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1、10申请公布号CN102319439A43申请公布日20120118CN102319439ACN102319439A21申请号201110240751722申请日20110822A61K47/48200601A61K47/30200601A61K45/00200601A61P35/00200601A61P31/04200601A61P31/1220060171申请人缪文良地址310011浙江省杭州市拱墅区北部软件园祥兴路18号72发明人王楠龙泉幺崇正缪文良龚佑静缪逸男74专利代理机构杭州浙科专利事务所33213代理人吴秉中54发明名称一种带磁性微球的药物及用途57摘要一种带磁性微球的药物及用途。
2、，属于生物制剂技术领域。其在磁性微球上通过偶联靶向识别物和/或药物，形成磁性微球与靶向识别物或与靶向药物的结合物，靶向识别物为抗原、抗体和核酸中的至少一种，靶向药物为靶向识别物与药物偶联得到的结合物，药物为化学合成药物、天然提取药物和生物药物中的至少一种。本发明结合血液免疫循环靶向治疗装置，能够在患者体外清除或灭杀血液中有害抗原性物质，其清除率可达到90以上，并且解决了现有技术中靶向药物或靶向识别物在患者体中发生免疫排斥反应的问题。本发明同时提供了磁性微球与靶向识别物或与靶向药物的结合物在制备清除或灭杀血液中有害抗原性物质药物中的应用的新用途。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12。
3、发明专利申请权利要求书1页说明书5页CN102319442A1/1页21一种带磁性微球的药物，其特征在于磁性微球上通过偶联靶向识别物和/或药物，形成磁性微球与靶向识别物或与靶向药物的结合物，所述的靶向识别物为抗原、抗体和核酸中的至少一种，所述的靶向药物为靶向识别物与药物偶联得到的结合物，所述的药物为化学合成药物、天然提取药物和生物药物中的至少一种。2如权利要求1所述的一种带磁性微球的药物，其特征在于所述的抗原为能够引起抗体选择性、特异性识别的多肽或化学分子，所述的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，可以是天然抗体、基因重组抗体或基因工程抗体，所述的核酸为脱氧核糖核酸和/或核糖核酸的寡聚物和/或多聚物。
4、。3如权利要求1所述的一种带磁性微球的药物，其特征在于所述的磁性微球偶联一个或一个以上的靶向识别物。4如权利要求1所述的一种带磁性微球的药物，其特征在于所述的磁性微球偶联一个或一个以上的靶向药物。5如权利要求1所述的一种带磁性微球的药物，其特征在于所述的化学合成药物、天然提取药物和生物药物为抗肿瘤药物。6如权利要求1所述的磁性微球与靶向识别物或与靶向药物的结合物在制备清除或灭杀血液中有害抗原性物质药物中的应用，所述的有害抗原性物质为病毒、细菌或癌细胞。权利要求书CN102319439ACN102319442A1/5页3一种带磁性微球的药物及用途技术领域0001本发明属于生物制剂技术领域，具体涉。
5、及一种带磁性微球的药物及用途。背景技术0002恶性肿瘤（癌症）正严重威胁人类的健康与生命，目前虽然针对不同种类癌症的疗法很多，但是对于晚期及扩散的癌症并没有很多有效的治疗方法，因此有效治疗成了当务之急。传统手术治疗只能切除可见的癌组织，血液及外周血中的癌细胞的灭杀与清除缺乏有效、完善的治疗措施。循环血液中瘤细胞，来自血细胞的恶变（如白血病）或恶性肿瘤的血液扩散，而且手术过程最易使恶性肿瘤经血道或淋巴扩散。临床也认识到只要血液中癌细胞达到一定数量后，就会发生恶性癌的远隔转移，形成新的转移病灶。因此，在术中或是术后，及时地清除血液中的瘤细胞是一项非常重要的辅助治疗措施。传统放、化疗在杀伤肿瘤细胞的。
6、同时也杀伤大量正常细胞，给患者带来严重的伤害。为了克服化疗药物的毒副作用，治疗肿瘤的靶向药物于上世纪八、九十年代开始用于临床，这类药品根据免疫原理，制备针对各种肿瘤的特异性抗体（单克隆抗体或多克隆抗体），将抗体与杀灭肿瘤细胞的药物或者抑制肿瘤生长的药物偶联，利用抗原、抗体特异性结合这一特性，引导药物与患者体内肿瘤细胞的结合，以达到靶向治疗、有效避免药物对患者体内正常细胞伤害的目的。目前，靶向治疗药物成为世界上最热门、最重要的治疗肿瘤的药物。0003现有的治疗肿瘤的分子靶向药物结合方式，是通过口服或静脉注射进入患者体内通过免疫反应，才能发挥靶向作用。根据免疫反应的原理，目前靶向治疗药物尚有以下不。
7、可克服的缺点1目前临床应用的靶向药物都带有抗体及化学药物。这种抗体不论是免疫动物制备的还是通过基因工程获得的，对患者而言均属于异体蛋白，进入体内后必然会发生免疫排斥反应。特别是进行多次长期的靶向治疗后，患者体内会产生针对进入体内靶向药物的新抗体（即抗抗体），从而使目前这种靶向药物的靶向功能弱化以致失效。00042异体蛋白进入体内积累到一定量时会产生严重的毒副作用，而且抗体携带的药物这类有机化合物属于半抗原，进入并再在患者体内后会引发异常免疫应答及超敏反应，造成患者机体组织损伤或生理功能紊乱，甚至危及生命。这就限制了目前这种靶向药物大剂量或多品种的同时使用。无法满足发生转移扩散的癌症病人的治疗需。
8、要。发明内容0005针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种带磁性微球的药物的技术方案，同时提供了磁性微球与靶向识别物或与靶向药物的结合物的新用途。0006所述的一种带磁性微球的药物，其特征在于磁性微球上通过偶联靶向识别物和/或药物，形成磁性微球与靶向识别物或与靶向药物的结合物，所述的靶向识别物为抗原、抗体和核酸中的至少一种，所述的靶向药物为靶向识别物与药物偶联得到的结合物，所述的药物为化学合成药物、天然提取药物和生物药物中的至少一种。说明书CN102319439ACN102319442A2/5页40007所述的一种带磁性微球的药物，其特征在于所述的抗原为能够引起抗体选择性、特异性。
9、识别的多肽或化学分子，所述的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，可以是天然抗体、基因重组抗体或基因工程抗体，所述的核酸为脱氧核糖核酸和/或核糖核酸的寡聚物和/或多聚物。0008所述的一种带磁性微球的药物，其特征在于所述的磁性微球偶联一个或一个以上的靶向识别物。0009所述的一种带磁性微球的药物，其特征在于所述的磁性微球偶联一个或一个以上的靶向药物。0010所述的一种带磁性微球的药物，其特征在于所述的化学合成药物、天然提取药物和生物药物为抗肿瘤药物。0011所述的磁性微球与靶向识别物或与靶向药物的结合物在制备清除或灭杀血液中有害抗原性物质药物中的应用，所述的有害抗原性物质为病毒、细菌或癌细胞。0012。
10、上述的一种带磁性微球的药物，设计合理，通过磁性微球与靶向识别物或靶向药物偶联构成带磁性微球的药物。本发明结合血液免疫循环靶向治疗装置，能够在患者体外清除或灭杀血液中有害抗原性物质，其清除率可达到90以上，并且解决了现有技术中靶向药物或靶向识别物在患者体中发生免疫排斥反应的问题。本发明同时提供了磁性微球与靶向识别物或与靶向药物的结合物在制备清除或灭杀血液中有害抗原性物质药物中的应用的新用途。具体实施方式0013以下结合具体的实施例来进一步说明本发明。0014实施例1磁性微球与靶向识别物或靶向药物的偶联反应磁性微球为现有产品，其由高分子聚合物（如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、硅材料和乳胶等）制成。这些。
11、磁性微球聚合过程中包含一定量的铁元素（如四氧化三铁以及具有同样功效的其它金属元素），以便利用磁力达到从血液中清除分离的目的。其粒度可以是微米级，也可以是纳米级。这种磁性微球表面应带有不同的一种与蛋白有高亲和力的基团（如羟基、氨基、羧基等），使磁性微球与抗体能紧密结合。0015本发明所用靶向识别物可以是天然抗体，人源化的基因重组抗体和基因工程抗体（如CEA单抗用于检测清除直肠癌细胞），也可以是抗原（如HCVAG用于检测丙肝患者），还可以是核酸片段（如DNA、RNA和PNA）。目前，已有许多针对人体实体瘤的单克隆抗体（如结、直肠癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌和乳腺癌抗体等）在传统的靶向治疗药物中。
12、得到应用。根据不同用途，可分别选用合适的单克隆抗体或多克隆抗体或根据患者病灶部位合成的特异性核酸探针片段，通过常规方法与磁性微球偶联和化学药物（如阿霉素）、天然提取药物（如紫杉醇）或生物工程药物（如肿瘤坏死因子TNF）与磁性微球用常规的方法直接偶联，或先与抗体或核酸偶联，再与磁性微球偶联，冷藏或冷冻保存，即成为一种全新的靶向治疗药物及可用于治疗的靶向识别物。0016磁性微球与靶向识别物，以及磁性微球与靶向药物之间的偶联方法是通用的，为直接偶联或通过偶联物偶联。偶联的方式为电极性力、共价键、氢键、疏水作用、范德华力和活性吸附（即库伦引力）中一种或多种组合。直接偶联是磁性微球表面带有的高亲和力说明。
13、书CN102319439ACN102319442A3/5页5的基团如羟基、氨基或羧基等与靶向识别物（如抗体）直接偶联。通过偶联物间接偶联，偶联物一般为二亚胺的衍生物（如1ETHYL33DIMETHYLAMINOPROPYLCARBODIIMIDE，EDC）、琥珀酰亚胺的衍生物（如NHYDROXYSUCCINIMIDE,NHS）、聚乙烯亚胺及其衍生物（如POLYETHYLENEIMINE）、戊二醛及其衍生物（如3METHYLGLUTARDEHYDE）、链霉素A蛋白和亲和素复合体（STREPTAVIDINPROTEINACHIMERA）、生物素亲和素（BIOTINAVIDIN）和核苷酸互补配对中的。
14、一种或几种的混合。0017以下举例说明磁性微球与靶向识别物的结合1采用NHS和EDC溶液来间接偶联带羧基磁性微球与带氨基单克隆抗体（共价键结合，结合牢固性好）。0018取20L20G/L羧基磁性微球（由山东轻工业学院提供），加入10103MOL/L新配制的NHS和EDC溶液（购自SIGMA公司）各500L，室温下在微量振荡器上振荡15MIN，磁分离，用PH72磷酸缓冲液振荡清洗已活化的磁性微球，加入50L新配的单克隆抗体，振荡反应2H，磁分离，弃上清，加入1ML乙醇胺溶液，混匀，在振荡器上振荡60MIN。反应结束后，磁分离，弃上清液。加入磁微球封闭液（封闭液一般用1的牛血请白蛋白，防止游离抗原。
15、和抗体的非特异性吸附）1ML，混匀，在振荡器上振荡5MIN，磁分离，弃上清，重复封闭4次即完成了磁性微球的包被。将包被磁性微球重悬于储存缓冲液（1MMEDTA，1BSA的PBS溶液）中保存以用于后续实验。即得到磁性微球与靶向识别物偶联的结合物。0019本发明中磁性微球与靶向识别物（抗原、抗体和核酸中的至少一种）的结合均采用现有常规的技术进行；靶向识别物和药物结合均采用现有常规的技术进行。0020实施例2磁性微球与靶向识别物的偶联物对吸附特定的抗原物质的有效性试验1制备结肠癌细胞悬浮液并测定悬浮液细胞初始浓度人结肠癌上皮细胞LOVO用胰蛋白酶消化细胞进行传代贴壁培养。吸去培养液，用PBS洗涤细胞。
16、一次，加入消化液，在37中消化约310MIN，待细胞开始变圆脱落时，加入新鲜培养液，终止消化液，悬浮和吹打分散细胞。1000RPM离心5MIN，去除上清培养液，用新鲜培养液悬浮细胞。1214稀释细胞后，分瓶继续培养。收集对数期的细胞用于实验，制成浓度为11041106CELL/ML的单细胞悬浮液，细胞浓度用血球计数板测定。00212包被靶向识别物的磁性微球对结肠癌细胞的吸附反应取培养好的人结肠癌上皮细胞悬浮液4ML，分别接种于直径10MM的无菌玻璃试管中，细胞贴壁后往试管中分别加入储存缓冲液（1MMEDTA，1BSA的PBS溶液；标记为CK1）、羧基磁性微球悬浮液（CK2）、单抗CEA羧基磁性。
17、微球悬浮液50L。室温振荡器上振荡3H。反应结束后，磁分离去除磁球，上清用于后续浓度测定。00223反应后细胞浓度测定上述三种上清液中结肠癌细胞浓度用血球计数板测定。对照CK1结肠癌细胞浓度为1212105CELL/ML；CK2的结肠癌细胞浓度为8217104CELL/ML；加入抗体羧基磁性微球悬浮液的结肠癌细胞浓度为5385103CELL/ML。CK1与CK2的数据差异较小，说明羧基磁微球能少量自由结合结肠癌细胞；但通过磁分离去除带靶向识别物的磁微球后，上清液浓度相对于CK1降低22倍。试验证明，偶联单抗CEA的磁性微球能够特异性的识别并结合结肠癌的细胞。由此可见，磁性微球与靶向识别物的偶联。
18、物以患者清除血液中的癌细胞是有效可行的。说明书CN102319439ACN102319442A4/5页60023试验例3磁性微球与靶向识别物的偶联物对吸附特定的核酸的有效性试验一、制备核酸靶向识别物磁性微球。00241根据BIRKIT淋巴瘤阳性患者感染EB病毒抗原核酸序列保守区设计单链蛋白核酸PNA探针序列5TGCCCTTGCTATTCCACAATGTCGTCTTACACCATTGAG3；5ATAATGGAGTCAACATCCAGGCTTGGGCACATCTGC3。2取EB病毒病毒表面抗原前BAMH1W区核酸保守区蛋白核酸探针的混合物10G，溶解1ML于无菌磷酸缓冲液中。3将磁珠包装瓶在垂直混。
19、合仪上混合10MIN，使之充分混匀。4取50L无菌磁珠，加入3ML容量玻璃瓶中。5加入1ML磷酸生理盐水洗涤，混匀，振荡器上振荡5MIN。用磁架磁静置分离10MIN，弃去上清液。6重复洗涤5次。7加入50L的EDC溶液，随即加入定量的亲和素蛋白，混匀，振荡器上震荡3H。8用磁架静置分离10分钟，弃去上清，加入封闭液1MMEDTA，1BSA,PBS,PH76500L，混匀后，振荡器上振荡10MIN，用磁架静置分离10MIN，弃去上清液。9重复步骤5与步骤6。10加入步骤2制备的生物素交联核酸探针混合物，震荡混匀后，振荡器上振荡反应30分钟。11重复步骤5与步骤6。12加入500L保护液1MMED。
20、TA，02MMATP,1BSA,PBS,PH72，混匀，静置于4保存。二、包被核酸靶向识别物的磁性微球对游离EB病毒核酸的吸附反应。00251在震荡反应器内加入通过方法一制备的磁微粒交联核酸药物的生理盐水悬液100ML。2取EB病毒阳性血浆100ML，加入抗凝剂。3控制血浆缓慢流入震荡反应器，300RPM震荡。4控制震荡反应器在65，300RPM震荡温育5MIN。然后37，300RPM震荡温育3H。5磁架磁静置10MIN分离磁珠。保留磁架，控制血液流出反应容器，300RPM震荡。6加入4，PH76的磷酸生理盐水200ML洗涤反应容器，300RPM震荡，弃去洗液。7重复步骤6。8撤除磁架，回收磁。
21、微粒的磷酸生理盐水悬液。9用抗DNA/PNA杂化抗体，采用板式双抗体夹心化学发光法检测血液中游离乙型肝炎DNA的滤除效果。多次检测滤除效果均达到90以上。此结果验证了偶联磁性微球的靶向识别物（核酸）吸附特定的核酸序列是有效可行的。0026本发明中其它磁性微球与靶向识别物或靶向药物的结合物通过常规的方法进行试验，其也能达到与实施例2和3相同的技术效果。0027本发明偶联磁性微球的靶向识别物及靶向药物在临床上的给药方式，是通过特制器械中国专利ZL2005200402400，对患者进行治疗。血液免疫循环靶向治疗装置有两根用于与患者血管连接的输血管，一根用于患者动脉血液的输出，另一根用于静脉血液的回输。
22、。在两根输血管之间依次用输血管串接蠕动泵、磁性微球靶向药物悬浮液存储器、一级或多级反应器、磁性微球富集器、磁性微球过滤器、磁性微球检测器及流量控制器。开始治疗前，先将本发明磁性免疫靶向识别物及靶向药物制成悬浮液存入存储器中备用，在患者血液体外循环阶段，开动蠕动泵，滴注磁性微球靶向识别物或靶向药物。通过反应器及输血管路，促使靶向识别物与患者血液进行充分接触反应（装置可串联多个反应器以达到充分反应的效果）。反应结束后，通过外加磁场将结合上患者血液中抗原性物质（如癌细胞）和未进行反应的磁微球靶向识别物分离、截留在体外，再将患者血液过滤后回输体内，以达到去除血液中对患者有害的抗原性物质的目的。该反应过。
23、程在连续、封闭的无菌环境中进行。如磁性微球单抗CEA阿霉素或紫杉醇或肿瘤坏死因子TNF的结合物结合上述的装置，进行临床实验，清除癌细胞达到85以上。磁性微球与肿瘤特异性抗体结合物或磁性微球与说明书CN102319439ACN102319442A5/5页7肿瘤特异性抗体、及阿霉素或紫杉醇或肿瘤坏死因子TNF的结合物以及实施例1中的其它形式的结合物通过上述实验，也能达到相同的结果。0028本发明偶联磁性微球的靶向识别物及靶向药物的给药方式也可以是间歇或分阶段进行的。先将患者血液适量抽取至体外存于特制灭菌容器中（如输血袋），然后滴注磁微球靶向识别物及靶向药物，通过各种方式（如保温、加温、摇动、震荡及加入凝血抑制剂等）促进药物与患者血液中抗原性物质充分反应，然后，通过外加磁场分离与目标抗原结合和未结合的磁性微球靶向识别物及靶向药物后，将血液回输患者体内。0029磁性微球早已被允许注入体内用以进行栓塞治疗。磁性微球与抗体偶联物在免疫诊断中应用已十分普遍成熟，但是至今临床上还没有用磁性微球与靶向识别物或与靶向药物偶联，用于清除或灭杀血液中有害抗原性物质（如癌细胞）的靶向药物问世。因此，本发明是免疫靶向治疗方法的创新与进步。说明书CN102319439A。