从酵母中制备的小分子双链核糖核酸群及制备方法和用途 【技术领域】
本发明涉及一种从酵母中制备的小分子双链核糖核酸群的制备方法及用途。背景技术 Toll 样受体 (Toll-like receptors， TLR) 是参与非特异性免疫 ( 天然免疫 ) 的 一类重要蛋白质分子， 也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁。 TLR 是单个的跨膜非催 化性蛋白质， 可以识别来源于微生物的具有保守结构的分子。当微生物突破机体的物理屏 障， 如皮肤、 粘膜等时， TLR 可以识别它们并激活机体产生免疫细胞应答。
目前， 在哺乳动物及人类中已经发现的人 TIRs 家族成员有 11 个。根据染色体的 位置、 基因结构和氨基酸序列， 人的 TLRs 受体可以分为 5 个亚科， 即 TLR2， TLR3， TLR4， TLR5 和 TLR9。TLR2 亚科有 TLR1， TLR2， TLR6 和 TLR10 ； TLR9 亚科有 TLR7， TLR8 和 TLR9 ； TLR3， TLR4 和 TLR5 各自形成一个亚科。
TLR 如同天然免疫的眼睛， 监视与识别各种不同的疾病相关分子模式 (PAMP)， 是 机体抵抗感染性疾病的第一道屏障。其中 TLR4 可以识别革兰氏阴性菌脂多糖 (LPS)， 还可 识别宿主坏死细胞释放的热休克蛋白 (heatshockproteins， HSP)， 体内类肝素硫酸盐和透 明质酸盐降解的多糖部分以及局部的内源性酶的级联活化反应也可激活 TLR4。TLR2 的配 体较 TLR4 的广泛， 包括脂蛋白， 脂多肽， 脂壁酸 (LTA) 阿拉伯甘聚糖 (LAM) 及酵母多糖等。 TLR5 可以识别鞭毛蛋白， 鞭毛蛋白是目前发现的 TLR5 的惟一配体。 具有鞭毛蛋白的 L 型细 菌、 铜绿假单胞菌、 枯草芽孢杆菌和鼠伤寒沙门菌等可被 TLR5 识别。TLR7 识别咪喹啉家族 低分子量的咪唑莫特、 R848 和 R847 等。TLR9 识别细菌的 CpGDNA( 含有胞嘧啶 - 鸟嘌呤模 体的未甲基化 DNA 片段， )， 激活 B 细胞和 APC 的免疫刺激特性。
TLR3 特异识别病毒复制的中间产物双链 RNA， 从而激活 NFκB 和干扰素 IFNβ 前 体。DoyleSE 等证实， 抗 TLR3 单克隆抗体能抑制成纤维细胞 IFNβ 的产生。ChristopherA 等证实 TLR3 还具有调控鼻病毒对人支气管细胞感染的能力， 这也说明了 TLR3 在宿主抵抗 活病毒中发挥重要的作用。TLR3 表达于免疫细胞和某些非免疫细胞如皮肤角质化细胞、 纤 维母细胞和肺上皮细胞等， 近年来发现人肿瘤组织中也有 TLR3 表达。 TLR3 配体双链 RNA 能 直接激活自然杀伤细胞， 增强抗原特异性 CD8+T 细胞应答， 促进树突状细胞的抗原呈递激 活。
双链 RNA 也能通过激活多条信号转导途径， 即： 诱生干扰素 (IFN)、 激活双链 RNA 激活蛋白激酶 (PKR)、 激活 2′， 5′ A 合成酶 (2′， 5′ oligoadenylate synthetase)、 抑制 蛋白质合成、 刺激前列腺素 E 的合成、 促进白细胞的分化、 促进巨噬细胞、 NK 细胞及特异性 细胞毒 T 淋巴细胞的活性， 诱导抗原呈递细胞产生各种细胞因子， 抑制化学致突变剂的作 用， 恢复细胞间的接触抑制等。
从肿瘤生长和转移的的内环境而言， 均依赖于丰富的血管形成， 血管内皮细胞生 长因子 (vascular endothelial growth factor， VEGF) 可以引起肿瘤血管生成， 并导致肿 瘤组织的快速生长。TLR3 配体双链 RNA 能通过刺激体内干扰素生成， 发挥抗肿瘤血管生成
的作用， 是抑制肿瘤的生成与转移的另一个重要因素。
双链 RNA 作为体内干扰素 (IFN) 诱生剂而言经济而实惠。从植物、 微生物到不同 种类的动物， 其细胞内的 dsRNA 组份都具有干扰素诱生活性。目前干扰素已经用于治疗许 多慢性病毒性疾病和肿瘤， 但基本上都是使用基因工程干扰素或从人的细胞组织培养中经 诱生、 纯化而生产的干扰素制品。前者不仅价格昂贵， 而且一般只含有单一亚型， 抗病毒效 果不尽完全 ； 组织细胞培养干扰素价格亦较昂贵， 而且经常存在批间差别、 外源性污染和纯 度等问题， 这些外源性干扰素反复使用还经常会出现抗干扰素抗体， 从而大大降低了干扰 素再使用的效果。以天然 dsRNA 为干扰素诱生剂直接用于机体， 在体内诱生的自身干扰素 是广谱的， 而且双链 RNA 是免疫调节剂 (immune modulator)， 已经证实双链 RNA 还可诱生其 他一些细胞因子。因此， 双链 RNA 作用于机体以后的生物学活性远远超出了单纯的干扰素 诱生活性， 而且自身干扰素在体内不会产生抗体， 因此可表现出更好的治疗效果。
TLR3 激动剂是不需要大分子 ( 长链 )dsRNA 的， 小分子 dsRNA 完全可以有效的激活 TLR3。 人们早就利用人工合成的双链 RNA 聚合物 - 聚肌胞 (Poly I:C ； 由多聚肌苷酸和多聚 胞苷酸组成的双股多核苷酸链 ) 作为免疫佐剂已应用到某些肿瘤的辅助性免疫治疗。由于 Poly I:C 的急性毒性较大， 且非天然品， 故不适合用于保健品类产品的的开发。近年来也 证实 ： 人工合成小分子 dsRNA 可以作为 TLR3 有效的激动剂而抗血管新生等 (WG Cho， PNAS 2009)。由于 dsRNA 作为配体激活 TLR3 为广谱的 ( 何序列度可以作为配体而激活 TLR3)， 只 要满足功能性长度 19-25bp 即可作激活 TLR3 受体 (ME Kleinman， Nature 2008)， 但原料造 价昂贵， 每克达数万元， 目前无法满足大规模产业化的要求。 天然酵母菌是人类文明史中被应用得最早的微生物。 最常提到的酵母为酿酒酵母 ( 也称面包酵母 )(， Saccharomyces cerevisiae)， 自从几千年前人类就用其发酵面包和酒 类， 在全球范围都被认定为食品。 酵母菌属于单细胞真核生物。 大多数酵母菌在生存竞争中 都有相互嗜杀特性。具有这种特性的酵母为嗜杀酵母。其遗传物质基础为这种酵母细胞核 外具有自我复制能力的双链 RNA 嗜杀质粒。利用天然酵母菌中的双链 RNA(dsRNA) 为原料， 将其制备为小分子 dsRNA 作为 TLR3 配体 ( 激动剂 )， 激活人体各种组织细胞膜表面的 TLR3 发挥其局部及提高全身免疫力用于防癌、 抗癌、 抗病毒保健品开发具有广阔的使用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备方法简便的从酵母中制备的小分子双链核糖核 酸群及制备方法和用途。
本发明的技术解决方案是 ：
一种从酵母中制备的小分子双链核糖核酸群， 其特征是 ： 是以核糖核酸酶 T1、 脱 氧核糖核酸酶 I、 核糖核酸酶 III 中至少二者的混合液， 以噬杀质粒的酵母总 RNA 为底物制 得的小分子双链 RNA 群。
所述小分子双链 RNA 的长度为 19-25bp。
所述嗜杀质粒的酵母至少含有如下之一的嗜杀质粒 dsRNA ： 大分子 dsRNA、 中等分 子 dsRNA。
一种从酵母中制备的小分子双链核糖核酸群的制备方法， 其特征是 ： 以核糖核酸 酶 T1、 脱氧核糖核酸酶 I、 核糖核酸酶 III 中至少二者的混合液， 以嗜杀质粒的酵母总 RNA为底物， 反应制得小分子双链 RNA 群。
一种从酵母中制备的小分子双链核糖核酸群在制备防癌、 抗癌及抗病毒保健品中 的应用， 是作为通过 TLR3 激活下游细胞活性物质或作为抑制动脉环内皮细胞增生能力的 物质。
发明原理 ：
在嗜杀酵母细胞中， 有两种核外双链 RNA 所编码的蛋白质和嗜杀现象有关 ： 一 6 种是分子量约为 2.5X10 道尔顿的大分子双链 RNA(Large dsRNA， 简称 LdsRNA， 长度约为 6 4.5kb)， 占 90％以上 ； 另一种是分子量约为 1 ～ 1.4X10 道尔顿的中等分子双链 RNA(Medium dsRNA， 简称 MdsRNA， 长度约为 1.8kb)， 占 6％左右。 两者的总和约占嗜杀酵母细胞全部核酸 的 0.1％。虽然这两种大、 中分子的 dsRNA 可以作为 Toll 样受体 3(TLR3) 的激动剂， 但生 物利用度不高。最新的研究表明， 长度为 19 ～ 25bp 的小分子 dsRNA 即可以作为 TLR3 的配 体， 有效的激活 TLR3 而发挥其应有的生理功能 (ME Kleinman， Nature 2008)。利用酵母小 分子 dsRNA TLR3 的激动剂开发新一代的天然健康产品不但可以使酵母天然的大分子及中 分子 dsRNA 生物利用率提高～ 20 倍， 而且更加安全 ( 理论上普遍认为， 分子量越大越易引 起过敏反应 )。
本发明以嗜杀酵母细胞总体 RNA 为底物， 以核糖核酸酶 T1(RNase T1) 与 III 型核 糖核酸酶 (RNase III) 及脱氧核糖核酸酶 1(DNase 1) 三种生物工具酶为手段， 完成如下的 反应 ：
1.)DNase 1 仅消化 DNA 而对 RNA 没有消化作用， 用来消化嗜杀酵母细胞总体 RNA 抽提中的 DNA 污染 ；
2.)RNase T1 仅消化消化嗜杀酵母细胞总体 RNA 中的单链 RNA(ssRNA) ： 包括核糖 体 RNA(rRNA) ； 信使 RNA(mRNA) 以及转运 RNA(tRNA)。保留反应液中嗜杀质粒大、 中分子 dsRNA(LdsRNA 和 MdsRNA) 进行下一步反应 ；
3.)RNaseIII 由于仅作用于 dsRNA， 以 LdsRNA 和 MdsRNA 进行限制性切割成 19 ～ 25bp 的小分子 dsRNA。
实施中， 反应体系核酸酶组合如如下通式样 ：
通式 -1 ： 酶混合液同时含有 X+Y+Z
“X”代 表 DNase 1 的 任 何 浓 度 ； “Y”代 表 RNaseT1 的 任 何 浓 度 ； “Z”代 表 RNaseIII( 或 Dicer 酶 ) 的任何浓度， 以 “鸡尾酒” 形式同时加入到反应体系中。
通式 -2 ： X+Y- ＞ Z
即先加 DNase 1 和 RNaseT1， 灭活后， 在反应体系中再加 RNaseIII( 或 Dicer 酶 )。
通式 -3 ： X- ＞ Y+Z
即先加 DNase 1， 灭活后， 在反应体系中再加和 RNaseT1 和 RNaseIII( 或 Dicer 酶 )“鸡尾酒” ( 酶混合液 )。
通式 -4 ： X- ＞ Y- ＞ Z
DNase I ； RNaseT1 及 RNaseIII( 或 Dicer 酶 ) 分别入到反应体系中， 每加一种酶 前， 先将前一种酶灭活。
以上各种实施方式所得到的 19-25bp 的小分子 dsRNA 群， 可以作为 TLR3 的配体激 活人体各种组织细胞膜表面的 TLR3， 发挥其局部及提高全身免疫力， 起防癌、 抗癌、 抗病毒的等作用。其用途在于开发如下新一代的天然健康产品 ：
1、 皮肤贴片用于提高全身免疫力， 防癌、 抗癌、 抗病毒的等。
2、 局部冲洗液可以对口腔、 阴道、 膀胱等器官的癌症及病毒的防治作用。
3、 呼吸道喷雾剂可以防治鼻腔、 气管， 肺癌症与病毒疾病。
4、 防病毒眼药水。
5、 口服液或胶囊， 提高局部及全身免疫力起到防癌、 抗癌、 抗病毒的作用。
6、 其他等。
本发明制备方法简便， 易操作。 附图说明 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图 1 是三种 RNA 酶 (RNase1、 RNaseT1 及 RNaseA) 对 ssRNA 和 dsRNA 消化作用的 电泳分析 (20％聚丙烯凝胶 ) 图。
图1中： 行列 ： “ss” 和” ds” 分别为合成的 “21bp 单链 RNA“和 “21bp 双链 RNA” 消化前样品 ； 行列 ： 1、 3、 5 以 ssRNA 为底物消化后标品 ； 行列 ： 2、 4、 6 以 dsRNA 为底物消化后 标品。结果显示 ： RNaseI 和 RNaseA 对 ssRNA 和 dsRNA 均有消化作用 ( 行列 ： 1、 2、 5、 6) ； 而 RNase T1 仅对 ssRNA 有消化作用 ( 行列 1)， 对 dsRNA 无明显作用 ( 行列 4)。
图 2 是三种 RNA 酶 (RNaseI、 RNaseT1 及 RNaseA) 对酵母小分子总 RNA 消化作用的 电泳分析 (1％琼脂糖凝胶 ) 图。
图2中： 行列 M 为小分子 Marker(NEB 公司 ) ； 行列 0 ： 酵母小分子总 RNA( 内含各 种 ssRNA 和 dsRNA ； 秋之友生物技术公司产品 ) ； 行列 ： A、 B、 C 分别为 RNaseI、 RNaseT1 及 RNaseA 消化后样品。结果显示 ： RNaseI 和 RNaseA 对全部 RNA(ssRNA 和 dsRNA) 均有消化作 用 ( 行列 ： A 和 C) ； 而 RNase T1 仅对 ssRNA 有消化作用， 对 dsRNA 则无消化作用 ( 行列 B)。
图 3 是酿酒酵母的总 RNA 1％琼脂糖凝胶电泳图。
图3中： 电泳条带从上至下为 ：
DNA( 酵母染色体 DNA) ；
LdsRNA ( 酵母嗜杀质粒的大分子双链 RNA) ；
28SrRNA 和 MdsRNA( 酵母嗜杀质粒的中分子双链 RNA) 的重叠带 ；
18SrRNA ；
tRNA 和 5SrRNA 的重叠带。
行列 1 ： 常温下离心 ； 行列 2 ： 置于 4℃离心。
图 4 是酿酒酵母总 RNA 经 DNaseI 和 RNase T1 处理后 LdsRNA 和 MdsRNA 的 1％琼 脂糖凝胶电泳图。
图 5 是酿酒酵母总 RNA 经 DNase1、 RNase T1 及 RNaseIII 混合液消化后的电泳图 (20％聚丙烯凝胶 )。
图5中： 行列 1 ： dsRNA 长度标示样品 ； 行列 2 ： 小分子 dsRNA 群 (21 ～ 23bp)。
图 6 是 pNF-κB-TA-luc 质粒图。
图 7 是各组之间萤火虫荧光素酶的 RLU 值海参荧光素酶的 RLU 的比值图。
图 8 是主动脉环血管向外生长迁出抑制试验显微镜观察图。
图8中： (A) 酵母小分子 dsRNA 群处理 ； (B)Avastin 处理 ( 阳性对照 ) ； C.5％葡萄 糖处理 ( 阴性对照 )。如图所示 ： 与阴性对照比较， 酵母小分子 dsRNA 群与 Avastin 对血管 环向外生长迁出受到明显的抑制。
图 9 是各处理组动脉环内皮细胞向外生长迁出的节点数统计学分析结果图。
图9中： 每组 6 个动脉环分别进行单独评分， 然后对各组评分的均数进行比较。如 图所示 ： 酵母小 dsRNA 群处理组和阳性对照 (Avastin) 组均有显著抑制动脉环内皮细胞增 生的能力， 其差异有显著的统计学意义 (**P ＜ 0.01)。 具体实施方式
主要仪器 ：
超净工作台 (SW-CJ-2F 苏州净化设备厂 ) ； 75L 高压蒸气灭菌器 ( 上海博讯实业有 限公司 ) ； 低温冰箱 (-80℃， DF-U4086S， 日本三洋 ) ； 恒温水浴箱 (Labnet D1200， 深圳赛泰 克)； 高速低温离心机 (5415c， Eppendorf， 德国 ) ； 电热鼓风干燥箱 (DZF-6050， 上海新苗 ) ； 电子天平 (OHAUS， 美国 ) ； 电泳仪 (Bio-rad， 美国 ) ； 凝胶成像系统 (Biosens， 美国 ) ； 相差显 微镜 (OLYMPUS， 日本 ) ； 全自动显微镜数码摄像系统 (OL YMPU S， 日本 ) ； 荧光显微镜 (50i， NIKKON， 日本 ) ； 去离子水装置 ( 密理博中国有限公司 ) ； 紫外分光光度计及分析工作站 ( 岛 津 Shimadazi， 日本 ) ； 加样器 (Biohit， 芬兰 ) ； 二氧化碳培养箱 ( 赛默飞世尔科技， 美国 ) ； 蛋白质电泳装置及转移系统 (Bio-rad， 美国 )。 一般试剂 ：
胰化蛋白胨及酵母提取物 ( 上海生工 ) ； 琼脂糖及琼脂粉 ( 大连宝生物工程公 TM 司)； RISO RNA 提取试剂 ( 百奥迈科 ) ； DNA Marker DL2000Ladder DNA marker(Takara， 日本 ) ； 溴化乙锭、 琼脂糖、 SD S、 TEMED、 丙烯酰胺、 N， N- 二甲基双丙烯酰胺、 MTT、 DTT、 DMSO 和 Poly(I:C)(Sigma， 美国 ) ； DEPC(Merk， 德国 ) ； IMDM 培养基为 (Hyclone， 美国 ) ； 新生牛 血清 ( 杭州四季青公司 )。
实施例 1
单、 双链 RNA 消化试验
实验目的旨在观察三种 RNA 酶 (RNaseT1 ； RNaseI 和 RNaseA) 以 ssRNA 和 dsRNA 以 及高复性的天然酵母总 RNA 为底物的消化作用， 挑选出本发明的最佳组合酶选。
1 主要试剂和材料
1.1 主要试剂 ： 三种 RNA 酶购于 Fermentas 公司 ( 中国代理 )， 其中 ： RNaseT1 为 1000,000U/mL ； RNaseI， 10,000U/mL ； RNaseA， 10mg/mL。DNaseI(5000U/mL) 购 于 Takara 日 本。
1.2 主要材料 ： 热带假丝酵母小分子总 RNA( 秋之友生物科技 ； 保存号为 ： CGMCC No.3558。酵母总 RNA 出厂时已经不完全降解成小分子。本实验用以观察 RNA 酶对其中高 复性 ssRNA 与 dsRNA 消化结果 ) ； 化学合成 RNA Oligo( 上海生工生物 )， 合成序列如下 ：
Oligo 代号 序列 (5’ → 3’ )
ss-UP 正义 AGAGAGAAAGUAGAGAAGGGC
ss-DN 反义 GCCCUUCUCUACUUUCUCUCU
( 其中 RNA 碱基 ： U 为尿嘧啶， C 为胞嘧啶， G 为鸟嘌呤， A 为腺嘌呤 )。本实验的双
链 (ds)RNA 为上述两条单链 (ss)RNA Oligo 退火而成 ； 取 ss-UP 作单链 (ss)RNA 实验。
2.ssRNA 及 dsRNA 的 RNA 酶消化实验 ：
RNA 酶消化的反应系如下 ： 20μL 的液中含有 1μL(1μg)RNA ； 1μLRNA 酶 ； 2μL 10XTE buffer， 16μL 无 菌 水。37 ℃ 反 应 30min， 加 2μLEDTA(250mM) 中 止 反 应， 72 ℃ 加 热 20min 灭活酶活性。各取 51μL 电泳分析。并用取 1μL 酵母 dsRNA 加入 1XTE 缓冲液 99μL(1OO 倍稀释 )， 紫外分光光度计检测 OD260 及 OD280 比值 ( 此值在 1.8 ～ 2.0 之间为 双链 RNA)。
3. 结果分析 ：
三 种 RNA 酶 (RNaseI、 RNaseT1、 RNaseA) 中， 仅 RNaseT1 对 化 学 合 成 的 单 一 ssRNA( 图 -1) 和混杂在酵母总 RNA 中 ssRNA( 图 -2) 均有选择性的消化作用， 保全的 dsRNA 在胶图上清晰可见 ； RNaseI 和 RNaseA 则消化所有的单、 双链 RNA。
RNaseT1 消化后的酵母 RNA 产物经紫外分光光度计下测得 OD260 及 OD280 比值为 1.88， 证实为 dsRNA。
实施例 2
1. 酵母菌培养 ： 将冻存的酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae AS21416， 购于中 国科学院微生物所菌种保藏中心 ) 按 1-3％浓度接种于 3ml YPD 液体培养基 (IOg 酵母提取 物； 20g 胰蛋白胨 ； 20g 葡萄糖 ； 加水至 1000mL) 中， 于 33℃下振荡过夜， 培养至对数生长后 期。将该菌悬液以 1 ∶ 50 的比例接种于 100mL YPD 液体培养基中， 33℃振荡培养 2-3h 至 OD600 达 0.45-0.55， 中止培养。加 1％蜗牛酶 ( 北京惠宝联化科技有限公司 ) 于培养液， 于 30℃振荡反应 1h。 2. 酵母总 RNA 的提取 ： 取酵母菌 5000 离心 10min， 弃上清收集菌体沉淀物。酵母 TM 菌沉淀物用百奥迈科公司 RISO RNA 提取液 ( 朱远源 ； 中国专利号 ZL01113523.9) 提取液 提取酵母总体 RNA， 离心 (12000rpm)10min 沉淀总 RNA， 用 1xTE 缓冲液 (10mM Tris-HCl， 1mM EDTA ； pH 7.4) 溶解， 电泳鉴定 ( 图 3)。 粗品中含有各种核酸条带 ： DNA ； LdsRNA ； 28SrRNA 和 MdsRNA( 重叠 ) ； 18SrRNA ； tRNA 和 5SrRNA( 重叠 )。其中 28S ； 18S ； 5S rRNA 以及 tRNA 为 ssRNA( 单链 RNA)。
实施例 3
酵母总 RNA 的 DNaseI 与 RNase T1 混合液消化
1.RNaseT1 与 DNase 1( 厂家同实施例 1) 混合液按 1 ∶ 0.001(V ∶ V) 混合。酶混 合液消化的反应系如下 ： 200μL 的液中含有 20μL(20μg)RNA ； 10μL RNaseT1 与 DNaseI 酶混合液 ； 20μL 10XTE buffer， 150μL 无菌水。37℃反应 1h， 加 20μL EDTA(250mM) 中止 反应， 72℃加热 20min 灭活酶。取 2X5μL 电泳分析 ( 两泳道平行重复鉴定 )。并用取 1μL 酵母 dsRNA 加入 99μL 的 1xTE 缓冲液 (100 倍稀释 )， 紫外分光光度计检测 OD260 及 OD280 比值 ( 此值在 1.8 ～ 2.0 之间为双链 RNA)。
2. 电泳分析消化产物 ：
酿酒酵母总 RNA 经 DNaseI 和 RNaseT1 处理后消化产物电泳结果如 ( 图 -4) 所示， 4.5kb LdsRNA 和 1.8kb MdsRNA。无 DNA 及其他单链 RNA 所见。
3. 紫外分光光度计检测 ： 测得 OD260 及 OD280 比值为 1.9， 证实为 dsRNA。
实施例 4
酵母总 RNA 的 DNase 1 与 RNaseT1 及 RNAseIII 混合液消化
1. 主要试剂和材料 ： RNaseIII( 为美国 NEB 产品 ； 1,300U/mL) 能在含有锰离子的 反应缓冲液下， 将较长双链 RNA 切割成一组由 21-23bp 组成的小分子 dsRNA。 10X RNaseIII 反应缓冲液 (500mMTris-HCl， 10mM DTT， 200mM MnCl2 ； pH 7.5)。 RNaseT1 和 DNaseI( 同前 )。 无 RNA 酶污染的肝糖 ( 上海瑞齐生物科技 )。
2.RNaseT1、 RNaseIII 及 DNase1 混合液配置 ： 比例为 1 ∶ 0.5 ∶ 0.001(V ∶ V ∶ V)。
3. 酶混合液消化的反应系 ： 100μL 的液中含有 10μL(1.0μg)RNA ； 5μL 三酶混 合液 ； 10μL 10X RNaseIII 反应缓冲液， 75μL 无菌水。 37℃反应 2h， 加 20μL EDTA(250mM) 中止反应。
4 离心沉淀消化产物 ： 加入 1/10 体积的 3M NaOAc(pH5.5)， 2μL 无 RNA 酶污染的 肝糖和 3 体积 90％的冰乙醇， 于 -70℃条件下放置 30 分钟或 -20℃条件下放置 2 小时。以 14,000rpm 的速度离心 15 分钟。去掉上清， 沉淀中加入 2 体积 80％的乙醇， 室温温育 10 分 钟， 离心 5 分钟， 清空离心管中液体。空气干燥沉淀物。加入 40μL 无菌水溶解 RNA。
5. 电泳分析消化产物 ： 酿酒酵母总 RNA 经 RNaseT1、 RNaseIII 及 DNaseI 混合液消 化产物电泳结果如 ( 图 -5) 所示， 酵母小分子 dsRNA 群主要分布在 21-23bp。
6. 紫外分光光度计检测 ： 取 1μL 酵母 dsRNA 加入 99μL 的 1TE 缓冲液 (100 倍稀 释 )， 紫外分光光度计检测 OD260 及 OD280 比值， 测得该值为 1.8， 证实为 dsRNA。
实施例 5
检测酵母小分子 dsRNA 群介导的 TLR3 对 NFκB 靶向激活
1. 原理 ： dsRNA 能够介导 TLR3 激活 NF-κB， 导致 IFN-γ 等细胞因子的分泌。本 实验通过检测酵母小分子 dsRNA 群处理 SMCC7721 细胞后的 NF-κB 活性， 来检测其小分子 dsRNA 群对 TLR3 的激活能力。实验以报道的 Poly(I:C) 作为阳性对照。用于检测 NFκB 转 录活性水平的报告基因质粒为 pNF-κB-TA-luc， 可以高灵敏度地检测 NFκB 的激活水平。 本实验通过将含有 NF-κB 结合位点的 pNF-κB-TA-luc 质粒 ( 图 -6) 转染 SMCC7721 细胞。 pNF-κB-TA-luc 质粒在 NF-κB 结合位点的下游有报告基因 Luciferase， 激活的 NF-κB 能 够与该质粒的 NF-κB 结合位点结合， 从而诱导 Luciferase 的表达。
2. 材料与仪器 ： 人肝癌细胞株 SMMC7721 购于美国 Sciencell。 pNF-κB-TA-Luc 和 Renilla( 海参 ) 荧光素酶报告基因质粒、 胎牛血清 (FBS) 购自美国 Clontech， 脂质体转染 TM 试剂 Lipofectamine 2000 购自美国 Gibco 公司， 双荧光素酶检测试剂盒 (dual luciferase assay kit) 与生物发光检测仪 luminometer 购自美国 Promega。
3. 细胞培养与 NF-κB 相对活性测定 ： 人肝癌细胞株 SMMC7721 行细胞常规培养于 含 10％ FBS 的 DMEM 培养液中 ( 美国 Invitrogen)。取对数生长期的细胞， 按 4.0×104/mL 接种于 96 孔板， 每孔接种 200μL， 继续培养 24h。根据依照 Lipofectamine 转染试剂的操 作指南， 将 pNF-κB-TA-luc 与 Renilla 荧光素酶报告基因质粒瞬时共转染到 SMMC7721 细 胞中， Renilla 荧光素酶报告基因作为内参。转染后 6h 更换新鲜培养基， 同时在培养中分 别进行如下处理以刺激细胞 ( 分为 4 组， 每组 12 孔 ) ： 每孔加 20μL(2μg)Poly(I:C)( 阳 性对照组 ； n ＝ 12) ； 20μL 5 ％葡萄糖 ( 阴性对照组 ； n ＝ 12) ； 20μL(2μg) 化学合成的 小分子 dsRNA(ss-UP/ssDN ； n ＝ 12) 和 20μL(2μg) 酵母小分子 dsRNA(n ＝ 12)。继续培 养 24h 后， NF-κB 的活性用双荧光素酶检测试剂盒根据厂家操作指南在生物发光检测仪(luminometer) 上进行检测。
4. 结果 ： 各组之间萤火虫荧光素酶的相对发光值 (relative light unit， RLU) 海参荧光素酶的 RLU 的比值如图 -7 所示。经单因素方差分析， 酵母小分子 dsRNA 群与合 成的单序列小 dsRNA 之间无显著差异 (P ＞ 0.05) ； 此两组荧光素酶的比值较 Poly(I:C) 阳性对照组及阴性对照组明显增高， 存在统计学的显著差异 (**P ＜ 0.001)， 表明 ： 酵母小 dsRNA( 群 ) 较 Poly(I:C) 更有效的通过 TLR3 激活 NF-κB 的活性。
实施例 6
动脉环内皮细胞生长
1. 溶液配制
1.1 纤维蛋白原溶液 ： 纤维蛋白原溶解于 MCDB131 无血清培养液中， 质量浓度 3g/ L。
1.2 牛凝血酶溶液 ： 牛凝血酶溶解于灭菌的蒸馏水中， 浓度为 50NIHU/mL ；
1.3D-Hanks 液 ： 氯化钠 8.0g， 磷酸氢二钠 (NaZHP04.H2O)0.06g， 氯化钾 0.4g， 磷酸 二氢钾 0.06g， 碳酸氢钠 0.35g 溶解于三蒸水 1000mL 中， 高温灭菌后 4℃备用。
2 实验方法 2.1 取材 ： 8 周龄雄性 Sprague Dawley 大鼠， 大剂量 2 ％戊巴比妥钠麻醉断头处 处死， 将处死后的大鼠浸入 75％酒精中， 放入超净台。无菌条件下切取胸主动脉， 立即放入 D-Hanks 液中， 在解剖显微镜观察下， 用眼科手术剪及镊子小心地去除血管外纤维和脂肪组 织， 切成 1mm 长的动脉环， 置 D-Hanks 液中冲洗数次备用， 48 孔板每孔加入 10uL 50NIH U/ mL 牛凝血酶溶液， 然后加入 0.4mL 的 3g/L 纤维蛋白原溶液， 立即垂直放人动脉环， 使其沉于 底部正中部位。大约 10min， 纤维蛋白凝固。预实验过程中， 在孔中加入含有不同浓度胎牛 血清的 MCDB131 培养液， 在培养液中加入抑制纤维蛋白水解的 6 一氨基己酸 150ug/mL， 每3 天换液一次。放入培养箱中培养动脉环， 隔天观察动脉环血管生成的情况并计数。血管生 长的分枝顶点被认为分枝形成。
2.1 计数 ： 新生血管生长迁出的分枝算作为一个 “节点” ， 代表新的血管形成 ( 图 8)。 根据预实验结果， 选择含 5％血清的 MCDB131 培养基培养大鼠主动脉环。 实验分为 3 组 ： 阴性对照组用含 5％血清的 MCDB131 培养基， 阳性对照组用含 5％血清的 MCDB131 培养基 + 阿瓦斯汀 (Avastin ； 美国罗氏公司 )10μg/mL 培养， 酵母小 dsRNA 组用 5％血清的 MCDB131 培养基 + 酵母小 dsRNA 群 (10μg/mL) 培养， 方法同前述。隔天计数新生血管数。实验重复 3 次。
3. 实验结果
按照动脉环外内皮细胞生长迁出的节点数对各组进行评分， 每组有 6 个动脉环分 别单独评分， 然后对各组评分的均数进行比较。 实验结果表明 ： 酵母小 dsRNA 群的投与组和 阳性对照的 Avastin 组均有显著抑制动脉环内皮细胞增生的能力 ( 图 9)。 单因素方差分析 表明酵母小 dsRNA 群的投与组与 5％葡萄糖对照组存在显著差异 (P ＜ 0.01)。