珍珠贝外套膜组织的离体培养方法及培养基.pdf

本发明公开了一种珍珠贝外套膜组织的离体培养方法及其专用培养液，该培养基包括水解珍珠液、贝液、抗生素和海水，常规从珠母贝取材获得外套膜上皮组织，除去裙带部分，净化处理后切成约1mm3～2mm3大小的组织块，置于蛋白酶溶液中，消化后加入上述培养液中止消化。将经初步消化的组织块分别置于培养皿中或贴附于已涂抹贴壁物质的珠核上，通过该方法培养的珍珠贝外套膜组织生长状况良好，4h细胞从组织块中迁出，2d后有效地形成体外珍珠囊。该方法可以在插入珍珠核的珠贝中选取不同位置注入无核珍珠囊培养无核珍珠，成本低，成活率及成珠率高，对珠母贝损伤少。

1、  一种珍珠贝外套膜组织的离体培养方法，其特征在于：
(1)准备培养皿，采用陶瓷或玻璃容器作为培养皿，培养皿的底面用自制的从贝闭壳肌或外套膜组织提取的贴壁物质预先处理，该贴壁物质从贝闭壳肌或外套膜提取后干燥消毒，待用；
(2)体外珍珠囊的培养，常规取材获得珍珠贝外套膜上皮组织，除去裙带部分，净化处理后切成约1mm³～2mm³大小的组织块，置0.1-0.8％的蛋白酶溶液，过滤除菌，4℃储存备用，在摄氏20℃-25℃的温度下消化5～10min后加入培养液中止消化，将经初步消化的组织块分别置于35mm×10mm培养皿中，或贴附于已涂抹贴壁物质的珠核上，每个培养皿底部贴若干块组织块，摆放组织块后，向培养皿内加入少量的培养液，盖好瓶盖，置于20℃培养箱中进行培养，24h后补加一次培养基，隔天或视细胞生长状况换液；
(3)珍珠囊移植与珍珠的养殖，以弯头吸管将珍珠囊移植于育珠贝体内，或与珠核一同移植育珠贝体内，休养期过后将手术贝放置于温度范围为15-30℃海水中吊养9-12个月，能取得较高的成活率及成珠率，获得高质量的无核珍珠或有核珍珠。

2、  根据权利要求1所述的珍珠贝外套膜组织的离体培养方法，其特征在于：所述的采用的健康珠母贝是指珍珠养殖生产中主要的海产贝种。

3、  根据权利要求1所述的珍珠贝外套膜组织的离体培养方法，其特征在于：所述的提供外套膜上皮组织以及贝血清的珠母贝是同一种属的海产贝或者是不同种属的海产贝种。

4、  根据权利要求1所述的珍珠贝外套膜组织的离体培养方法，其特征在于：所述的注入育珠贝体内的体外珍珠囊注射到相同或不同品种的珠母贝。

5、  根据权利要求1所述的珍珠贝外套膜组织的离体培养方法，其特征在于：所述的蛋白酶溶液是木瓜蛋白酶、胰蛋白酶或菠萝蛋白酶的商品酶，蛋白酶溶液的制备是按比例秤取蛋白酶，溶解于重蒸馏水中配制成0.1-0.8％的蛋白酶溶液，混匀，过滤除菌，4℃备用。

6、  一种如权利要求1所述的珍珠贝外套膜组织的离体培养液，其特征在于：它包括天然海水、水解珍珠液、贝液和抗生素，其主要原料和质量份数如下：
水解珍珠液：0.1-0.5份；
贝液：      2-10份；
抗生素：    0.01-0.03份；
海水：      90-100份。

7、  根据权利要求6所述的珍珠贝外套膜组织的离体培养液，其特征在于：水解珍珠液是将洗净的珍珠母贝壳用醋酸浸泡，软化，经机械打磨，得到纯净的珍珠层片，经烘干、粉碎、磨细，用硫酸加热水解，碳酸钙或石灰乳中和，真空浓缩，活性炭脱色除杂，得到珍珠原液；或者是将珍珠质粉和pH 2.5～6的蜂蜜按0.1～5∶100混合后在5℃以上室温搅拌，或室温搅拌后再隔水逐段加温搅拌2～3小时，得到。

8、  根据权利要求6所述的珍珠贝外套膜组织的离体培养液，其特征在于：所述的抗生素是含青霉素类、链霉素类抗生素，选择青霉素-链霉素双抗溶液，或者是单一的青霉素、链霉素、氨苄青霉素或硫酸链霉素，青霉素浓度为100IU/ml，链霉素浓度为0.1g/L。

9、  根据权利要求6所述的珍珠贝外套膜组织的离体培养液，其特征在于：所述的贝液是贝组织液或贝血清，贝组织液是取珠贝体内的液体经过滤除菌得到，贝血清是从珍珠贝心脏或大血管中取血，经离心，取上清液即为珍珠贝血清。

珍珠贝外套膜组织的离体培养方法及培养基
技术领域
本发明涉及一种水生无脊椎动物的组织培养技术及应用领域，特别是珍珠贝外套膜组织的离体培养方法及培养基。
背景技术
珍珠是由珍珠贝体内的珍珠囊分泌珍珠质而形成的，珍珠囊是珍珠贝外套膜的上皮细胞受到刺激后增殖形成的，因此珍珠贝的外套膜在珍珠形成中起着重要的作用。现代人工珍珠培养方法是将供体珍珠贝外套膜组织块单独或与珠核一道植入受体珍珠贝体内形成无核珍珠或有核珍珠。在插植手术过程中，上皮细胞贴附于珠核的位置、紧密程度、组织块的面积、形状及取材的位置、植核位置、植核手术时对育珠贝的机械损伤程度都直接关系到珍珠囊的形成和上皮细胞的分泌状态，常引起各种疵珠的产生，如污珠、尾巴珠、素珠等。此外，外套膜植片法还会使育珠贝损伤严重，增加植核后育珠贝的死亡率和吐核率，从而严重地影响珍珠的质量和产量。由于外套膜植片法固有的缺陷，学者们根据珍珠形成的原理，利用组织培养技术及细胞培养技术、体外培育有核珍珠囊，再进行插囊育珠，试图建立一种新的珍珠培育方法。
对于珍珠贝外套膜的组织培养国内外已开展了不少工作，日本学者町井昭(Machii)从20世纪60年代末期就对日本产的马氏珠母贝外套膜组织培养进行了系统的研究，使培养的外套膜组织在体外存活30d左右并能分泌微型颗粒的珍珠质，我国四川大学的石安静等从80年代初期对我国的淡水珍珠蚌、三角帆蚌、褶纹冠蚌和背角无齿蚌的外套膜组织培养进行深入的研究，不但成功地建立组织培养技术和方法，而且对外套膜组织在体外培养中产生的分泌物(珍珠质)的性质进行了分析。学者们既往遇到的一个共同难题是，外套膜细胞培养难以形成细胞系，后续工作无法开展[喻达辉，苏天凤.生物技术在珍珠养殖业中的应用.水产科技，2000，(1)：13]。
本发明人认为，目前对珍珠贝类的生理、生化研究薄弱，尤其是对珍珠贝类的免疫机制尚不清楚，在实验室中直接培养出真正意义的珍珠是困难的，但采取组织培养或细胞培养的方法，帮助外套膜上皮细胞尽快与珠母贝建立血液循环关系，加速珍珠囊的形成；减少细胞、组织块及珠核植入过程对珠母贝造成的伤害，不但对提高海水有核珍珠的成珠率是有帮助的，而且，在海水无核珍珠(主要为药用)的生产中有特别重要的意义，也较容易在生产中得到推广。
广西海洋研究所王爱民等同志从20世纪90年代初对体外培养有核珍珠囊进行研究，研究得出一个共同的结果是：用外套膜细胞培养形成的体外珍珠囊用于插囊育珠无法得到珍珠，而将外套膜组织块培养形成的体外珍珠囊用于插囊育珠能够得到珍珠。说明，细胞培养悬液所形成的珍珠囊还不是完善的珍珠囊，而由外套膜组织培养形成的珍珠囊才具有完整的结构和功能。在体外培养珍珠囊最重要的是建立完整的珍珠囊结构。由于目前尚无法精确地分离外套膜组织中的各类细胞，特别是外上皮细胞、内上皮细胞和结缔组织细胞三类细胞，因此无法按比例在体外建立珍珠囊。其结果是虽然有不少细胞粘附在珠核上，但细胞之间无法建立应有的连接，故单纯的细胞培养法不能形成结构完整的体外珍珠囊。相反，用外套膜组织块贴附在珠核上进行培养，外套膜组织建立体外珍珠囊的过程同体内建立珍珠囊的过程基本上是一致的，外上皮细胞从外套膜组织块中迁出，沿着珠核的表面移动，逐渐包裹珠核表面，同时外套膜组织中的结缔组织细胞再包裹在外上皮细胞表面，最终形成结构较完整的珍珠囊，这种珍珠囊是真正意义上的珍珠囊。
但是用外套膜组织块形成的体外珍珠囊用于插囊育珠实验出现成珠率低、素珠多和育珠贝死亡率高的情况，这同插核技术无不相关，这是因为切口的大小及珠核通过切口运至预定核位的方式直接影响到体外珍珠囊的结构变化。若体外珍珠囊在珠核上贴附不牢固、切口过小，就会造成体外珍珠囊受到破坏，使它们在到达预定核位之前完全脱落，无法产生珍珠，只能是素珠，而保持完整结构珍珠囊的珠核最终产生珍珠。王爱民等虽然对插入工艺进行了改进，但插囊育珠技术应用于海水养殖，只是取得4.05％的成功率，要应用于生产，还有很多基础工作要做(王爱民，阎冰，苏琼，等.马氏珠母贝珍珠囊体外培养及插囊育珠.广西科学，2000，7(1)：70)。
发明内容
本发明的目的主要是针对以上技术的不足以及既往实验中反映出的问题，提供一种珍珠贝外套膜组织的离体培养方法及培养基。
本发明人本着与珠母贝生态接近的思路，紧紧抓住降低成本，易于操作，便于推广，提高产量及质量的生产技术环节，本发明人开展了一系列有益的工作。
从上述背景技术得知，由于珍珠的形成是通过珍珠囊来实现的，因此，国内外学者都比较关注珍珠囊的形成和珍珠囊的结构。在珍珠囊形成和结构的细节上，不同学者研究的结果虽然有差异，但他们普遍认为外套膜植片(组织)外上皮细胞经迁移和增殖能形成珍珠囊的上皮细胞，其结缔组织细胞和受体贝的结缔组织细胞共同围绕珍珠囊上皮细胞组成完整的珍珠囊，而外套膜植片的内上皮细胞则退化，不参加珍珠囊的形成。在体外培养珍珠囊时既要解决体外珍珠囊的细胞组成问题，又要解决细胞在珠核表面的粘附问题。为快速获得结构完整的体外珍珠囊，本发明技术选择了经短时间消化后的外套膜上皮组织培养；为了更好地解决细胞在珠核表面的粘附问题并且降低生产成本，本发明技术从植珠过程的弃料闭壳肌等软组织中提取高分子的贴壁物质，工艺简单价格低廉，成功解决了细胞的粘附问题。
本发明的方法主要包括贝外套膜组织的离体培养基(培养液)以及贝外套膜离体培养方法。
珠母贝类为低等无脊椎动物，市售的培养基是针对脊椎动物及昆虫细胞培养研发的，照搬通用的细胞培养方案运用于贝类外套膜上皮细胞培养，并不能获得理想的效果，且试剂价格昂贵，配剂繁杂，为此，我们对培养基进行了改进。
本发明的珍珠贝外套膜组织的离体培养基(培养液)包括天然海水、水解珍珠液、贝液和抗生素，其主要原料和质量份数如下：
水解珍珠液：0.1-0.5份；
贝液：2-10份；
抗生素0.01-0.03份；
海水90-100份。
以上所述的水解珍珠液是将洗净的珍珠母贝用醋酸浸泡，软化，经机械打磨，得到纯净的珍珠层片，经烘干、粉碎、磨细，用硫酸加热水解，碳酸钙或石灰乳中和，真空浓缩，活性炭脱色除杂，得到珍珠原液。
或者是将珍珠质粉和pH2.5～6的蜂蜜按0.1～5∶100混合后在5℃以上室温搅拌，或室温搅拌后再隔水逐段加温搅拌2～3小时，得到。
以上所述的抗生素是含青霉素类、链霉素类抗生素，可以是青霉素-链霉素双抗溶液，或者是单一的青霉素、链霉素、氨苄青霉素或硫酸链霉素。青霉素浓度为100IU/ml，链霉素浓度为0.1g/L。
以上所述的贝液是贝组织液或贝血清，贝组织液是取珠贝体内的液体经过滤除菌得到，贝血清是从珍珠贝心脏或大血管中取血，经离心，取上清液即为珍珠贝血清。其中的过滤除菌可以采用板框过滤器、微孔滤膜密闭过滤等形式。
以上所述的贝外套膜组织的离体培养基的pH值为6.8～7.2，如果偏离，可以用盐酸或氢氧化钠调整酸碱度。
本发明的珍珠贝外套膜组织的离体培养方法如下：
1、准备培养皿
本发明的培养皿可以使用陶瓷或玻璃容器，但是培养皿的底面用自制的从贝闭壳肌或外套膜组织提取的贴壁物质预先处理，该贴壁物质从贝闭壳肌或外套膜提取后干燥消毒，待用。
2、体外珍珠囊的培养
常规取材获得珍珠贝外套膜上皮组织，除去裙带部分，净化处理后切成约1mm³～2mm³大小的组织块，置0.1-0.8％的蛋白酶溶液(过滤除菌，4℃储存备用)中，在摄氏20℃-25℃的温度下消化5～10min后加入自制的培养液中止消化。将经初步消化的组织块分别置于35mm×10mm培养皿中(或贴附于已涂抹贴壁物质的珠核上)，每个培养皿底部贴15-25块组织块(如采用不同大小规格的培养皿，贴附的组织块数目应参照此密度作调整)，摆放组织块后，向培养皿内加入少量的培养液，以能保持组织块湿润即可。盖好瓶盖，置于20℃培养箱中或摄氏20℃-28℃的无菌环境中进行培养。24h后补加一次培养基。隔天或视细胞生长状况换液。通过该方法培养的珍珠贝外套膜组织4h后上皮细胞从组织中迁出并迅速增多，生长状况良好，2天后有效地形成体外珍珠囊。
所述的蛋白酶溶液是木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶等商品酶。
所述的蛋白酶溶液的制备是按比例秤取蛋白酶，溶解于重蒸馏水中配制成0.1-0.8％的蛋白酶溶液，混匀，过滤除菌，4℃备用，其中的过滤除菌可以采用板框过滤器、微孔滤膜密闭过滤等形式。
3、珍珠囊移植与珍珠的养殖
以弯头吸管将珍珠囊移植于育珠贝体内，或与珠核一同移植育珠贝体内，休养期过后将手术贝放置于温度范围为15-30℃海水中吊养9-12个月，能取得较高的成活率及成珠率，获得高质量的无核珍珠或有核珍珠。
以上所述的采用的健康珠母贝是指珍珠养殖生产中主要的海产贝种，包括：马氏珠母贝、解氏珠母贝、白蝶珠母贝、黑氏珠母贝、企鹅珍珠贝。
以上所述的提供外套膜上皮组织以及贝血清的珠母贝是同一种属的海产贝，或者是不同种属的，只要是贝类血清就可以了。如果以上述取外套膜上皮组织的珍珠贝取贝血清，可以大大降低成本。
以上所述的注入育珠贝体内的体外珍珠囊可以注射到不同品种的珠母贝。
本发明的有益效果在于：
1、被移植到育珠贝体内的是在体外培育形成的珍珠囊，而不是珠母贝外套膜组织块，更区别于传统的用器械直接挟持珠核插入的方法，植入的珍珠囊比组织块更宜于在珠母贝体内生长。
2、成活率及成珠率高：组织块经过初步消化，迁出迅速，移植到育珠贝体内的是细胞结构完整的珍珠囊，易于与育珠贝建立血液循环关系，且采用弯头吸管注入的方法，对育珠贝基本没有造成损伤，也没有对珍珠囊的损伤，故应用本发明的技术珠贝成活率及成珠率高。既往报道用外套膜上皮组织培养的珍珠囊插囊育珠成珠率只是4.05％，据我们观察海水插片育无核珠的成珠率只有25％左右，有核海水珍珠优质珠在30％左右，而用本发明技术成珠率及优质珠在50％以上，休养期及育珠期珠贝成活率提高10％以上。
3、成本低：供给外套膜上皮、贝组织液、贝血清及贝闭壳肌的可以使用同一贝体，节约了贝资源；另外，由于对珠母贝损伤少，可以在插入有核珍珠囊的珠贝中选取不同位置注入无核珍珠囊培养无核珍珠，既可以收获观赏珠又可以收获药用珠，增加珠农的收入。
4、操作简单，减少污染机会，降低污珠率：国内养殖场普遍条件较差，手术过程很难做到无菌操作，弯头吸管注入法比插入法操作方便，珍珠囊粘附好，操作人员易掌握，对珠贝损伤少，减少了感染机会，降低了污珠率。
5、社会效益及经济效益显著：天然珍珠及优质珍珠的价格历来比黄金贵，本发明为提高珍珠的产量及质量提供了技术支撑，对于弘扬南珠文化，提高中国南珠的国际地位，增加珠农收入，带动和支持地方经济建设具有重要的意义。
具体实施方式
下面结合实例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。
一、专用培养基的配制
实施例1
取100ml煮沸的天然海水，加入贝组织液或贝血清2-10ml，(贝组织液是用马氏珠母贝体内的液体经过滤除菌得到，贝血清是从珍珠贝心脏或大血管中取血，经离心，取上清液得到珍珠贝血清)，加入0.1-5％水解珍珠液10ml，并加入100IU/ml青霉素1ml，0.1g/L链霉素1ml，调pH值至6.8-7.2。水解珍珠液的配制是将珍珠质粉和pH2.5～6的蜂蜜按0.1～5∶100混合后在5℃以上室温搅拌，或室温搅拌后再隔水逐段加温搅拌2～3小时，得到。
实施例2
取100ml煮沸的天然海水，加入贝组织液或贝血清2-10ml，(贝组织液是用马氏珠母贝体内的液体经过滤除菌得到，贝血清是从珍珠贝心脏或大血管中取血，经离心，取上清液得到珍珠贝血清)，加入0.1-5％水解珍珠液10ml，并加入100IU/ml氨苄青霉素2ml，或0.1g/L硫酸链霉素2ml，调pH值至6.8-7.2。水解珍珠液的配制是将洗净的珍珠母贝用醋酸浸泡，软化，经机械打磨，得到纯净的珍珠层片，经烘干、粉碎、磨细，用硫酸加热水解，碳酸钙或石灰乳中和，真空浓缩，活性炭脱色除杂，得到珍珠原液。
二、珍珠贝外套膜组织的离体培养方法：
实施例1
(1)按比例秤取胰蛋白酶，溶解于三蒸水中配制成0.1-0.5％的胰蛋白酶溶液，混匀，过滤除菌，4℃备用；按常规方法取出1-2龄的健康马氏珠母贝外套膜上皮组织，除去裙带部分，净化处理后切成约1mm³～2mm³大小的组织块，置胰蛋白酶溶液中作初步消化，温度为摄氏20℃-25℃，时间是5～10min。加入下述培养液中止消化。
(2)专用培养基配制：可快速从从上述提供外套膜上皮组织的马氏珠母贝体中提取贝组织液，贝血清(从珍珠贝心脏或大血管中取血，离心取上清液即为珍珠贝血清)；微孔滤膜密闭过滤，也可以事先从同种马氏珠母贝制备贝血清于-20℃保存(也可以用不同种的贝血清)。使用前置入4℃融化，尽快使用，使用之前无需水浴灭活处理；配制珍珠水解液，过滤灭菌后使用。
(3)将经初步消化的组织块分别置于35mm×10mm培养皿中(或贴附于已涂抹贴壁物质的珠核上)，培养瓶的底面(或珠核)用自制的从贝闭壳肌等软组织提取的贴壁物质预先处理。每个培养皿底部贴15-25块组织块(如采用不同大小规格的培养皿，贴附的组织块数目应参照此密度作调整)，摆放组织块后，向培养皿内加入少量的培养液，以能保持组织块湿润即可。盖好瓶盖，置于摄氏20℃无菌培养箱中(或摄氏20℃-25℃的无菌环境中)进行培养。24h后补加一次培养基。隔天或视细胞生长状况换液。通过该方法培养的珍珠贝外套膜组织4h后上皮细胞从组织中迁出并迅速增多，生长状况良好，2天后有效地形成体外珍珠囊。
(4)以玻璃弯头吸管将珍珠囊移植于育珠贝体内，或与珠核一同移植育珠贝体内，休养期过后将手术贝放置于温度范围为15-30℃海水中吊养9-12个月，能取得较高的成活率及成珠率，获得高质量的无核珍珠或有核珍珠。
实施例2
(1)秤取0.15g的菠萝蛋白酶溶解于50ml的三蒸水中配制成0.3％的菠萝蛋白酶溶液，混匀，过滤除菌，4℃备用；按常规方法取出1-2龄的健康白蝶珠母贝外套膜上皮组织，除去裙带部分，净化处理后切成约1mm³～2mm³大小的组织块，置菠萝蛋白酶溶液中作初步消化，温度为摄氏20℃-25℃，时间是5～10min。加入下述培养液中止消化。
(2)专用培养基配制：可快速从上述提供外套膜上皮组织的白蝶珠母贝体中提取贝组织液(滤过除菌)及贝血清(从珍珠贝心脏或大血管中取血，离心取上清液即为珍珠贝血清)；也可以事先从同种白蝶珠母贝制备贝血清于-20保存，或者不同种的贝血清。使用前置入4℃融化，尽快使用，使用之前无需水浴灭活处理；配制珍珠水解液，过滤灭菌后使用。
(3)将经初步消化的组织块分别置于35mm×10mm培养皿中(或贴附于已涂抹贴壁物质的珠核上)，培养瓶的底面(或珠核)用自制的从贝闭壳肌等软组织提取的贴壁物质预先处理。每个培养皿底部贴15-25块组织块(如采用不同大小规格的培养皿，贴附的组织块数目应参照此密度作调整)，摆放组织块后，向培养皿内加入少量的培养液，以能保持组织块湿润即可。盖好瓶盖，置于摄氏20℃无菌培养箱中(或摄氏20℃-25℃的无菌环境中)进行培养。24h后补加一次培养基。隔天或视细胞生长状况换液。通过该方法培养的珍珠贝外套膜组织4h后上皮细胞从组织中迁出并迅速增多，生长状况良好，2天后有效地形成体外珍珠囊。
(4)以玻璃弯头吸管将珍珠囊移植于育珠贝体内，或与珠核一同移植育珠贝体内，休养期过后将手术贝放置于温度范围为15-30℃海水中吊养9-12个月，能取得较高的成活率及成珠率，获得高质量的无核珍珠或有核珍珠