黑色素生成抑制组合物 【技术领域】
本发明涉及具有抑制由于光照射等导致的发病的皮肤变黑的作用的黑色素生成抑制组合物，更详细的是，涉及以醋酸菌的细胞内容物作为有效成分的黑色素生成抑制组合物以及使用这种组合物的美白方法。
背景技术
一直以来已知的是，为了防止由于紫外线等导致的皮肤变黑(晒黑)，防止斑点·雀斑的皮肤色素沉积，以及促进皮肤美白和美肤效果等，抑制皮肤表皮中黑色素的生成十分重要。
黑色素的生成是由于色素细胞的活性化而显著促进了黑色素产生能力而产生的，其机制并不完全清楚，但据推测这是通过酪氨酸酶的作用由酪氨酸变成二羟基苯丙氨酸(DOPA)，再由二羟基苯丙氨酸变成DOPA苯醌后，经过各种中间体产生的。
其结果是提出了很多用于抑制黑色素生成的化妆品，例如，以往广泛使用了混合了过氧化氢，过氧化钠，过硼酸锌，过硼酸镁和过硼酸钠等过氧化物的化妆品。
但是，这些过氧化物在保持性，物理或化学稳定性等方面存在问题。
近年来，开发了混合有半胱氨酸，羟基醌，曲酸，抗坏血酸(维生素C)等天然物质的化妆品。
但是，实际状况是，它们无论如何，都难以具有能够充分满足的保存性，稳定性和美白效果。
而且，上述天然物质中的曲酸是通过醋酸杆菌属(Acetobacter)和葡糖杆菌属(Gluconobacter)等醋酸菌产生的物质，尽管有人提出了混合有曲酸生产性的醋酸菌的培养液(除去了醋酸菌)的具有美白效果和防止晒黑效果的美白化妆品(例如，参照专利文献1)，但需要开发出安全性更高，效果更强的黑色素生成抑制组合物。
专利文献1：特开昭53-6432号公报
【发明内容】
发明要解决的课题
本发明的目的在于提供：内用(经口摄取、注射等)和/或外用(皮肤涂布，贴布等)时安全性高且效果更强的黑色素生成抑制组合物，而且还在于提供使用这种黑色素生成抑制组合物的防止晒黑的方法。
用于解决课题的方法
鉴于上述课题，本发明人着眼于一直作为酿造制醋菌等使用的认识到高安全性的醋酸菌。此外，已知醋酸菌自古以来就与人们的饮食生活深深相关，在食醋制造之外，例如欧洲的传统食品：里海酸奶(caspian sea yogurt)中也含醋酸菌，也有长期的食用历史。
而且，由于醋酸菌在食醋发酵工序中的发酵终止后，经过过滤，再被废弃，因此可以便宜地获得。
本发明人从在这种醋酸菌的细胞内容物中看到了强黑色素生成抑制作用，确认具有防止晒黑效果，从而完成本发明。
也就是说，权利要求1中涉及的本发明提供黑色素生成抑制组合物，其特征在于含有醋酸菌的细胞内容物作为有效成分。
而且，权利要求2中涉及的本发明提供权利要求1所述的黑色素生成抑制组合物，其被制备成适于内用。
此外，权利要求3中涉及的本发明提供权利要求1所述的黑色素生成抑制组合物，其被制备成适于外用。
此外，权利要求4中涉及的本发明提供美白方法，其特征在于内用和/或外用权利要求1-3任一项所述的黑色素生成抑制组合物。
而且，本发明和以往所知具有美白效果的醋酸菌在培养液中产生的曲酸不同，是以醋酸菌的细胞内容物作为有效成分。
发明的效果
本发明的醋酸菌的细胞内容物通过内用和/或外用能够发挥强黑色素生成抑制作用，因此通过本发明能够提供安全性高、效果强的黑色素生成抑制组合物以及美白方法。
【附图说明】
图1：是改良型布罗诺(Bronaugh)扩散腔的模式图。
【具体实施方式】
作为本发明中使用的醋酸菌，没有特别限制，例如，可以例举属于葡糖酸醋杆菌属(Gluconacetobacter)，葡糖杆菌属(Gluconobacter)，醋杆菌属(Acetobacter)，Asaia属或Acidomonas属等地醋酸菌。
更详细的是，首先，作为葡糖酸醋杆菌属(Gluconacetobacter)的醋酸菌，可以例举汉氏葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacterhansenii)，重氮营养葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacterdiazotrophicus)，Gluconacetobacter intermedius，Gluconacetobacter sacchari，木糖葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)，欧洲葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter europaeus)，服从葡萄酸醋杆菌(Gluconacetobacter oboediens)等。
接着，作为葡糖酸醋杆菌属(Gluconacetobacter)的醋酸菌，可以例举弗氏葡萄杆菌(Gluconacetobacter frateurii)，蜡状葡糖杆菌(Gluconacetobacter cerinus)等。
此外，作为醋杆菌属(Acetobacter)的醋酸菌，可以例举Acetobacter tropicalis，Acetobacter indonesiensis，Acetobactersyzygii，Acetobacter cibinongensis，Acetobacter orientalis，巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)，Acetobacterorleanensis，Acetobacter lovaniensis，醋化醋杆菌(Acetobacteraceti)，果实醋杆菌(Acetobacter pomorum)，Acetobacter malorum等。
此外，作为Asaia属的醋酸菌，可以例举Asaia bogorensis，Asaiasiamensis等。
而且，作为Acidomonas属的醋酸菌，可以例举Acidomonasmethanolica等。
此外，作为醋酸菌，除上述外，还可以适当使用可以在食醋制造或酸奶等发酵食品中使用的醋酸菌，从自然界分离的并且已经在微生物保藏机构中保藏的可以发放的保藏菌株等。
而且，由于醋酸菌可以在醋酸发酵中使用而且在椰果(Natadecoco)，里海酸奶，红茶菌等中有食用历史，因此认为其安全性高，尤其是，由于在食醋发酵工序中在发酵后通过过滤而被分离，再被废弃，因此还可以大量便宜地获得。
权利要求1中涉及的本发明中，使用从上述醋酸菌中取出的细胞内容物构成黑色素生成抑制组合物，细胞内容物的制备，可以使用例如通过对清洗的醋酸菌进行破碎处理使细胞内容物漏出，以悬浮状态含有破碎细胞片的悬浮液(以下有时也称为悬浮液)等，而且，也可以使用通过用离心分离机等使该悬浮液离心分离，除去细胞残渣获得的上清液(以下有时也称为上清液)。
而且，还可以有效利用对这些悬浮液和上清液进行浓缩，使之干燥后的物质。
醋酸菌的破碎处理可以按照常规方法，例如在将醋酸菌悬浮于蒸馏水，磷酸缓冲液，柠檬酸缓冲液等各种缓冲液等后，用超声波式破碎机，法式冲床(French press)等高压式破碎机来实施。
而且，在上述悬浮液和上清液的制备中，除了水和各种缓冲液之外，还可以联合使用丙酮，乙醇，甲醇，丙醇，异丙醇，丁醇等各种亲水性有机溶剂。
而且，权利要求1涉及的本发明中的黑色素生成抑制效果，可以通过下述试验法进行确认。
也就是说，可以利用对从人取出的皮肤切片进行UVA照射使黑色素沉淀的试验系统。该试验系统在设想为内用时，可以通过对从人取出的皮肤切片正下方添加评价物质来验证效果。此外，在设想为外用时，可以通过对从人取出的皮肤切片表面添加评价物质来验证效果。
使用醋酸菌的细胞内容物的黑色素生成抑制组合物可以按照常规方法，例如如前所述将醋酸菌悬浮于蒸馏水等中后，通过离心分离经超声波破碎处理的悬浮液，制备出除去细胞残渣的上清液。而且，还可以根据需要对该上清液进行浓缩。
这些上清液和浓缩物可以直接作为黑色素生成抑制组合物来使用，而且还可以通过液相色谱法或逆流分布法等分离纯化黑色素生成抑制物质，并且收集这些物质，将其作为黑色素生成抑制物质使用。
权利要求1涉及的本发明的黑色素生成抑制组合物的形态，可以作为溶解于水、醇、含水醇等中的溶液的形态，以及通过对其进行干燥获得的粉末的形态，或者通过将其成形获得的片剂的形态等来使用。
权利要求2涉及的本发明是被制备成适于内用的权利要求1记载的黑色素生成抑制组合物。
内用时，可以是美容辅助食品，食品，药品等(口服剂，注射剂等)等，其形态没有特别限制。
例如，作为内用时的食品形态，具体可以例举混合于以西红柿，胡萝卜等作为原料的蔬菜汁，苹果，菠萝，葡萄柚，橙子，桃等为原料的果汁，或者蔬菜汁和果汁的混合品，醇饮料，牛奶，酸奶等乳制品，运动饮料，咖啡，红茶，绿茶，乌龙茶等茶制品，或者黑醋，谷物醋，米醋，玄米醋，黑醋，醇醋，苹果醋和葡萄醋等以水果作为原料的水果醋，含有蔬菜作为原料的蔬菜醋等的食醋制品，糖果，口香糖，果冻，冰淇淋，小甜饼等点心类；主食面包，米饭，面等主食等中。
权利要求3中涉及的本发明是被制备成适于外用的权利要求1中记载的黑色素生成抑制组合物。
外用时，其形态可以是贴布剂，涂布剂等，其形态没有特别限定。
例如，作为外用时的涂布剂的形态，具体可以例举混合在分别混合了丙三醇，纤维素等赋形剂，羟甲基纤维素，阿拉伯树胶等增稠剂以及聚环氧乙烷，山梨聚糖脂肪酸酯等表面活性剂的化妆水，化妆乳剂，乳液，美容涂敷剂(pack)等基础化妆品，粉底等彩妆化妆品，洗发液，护发素，沐浴液等化妆用品，入浴剂(bath agent)等中。
通过以上述形态联合使用本发明的黑色素生成抑制组合物，含有其它天然物来源的功能成分，可以预期累加效应乃至协同效应。
作为本发明的黑色素生成抑制组合物的醋酸菌的细胞内容物的给药量，根据该细胞内容物中活性成分的浓度等而不同，一般在内用时，成人每天为0.001mg～100g，优选在0.1mg～10g。
在外用时，每100cm2皮肤为0.001mg～100g，优选在0.01mg～10g。
在内用和外用同时给药时，内用为成人每天0.001mg～100g，并且，外用为每100cm2皮肤为0.001mg～100g，优选内用为成人每天0.01mg～10g，并且，外用为每100cm2皮肤为0.01mg-10g。
权利要求4涉及的本发明为美白方法，其特征在于内用和/或外用权利要求1-3任一项记载的黑色素生成抑制组合物。
当防止晒黑进行美白时，能够内用或者外用权利要求1-3任一项记载的黑色素生成抑制组合物，还能够两种方式一起使用。
在内用或者外用时，醋酸菌的细胞内容物的给药量等如上所述。
权利要求4涉及的本发明中，能够通过内用或者外用权利要求1-3任一项记载的黑色素生成抑制组合物，可以防止晒黑。
实施例
接下来，通过实施例更详细地说明本发明，本发明的范围不受这些实施例的任何限制。
实施例1(悬浮液以及上清液的大量制备)
作为醋酸菌株，使用木糖葡糖酸醋杆菌NBRC15237(Gluconacetobacter xylinus NBRC15237)株。该菌株保藏于独立行政法人制品评价技术基础机构生物技术本部生物遗传资源部门(千叶县木更津市上总镰足2-5-8)，是可以发放的醋酸菌。
用高速离心机(8000rpm，20分钟)对使用该醋酸菌的醋酸发酵中的10千升醋酸发酵液收集菌体，获得了10kg湿菌体。将获得的10kg湿菌体悬浮于35升水中，用法式冲床压力式细胞破碎机，在10000psi的破碎压力破碎后，制成悬浮液。
然后，用高速离心机(8000rpm，20分钟)除去获得的40kg悬浮液的细胞残渣，获得30kg上清液。
实施例2(设想内用时的黑色素生成抑制效果)
为了验证作为内用剂的效果，按照下述(1)-(4)的顺序，评价实施例1中制备的悬浮液或上清液的黑色素生成抑制效果。
(1)将从人取出的皮肤切片(informed consent完成)装入改良型布罗诺扩散腔(概略示于图1)。在皮下侧的培养液中按预定浓度添加实施例1中制备的悬浮液或上清液。
(2)添加悬浮液或上清液后，3小时后，按20J/cm2的强度对皮肤切片照射紫外线A波(UV-A)40秒。而且，将硅酸玻璃夹在灯与试样之间。
(3)对皮肤切片进行器官培养。而且，培养基采用DMEMab培养基(+)10％FBS(胎儿牛血球)。
(4)24小时后，通过对黑色素进行DOPA染色，根据柱状图分析评价黑色素生成程度(n＝2～3)。此外，黑色素浓度用DOPA染色度pixel/皮肤基底层距离mm表示。
以上结果示于表1和表2。
其结果是，在设定内容的试验系中，可以在悬浮液和上清液中确认存在抑制黑色素生成的作用。
表1
表2
实施例3(设想为外用时的黑色素生成抑制效果)
为了验证作为外用剂的效果，按照下述(1)-(4)的顺序，评价实施例1中制备的悬浮液或上清液的黑色素生成抑制效果。
(1)将从人取出的皮肤切片(informed consent完成)装入改良型布罗诺扩散腔(概略示于图1)。按预定浓度将实施例1中制备的悬浮液或上清液溶解于水中再添加到皮肤表面上。
(2)添加悬浮液或上清液后，3小时后，按20J/cm2的强度对皮肤切片照射紫外线A波(UV-A)40秒。而且，将硅酸玻璃夹在灯与试样之间。
(3)对皮肤切片进行器官培养。而且，培养基采用DMEMab培养基(+)10％FBS(胎儿牛血球)。
(4)24小时后，通过对黑色素进行DOPA染色，根据柱状图分析评价黑色素生成程度(n＝2～3)。此外，黑色素浓度用DOPA染色度pixel/皮肤基底层距离mm表示。
以上结果示于表3和表4。
其结果是，不仅在内用而且在外用给药时，可以在悬浮液和上清液中确认存在抑制黑色素生成的作用。
表3
表4
实施例4(设想内用/外用联合施用时黑色素生成抑制效果试验)
为了验证作为内用剂和外用剂联合使用的效果，按照下述(1)～(4)的顺序，评价实施例1中制备的悬浮液和上清液的黑色素生成抑制效果。
(1)将从人取出的皮肤切片(informed consent完成)装入改良型布罗诺扩散腔(概略示于图1)。在皮下侧(内用)的培养液中按预定浓度添加实施例1中制备的悬浮液或上清液。此外，将实施例1制备的悬浮液按照预定浓度溶解于水中，再添加到皮肤侧(外用)。并且，作为联合施用，按预定浓度在皮下侧(内用)的培养液中添加实施例1制备的上清液，将实施例1制备的悬浮液按照预定浓度溶解于水中，再添加到皮肤侧(外用)
(2)分别添加悬浮液和上清液后，3小时后，按20J/cm2的强度对皮肤切片照射紫外线A波(UV-A)40秒。而且，将硅酸玻璃夹在灯与试样之间。
(3)对皮肤切片进行器官培养。而且，培养基采用DMEMab培养基(+)10％FBS(胎儿牛血球)。
(4)24小时后，通过对黑色素进行DOPA染色，根据柱状图分析评价黑色素生成程度(n＝2～3)。此外，黑色素浓度用DOPA染色度pixel/皮肤基底层距离mm表示。
以上结果示于表5。
根据表5的结果，悬浮液或上清液的单独施用中确认存在抑制黑色素生成的作用，与此同时通过联合施用获得了更为显著的黑色素生成抑制效果。
表5
实施例5(片剂的制造)
用高速离心机(8000rpm，20分钟)对10千升的醋酸发酵液收集菌体，获得10kg的湿菌体。将10kg湿菌体悬浮于35千升水中，用法式冲床压力式细胞破碎机，用10000psi的破碎压力破碎，破碎形成的物质形成醋酸菌的悬浮液。然后，用高速离心机(8000rpm，20分钟)除去获得的醋酸菌的40kg悬浮液的细胞尘(cell debris)，获得30kg上清液。用大型冷冻干燥机对获得的30kg上清液进行冷冻减压干燥，获得了约50g的干燥菌体。加入获得的干燥物1g(0.7重量％)，结晶纤维素35g(26.9重量％)，干燥玉米淀粉67g(51.5重量％)，乳糖22g(16.9重量％)，硬脂酸钙2g(1.5重量％)和作为结合剂的聚乙烯吡咯烷酮3g(2.3重量％)，混合粉末化后，填充于硬明胶胶囊中。
可以期待上述制备的片剂作为黑色素抑制组合物可以有效经口摄取。
实施例6(果冻的制造)
用高速离心机器(8000rpm，20分钟)对醋酸发酵液10千升的收集菌体，获得了湿菌体10kg。使获得的湿菌体10kg分散于等量的蒸馏水。在通过使分散的20kg的醋酸菌分散液3次通过高压均化器(20000psi)实施细胞破坏处理获得悬浮液后，用大型冷冻干燥机冷冻减压干燥，获得了1.5kg的干燥菌体粉末。
均匀混合获得的干燥菌体粉末8g(0.8重量％)，砂糖250g(25重量％)，角叉菜胶1.6g(0.16重量％)，刺槐豆胶0.8g(0.08重量％)，黄原胶0.8g(0.08重量％)，获得粉状混合物。用锅计量300g的水，溶解黑砂糖30g(3.0重量％)，再混合还原糖浆150g(15重量％)，加入先前获得的粉状混合物，一边搅拌使其不成块状，再混合。将它们搅拌均匀，加入余下的水258.8g，加温。溶液温度在85℃加热10分钟溶解后，用流水冷却，获得了果冻食品。
上述制备的果冻可以作为黑色素生成抑制组合物，期待可有效经口摄取。
实施例7(饮料的制造)
用高速离心机器(8000rpm，20分钟)对10千升醋酸发酵液收集菌体，获得了湿菌体10kg。使获得的湿菌体10kg分散于100L食醋中。使分散的醋酸菌分散液3次通过高压均化器(20000psi)，实施细胞破坏处理。将该溶液分注于容积为500ml的瓶中，通过加温至75℃进行杀菌，获得了食醋饮料。
上述制备的饮料可以作为黑色素生成抑制组合物，期待可有效经口摄取。
实施例8(化妆水的制造)
用高速离心机器(8000rpm，20分钟)对醋酸发酵液10千升的收集菌体，获得了湿菌体10kg。使获得的湿菌体10kg悬浮于35升水中，用法式冲床压力式细胞破碎机，用10000psi的破碎压力破碎，破碎形成的物质形成醋酸菌的悬浮液。然后，用高速离心机(8000rpm，20分钟)除去获得的醋酸菌的40kg悬浮液的细胞尘，获得30kg上清液。混合获得的1g上清液(2.0重量％)，丙三醇1.5g(3.0重量％)，1.3丁二醇2.5g(5.0重量％)，榅桲(PYRUS CYDONIA)籽提取物4.0g(8.0重量％)，纯化水37.75g(75.5重量％)，再混合聚氧化乙烯山梨聚糖月桂酸酯0.6g(1.2重量％)，乙醇2.5g(5.0重量％)，对氧基苯甲酸甲酯0.1g(0.2重量％)，香料0.05g(0.1重量％)，混合溶液，制成化妆水。
可以期待上述制备的化妆水作为黑色素抑制组合物可以有效涂布。
实施例9(化妆乳剂的制造)
用高速离心机器(8000rpm，20分钟)对醋酸发酵液10千升的收集菌体，获得了湿菌体10kg。使获得的湿菌体10kg分散于等量的蒸馏水。在通过使分散的20kg的醋酸菌分散液3次通过高压均化器(20000psi)实施细胞破坏处理获得悬浮液后，用大型冷冻干燥机冷冻减压干燥，获得了1.5kg的干燥菌体粉末。
在75度加温混合获得的干燥物10g(10.0重量％)，黄原胶0.1g(0.1重量％)，甘油1.0g(1.0重量％)，1，3丁二醇5.0g(5.0重量％)，对氧基苯甲酸甲酯0.2g(0.2重量％)，纯化水55.0g(55.0重量％)，再对在75度加温溶解了荷荷巴油3.0g(3.0重量％)，角鲨烯2.0g(2.0重量％)，甲基聚硅氧烷0.5g(0.5重量％)，硬脂醇0.5g(0.5重量％)，三己酸甘油酯12.5g(12.5重量％)，单硬脂酸甘油酯0.5g(0.5重量％)，单硬脂酸二甘油酯1.5g(1.5重量％)，单硬脂酸十甘油酯3.0g(3.0重量％)，对氧基苯甲酸丙酯0.1g(0.1重量％)的溶液进行混合乳化，搅拌的同时冷却到50℃，添加0.1g(0.1重量％)各种香料，制成化妆乳剂。上述制备的化妆乳剂作为黑色素生成抑制组合物能够期待可以有效涂布。
产业上利用的可能性
本发明的醋酸菌的细胞内容物，通过内用和/或外用可以发挥强的黑色素生成抑制作用，因此通过本发明能够提供安全性高且效果强的黑色素生成抑制组合物以及美白方法。
因此，本发明能够广泛应用于食品领域，美容领域，化妆品领域等。