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用于口用组合物的组合物及其制备和应用
技术领域
本发明涉及用于制备如霜剂、凝胶、牙膏、洗口药水或牙科漱剂之类的组合物的含类黄酮组合物，该含类黄酮组合物包括高分子量透明质酸的钠盐。特别地，涉及一种包含与高分子量透明质酸的钠盐组合的抗菌生物类黄酮原液的组合物，优选为口用组合物，及其制备和应用。
背景技术
人们已知某些包含类黄酮的组合物，该类黄酮具有抗微生物活性，特别是抗细菌活性，尤其是抗病毒活性。然而，术语“类黄酮”涵盖了大量的各种不同化合物，这些化合物可从各种自然来源提取而制得。根据提取的来源和性质或方法的不同，所得类黄酮混合物的总的化学成分可能相差甚大。就毒性和抗微生物如抗病毒和抗细菌的效力而言，各种类黄酮的生物活性可能有很大不同(或无活性)。因此，组合起来，这样的类黄酮在其生物活性上也可能各不相同。
人们发现，通过往所述类黄酮组合物中添加其他作用剂，可以与类黄酮的某些组合的生物活性起协同作用、或者增强或促进类黄酮的某些组合的生物活性。因此，人们一直致力于寻找类黄酮的适当组合，通过添加或不添加其他的作用剂，使之具有理想的抵抗某些微生物的效力，而又不会在应用中伴随中毒或其他不良影响发生。这种组合的一个实例可在一种橙提取物组合物中发现，这种橙提取物就是大家知道的生物类黄酮和如维生素C之类的天然果酸，其在氧禽业中用于杀灭跟食物有关的微生物，如大肠杆菌及沙门氏菌。
然而，直到本发明之前，都未见有人提出过将橙源性生物类黄酮/果酸组合物用于个人卫生用，如口用制剂。特别是，这些已知的组合物对于口用来说会太酸。此外，虽然有人建议，将类黄酮用于诸如牙膏和洗口药水这样的组合物，但是，谁也没有特别指明其类黄酮成分，和/或限定具体的类黄酮。例如，专利说明书WO 02/47615公开了一种口用组合物，包含感官上适合的载体和分散在载体中的类萜和/或类黄酮；DE19949575公开了一种用于治疗牙病和预防龋齿的氟化物和类黄酮的组合物；以及JP62051613涉及一种牙膏组合物，含有0.001～0.1wt％的选自黄酮醇、白杨素、橙皮素和橙皮苷类黄酮化合物。没有哪个在先技术的配方公开过一种生物类黄酮(其本身包含一种水溶性类黄酮的具体组合)与一种或多种水溶性果酸的组合物，该组合物在数量和形式上都适合以溶液口用、并具有抗菌活性。
从严格的生物化学和生理学这两者的观点来看，透明质酸是结缔组织基本物质中最重要的粘多糖。在人体中，透明质酸不仅存在于结缔组织还存在于重要的生物流体中，例如玻璃状体、水状体等，还存在于脐带中。它实际上没有毒性，也未发现对于人使用的特别禁忌征候。
与其它天然物质的组分一样的情况，透明质酸可从相对天然的物质提取得到，例如，它可从鸡冠提取，或可用生物技术生产。透明质酸具有非常宽的分子量范围，根据生产工艺的不同，分子量可以从30,000至超过15,000,000变化。有时，透明质酸还能以钠盐形式用于人的治疗和化妆处理。
在这方面，透明质酸的外部施用在改善结缔组织方面具有有利的效果，且能对抗由透明质酸酶生成菌引起的发炎过程；它有利于引起炎症的成分的分解，减低反常的毛细渗透，加速组织修复过程，并且它通过代谢性将游离水结合至它的分子结构，而进行抗水肿形成行为。透明质酸的治疗适应症很多，包括摩擦脱屑皮肤病，由动脉硬化血管病变、曲张性溃疡、结瘢延迟和外科切除引起的溃疡。
EP0444492A1中可知，分子量为800,000～4,000,000，优选为1,000,000～2,000,000的钠盐形式的透明质酸在药物组合物的制备中可用作活性成分，所述药物组合物用于治疗和预防口腔炎性感染的局部施用，并用于化妆处理和口腔卫生。
制备包括透明质酸和其它抗菌剂例如氯己定的制剂，具体是口腔制剂，的努力已经失败，这是因为所得到的制剂不稳定。在有些组合物中，需使用醇以制备制剂，通常不希望这样。盐形式的透明质酸与类黄酮的组合物可配制成局部用，优选是口用，且具体地，该组合物无需醇。不希望受任何具体理论的束缚，类黄酮混合物被认为可杀死细菌和病毒为透明质酸创造理想的环境，以提高和促进粘性或其它发炎组织的愈合速率。有利的是，所有配料来自天然，且在制备时没有使用危害性或合成的化学品。
发明内容
因此，本发明提供一种组合物，其pH范围为3至8.5，以3.5至8为佳，4至7更佳，5至6.5还更佳，包含：
(a)基于组合物的总重量，范围为0.1％至＜10％w/w的原液，所述原液包含生物类黄酮的混合物和果酸或其盐；
(b)透明质酸纳；和
(c)水；以及任选的
(d)制药学上可接受的载体；
其中所述透明质酸钠的平均分子量为800,000～4,000,000，
且其自身可包含在制药学上或药理学上可接受的适合于口用的另一或其它配料。
优选地，透明质酸纳的分子量为800,000～4,000,000，最好为1,000,000～2,000,000，例如1,500,000。本发明的组合物通常包含所述组合物总重量的0.005至10％的所述透明质酸钠。
用于治疗用途的本发明组合物通常含有所述组合物总重量的0.2至10％w/w的透明质酸钠，优选为0.2至1％w/w的透明质酸钠，例如0.4、0.6或0.8％。
口腔疾病预防、化妆和护理用途的本发明组合物包含所述口用组合物总重量的0.005至0.1％w/w的透明质酸钠，例如0.01、0.02或0.08％，最好包含0.1％w/w的透明质酸钠。
所述组合物，以包含范围为0.1至5％w/w的原液为佳，0.1至2％w/w更佳，例如约为1％。所述组合物以包含范围为20至80％w/w的水为佳，该范围的低端适合于牙膏的情况，该范围的高端适合于液体组合物，如洗/冲/喷口药水的情况。例如，牙膏可以包含范围为20至45％w/w的水，例如20至30％w/w，特别是在组分(d)中如果包含二氧化硅的情况下；液体配方可以包含范围为60至80％w/w水(所有w/w，均基于组合物的总重量)。
特别首选的是当所述原液可从水溶性生物类黄酮与果酸，如柠檬酸、苹果酸和抗坏血酸组合来制备的时候。一种或多种酸，最好用合适的碱，如季铵碱来中和，例如胆碱，如胆碱碳酸盐、胆碱碳酸氢盐，或者，优选为氢氧化物。当柠檬酸、苹果酸和抗坏血酸都用于制备所述组合物时还更好，尤其是当它们被完全中和以形成柠檬酸盐、苹果酸盐和/或抗坏血酸盐的时候最好。特别首选的是胆碱抗坏血酸盐。因此，首选的是所述原液基本没有果酸，这就意味着其pH在中性范围内。作为示例，原液的pH范围为3至8.5、3.5至8.5、3.5至8、4至8、4至7.5、4.5至7.5、4.5至7、5至7、5至6.5、5.5至6.5和5.5至6，例如，pH为约5、约5.5、约6、约6.5或约7。
具体实施方式
本发明人不想受任何具体理论的约束，认为，所述果酸既对硬水具有螯合效应，还与活性剂的生物活性起协同作用，例如，生物类黄酮和胆碱抗坏血酸盐。因此，优选的原液包含水溶性生物类黄酮和胆碱抗坏血酸盐(以胆碱(如氢氧化物)和抗坏血酸形式，或以其本身的盐形式存在)。
优选地，所述原液还包含无毒性溶剂，例如易与水混合的或亲水的溶剂，且更优选地，包含水和易与水混合的助溶剂，如甘油、多元醇等。所述溶剂尤以包含水/甘油混合物为佳，其混合比例以2∶1～1∶2(水：助溶剂)为佳。更优选地，组分(c)和(d)(余量包含水、一种或多种助溶剂和赋形剂和/或载体)是不含醇，具体地不含乙醇。
因此，所述原液，最好从下表所列配料制备：

  配料  ％(w/w)在原液中的配料  生物类黄酮混合物  (生物质45％)  1～20，以2至15为佳，3至15更佳，  如3，4或15，最佳为3.3  柠檬酸  1～20，以4至15为佳，  如4，5，10或15，最佳为4.5  苹果酸  1～20，以4至15为佳，  如4，5，10或15，最佳为4.5  抗坏血酸(维生素C)^*  1～20，以1至5为佳^*，  如1，2，3，4，或5，最佳为1.5  氢氧化胆碱溶液  (45％的水溶液)^*  1～45，以4至20为佳^*，  如5，8，10，12，15或18.  甘油/水或其他溶剂  余量，补足至100％，  以5至50为佳^*，如7，10或15，最佳为7.5
^*抗坏血酸和氢氧化胆碱(或其他胆碱)可用胆碱抗坏血酸盐替代，并同时适当增加甘油和水(或替代溶剂)的量。首选的是，溶剂包含大约等百分比的甘油和水两者，如各5至25％，如15％的甘油和20％的水(当胆碱是以氢氧化溶液存在时)，或如25％的甘油和25％的水(当胆碱和抗坏血酸以5％胆碱抗坏血酸盐存在时)。
因此，优选地，本发明的组合物如以下所述制备(基于组合物的重量)：
(a)(i)范围为0.0002～1.5％w/w的生物类黄酮[不包括生物质，以另贡献0.00024～1.83％w/w为宜]；
(ii)范围为0.001～2.0％w/w的柠檬酸；
(iii)范围为0.001～2.0％w/w的苹果酸；
(iv)范围为0.001～2.0％w/w的抗坏血酸；
(v)范围为0.00045～2.03％w/w的胆碱；和
(b)、(c)和(d)余量，包含水、一种或多种助溶剂和赋形剂和/或载体。
更优选地，本发明的组合物按如下所述制备(基于组合物的重量)：
(a)(i)范围为0.00045～0.9％w/w的生物类黄酮[不包括生物质，以另贡献0.00055～1.1％w/w为宜]；
(ii)范围为0.001～2.0％w/w的柠檬酸；
(iii)范围为0.001～2.0％w/w的苹果酸；
(iv)范围为0.001～2.0％w/w的抗坏血酸；
(v)范围为0.00045～2.03％w/w的胆碱；和
(b)、(c)和(d)余量，包含水、一种或多种助溶剂和赋形剂和/或载体。
由于本发明的原液，更优选地是按上述表格中给出的百分数制备，所以更优选地，本发明的组合物可按如下述制备：
(a)(i)范围为0.000675～0.675％w/w的生物类黄酮[不包括生物质]；
(ii)范围为0.015～1.5％w/w的柠檬酸；
(iii)范围为0.015～1.5％w/w的苹果酸；
(iv)范围为0.005～0.5％w/w的抗坏血酸；
(v)范围为0.015～0.9％w/w的胆碱；和
(b)、(c)和(d)余量，包含水、一种或多种助溶剂和赋形剂和/或载体。
由于本发明优选的组合物，包含大约1％w/w的原液，在一个实施例中，本发明优选的口用组合物可按如下所述制备：
(a)(i)大约0.0675％w/w的生物类黄酮[不包括生物质]；
(ii)大约0.15％w/w的柠檬酸；
(iii)大约0.15％w/w的苹果酸；
(iv)大约为0.05％w/w的抗坏血酸；
(v)大约为0.09％w/w的胆碱；和
(b)、(c)和(d)余量，包含水、一种或多种助溶剂和赋形剂和/或载体。
在另一个实施例中，本发明最佳的组合物可按如下所述制备：
(a)(i)大约0.01485％w/w的生物类黄酮[不包括生物质]；
(ii)大约0.045％w/w的柠檬酸；
(iii)大约0.045％w/w的苹果酸；
(iv)大约0.015％w/w的抗坏血酸；和
(b)、(c)和(d)余量，包含水、一种或多种助溶剂和赋形剂和/或载体。
优选地，本发明的组合物为局部用组合物。本文所指的所有组合物最好是适合局部施用的形式。
更优选地，本发明的组合物为口用组合物。更优选地，本文所指的所有组合物为适合口用的形式。
在另一个实施例中，本发明最佳的口用组合物可按如下所述制备：
(a)(i)大约0.01485％w/w的生物类黄酮[不包括生物质]；
(ii)大约0.045％w/w的柠檬酸；
(iii)大约0.045％w/w的苹果酸；
(iv)大约0.06％w/w胆碱抗坏血酸盐；和
(b)和(c)余量，包含水、一种或多种助溶剂和赋形剂和/或载体。
所述原液是按本领域技术人员熟知的工艺制备的。较合适的是，所述助溶剂在常温下与水混合，然后将中和过程涉及的酸，如抗坏血酸，在升温的情况下与所述溶剂一起混合，该温度保持在足以确保任何配料都不降解的低温。对于抗坏血酸的情况，其热降解温度大约在55℃以上，上述升温范围保持在约25℃至55℃以下，最好在大约在50℃左右。较合适的是，所述中和反应包括将氢氧化胆碱添加到混合物(初始pH＝1.2；最终pH＝5.5～6.0)的抗坏血酸中，或者添加胆碱抗坏血酸盐(即，其中抗坏血酸已被中和)本身。
然后，加入剩余的酸(以柠檬酸和苹果酸为佳)，接着加入生物类黄酮，以得到一种pH范围为约2.0至6.5，通常在2.2至3.5，尤其是在2.3至3.0的溶液。其余未中和的酸也例如用氢氧化胆碱基本上中和，以得到一种基本上中和的溶液，其pH范围为例如5至8.5，其中以5.5至7为佳，以5.5至6.5更佳。
包含生物类黄酮的在先技术配方的所述抗菌作用依赖于生物类黄酮对微生物细胞质膜中必需氨基酸摄取的抑制，例如通过抑制病毒神经酰胺酶(neuroamidase)。然而，本发明的配方被认为是有效的，因为所选择的可溶的生物类黄酮与胆碱抗坏血酸盐的组合物，会引起微生物的包裹，二氢黄酮和葡糖苷成分分解成独立的片段，以及随后由二氢黄酮片段和胆碱抗坏血盐导致的微生物失活。
较好的是，所述生物类黄酮混合物包含由萃取工艺产生的与生物质结合的水溶性生物类黄酮；因此，所述生物类黄酮混合物，可能与高达40～60％w/w，最好是约55％w/w的生物质(基于该生物类黄酮混合物的重量)结合。所述生物类黄酮以葡糖苷为佳，尤以选自异克奥索姆(isocriocirm)、异柚皮苷、柚皮苷(narangin)、橙皮苷(hesperidin)、新橙皮苷(neohesperidin)、新地奥明(neodiomin)、柚皮素(naringenin)、枸橘苷(poncirin)和野漆树苷(rhiofolen)为佳，而且以上述各种以混合物形态存在为更佳。特别首选的是，生物类黄酮混合物的主要部分包含柚皮苷和新橙皮苷，例如超过75％的生物类黄酮组分(不包含生物质)由它们组成。合适的是，所述生物类黄酮混合物中基本不存在其他生物类黄酮(如黄酮醇、白杨素，橙皮苷)，因此所述生物类黄酮组分基本上就由上文所列的水溶性生物类黄酮组成，尽管也可能存在痕量的其他生物类黄酮。特别合适的是，水溶性的生物类黄酮包含以下百分比(按总生物类黄酮组分中的生物类黄酮重量计)：
生物类黄酮总生物类黄酮组分的％异克奥索姆2.4异柚皮苷2.7柚皮苷52.0橙皮苷3.1新橙皮苷27.8新地奥明3.1柚皮素3.4枸橘苷4.4野漆树苷1.1合计100％
这种水溶性生物类黄酮混合物的合适来源在此称作“HPLC45”，其中(HPLC45的总组分的)约45％为所述生物类黄酮，余量(约55％)包含生物质，如果胶、糖和少量有机酸。如前所述，特别合适的是，生物类黄酮混合物主要部分包含柚皮苷和新橙皮苷，例如，它们作为生物类黄酮在带有生物质的混合物如HPLC45中超过35％。因此，按HPLC45总组分重量计算，最好有下面的生物类黄酮：
生物类黄酮％，在HPLC45中(生物类黄酮组分+生物质)异克奥索姆1.1异柚皮苷1.2柚皮苷23.4橙皮苷1.4新橙皮苷12.5新地奥明1.4柚皮素1.5枸橘苷2.0野漆树苷0.5合计HPLC45的45％
作为柑橘属生物类黄酮复合物(Citrus Bioflavonoid Complex)45％HPLC，HPLC45可从Exquim(Grupo Ferrer的食品分支机构)获得。它源自于包含未长熟苦(血/红)橙中果皮的起始原料，例如塞维利亚柑橘，这种柑橘被归类为“不适于食用的”，其果核、果肉和油性皮已基本去除或仍未充分发育。该起始原料在亲水的离子性溶剂中压榨，例如在水/醇混合物中，最好是比例约为1∶10～20(溶剂：起始原料)的水/乙醇中。由此得到的混合物经过滤分离水溶性生物质(被保留)和不溶性生物质(废弃)。然后对水溶性生物质作进一步精过滤，再经闪蒸而留下一种棕色的吸湿性粉末(HPLC45)。
较好的是，用于本发明组合物的生物类黄酮混合物包含水溶性葡糖苷，这有别于从包含水不溶性类黄酮的柚子或其他柑橘类水果或其他植物来源得到的混合物；还更好的是，它还有别于从那些含有大量籽、果肉和/或鲜果，具体是包含水不溶性成分的起始原料得到的混合物；此外，在先技术的发育更全/成熟的起始原料，更可能经受过杀虫剂和/或合成肥料，因此，其来源不如本发明溶液的生物类黄酮混合物来得“有机”或纯净。
较好的是，所述原液包含1～20％w/w的HPLC45，其中以2至15％为佳，以3至15％更佳，例如3、4、或15，最佳是3.3％。因此，所述原液包含0.45～9％的生物类黄酮混合物，其中以0.9至6.75％为佳，以1.35至6.75％更佳，例如1.35、1.8、或6.75，最佳是1.485％。
较好的是，本发明组合物，特别是除了水没有其他配料的情况下，以及所述原液，具有3至约8.5的pH，其中以约3至8.5％为佳，以约4至7.5％更佳，例如约5至7；尤其好的是pH在约5.5至6.5。因此，最好的是，所述组合物基本没有氢离子，例如没有果酸的氢离子；因此，最好如上所述，通过往原液中添加碱的方法，充分中和用于制备原液和/或组合物的所述果酸。另一方面，当组合物还包含缓冲剂的情况下，假设缓冲剂的存在量能有效地使组合物的pH在这些范围内，那么该原液的pH可以变动超过这些范围。
因此，本发明组合物的组分(d)，可以包含一种调节或调整最后组合物的pH的缓冲剂，例如碱金属氢氧化物或氢氧化铵，或一元、二元或三元磷酸盐，如三(碱金属)磷酸盐。由于氢氧化物的量，比二元磷酸盐难以测定，所以最好使用一元磷酸盐和二元磷酸盐。另一供选方法，是使用正磷酸和二元或三元磷酸盐，如三(碱金属)磷酸盐的组合物。所述磷酸盐以钠盐、钾盐或铵盐的形式为佳；尤以采用钠盐更佳。然而，当担心钠离子对高血压影响的情况下，可采用单钾和二钾磷酸盐。当缓冲剂是磷酸二钠的时候，例如，它在组合物中可以高达约5％w/w，尤以在0至0.5％，例如在约0.05％w/w为佳。
另一可选配料，组分(d)，可以包含氟化物源，例如氟化钠和单氟磷酸钠，其含量可高达本发明组合物的大约0.5％w/w。氟化物源以在0至0.15％的范围为佳，例如在液体组合物的情况下，约为0.05％w/w，但在牙膏的情况下，要更高些，其在0至0.3％之间，例如约为0.24％w/w，或者在0至1500ppm(以氟离子计)的范围之内为佳。
本发明组合物中，可以存在其他添加剂，例如调味剂、甜味剂或着色剂，或防腐剂。例如取自椒薄荷(peppermint)或荷兰薄荷(spearmint)的薄荷、桂皮(cinnamon)、桉树(eucalyptus)，柑橘(citrus)、肉桂(cassia)、茴香(anise)、薄荷脑(menthol)等，都是合适的调味剂的实施例。调味剂在所述组合物中的存在量在0至3％的范围之内为佳；以高至2％为佳，例如高至0.5％，在液体组合物情况下，以0.2％左右为佳；对于牙膏的情况，可任选地多些，以0.5至2％为佳，在1％w/w左右更佳。甜味剂包含人工甜味剂或天然甜味剂，例如糖精钠，其存在量的范围可在0至2％，以高至1％w/w为佳，例如为组合物的0.05至0.3％w/w。着色剂是适宜的天然或合成色素，如二氧化钛或CI42090，或其混合物。在所述组合物中最好存在着色剂，其范围为0至3％之间；以高至0.1％为佳，例如高至0.05％，在液体组合物的情况下，以在0.005～0.0005％左右为佳；但对于牙膏的情况，可任选地多些，以高至1％为佳，在约0.5％w/w左右更佳。常用的防腐剂中，苯甲酸钠的浓度，以不足以达到改变所述组合物pH的大小为宜，否则，需要调节缓冲剂的用量，以到达所希望的pH。
组分(d)的其他可选配料，可以包含其他的活性作用剂，如抗菌斑剂和/或抗微生物剂。合适的作用剂包括季铵盐化合物，如度米芬(Domiphenbromide)、氯化十六烷基吡啶(CPC)、酚类化合物、乙醇以及上述的防腐剂。这些活性作用剂的存在量的浓度范围为0至4％w/w之间，但对于乙醇的情况，可高达70％，例如高达30％。例如，尤其是在本发明的液体组合物中，氯化十六烷基吡啶(CPC)等以高至2％为佳，例如约0.05％w/w左右。在本发明的液体组合物中，乙醇可含多达70％，以0至30％w/w为佳，如在喷口药水中约为15％w/w，但本发明组合物，具体为口用组合物，最好基本不存在乙醇或任何其他的醇。
组分(d)的其他可选配料，可以包含保湿剂、表面活性剂(非离子、阳离子或两性)、增稠剂、胶体和粘结剂。合适的保湿剂包括甘油、木糖醇、丙三醇和二醇，如丙二醇，其存在量各可高达50％w/w，但所述组合物的总保湿剂最好不超过约60～80％w/w。例如，液体组合物可包含多达约30％的甘油，外加高达约5％，最好是约2％w/w的木糖醇。表面活性剂最好不是阴离子性的，并且还可包括聚山梨醇酯20或可可酰胺甜菜碱(cocoamidobetaine)等，其含量高至为所述组合物的约6％，尤以约1.5至3％w/w为佳。
当本发明的口用组合物未喷口水形式时，所述口用组合物最好包括高至3％w/w左右的成薄膜剂，例如在0至0.1％的范围内，尤以约0.001至0.01％为佳，例如为所述口用组合物的约0.005％w/w。适合的成膜剂包括透明质酸钠以及以Gantrez商标出售的那些成膜剂。
当本发明的所述口用组合物是以牙膏形式存在时，最好包括胶体、粘结剂和/或增稠剂，如胶体二氧化硅、卡拉胶和纤维素衍生物，如羧甲基纤维素钠。这些配料在所述口用组合物的含量可高至3％w/w左右，如高至约2％，尤以约0.5至1％w/w为佳。
本发明的牙膏组合物还可包含研磨剂，如水合二氧化硅、磷酸氢钙、或水不溶性碱金属偏磷酸盐，其在所述口用组合物可高至约25％w/w，尤以约10至15％w/w左右为佳。
本发明组合物可局部施用，且可以是霜剂、凝胶、膏体、牙膏和洗口药水形式。对此，本发明的药物组合物通常包含常规的赋形剂，例如，如山梨醇和/或麦芽糖醇之类的多元醇，如聚乙二醇之类的二元醇，如羧甲基纤维素之类的增稠剂，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯的防腐剂，如辣椒素之类的调味剂，如糖精之类的甜味剂，以及着色剂。
本发明组合物可以采用本技术领域中已知的用于制备类似组合物(如牙膏、洗口药水或冲口药水、喷口药水等)的任何方法制备。所有这些方法，都包括将组分(a)、(b)以及，如果存在的话，还有(d)，均匀地物理混合在一起。
所述组合物最好采用合适的包装，如带有使用说明书的、具有或没有喷头或其他敷抹装置的塑料管或金属管，塑料或玻璃的透明瓶、半透明或不透明的瓶子，罐或分配器。这种包装本身还可以进一步包装到一个硬纸板箱或其他合适的容器中，相同的或进一步的使用说明书可附在其内或写在其上；这种说明书写在附带的小纸盒或散页上也很合适。包装上最好列出组合物的活性成分、主要成份或全部成分。该说明书可包含组合物领域的技术人员已知的内容，特别是有关抗菌使用的内容。于是，他们可建议按规定的时间间隔，每天2～3次，将豌豆大小的牙膏施用于牙齿；每天至少一次，最好是在饭后，用满口的洗口药水或冲口药水冲洗口腔周围；等等。
因此，本发明的所述口用组合物，可用于：治疗、预防或改善口腔中的微生物尤其是细菌性感染或其他牙周疾病的影响；清洁口腔，消毒口腔或从口腔清除碎渣；清爽、清新、消除或改善口气或口味；以及常规护理口腔的卫生、外观和感觉。因此，本发明进一步提供了一种包含与高分子量透明质酸钠组合的生物类黄酮混合物(如上文所述的混合物)和果酸的原液，该原液用于制备治疗口腔中微生物尤其是细菌感染的药剂；特别地，所述药物包含0.1％至10％w/w(基于所述口用组合物的总重量)的原液。较好的是，本发明提供(a)包含生物类黄酮和果酸混合物的原液，以及(b)透明质酸钠，其中所述透明质酸钠的平均分子量为800,000～4,000,000，和(d)其他制药学或药理学上可接受的适合口用的配料(如上文所述)，用于制备微生物尤其是细菌性口腔感染的治疗的药剂；特别地，其中所述药物包含0.1％至10％w/w(基于所述口用组合物的总重量)的原液。
治疗用途的本发明组合物可有利地用于治疗齿龈感染，该感染表现为齿龈组织的炎性症状，例如，齿龈炎、口腔炎、由如固定或移动修补物或外科手术之类的机械原因引起的疼痛。本发明组合物的牙龈膏可在儿童长牙阶段使用。本发明的所述口用组合物可用于治疗粘膜炎、阿弗他溃疡、扁平苔藓、口腔念珠菌病、齿龈炎、牙周炎或干槽症。本发明组合物可用于治疗已感染的、或潜在地感染的、和/或红肿的皮肤，例如粉刺、灼伤和创伤。
本发明组合物对治疗或预防由下列细菌引起的感染、疾病或病征是有用的：龋齿放线菌(Actinomyces odontolyticus)、粘性放线菌(Actinomycesviscosus)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、中间普雷沃菌(Prevotella intermedia)、颊普雷沃菌(Prevotella buccae)、牙普雷沃菌(Prevotella dentalis)、格登链球菌(Streptococcus gordonii)、血链球菌(Streptococcus sanguinis)、口腔链球菌(S oralis)、远缘链球菌(S sobrinus)、变形链球菌(S mutans)、中间链球菌(S intermedius)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、缠结优杆菌(Eubacterium nodatum)、衣氏放线菌(Actinomyces israelii)、奈斯隆迪放线菌(Actinomyces naeslundii)、白假丝酵母(C albicans)和热带假丝酵母(C tropicalis)。
在生物试验中，用于制备本发明组合物的原液(参见实施例1)稀释成1/10时可抑制上述所有细菌，且稀释成1/100时也可抑制上述链球菌属细菌。其他生物学数据在本文下述实施例中给出。现将通过下面的实施例阐明本发明。
实施例1：原液的制备
(a)HPLC45的制备
起始原料包含未长熟的苦(血/红)橙，例如塞维利亚柑橘的中果皮，这种柑橘被归类为“不适于食用”，并其果核、果肉和油性皮已被基本去除。起始原料被碾碎后以1∶10～20的比例(溶剂：起始原料)在水/乙醇中压榨到。所得混合物经过滤，保留水溶性生物质，丢弃不溶性的生物质。然后进一步精滤水溶性生物质，在经闪蒸后，得到棕色的吸湿性粉末(HPLC45)。或者，可从Exquim(Grupo Ferrer)获得HPLC45。
(b)HPLC45的生物类黄酮组合物
对在步骤(a)所得HPLC45的分析表明，HPLC45总成分的45％为生物类黄酮，其余量(55％)包含果胶、糖和低级有机酸。下列生物类黄酮所占的百分比(以HPLC45中的生物类黄酮重量计)为：
生物类黄酮％，HPLC45中的生物类黄酮
异克奥索姆2.4异柚皮苷2.7柚皮苷52.0橘皮苷3.1新橘皮苷27.8新地奥明3.1柚皮素3.4枸橘苷4.4野漆树苷1.1合计100％
因此，以HPLC45总成分的重量计，存在下列生物类黄酮：
生物类黄酮％HPLC45异克奥索姆1.1异柚皮苷1.2柚皮苷23.4橘皮苷1.4新橘皮苷12.5新地奥明1.4柚皮素1.5枸橘苷2.0野漆树苷2.8
(c)原液的制备
配料％原液HPLC4515柠檬酸15苹果酸15抗坏血酸(维生素C)^*5^*氢氧化胆碱溶液(45％的水溶液)15^*
甘油15^*水20^*合计100％
水、甘油和抗坏血酸是在常温下混合在一起的，然后升温至50℃。加入氢氧化胆碱，以中和抗坏血酸(开始pH＝1.2；最终pH＝5.5～6.0)。
[^*抗坏血酸和氢氧化胆碱可用5％的胆碱抗坏血酸盐替代，而甘油和水的量各提高至25％]
然后，加入剩余的酸(柠檬酸和苹果酸)，随后加入HPLC45，得到原液，其pH为6.2至7.2，并包含6.75％(原液的w/w)的生物类黄酮。
实施例2A：喷口药水
配料百分比甘油10.000乙醇15.000木糖醇2.000聚山梨醇酯201.500原液，pH调至6.441.000调味剂0.200糖精钠0.080氯化十六烷基吡啶0.050磷酸氢二钠·12H₂O0.075透明质酸钠0.005水补足至.100％
A.实验室样品：一种基于本发明的喷口药水，使用上述配料按如下方法制备：在容器(A)中，边搅拌边将透明质酸钠分散在水中，得到没有结块的溶液。添加糖精钠、氯化十六烷基吡啶、磷酸氢二钠、木糖醇和原液，搅拌至所有配料完全溶解。添加甘油，混合均匀。在另一容器(B)中，使聚山梨醇酯20、调味剂和乙醇混合。混合至调味剂完全分散。将容器(B)的内容物加至容器(A)，搅拌得到均质液体。
B.替代(生产)方法：一种基于本发明的喷口药水，使用上述配料按如下方法制备：在容器(A)中，将透明质酸钠分散在甘油中。搅拌并加水得到没有结块的溶液。添加木糖醇、原液、糖精钠、氯化十六烷基吡啶和磷酸氢二钠，搅拌至所有配料完全溶解。在另一容器(B)中，使聚山梨醇酯20、调味剂和乙醇混合。混合至调味剂完全分散。将容器(B)的内容物加至容器(A)，搅拌得到均质液体。
实施例2B：喷口药水
  配料  百分比  甘油  10.000  乙醇  15.000  木糖醇  2.000  聚山梨醇酯20  1.500  原液，pH调节至6.44  1.000  调味剂  0.200  糖精钠  0.080  氯化十六烷基吡啶  0.050  磷酸氢二钠·12H₂O  0.075  透明质酸钠  (平均分子量1,500,000)  0.01  水  补足至100％
本发明的喷口药水可用上述配料以上面的方法制备。
实施例3：冲口药水
 配料  百分比 甘油  25.000 乙醇  0.000 木糖醇  2.000 聚山梨醇酯20  1.500 原液(pH＝6.23，在室温 下放置6个月后)  0.500
  调味剂  0.200  糖精钠  0.050  氟化钠  0.050  磷酸氢二钠·12H₂O  0.050  CI 18965(黄2G)  CI 42051(专利蓝V)  0.0009  0.0003  透明质酸钠  (平均分子量1,500,000)  0.01  水，补足至100％  70.53
A.实验室样品：一种基于本发明的冲口药水，可使用上述配料按如下方法制备：在混合容器(A)中，通过搅拌将透明质酸钠分散水，得到无结块的溶液。将加入糖精钠、氟化钠、磷酸氢二钠、色素、木糖醇和原液，并混合至所有配料完全溶解。加入甘油，并混合至均匀。在另一容器(B)中，使聚山梨醇酯20、调味剂混合。混合至调味剂完全分散。将容器(B)的内容物加至容器(A)，搅拌得到均质液体。
B.替代(生产)方法：一种基于本发明的冲口药水，可使用上述配料按如下方法制备：在混合容器(A)中，通过搅拌将透明质酸钠分散于水，得到无结块的溶液。加入保湿剂、原液、糖精钠，氟化钠、磷酸氢二钠和色素。混合至所有配料完全溶解。在另一容器(B)中，使聚山梨醇酯20、调味剂和乙醇混合。混合至调味剂完全分散。将容器(B)的内容物加至容器(A)，搅拌得到均质液体。
实施例4：牙膏
 配料  百分比 甘油  30.000 水合二氧化硅-研磨剂  12.000 水合二氧化硅-增稠剂  11.000 木糖醇  10.000 可可酰胺甜菜碱(30％)  3.000 黄原胶  1.000 原液(pH＝6.68，在常温  0.500
  下放置6个月后)  透明质酸钠  (平均分子量1,500,000) 0.1  调味剂 1.000  糖精钠 0.260  氟化钠 0.240  二氧化钛 0.500  水 补至100％
A.实验室样品：一种基于本发明的牙膏，可使用上述配料按如下所述制备：在容器A中，通过搅拌将透明质酸钠分散于水，得到无结块的溶液，并加入甘油。向其中加入糖精钠，氟化钠，原液和木糖醇，搅拌溶解。将容器(A)的内容物，转移至真空混合器(容器B)。将粉末(水合二氧化硅、黄原胶和二氧化钛)在容器C内进行预混合，然后加入到真空搅拌器(B)的液相中。在真空状态下混合均匀，以形成平滑的膏体。
实施例5：原液的制备
下述原液是按上述方法制备的：
生物类黄酮混合物          3.3％
苹果酸                    4.5％
柠檬酸                    4.5％
甘油                      7.5％
抗坏血酸                  1.5％
水                        78.6％
溶液的pH                  1.5～1.75
实施例6：原液的制备
下述原液是按上述方法制备的：
生物类黄酮混合物          3.3％
苹果酸                    4.5％
柠檬酸                    4.5％
胆碱抗坏血酸              6.0％
LFG61烷基糖苷    13.3％
丙二醇           7.5％
水               60.9％
溶液pH           1.5～1.75
判断本发明的组合物对一些与牙周病相关的厌氧菌和兼性细菌是否有抗菌活性的试验，按如下方法进行。
方法和材料
可采用的细菌包括：龋齿放线菌、粘性放线菌、牙龈卟啉单胞菌、中间普雷沃菌、颊普雷沃菌、牙普雷沃菌、格登链球菌和血链球菌，特别是ATCC菌株。所有厌氧菌均可在唐怀特利厌氧室(Don Whitely AnaerobicChamber)(可从UK，Don Whitely，Yorkshire得到)内，在严格厌氧培养基(Fastidious Anaerobic Broth(FAB))中，37℃下生长24小时。所述兼性细菌可在营养培养基中，在10％(v/v)二氧化碳的条件下，于37℃生长24小时。起始培养物为1mL约10⁶cfu/mL的过夜生长物。所述培养物添加浓度最低至1/10,000(0.001％)的本发明组合物。所述稀释液就是适当的培养液。其生长情况可采用分光光度法以在650nm下的吸光度增加值进行评价。
可用5％(v/v)血琼脂平板上的生长来评估牙膏和洗口药水组合物。可在琼脂中切出直径约0.5厘米的孔，并填充各组合物的稀释液；该稀释剂就是适当的培养液。所述平板可用约0.2毫升10⁶cfu/mL左右的培养液预先接种。未见生长抑制的孔浓度可视作最低抑菌浓度。
附加试验
试验了两种原液：实施例5和实施例6。使用血心浸液(Blood-HeartInfusion(BHI)或沙氏培养基(Sabouraud’s broth)作为稀释剂，每种配方都制备了一系列两倍稀释液，它们的pH分别为1.75和2.0，得到具有一组浓度范围(在8％～0.015625％v/v之间)的溶液。
获得一些细菌和假丝酵母的菌株(见表1)，并在适当的条件下培养48h。在培养液(细菌用BHI，假丝酵母用沙氏培养基)中制备各种微生物的悬浮液，以达到约等于麦氏标准3.0(MacFarland3.0)的浊度水平。
表1本研究使用的微生物菌种
  需氧细菌 厌氧细菌  酵母  格登链球菌  血链球菌 龋齿放线菌 粘性放线菌 难辨梭菌 (Clostridium difficile) 牙龈卟啉单胞菌 颊普雷沃菌 中间普雷沃菌  白假丝酵母  都柏林假丝酵母  (Candida dubliniensis)  光滑假丝酵母(Candida glabrata)  克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)  近平滑假丝酵母  (Candida parapsilosis)  热带假丝酵母
将100μL体积的各微生物悬浮液，加入到微量滴定板的孔中。再往每个孔添加同等体积的实施例5或实施例6的溶液(含有匹配的培养液)，以得到最终4％～0.0078125％(v/v)的原液浓度。还制备不含原液和/或微生物的孔，作为对照。每个微量滴定板都置于适当气氛下，37℃下，培养24小时。在培养之后，通过使用分光光度计在波长544纳米下吸光度读数，测定每个孔中的浊度，以估计各种微生物种的相对量。吸光度读数用不存在微生物的对照样进行背景扣除。
最小抑菌浓度(MIC)定义为与微生物是在无原液的情况下生长的对照样相比，导致微生物量显著下降(即下降＞50％)的的最低原液浓度。试验进行3次，在存在各种微生物情况下确定实施例5和实施例6的配方的最小抑菌浓度。
结果：
观察所得到的实施例5和实施例6两配方对13种微生物的MIC值归纳于表2。
所研究的每种微生物的生长，除光滑假丝酵母外，都受到实施例5和实施例6两配方的抑制。该酵母菌的生长根本不受实施例6的抑制，甚至在本研究使用的最高浓度8％(v/v)下也存在生长。
对实施例5和实施例6的两配方的MIC值进行比较表明，在抑制微生物生长方面，实施例5比实施例6更为有效。除了对牙龈卟啉单胞菌两种配方具有相同的MIC值1％之外，对每种微生物的MIC值，实施例5的都比实施例6的更低。此外，实施例5在浓度为1％(v/v)时，抑制每种微生物的生长，虽然生长的降低没有完全大于50％(在本研究设定的用于定义MIC的标准)。这就支持使用1％(v/v)的实施例5原液作为今后产品和研究中的首选工作浓度。
表2就实施例5和实施例6两配方，本研究所观察到的对每种微生物的MIC值

^*即使在本研究所用最高浓度的情况下，也没有明显的生长抑制。