一种大豆 GDP-D- 甘露糖焦磷酸化酶及其编码基因与应用 技术领域 本发明属于植物基因工程领域， 涉及一种大豆 GDP-D- 甘露糖焦磷酸化酶及其编 码基因与应用。
背景技术 维生素 C 又叫抗坏血酸 (L-ascorbic acid， AsA)， 是植物和大多数动物体内合成 的一类己糖内酯化合物。维生素 C 在生物体中不仅具有抗氧化作用而且具有重要的代谢功 能。研究发现， 植物中， 维生素 C 与植物的抗逆性表现为正相关性， 提高植物细胞内的维生 素 C 的含量， 能使植物耐炎热、 寒冷和盐碱等逆境的能力得到增强。维生素 C 是人类和动物 维持生长、 繁殖和保证健康所必需的营养物质。 植物、 微生物和大多数动物体内可自行合成 维生素 C， 但是人类、 猿猴、 天竺鼠等自身已经丧失了合成能力， 必须从食物中摄取， 而新鲜 蔬菜和水果是维生素 C 最好的来源。 因此维生素 C 含量已成为衡量农产品品质的重要指标。
GDP-D- 甘露糖焦磷酸化酶 (GMPase) 是植物中维生素 C 合成途径 L- 半乳糖途 径中第一步反应所需要的酶， 催化 D- 甘露糖 -1-P 生成 GDP-D- 甘露糖。目前已经从烟草 (AB066279)、 土豆 (AF022716)、 拟南芥 (AF076484)、 金虎尾 (DQ229168)、 番茄 (AY605668) 等 多个物种中获得了编码 GMPase 的基因。大豆中 GMPase 基因的序列还未见报道。
提高菜用大豆维生素 C 含量， 提高菜用大豆的营养品质， 对提高农业经济效益和 改善人类生活质量具有积极而深远的现实意义。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足， 提供一种大豆 GDP-D- 甘露糖焦磷酸化酶。 本发明的另一目的是提供该大豆 GDP-D- 甘露糖焦磷酸化酶的编码基因。
本发明的又一目的是提供该基因的应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现 ：
本发明所提供的大豆 GDP-D- 甘露糖焦磷酸化酶， 名称为 GmGMP1， 来源于大豆属大 豆 [Glycine max(L.)]， 具有 SEQ ID NO.2 所述的氨基酸序列。
上述大豆 GDP-D- 甘露糖焦磷酸化酶的编码基因 GmGMP1， 其 cDNA 基因具有 SEQ ID NO.1 所示的 DNA 序列， 该序列为 GmGMP1 基因的读码框， 编码具有 SEQ ID NO.2 所示氨基酸 序列的大豆 GDP-D- 甘露糖焦磷酸化酶。
含有编码大豆 GDP-D- 甘露糖焦磷酸化酶的基因的表达载体。
所述的表达载体优选以 pBI121 为出发载体， 将编码所述的大豆 GDP-D- 甘露糖焦 磷酸化酶的基因 GmGMP1 插入到 pBI121 质粒的 Xba I 和 BamH I 酶切位点间得到的植物过 量表达载体 pBI-GmGMP1。
含有所述的编码大豆 GDP-D- 甘露糖焦磷酸化酶的基因的工程菌。
该工程菌优选利用基因工程手段将 GmGMP1 基因转入的根癌农杆菌菌株 EHA105 所
得。
本发明所述的大豆 GDP-D- 甘露糖焦磷酸化酶在培育高维生素 C 含量的植物中的应用。 本发明所述的大豆 GDP-D- 甘露糖焦磷酸化酶编码基因在培育高维生素 C 含量的 植物中的应用。
有益效果
本发明首次从大豆中克隆出了 GDP-D- 甘露糖焦磷酸化酶基因， 通过构建植物过 量表达载体 pBI-GmGMP1， 对该基因进行过量表达， 发现过量表达 GmGMP1 的拟南芥与野生型 拟南芥相比， 其维生素 C( 抗坏血酸 ) 含量显著提高， 说明 GmGMP1 基因在提高植物维生素 C( 抗坏血酸 ) 含量方面起着重要作用。
本发明大豆 GDP-D- 甘露糖焦磷酸化酶 (GmGMP1) 及其编码基因 GmGMP1 对培育高 维生素 C( 抗坏血酸 ) 农作物， 提高农作物营养品质的影响特别是对菜用大豆营养品质的影 响具有重要意义。
附图说明 图 1 为大豆 GMP1 与其他物种的 GMPase 的氨基酸序列多重比较。
图 2 为含有 GmGMP1 的植物表达载体的结构示意图。
图 3ASA 标 准 曲 线， 其 中 纵 坐 标 为 OD 对 照 -OD 反 应 后， 横 坐 标 为 ASA 含 量， 单位为 0.01mg/ml。
图 4DHA 标 准 曲 线， 其 中 纵 坐 标 为 OD 对 照 -OD 反 应 后， 横 坐 标 为 DHA 含 量， 单位为 0.01mg/ml。
图 5 为转 GmGMP1 拟南芥株系与野生型拟南芥的叶片中总维生素 C 含量示意图， 其 中纵坐标单位为 mg/100g。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明， 均为本领域的常规方法。
实施例 1GmGMP1 基因的分离与克隆
用已发表的拟南芥 GDP- 甘露糖焦磷酸化酶序列 (AtGMP， AF076484) 为探针， 搜 索 GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.blast) 和 Gene Index(http://compbio. dfci.harvard.edu/tgi/) 数 据 库， 得 到 了 匹 配 的 大 豆 EST 序 列， 进 行 EST 片 段 拼 接， 得 到了一个 GMPase 基因片段， 该 GMPase 基因片段的 CDS 序列在大豆基因组上的位置为 Glyma14g07150， 设 计 PCR 扩 增 引 物， 正向引物F： 5‘-ATGAAGGCATTGATTCTGG-3’ (SEQ IDNO.3) ； 反向引物 R ： 5 ‘-CATGACAATCTCCGGCTTC-3’ (SEQ ID NO.4)。以大豆品种波高 ( 来 自国家大豆改良中心种子库 ) 的总 cDNA 为模板， 进行 PCR 获得 GmGMP1 读码框序列， PCR 扩增反应体系为 ： 1μl 大豆 cDNA(0.05μg)、 1μl 引物对 (10μM)、 2.5μl 10×PCR 缓冲 2+ 液、 2.5μl Mg 、 4μl dNTP(10mM) 和 1.25U LA Taq DNA 聚合酶， 用超纯水补足 25μl。反 应在 BIO-RADPTC-200 型 PCR 仪上进行， 其程序为 95 ℃变性 5min ； 再 94 ℃ 30s， 58 ℃ 30s， 72℃ 2min， 共 30 个循环 ； 然后 72℃延伸 10min ； 4℃保存。PCR 产物回收后经链接 PMD19-T 载体 (TaKaRa)、 转化大肠杆菌 DH5α、 蓝白斑筛选、 摇菌、 测序、 序列分析， 结果表明 PCR 产物具有序列表中 SEQ ID NO.1 的核苷酸序列， 命名为 GmGMP1 基因。
实施例 2GmGMP1 基因植物表达载体 pBI-GmGMP1 的构建和鉴定
将 pBI121 质粒 ( 购自北京拜尔迪生物技术有限公司 ) 分别经过 Xba I、 BamH I 单酶切， 用核酸共沉剂 DNAmate 沉淀回收酶切后的 pBI121 线性质粒。将测序正确的含有 GmGMP1 基因的大肠杆菌进行 PCR 扩增 ( 上游引物 F 含有 XbaI 的酶切位点 ：
5’ -GCTCTAGACACATCACAATGAAGGCATTG-3’ (SEQ ID NO.5)， 下游引物 R 含有 BamHI 的酶切位点 ： 5’ -CGGGATCCTGACCTCACTCACATGACAAT-3’ (SEQ ID NO.6)， 对扩增产物胶回收 后进行 Xba I、 BamH I 双酶切得到含 Xba I/BamH I 酶切位点的 GmGMP1， 将酶切产物含 Xba I、 BamH I 酶切位点的 GmGMP1 与酶切后的 pBI121 线性质粒连接， 并转化大肠杆菌 DH5α。 蓝白斑筛选及 PCR 检测得到阳性克隆， 命名为 pBI-GmGMP1。用限制性内切酶 Xba I/BamH I 双酶切 pBI-GmGMP1 得到 1,100bp 左右的条带， 与预期的值相符， 所以确认所构建的载体是 正确的， 即得到了由 CaMV35S 启动子驱动的 GmGMP1 基因的表达载体 pBI-GmGMP1， 载体构造 如图 2 所示。
实施例 3 转 GmGMP1 基因拟南芥阳性植株的获得以及功能验证
用冻融法将 pBI-GmGMP1 转入根癌农杆菌菌株 EHA105 中。 pBI-GmGMP1 通过农杆菌 介导浸染法转化拟南芥， PCR 检测 T1 代结果表明获得阳性植株。将转基因拟南芥植株和野 生型拟南芥植株种植于同等环境条件下 ( 人工气候箱， 白 22℃， 10h/ 夜 19℃， 14h)。
30d 后取叶片用以下方法进行维生素 C 含量测试 ( 方法参照秦诚拟南芥 NH4+ 超敏 突变体 hsn1 分子机制的相关研究 [D]. 浙江大学， 2008， (12)) ：
1. 标准曲线的制作
试剂配置 ：
维生素 C(L-ascorbic acid， AsA) 购自北京鼎国生物技术公司
脱氢抗坏血酸 (DHA) 购自 Sigma 公司
维生素 C 氧化酶 (ascorbate oxidase， AO) 购自 Sigma 公司
二硫苏糖醇 (DTT) 购自南京基天生物技术公司
其他药剂均购自国药集团化学试剂有限公司
6％偏磷酸 ： 6g 偏磷酸溶解于水定容至 100ml， 加 2ml 100mM EDTA-Na2，
10％柠檬酸钠 ： 10g 柠檬酸钠溶解于水中定容至 100ml，
磷酸钾缓冲液 ： 1mol/L K2HPO4 ∶ 1mol/L KH2PO4 ＝ 8.5 ∶ 91.5(v ∶ v)， PH ＝ 5.8，
混 合 液 ∶ 6 ％ 偏 磷 酸 ∶ 10 ％ 柠 檬 酸 钠 ∶ 磷 酸 缓 冲 液 ＝ 75.6 ∶ 50.4 ∶ 14(v ∶ v ∶ v)，
100mg AsA 溶于混合液中， 定容至 100ml( 含 AsA 1mg， /ml)，
100mg DHA 溶于混合液中， 定容至 100ml( 含 DHA 1mg/ml)，
10ml 的 1mg/ml ASA 溶于混合液中， 定容到 100ml( 含 AsA 0.1mg/ml)，
10ml 的 1mg/ml DHA 溶于混合液中， 定容到 100ml( 含 DHA 0.1mg/ml)，
稀释至各个浓度 (0mg/ml ～ 0.1mg/ml)， 酶标仪板加样体积 ： 150ul/ 每孔， 另每份 样品 3 个一组， 共三组， 分别加入 20ul 的 ddH2O、 250U/10ml AO 溶液以及 100mM 的 DTT 溶液 反应 30min ～ 45min， 在： 265nm 波长处检测， 并绘制 ASA 和 DHA 的标准曲线。ASA 标准曲线 结果见图 3， DHA 标准曲线结果见图 4。2. 样品中维生素 C 含量的测定
1) 称空管的质量 M1 ；
2) 大约 0.1 克样品 ( 叶片 ) 在液氮中碾磨， 加入 6％偏磷酸钠 1ml( 质量为 M0)， 称 重 M2， 冰浴 30 分钟 ；
3)M2-M1-M0 为样品的净重 ；
4)4℃， 12000rpm， 15 分钟， 离心 ；
5) 取 750μl 上清， 加入 500μl 的 10％柠檬酸钠， 中和 ；
6) 取 900μl 中和液加入 100μl 磷酸钾缓冲液 (pH ＝ 5.8) ；
7) 测 OD265(OD1)( 准备两份样品， 一份加入 DTT 后， 再重复 7-8) 步骤 ；
8) 加入维生素 C 氧化酶 (ascorbate oxidase， AO， Sigma)1μl， 室温反应 45 分钟 ；
9) 测 OD265(OD2) ；
10)OD1-OD2 绝对值， 根据 AsA 标准曲线 ( 图 3) 计算 ASA 的含量 ；
11) 加 DTT 的样品， 室温 45min 后， 测 OD265(OD3)， OD1-OD3， 根据 DHA 标准曲线 ( 图 4) 计算 DHA 的含量。
总维生素 C 含量＝ ASA 含量 +DHA 含量
背景技术 维生素 C 又叫抗坏血酸 (L-ascorbic acid， AsA)， 是植物和大多数动物体内合成 的一类己糖内酯化合物。维生素 C 在生物体中不仅具有抗氧化作用而且具有重要的代谢功 能。研究发现， 植物中， 维生素 C 与植物的抗逆性表现为正相关性， 提高植物细胞内的维生 素 C 的含量， 能使植物耐炎热、 寒冷和盐碱等逆境的能力得到增强。维生素 C 是人类和动物 维持生长、 繁殖和保证健康所必需的营养物质。 植物、 微生物和大多数动物体内可自行合成 维生素 C， 但是人类、 猿猴、 天竺鼠等自身已经丧失了合成能力， 必须从食物中摄取， 而新鲜 蔬菜和水果是维生素 C 最好的来源。 因此维生素 C 含量已成为衡量农产品品质的重要指标。
GDP-D- 甘露糖焦磷酸化酶 (GMPase) 是植物中维生素 C 合成途径 L- 半乳糖途 径中第一步反应所需要的酶， 催化 D- 甘露糖 -1-P 生成 GDP-D- 甘露糖。目前已经从烟草 (AB066279)、 土豆 (AF022716)、 拟南芥 (AF076484)、 金虎尾 (DQ229168)、 番茄 (AY605668) 等 多个物种中获得了编码 GMPase 的基因。大豆中 GMPase 基因的序列还未见报道。
提高菜用大豆维生素 C 含量， 提高菜用大豆的营养品质， 对提高农业经济效益和 改善人类生活质量具有积极而深远的现实意义。
GDP-D- 甘露糖焦磷酸化酶 (GMPase) 是植物中维生素 C 合成途径 L- 半乳糖途 径中第一步反应所需要的酶， 催化 D- 甘露糖 -1-P 生成 GDP-D- 甘露糖。目前已经从烟草 (AB066279)、 土豆 (AF022716)、 拟南芥 (AF076484)、 金虎尾 (DQ229168)、 番茄 (AY605668) 等 多个物种中获得了编码 GMPase 的基因。大豆中 GMPase 基因的序列还未见报道。
提高菜用大豆维生素 C 含量， 提高菜用大豆的营养品质， 对提高农业经济效益和 改善人类生活质量具有积极而深远的现实意义。
【发明内容】
本发明的目的是针对现有技术的上述不足， 提供一种大豆 GDP-D- 甘露糖焦磷酸化酶。 本发明的另一目的是提供该大豆 GDP-D- 甘露糖焦磷酸化酶的编码基因。
本发明的又一目的是提供该基因的应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现 ：
本发明所提供的大豆 GDP-D- 甘露糖焦磷酸化酶， 名称为 GmGMP1， 来源于大豆属大 豆 [Glycine max(L.)]， 具有 SEQ ID NO.2 所述的氨基酸序列。
上述大豆 GDP-D- 甘露糖焦磷酸化酶的编码基因 GmGMP1， 其 cDNA 基因具有 SEQ ID NO.1 所示的 DNA 序列， 该序列为 GmGMP1 基因的读码框， 编码具有 SEQ ID NO.2 所示氨基酸 序列的大豆 GDP-D- 甘露糖焦磷酸化酶。
含有编码大豆 GDP-D- 甘露糖焦磷酸化酶的基因的表达载体。
所述的表达载体优选以 pBI121 为出发载体， 将编码所述的大豆 GDP-D- 甘露糖焦 磷酸化酶的基因 GmGMP1 插入到 pBI121 质粒的 Xba I 和 BamH I 酶切位点间得到的植物过 量表达载体 pBI-GmGMP1。
含有所述的编码大豆 GDP-D- 甘露糖焦磷酸化酶的基因的工程菌。
该工程菌优选利用基因工程手段将 GmGMP1 基因转入的根癌农杆菌菌株 EHA105 所
得。
本发明所述的大豆 GDP-D- 甘露糖焦磷酸化酶在培育高维生素 C 含量的植物中的应用。 本发明所述的大豆 GDP-D- 甘露糖焦磷酸化酶编码基因在培育高维生素 C 含量的 植物中的应用。
有益效果
本发明首次从大豆中克隆出了 GDP-D- 甘露糖焦磷酸化酶基因， 通过构建植物过 量表达载体 pBI-GmGMP1， 对该基因进行过量表达， 发现过量表达 GmGMP1 的拟南芥与野生型 拟南芥相比， 其维生素 C( 抗坏血酸 ) 含量显著提高， 说明 GmGMP1 基因在提高植物维生素 C( 抗坏血酸 ) 含量方面起着重要作用。
本发明大豆 GDP-D- 甘露糖焦磷酸化酶 (GmGMP1) 及其编码基因 GmGMP1 对培育高 维生素 C( 抗坏血酸 ) 农作物， 提高农作物营养品质的影响特别是对菜用大豆营养品质的影 响具有重要意义。
附图说明 图 1 为大豆 GMP1 与其他物种的 GMPase 的氨基酸序列多重比较。
图 2 为含有 GmGMP1 的植物表达载体的结构示意图。
图 3ASA 标 准 曲 线， 其 中 纵 坐 标 为 OD 对 照 -OD 反 应 后， 横 坐 标 为 ASA 含 量， 单位为 0.01mg/ml。
图 4DHA 标 准 曲 线， 其 中 纵 坐 标 为 OD 对 照 -OD 反 应 后， 横 坐 标 为 DHA 含 量， 单位为 0.01mg/ml。
图 5 为转 GmGMP1 拟南芥株系与野生型拟南芥的叶片中总维生素 C 含量示意图， 其 中纵坐标单位为 mg/100g。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明， 均为本领域的常规方法。
实施例 1GmGMP1 基因的分离与克隆
用已发表的拟南芥 GDP- 甘露糖焦磷酸化酶序列 (AtGMP， AF076484) 为探针， 搜 索 GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.blast) 和 Gene Index(http://compbio. dfci.harvard.edu/tgi/) 数 据 库， 得 到 了 匹 配 的 大 豆 EST 序 列， 进 行 EST 片 段 拼 接， 得 到了一个 GMPase 基因片段， 该 GMPase 基因片段的 CDS 序列在大豆基因组上的位置为 Glyma14g07150， 设 计 PCR 扩 增 引 物， 正向引物F： 5‘-ATGAAGGCATTGATTCTGG-3’ (SEQ IDNO.3) ； 反向引物 R ： 5 ‘-CATGACAATCTCCGGCTTC-3’ (SEQ ID NO.4)。以大豆品种波高 ( 来 自国家大豆改良中心种子库 ) 的总 cDNA 为模板， 进行 PCR 获得 GmGMP1 读码框序列， PCR 扩增反应体系为 ： 1μl 大豆 cDNA(0.05μg)、 1μl 引物对 (10μM)、 2.5μl 10×PCR 缓冲 2+ 液、 2.5μl Mg 、 4μl dNTP(10mM) 和 1.25U LA Taq DNA 聚合酶， 用超纯水补足 25μl。反 应在 BIO-RADPTC-200 型 PCR 仪上进行， 其程序为 95 ℃变性 5min ； 再 94 ℃ 30s， 58 ℃ 30s， 72℃ 2min， 共 30 个循环 ； 然后 72℃延伸 10min ； 4℃保存。PCR 产物回收后经链接 PMD19-T 载体 (TaKaRa)、 转化大肠杆菌 DH5α、 蓝白斑筛选、 摇菌、 测序、 序列分析， 结果表明 PCR 产物具有序列表中 SEQ ID NO.1 的核苷酸序列， 命名为 GmGMP1 基因。
实施例 2GmGMP1 基因植物表达载体 pBI-GmGMP1 的构建和鉴定
将 pBI121 质粒 ( 购自北京拜尔迪生物技术有限公司 ) 分别经过 Xba I、 BamH I 单酶切， 用核酸共沉剂 DNAmate 沉淀回收酶切后的 pBI121 线性质粒。将测序正确的含有 GmGMP1 基因的大肠杆菌进行 PCR 扩增 ( 上游引物 F 含有 XbaI 的酶切位点 ：
5’ -GCTCTAGACACATCACAATGAAGGCATTG-3’ (SEQ ID NO.5)， 下游引物 R 含有 BamHI 的酶切位点 ： 5’ -CGGGATCCTGACCTCACTCACATGACAAT-3’ (SEQ ID NO.6)， 对扩增产物胶回收 后进行 Xba I、 BamH I 双酶切得到含 Xba I/BamH I 酶切位点的 GmGMP1， 将酶切产物含 Xba I、 BamH I 酶切位点的 GmGMP1 与酶切后的 pBI121 线性质粒连接， 并转化大肠杆菌 DH5α。 蓝白斑筛选及 PCR 检测得到阳性克隆， 命名为 pBI-GmGMP1。用限制性内切酶 Xba I/BamH I 双酶切 pBI-GmGMP1 得到 1,100bp 左右的条带， 与预期的值相符， 所以确认所构建的载体是 正确的， 即得到了由 CaMV35S 启动子驱动的 GmGMP1 基因的表达载体 pBI-GmGMP1， 载体构造 如图 2 所示。
实施例 3 转 GmGMP1 基因拟南芥阳性植株的获得以及功能验证
用冻融法将 pBI-GmGMP1 转入根癌农杆菌菌株 EHA105 中。 pBI-GmGMP1 通过农杆菌 介导浸染法转化拟南芥， PCR 检测 T1 代结果表明获得阳性植株。将转基因拟南芥植株和野 生型拟南芥植株种植于同等环境条件下 ( 人工气候箱， 白 22℃， 10h/ 夜 19℃， 14h)。
30d 后取叶片用以下方法进行维生素 C 含量测试 ( 方法参照秦诚拟南芥 NH4+ 超敏 突变体 hsn1 分子机制的相关研究 [D]. 浙江大学， 2008， (12)) ：
1. 标准曲线的制作
试剂配置 ：
维生素 C(L-ascorbic acid， AsA) 购自北京鼎国生物技术公司
脱氢抗坏血酸 (DHA) 购自 Sigma 公司
维生素 C 氧化酶 (ascorbate oxidase， AO) 购自 Sigma 公司
二硫苏糖醇 (DTT) 购自南京基天生物技术公司
其他药剂均购自国药集团化学试剂有限公司
6％偏磷酸 ： 6g 偏磷酸溶解于水定容至 100ml， 加 2ml 100mM EDTA-Na2，
10％柠檬酸钠 ： 10g 柠檬酸钠溶解于水中定容至 100ml，
磷酸钾缓冲液 ： 1mol/L K2HPO4 ∶ 1mol/L KH2PO4 ＝ 8.5 ∶ 91.5(v ∶ v)， PH ＝ 5.8，
混 合 液 ∶ 6 ％ 偏 磷 酸 ∶ 10 ％ 柠 檬 酸 钠 ∶ 磷 酸 缓 冲 液 ＝ 75.6 ∶ 50.4 ∶ 14(v ∶ v ∶ v)，
100mg AsA 溶于混合液中， 定容至 100ml( 含 AsA 1mg， /ml)，
100mg DHA 溶于混合液中， 定容至 100ml( 含 DHA 1mg/ml)，
10ml 的 1mg/ml ASA 溶于混合液中， 定容到 100ml( 含 AsA 0.1mg/ml)，
10ml 的 1mg/ml DHA 溶于混合液中， 定容到 100ml( 含 DHA 0.1mg/ml)，
稀释至各个浓度 (0mg/ml ～ 0.1mg/ml)， 酶标仪板加样体积 ： 150ul/ 每孔， 另每份 样品 3 个一组， 共三组， 分别加入 20ul 的 ddH2O、 250U/10ml AO 溶液以及 100mM 的 DTT 溶液 反应 30min ～ 45min， 在： 265nm 波长处检测， 并绘制 ASA 和 DHA 的标准曲线。ASA 标准曲线 结果见图 3， DHA 标准曲线结果见图 4。2. 样品中维生素 C 含量的测定
1) 称空管的质量 M1 ；
2) 大约 0.1 克样品 ( 叶片 ) 在液氮中碾磨， 加入 6％偏磷酸钠 1ml( 质量为 M0)， 称 重 M2， 冰浴 30 分钟 ；
3)M2-M1-M0 为样品的净重 ；
4)4℃， 12000rpm， 15 分钟， 离心 ；
5) 取 750μl 上清， 加入 500μl 的 10％柠檬酸钠， 中和 ；
6) 取 900μl 中和液加入 100μl 磷酸钾缓冲液 (pH ＝ 5.8) ；
7) 测 OD265(OD1)( 准备两份样品， 一份加入 DTT 后， 再重复 7-8) 步骤 ；
8) 加入维生素 C 氧化酶 (ascorbate oxidase， AO， Sigma)1μl， 室温反应 45 分钟 ；
9) 测 OD265(OD2) ；
10)OD1-OD2 绝对值， 根据 AsA 标准曲线 ( 图 3) 计算 ASA 的含量 ；
11) 加 DTT 的样品， 室温 45min 后， 测 OD265(OD3)， OD1-OD3， 根据 DHA 标准曲线 ( 图 4) 计算 DHA 的含量。
总维生素 C 含量＝ ASA 含量 +DHA 含量
结果如图 5 所示 ： 部分转基因拟南芥叶片的总维生素 C 含量显著高于野生型拟南 芥叶片， 说明转基因株系与野生型相比总维生素 C 含量显著提高， 过量表达 GmGMP1 基因能 提高转基因拟南芥的总维生素 C 含量。6102321593 A CN 102321599
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