-mir-132为符合上述标准。
选择在Alan E.Beer中心因反复性流产和不育症就诊并接受静脉内免疫球蛋白(IVIG)治疗的十七位女性患者(平均年龄35.8±4.8年)(平均有1.5±1.8次先前流产；有1.6±1.5次先前IVF失败)。各患者都签署了同意书，允许其血液被用于研究目的。该研究选择的各患者在IVIG治疗之前平均13.2±6.0天和在IVIG治疗之后平均11.8±5.6天进行采血(在微小RNA采血之间平均25.1±7.9天)。血液作为对患者进行的常规血研究的部分来采得。从室温保持24～48小时久的肝素化血液，通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心来分离PBMC。大约10x10⁶个细胞保存在1ml Trizol(英杰公司)中并保持在-20℃备用。表1总结了患者特点。
表1


然后，对来自十七位患者的PBMC研究mir-16、mir-132、mir-146a、mir-155、mir-181a、mir-196a、mir-223，采用RNU48作为管家基因，在通过实时PCR进行反转录RNA中用于标准化目的。各患者已接受静脉内免疫球蛋白(IVIG)治疗处理，并在治疗之前和之后采血，并且对各样品的微小RNA定量。通过查阅文献选择候选微小RNA。基于自体免疫/炎性疾病(狼疮和类风湿性关节炎)对PBMC选自微小RNA。(基于来自如下文献的信息选择mir16、mir-132、mir146a、mir155、mir181a、mir196a和mir223：(1)Pauley KM,Satoh M,Chan AL,Bubb MR,Reeves WH,Chan EK.Upregulated mir-146a expression in peripheral blood mononuclear cells from rheumatoid arthritis patients(来自类风湿性关节炎的外周血单核细胞中mir-146a表达上调).Arthritis Res Ther.2008；10(4):R101.；(2)Dai Y,Huang YS,Tang M,Lv TY,Hu CX,Tan YH,Xu ZM,Yin YB.Microarray analysis of microRNA expression in peripheral blood cells of systemic lupus erythematosus patients(系统性红斑狼疮患者的外周血细胞中微小RNA表达微阵列分析).Lupus.2007；16(12):939-46.；(3)Fehniger TA,Wylie T,Germino E,Leong JW,Magrini VJ,Koul S,Keppel CR,Schneider SE,Koboldt DC,Sullivan RP,Heinz ME,Crosby SD,Nagarajan R,Ramsingh G,Link DC,Ley TJ,Mardis ER.Next-generation sequencing identifies the natural killer cell microRNA transcriptome(新一代测序鉴定自然杀伤细胞微小RNA转录组).Genome Res.2010Nov；20(11):1590-604.)。
血样收集在EDTA处理的管中，并根据本领域普通技术人员已知的方法通过标准Ficoll密度梯度离心来分离PBMC。或者，可按照生产商方案(方案号AST-1)采用来自西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)的Accupsin管进行处理。PBMC在RNA分离之前于无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤一次。采用mir-Vana微小RNA分离试剂盒(美国德克萨斯州奥斯汀的安碧公司(Ambion))按照生产商方案从新鲜获得的PBMC分离总RNA。通过吸收光谱根据DNA和RNA在260nm的吸收峰测定RNA浓度。10ng各RNA样品用于定量实时RT-PCR(qRT-PCR)。微小RNA qRT-PCR采用TaqMan微小RNA反转录试剂盒、TaqMan通用PCR主混物和TaqMan微小RNA测定(美国加利福尼亚州福斯特城的应用生 物系统公司(Applied Biosystems))处理。为这些特定人类微小RNA采用来自SA生物科学公司的引物：mir-16(MPH00062A)、mir-132(MPH01167A)、mir-146a(MPH00047A)、mir-155(MPH00059A)、mir-223(MPH01231A)、let-7a(MPH00001A)。mRNA qRT-PCR可采用TaqMan高性能cDNA反转录试剂盒、TaqMan快速PCR主混物和TaqMan mRNA测定引物(应用生物系统公司)进行。参见http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_support/documents/generaldocuments/cms_042167.pdf。反应可采用StepOne实时PCR系统(应用生物系统公司)进行分析。例如，使微小RNA水平对18S RNA进行标准化。测定荧光发射达到高于基线发射的阈值时对应PCR循环数的循环阈(Ct)值，并采用2-ΔΔCt法(应用生物系统用户简报2号)计算微小RNA或mRNA相对表达。
基于文献，可预计微小RNA中的同等变化。此外，还预计样品间若干倍范围的变化。例如，可根据上述Pauley参考文献预计mir-146a中的变化。也可预期mir-16的变化。然而，预料之外的是，单一微小RNA，mir-132被抑制了最多约100倍。IVIG治疗似乎非常特异性且非常显著地抑制mir-132的表达。此外，患者间初始值的显著差异有最多约100倍。表2显示进行了之前和之后研究的17位患者间，IVIG治疗导致统计学显著的下降。
表2

*p＝0.004
如本文所述，基于IVIG治疗之前的一种微小RNA(mir-132)的表达模式，可将处理组分成两组。A组具有低初始CT(阈交)，指示相对较高的hsa-mir-132初始水平。剩余患者，组B，具有高初始CT，指示低水平的hsa-mir-132。在IVIG治疗后，两组的hsa-mir-132水平趋同至高CT，指示mir-132水平显著下降。A组中观察到的所述变化显著大于B组。在具有mir-132治疗前最高水平的组中，IVIG似乎在降低mir-132上最为有效。
尽管两组均在统计上响应IVIG治疗，表3通过患者的初始hsa-mir-132CT将患者二分化。可见初始CT簇可分为有相对较低CT的那些(高浓度hsa-mir-132) 和有相对较高CT的那些(低水平hsa-mir-132)。在IVIG治疗后，所述两组靠近，从而低CT组的CT变化显著大于高CT组。因此，本发明的一个实施方式是基于微小RNA表达将患者分成两个不同的组(二分化)。
表3

**p<0.0001
结果示于图1和2，其分别显示A组和B组患者在IVIG治疗之前和之后的CT水平。如图1所示，A组在IVIG治疗之前显示CT水平为16-18，在治疗之后显示水平为24-27。另一方面，图2显示组B在治疗前显示水平为21-29，并在治疗后显示水平为23-30。
初始水平很低的那些患者具有适度至很小程度的抑制。IVIG治疗后，两个患者组的mir-132值似乎均汇集到相对而言同样低的微小RNA活性(或高CT)水平(CT值在23-28之间)。IVIG对mir-132的作用似乎很大程度上局限于初始具有相对大量mir-132的那些患者(CT水平低的那些)。该群体的初始mir-132CT范围在16-18之间。因此，IVIG治疗在具有最高治疗前mir-132水平的患者组中对mir-132的抑制最为有效。
如上所述采用hsa-mir-132鉴定对于两个离散组的患者归属，然后，通过安捷伦微阵列来评估来自A组和B组的每组四名患者，所述安捷伦微阵列包含全部已知人类微小RNA(大约900种微小RNA)。
分别评估来自所述两组的数据，并通过独立对每组特定微小RNA的第一定量和第二定量间的平均差异来对每组排序，并按差异递减的顺序排列。根据所述列表，将第一组中增大最多的差异与第二组中减小最多的差异作比较。相反地，第一组中减小最多的与第二组中增大最多的相比较。认为在各组差异平均值间显示最大差异的那些个体微小RNA是暂定的最优标志物。通过将各组平均值的标准偏差加和来进一步评估这些最优微小RNA的能力，以确定其作为最优标志物的状态，其中将所述差异的比例除以所述标准偏差的加和。最优标志物具有最高比例。例如，下表4-6中所列的全部微小RNA显示的比例 绝对值大于或等于1。更优选地，可选择显示比例的绝对值大于或等于2的微小RNA。
表4中的数据鉴定出符合上述标准的有用的微小RNA标志物。下文中，当报告的第一值减去第二值的差异是负值时，值为“减小的”，而当第一值减去第二值是正值时，值为“增大的”。
表4

如所列来自所述两组各组的微小RNA研究所见，可获得两种不同的观察结果。首先，IVIG治疗之后的两组中的值向相反方向变化。例如，IVIG之后hsa-mir-136增大，而在B组中其减小。相反地，hsa-mir-513-5p在A组中减小， 而在B组中增大。第二，以单一组来看，标准偏差范围很宽，而A组或B组各组内的标准偏差大幅减小。这些结果证实对两个不同组患者的区分。就患者的单一微小RNA结果来看，可统计学上将该患者分配到所述两组之一。本领域普通技术人员可将患者分配至合适的组。
以IVIG后显示相反表现为基础，选择已经鉴定的可分开或联合用以确定A组或B组成员的其它序列。表5列出了选自A组中最前100种增大最多的和B组中100种减小最多的共通微小RNA，而表6列出选自A组中最前100种减小最多和B组中100种增大最多的共通微小RNA。
表5


表6


对二分组的鉴定可通过进行单一微小RNA测定来确定。从上可见，hsa-mir-132独立分离A组和B组。表6中所列其它序列提供可用于确定所述两组的其它序列。它们可单独或联合使用。群体的二分化性质可通过选择显示大标准偏差的微小RNA来确定。这些微小RNA很可能包含微小RNA平均值的双峰性分布。由统计学领域普通技术人员研究或应用的统计学检验可验证双峰性。
为测试患者可分为二分组而组中可鉴定出差异响应治疗介入的个体微小RNA的假说，用二分性分组已显示如表4-6所示的差异微小RNA反应的相同患者建立假性分组。在上述示例中，根据IVIG治疗后的hsa-mir-132反应指定 患者为A或B组。各组包含四名患者。在假性实验中，从A组任意挑选两名患者并从B组任意挑选两名患者以形成假性C组，而A组剩余的两名患者和B组剩余的两名患者形成假性D组。计算治疗之前和治疗之后的平均值的差异与标准偏差，并将治疗后30种增大最多和30种减小最多的以表7所示方式显示。
表7



所述两个假性组之间不仅平均值差异相对较小，而且标准偏差足够大从而没有鉴定出可被认为具有双峰性的微小RNA。换言之，就采用该随机分组的各微小RNA而言，均值差异的绝对值除以标准偏差之和小于1。因此，随机“二分化”并不能鉴定本公开内容中定义的不同的患者组。
为预测将患者分配至响应组的分配，在介入之前或之后获得的样品中，在上文定义的两组间按微小RNA之间的最大差异来排序微小RNA。通过由微小RNA值的均值差异除以其标准偏差总和的比例来进一步评估这些微小RNA标志物的能力。表8和9分别包含此类微小RNA的选择性列表和更全面列表，包括IVIG治疗之前的表达水平的平均值和标准偏差。
表8