人表皮生长因子核酸序列及其应用 技术领域
本发明涉及基因工程和多肽类药物生产领域，具体涉及一种人工合成的用于大肠杆菌和家蚕高效表达的人表皮生长因子核酸序列，以及其表达载体和在制备人表皮生长因子中的应用。
背景技术
随着人表皮生长因子(Human epidermal growth factor，hEGF)和尿抑胃素(Urogastrone)的分离，发现这两种物质具有相似的氨基酸组成和生物学活性。后来的研究进一步证实hEGF和尿抑胃素是同一种物质。hEGF是分子量为6000Da左右的小分子蛋白，有多种药理作用。具有53个氨基酸，是重要的生长因子之一，也是最早发现并试用于临床的生长因子之一。临床试用结果表明，hEGF可促使外胚层细胞和毛细血管生长，促进烧伤、创伤及外科伤口的愈合，加速移植表皮和移植角膜的生长，因此，对创烧伤救治、皮肤和角膜移植、外伤性皮肤溃疡、胃溃疡等治疗有重要实用价值，亦可用于促进外科手术伤口的愈合。另外，人随着年龄增加表皮细胞活性降低，逐渐引起皮肤的老化，而hEGF可刺激表皮细胞生长，起到抗衰老作用，因而现在也被广泛用于化妆品中。
人表皮生长因子(hEGF)基因公布在GenBank中的序列号为X04571，人表皮生长因子活性肽对应的核酸位置为3347-3505，多肽链的相对位置在AA949-1001。
国内外已有数个单位在大肠杆菌(E.coli)中成功表达了人表皮生长因子，其采用的核苷酸序列人表皮生长因子(hEGF)基因，但其在大肠杆菌中表达量较低，同时获得的基本上是注射用药。
家蚕-杆状病毒表达系统是真核表达系统，由于家蚕淋巴血本身的大量蛋白的保护作用，家蚕表达的蛋白可以生产口服药物。中国发明专利申请CN1405310A公开了一种用蚕表达人表皮生长因子生产药物的方法，其根据报道的人的EGF基因序列，用DNA合成仪化学合成人的EGF基因，克隆到转移载体中，并获得重组家蚕杆状病毒，将病毒接种至家蚕幼虫或蛹中，表达产生人表皮生长因子。
然而，蚕或大肠杆菌对基因密码的偏好与人体不同，上述方法均采用人地基因进行重组表达，虽然可以获得人表皮生长因子，但表达水平低，造成实际制备得率低，成本高。
家蚕-杆状病毒表达系统具有表达水平高，表达产物天然性好等优点。为了提高人表皮生长因子的表达水平，我们依据人表皮生长因子(hEGF)基因序列，参照家蚕密码子的偏爱性，并适当参照大肠杆菌优选密码子，设计并合成了人表皮生长因子基因(HCEGF)，通过在大肠杆菌和家蚕中的表达，结果证实我们所合成的序列在大肠杆菌和家蚕中均得到了高效的表达，突破了人表皮生长因子表达量低的瓶颈。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种新的人表皮生长因子核酸序列，通过对基因序列的改变，使得在制备时极大提高表达水平，同时又获得相同的人表皮生长因子蛋白质。
本发明的第二个目的是提供含有所述核酸序列的载体。
本发明的第三个目的是提供利用上述载体制备人表皮生长因子的过程。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种人表皮生长因子核酸序列，其具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。
该核苷酸序列共有162个核苷酸，由人工合成获得，其中，最后三个TAA为终止密码子。与公布的人的表皮生长因子核酸序列比较，有22％的碱基不同(除外加TAA终止密码子外)，其对比表如下，其中，HCEGF为本发明的核苷酸序列，HEGF为公布的人的表皮生长因子核酸序列。
HCEGF (1)AACAGCGACAGCGAATGCCCGTTGAGCCACGACGGCTACTGCTTGCACGACGGCGTGTGCATGTACATTG
HEGF (1)AATAGTGACTCTGAATGTCCCCTGTCCCACGATGGGTACTGCCTCCATGATGGTGTGTGCATGTATATTG
HCEGF (71)AAGCGTTGGACAAATACGCGTGCAACTGCGTGGTGGGCTACATTGGCGAACGCTGCCAATACCGCGACTT
HEGF (71)AAGCATTGGACAAGTATGCATGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGATGTCAGTACCGAGACCT
HCEGF(141)GAAATGGTGGGAATTGCGCTAA
HEGF (141)GAAGTGGTGGGAACTGCGC
而在最终的氨基酸水平，两者取得了完全一致的结果：
HCEGF NSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELR
HEGF NSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELR
本发明同时提供了包括SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的载体。
进一步，所述载体是包括SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的表达载体pET-28a。
以及，所述载体是包括SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的转移载体pBacPAK-His。
本发明同时公开了一种制备人表皮生长因子的方法，采用包括SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的转移载体pBacPAK-His构建重组杆状病毒，接种至家蚕幼虫或蛹中，获得人表皮生长因子。
本发明的制备人表皮生长因子的方法也可以是，采用包括SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的表达载体pET-28a，转化大肠杆菌，获得人表皮生长因子。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
家蚕-杆状病毒表达系统具有表达水平高，表达产物天然性好等优点。为了进一步提高人表皮生长因子的表达水平，我们依据人表皮生长因子基因(hEGF)序列，参照家蚕密码子偏爱性，并适当参照大肠杆菌优选密码子，设计并合成了人表皮生长因子基因(HCEGF)，通过在大肠杆菌和家蚕中的表达，结果证实我们所合成的序列在大肠杆菌和家蚕中均得到了高效的表达，突破了人表皮生长因子表达量低的瓶颈。
该序列能够在大肠杆菌和家蚕体内高效表达人表皮生长因子，在大肠杆菌中表达量可达菌体总蛋白的30％以上，在家蚕中可达到28.4μg/ml蛹血淋巴。此合成序列不同于人表皮生长因子基因序列，但所表达的产物同天然人表皮生长因子的表达产物完全相同，因而具有天然人表皮生长因子的全部特性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述：
实施例一：人表皮生长因子核酸序列的人工合成：
根据SEQ ID NO.1所示核苷酸序列构成的基因(HCEGF)，采用固相合成法在3900全自动DNA合成仪上按操作手册合成4条长链引物，其序列分别为：
EGF-F1：GGATCCAACAGCGACAGCGAATGCCCGTTGAGCCACGACGGCTACTGCTTGCACG
EGF-R1：GCACGCGTATTTGTCCAACGCTTCAATGTACATGCACACGCCGTCGTGCAAGCAGTAGCCG
EGF-F2：TGGACAAATACGCGTGCAACTGCGTGGTGGGCTACATTGGCGAACGCTGCCAATAC
EGF-R2：GAATTCTTAGCGCAATTCCCACCATTTCAAGTCGCGGTATTGGCAGCGTTCGCC
分别对EGF-F1、EGF-R1和EGF-F2、EGF-R2进行第一轮聚合酶连反应(PCR扩增反应)。
反应1：采用下列原料进行扩增反应
0.5微升的嗜热性DNA聚合酶(Taq polymerase)
1微升10毫摩尔的四种单核苷酸混合物(dNTPs)
5.0微升10xPCR缓冲液
3微升25毫摩尔的MgCl2
2微升25微摩尔的EGF-F1和EGF-R1的混合物
37.5微升的水
先在94℃下进行预变性反应1分钟，再进行30次变性-复性-延伸循环反应，每个循环包括，94℃反应1分钟，55℃反应1分钟，72℃反应1分钟。
反应2：与反应1相同，只是反应对象变为2微升25微摩尔的EGF-F2、EGF-R2的混合物。
再将二个反应的产物进行混合，进行第二次PCR扩增反应，反应条件与上述反应相同。
扩增后将PCR产物进行凝胶回收，再进行TA克隆。挑取十个克隆进行测序，将测序完全正确的结果挑选出来，就得到人工合成的HCEGF。
实施例二：原核表达载体的构建及基因在大肠杆菌中的表达
实施例一中合成的HCEGF序列两端设计有BamH I、EcoR I位点，经酶切后，克隆进pET-28a中，获得原核表达载体pET-28a-HCEGF。
菌体的诱导表达：将重组的pET-28a-HCEGF DNA转化至E.coli(大肠杆菌)BL21中，转化菌以1∶100接种于含有卡那霉素的LB培养基中，37℃培养3小时，加入IPTG至终浓度为1mmol/mL，进行诱导表达3小时。
HCEGF在E.coli中的表达结果检测：将鉴定正确的表达质粒pET-28a-HCEGF转化E.coli受体菌BL21，并用IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western blot检测表明，重组蛋白的分子量10kDa，表达的重组蛋白占细菌总蛋白的30％以上。
原核表达产物的一步纯化：将表达菌液超声处理后进行金属鏊合亲和层析。纯化产物浓缩后进行SDS-PAGE分析可检测到1条分子量为10kDa蛋白条带。
实施例三：真核转移载体的构建及基因在家蚕幼虫和蛹中的表达
重组杆状病毒转移载体的构建：合成的HCEGF经BamH I、EcoR I位点，克隆至pBacPAK-His中，获pBacPAK-His-HCEGF。
病毒重组操作：病毒Bm-BacPAK6 DNA经Bsu36 I切割后，采用脂质体(Lipofectin)法，与pBacPAK-His-HCEGF共转染BmN细胞。共转染培养液进行空斑纯化，筛选出重组病毒Bm-HCEGF，用PCR鉴定后，在细胞中扩增后待用。
家蚕幼虫或蛹中重组蛋白样品的收集：将重组病毒2μL注射接种五龄起蚕或刚化蛹的嫩蛹，对照区分别注射水和Bm-BacPAK6，120小时后分别收集蚕或蛹的血淋巴，-20℃保存待测。
重组病毒Bm-HCEGF的筛选及表达产物检测：pBacPAK-His-HCEGF与经Bsu36 I酶切线性化的Bm-BacPAK6 DNA共转染BmN细胞，通过空斑筛选获得重组病毒Bm-HCEGF感染BmN细胞，抽提细胞总DNA，PCR可扩增出170bp左右DNA插入片段。
SDS-PAGE分析感染重组病毒120小时后的家蚕蛹血淋巴，可在10kDa左右检测到与EGF理论分子量相当的蛋白质组分，而感染野生型病毒的血淋巴中则没有，表明外源基因已在蚕体中得到表达。ELISA检测，接种病毒120小时后表达量为28.4μg/ml蛹血淋巴。
<110>苏州大学
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>cDS
<222>(1)…(162)
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aacagcgaca gcgaatgccc gttgagccac gacggctact gcttgcacga cggcgtgtgc 60
atgtacattg aagcgttgga caaatacgcg tgcaactgcg tggtgggcta cattggcgaa 120
cgctgccaat accgcgactt gaaatggtgg gaattgcgctaa 162