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1、10申请公布号CN102318585A43申请公布日20120118CN102318585ACN102318585A21申请号201110128860X22申请日20110518A01K67/033200601A23K1/18200601A23K1/1420060171申请人江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所地址223001江苏省淮安市清河区淮海北路104号72发明人王宏宝梁照文李茹74专利代理机构淮安市科文知识产权事务所32223代理人谢观素54发明名称一种纯化培养甘薯腐烂茎线虫的方法57摘要本发明公开了一种纯化培养甘薯腐烂茎线虫的方法，包括下列步骤（1）线虫的准备。在40体式显微镜下用针挑取腐。
2、烂茎线虫种群雌虫放在玻片上，在100显微镜下进一步确认为受孕雌虫，然后放到器皿中备用；（2）纯化培养。将整薯横向或纵向切开，在其中的一个断面上打孔，在每个孔里注入少许无菌水，以不溢出孔为准，之后将步骤（1）得到的腐烂茎线虫，一条接入一个小孔内，再将切下的薯块做为天然保湿盖盖在接入腐烂茎线虫后的薯块上，用石蜡将边缘缝隙密封好，并用弹性材料捆绑后放置在培养箱里，于25培养30天，用直径为13毫米打孔器将接种过线虫的小孔取下分别进行线虫分离。本发明方法简单、容易操作、工作量小，更为重要的是获得的群体纯度高、生命力好，为系统研究该线虫的生物学特性、致病机理、种群群体及个体的遗传变异等工作的提供了保证。。
3、51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页附图1页CN102318586A1/1页21一种纯化培养甘薯腐烂茎线虫的方法，其特征在于包括下列步骤（1）线虫的准备在40体式显微镜下用针挑取腐烂茎线虫种群雌虫放在玻片上，在100显微镜下进一步确认为受孕雌虫，然后放到器皿中备用；（2）纯化培养将整薯横向或纵向切开，在其中的一个断面上打孔，在每个孔里注入少许无菌水，以不溢出孔为准，之后将步骤（1）得到的腐烂茎线虫，一条接入一个小孔内，再将切下的薯块做为天然保湿盖盖在接入腐烂茎线虫后的薯块上，用石蜡将边缘缝隙密封好，并用弹性材料捆绑后放置在培养箱里，于25培养3。
4、0天得到若干纯腐烂茎线虫。2如权利要求1所述的一种纯化培养甘薯腐烂茎线虫的方法，其特征在于甘薯断面上接种线虫孔的直径为26毫米，深度为1030毫米，孔与孔的间距为254厘米。3如权利要求1所述的一种纯化培养甘薯腐烂茎线虫的方法，其特征在于在培养箱内接入腐烂茎线虫前，预先喷施少量无菌水，以保持薯块湿润的生长环境。4一种纯化培养甘薯腐烂茎线虫的方法，其特征在于包括下列步骤（1）线虫的准备在40体式显微镜下用针挑取腐烂茎线虫的大龄幼虫、雄虫放到器皿中备用；（2）纯化培养将整薯横向或纵向切开，在其中的一个断面上打孔，在每个孔里注入少许无菌水，以不溢出孔为准，之后将步骤（1）得到的腐烂茎线虫，一条大龄幼。
5、虫和两条雄虫接入一个小孔内，再将切下的薯块做为天然保湿盖盖在接入腐烂茎线虫后的薯块上，用石蜡将边缘缝隙密封好，并用弹性材料捆绑后放置在培养箱里，于25培养30天得到若干纯腐烂茎线虫。5如权利要求4所述的一种纯化培养甘薯腐烂茎线虫的方法，其特征在于甘薯断面上接种线虫孔的直径为26毫米，深度为1030毫米，孔与孔的间距为254厘米。6如权利要求4所述的一种纯化培养甘薯腐烂茎线虫的方法，其特征在于在培养箱内接入腐烂茎线虫前，预先喷施少量无菌水，以保持薯块湿润的生长环境。权利要求书CN102318585ACN102318586A1/4页3一种纯化培养甘薯腐烂茎线虫的方法技术领域0001本发明属于植物病。
6、原线虫生物学领域，涉及腐烂茎线虫种群高质量纯化培养的方法。技术背景0002甘薯腐烂茎线虫病是我国农业上的重要病害，在国内主要分布于河南、河北、山东、山西、安徽、江苏等省区。其病原物甘薯腐烂茎线虫（DITYLENCHUSDESTRUCTOR）最早在马铃薯上发现，导致马铃薯腐烂（THORNEG，1945年提出）。甘薯茎线虫病是我国甘薯产区的重要病害之一，其病原腐烂茎线虫是我国重要的检疫性对象。近年来由于甘薯生产上引种不当，造成甘薯茎线虫病的大面积蔓延。危害越来越严重，已经危及了甘薯的生产。该病害是由线虫危害引起的，病原经南京农业大学丁再福，林茂松等鉴定是马铃薯腐烂茎线虫DITYLENCHUSDES。
7、TRUCTOR，这是植物寄生线虫中惟一引起植物干腐症状的病原物，甘薯受到马铃薯腐烂茎线虫的侵染，轻者减产1030，重者达5080，甚至绝收。该线虫除了危害马铃薯、甘薯，还危害胡萝卜、花生、薄荷等。获得群体纯度高、生命力良好的线虫是系统研究该线虫生物学特性、致病机理、种群群体及个体遗传变异等工作的基础和前提。0003目前系统进行纯化培养该线虫的方法，一般通过下述几种渠道获得，如在PDA平板中接入茄腐镰刀菌FUSARIUMSOLANI、灰葡萄孢BOTRYTISCINEREAPERS和毛壳菌CHAETOMIUMSP，25温箱中暗培养腐烂茎线虫，另外刘斌等人报道采用玉米培养基培养的灰葡萄孢菌BOTRY。
8、TISCINEREA对腐烂茎线虫进行的单异活体培养，在室内可以快速和大量繁殖腐烂茎线虫（刘斌，郑经武，2006,浙江农业学报）；阮龙等人报道采用甘薯发根单寄主培养体系繁殖马铃薯腐烂茎线虫的方法（阮龙，吴飞，姜疆等，生物技术通报，2006第六期），上述纯化培养方法都是通过接种大量线虫获得成功，且纯化成功的基础是在大量线虫接种前进行腐生线虫等其他虫体的去除，如漆永红等人报道在接种线虫前先吸出400至500条腐烂茎线虫，然后在显微镜下去除腐生线虫漆永红，李秀花，马娟华北农学报2008。上述方法在实际应用中如果线虫群体纯度不高，且携带其他土壤线虫的话，去除这些杂虫所需工作量必然加大，难免携带杂虫，降低。
9、了培养的纯度，这对于快速接种、高质量纯化线虫带来不便，同时上述纯化培养繁殖方法虽然给快速大量繁殖线虫带来了便利，但若腐烂茎线虫在真菌上长时期繁殖培养（寄主发生改变的情况下），可能在致病力等生物学特性方面发生转变。阮龙等人报道采用甘薯发根单寄主培养体系繁殖马铃薯腐烂茎线虫的方法不仅存在着上述缺陷，而且方法非常繁杂。因此，高质量纯化培养线虫显得非常重要。发明内容0004本发明要解决的技术问题是提供一种纯化培养甘薯腐烂茎线虫的方法，该方法不仅简单、容易操作，而且获得的线虫群体纯度高、生命力好。说明书CN102318585ACN102318586A2/4页40005本发明通过以下技术方案实现一种纯化培。
10、养甘薯腐烂茎线虫的方法，包括下列步骤（1）线虫的准备在40体式显微镜下用针挑取腐烂茎线虫的大龄幼虫、雄虫放到器皿中备用；（2）纯化培养将整薯横向或纵向切开，在其中的一个断面上打孔，在每个孔里注入少许无菌水，以不溢出孔为准，之后将步骤（1）得到的腐烂茎线虫，一条大龄幼虫和两条雄虫接入一个小孔内，再将切下的薯块做为天然保湿盖盖在接入腐烂茎线虫后的薯块上，用石蜡将边缘缝隙密封好，并用弹性材料捆绑后平放在培养箱里，于25培养30天，用直径为13毫米打孔器将接种过线虫的小孔取下分别进行线虫分离。0006本发明进一步改进方案是，一种纯化培养甘薯腐烂茎线虫的方法，包括下列步骤（1）线虫的准备在40体式显微镜。
11、下用针挑取腐烂茎线虫种群雌虫放在玻片上，在100显微镜下进一步确认为受孕雌虫，然后放到器皿中备用；（2）纯化培养将整薯横向或纵向切开，在其中的一个断面上打孔，在每个孔里注入少许无菌水，以不溢出孔为准，之后将步骤（1）得到的腐烂茎线虫，一条接入一个小孔内，再将切下的薯块做为天然保湿盖盖在接入腐烂茎线虫后的薯块上，用石蜡将边缘缝隙密封好，并用弹性材料捆绑后放置在培养箱里，于25培养30天，用直径为13毫米打孔器将接种过线虫的小孔取下分别进行线虫分离。0007上述两种方法，甘薯断面上孔的直径均为26毫米（直径太大容易漂移，且浪费薯块），深度为1030毫米，孔与孔的间距为254厘米（只要便于培养后的线。
12、虫取出分离，孔间距应尽量小一些，节约薯块）。0008在培养箱内预先喷施少量无菌水，以保持薯块湿润的生长环境。0009在每个孔里注入少许无菌水，其目的在于接种线虫时，便于线虫由挑针游离到无菌水里，而不至于被挑针与薯块挤压致死。上述两种方法，分别重复20次。0010将每次得到的腐烂茎线虫均放入计数皿中分离观察，对原始数据进行标准化处理，应用DPS统计软件处理数据，计算平均数并进行差异性比较。0011结果显示，腐烂茎线虫群体采用已受孕单条雌虫及线虫自交两种方法进行种群的纯化培养试验是可行的。单雌纯化培养与该线虫亲本自交相比，纯化繁殖成功的概率显著增高，达65，培养30天后分离观察后代平均数量为841。
13、5，比亲本自交平均繁殖后代数1374在P005水平上显著降低，分析认为可能在单条雌虫接种之前部分卵块已经排出体外所致。研究也发现两种方法所分离到的线虫群体整齐度相对均一，但采用单雌纯化繁殖所需工作量相对较少，约为2小时；而采用线虫亲本自交的工作量相对较大，约为4小时；另研究发现腐烂茎线虫不存在孤雌生殖现象，其繁殖后代只能通过有性生殖进行。0012表1为单雌纯化培养与亲本自交纯化培养结果统计说明书CN102318585ACN102318586A3/4页5注表中平均后代数A、B分别代表在P005水平上存在显著性。即亲本自交平均后代数1374条与单雌繁殖平均后代数8415条在数量差异显著性表现上有9。
14、5置信度。0013本发明与现有技术相比，具有以下明显优点本发明用两种方法纯化培养腐烂茎线虫，分别都获得较好的效果，方法简单、容易操作、工作量小，更为重要的是获得的群体纯度高、生命力好，为系统研究该线虫的生物学特性、致病机理、种群群体及个体的遗传变异等工作的提供了保证。附图说明0014图1为薯块切片打孔示意图。具体实施方式0015实施例1本实施例中供试腐烂茎线虫群体由南京农业大学植物保护学院线虫实验室提供。所用薯块品种为苏渝303（对腐烂茎线虫无抗性），由江苏省农科院提供。0016一种纯化培养甘薯腐烂茎线虫的方法，包括下列步骤（1）线虫的准备在40体式显微镜下用针挑取腐烂茎线虫种群雌虫放在玻片上。
15、，在100显微镜下进一步确认为受孕雌虫，然后放到凹面皿中备用；（2）纯化培养将整薯纵向切去三分之一（得到三分之一的薯块1，三分之二的薯块2），在三分之二薯块的断面上打孔（如图1所示，甘薯断面上孔3的直径为3毫米，深度为20毫米，孔与孔的间距为3厘米），在每个孔里注入少许无菌水，以不溢出孔为准，之后将步骤（1）得到的腐烂茎线虫，一条接入一个小孔内，再将三分之一的薯块1作为天然保湿盖盖在接入腐烂茎线虫后的三分之二的薯块2上，用石蜡将边缘缝隙密封好，并用弹性材料捆绑后放置在培养箱里（放置前，预先在培养箱内喷施少量无菌水，以保持薯块湿润的生长环境），于25培养30天得到若干纯腐烂茎线虫。0017在本实。
16、施例中，分离线虫时选用孔径为13MM的打孔器将孔3取出分离。图中所示，共有二十个孔3。分离结果见表1中单雌繁殖。0018实施例2一种纯化培养甘薯腐烂茎线虫的方法，包括下列步骤说明书CN102318585ACN102318586A4/4页6（1）线虫的准备在40体式显微镜下用针挑取腐烂茎线虫的大龄幼雌虫、雄虫放到器皿中备用；（2）纯化培养将整薯纵向切去三分之一（得到三分之一的薯块1，三分之二的薯块2），在三分之二薯块的断面上打孔（如图1所示，甘薯断面上孔3的直径为3毫米，深度为20毫米，孔与孔的间距为3厘米），在每个孔里注入少许无菌水，以不溢出孔为准，之后将步骤（1）得到的腐烂茎线虫，一条大龄幼雌虫和两条雄虫接入一个小孔内，再将三分之一的薯块1作为天然保湿盖盖在接入腐烂茎线虫后的三分之二的薯块2上，用石蜡将边缘缝隙密封好，并用弹性材料捆绑后平放在培养箱里（放置前，预先在培养箱内喷施少量无菌水，以保持薯块湿润的生长环境），于25培养30天得到若干纯腐烂茎线虫。0019在本实施例中，分离线虫时选用孔径为13MM的打孔器将孔3取出分离。图中所示，共有二十个孔3。分离结果见表1中亲本自交。说明书CN102318585ACN102318586A1/1页7图1说明书附图CN102318585A。