大菱鲆选择育种个体标记方法 技术领域：
本发明属于在鱼类育种、种群估算、资源评估、以及洄游与分布调查领域中鱼类个体标记技术，是一种在大菱鲆育种中实现识别大数量检测每一条鱼的技术方法。
背景技术：
大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)是大西洋东北部，欧洲沿海特有的一种比目鱼。我国于1992年首次从英国引进大菱鲆苗种，由于在我国大菱鲆苗种生产过程中采用的亲鱼通常未经科学选育，加之累代养殖和近亲交配，造成后代苗种的种质退化现象比较严重，已经出现孵化率和出苗率降低、生长速度减慢、抗逆性变差等性状退化现象，为此需要开展大菱鲆的选择育种工作。在大菱鲆的育种中，通过标记可以追踪每条鱼的群体来源、父母本、系谱、生产表现以及鱼的出厂和销售去向等情况，同时在进行与经济性状相关的检测时，需要将不同来源的、于同一环境直至养成的大菱鲆幼体，实现在同一养殖环境下的检测，以便提高遗传参数估计的准确性。中国水产科学研究院黄海水产研究所马爱军等申请的‘基于大菱鲆选择育种的一种亲鱼标记方法’(申请号：200810083837.1)，主要用红铜为材料做成标记数字放入液氮罐内静置3分钟，取出后放置在鱼体标记部位2分钟；本发明所需费用低、操作简便，效果显著、且易于观察；但本专利也要求在鱼体长到一定的规格后进行标记，并且由于大菱鲆生长快，很难保证时间长后标记数字清晰可见，从而降低标记的有效识别率；而且红铜为材料做成标记数字(每个个体的标记数字不同，因而需要带标记数字的红铜模具数量非常大)成本较高。中国科学院水生生物研究所张堂林等的“鱼类标志技术的研究进展”(中国水产科学/2003年/第10卷/第3期)和中国水产科学研究院淡水渔业研究中心董在杰等申请的专利“一种罗非鱼个体标记的方法”(申请号：200810018667.9)，其中大数量的个体标记方法主要是把PIT标记芯片注射入鱼体内进行个体标记；但是受PIT标记芯片大小的影响，这种标记方法要求在鱼体长到一定的规格(一般应用于鱼成体的标记)；并且PIT标记芯片目前市场价格较高(价格：一个PIT标记芯片，国产20元人民币左右；国外进口30元人民币以上)，对于大规模大菱鲆的选育育种无疑成本也太高。
发明内容：
本发明的目的是：在大菱鲆的育种中，通过标记追踪每条鱼的群体来源、父母本、系谱、生产表现以及鱼的出厂和销售去向等情况，同时在进行与经济性状相关的检测时，对混养的不同个体和家系进行识别，提高遗传参数估计的准确性，同时为鱼的留种亲本提供身份标记，实现大菱鲆交配可控性，避免近交衰退。
本发明所采用的技术方法包括：1、标记前的准备；2、鱼的选择；3、鱼体的标记。
1、标记前的准备：选取胶针、吊牌枪和标识牌，胶针为10mm，平头、呈“工”字型，型号为：MUXP-25，同时准备瓢网、毛巾、装有新鲜海水的池子和充气的气石，并用浓度为75％的酒精对吊牌枪、胶针、标识牌、手进行酒精消毒；
2、鱼的选择：大菱鲆为活体幼鱼，体长大于5cm；标记前，大菱鲆必须先池养1-2天，幼鱼不能进食；标记时用湿毛巾将其头部整个包埋；
3、鱼体标记：在用吊牌枪枪针插入鱼体前，用百多邦或红霉素药膏涂抹消毒枪针，然后将标识牌套入到枪针上，吊牌枪型号为：SAGA 70L；在吊牌枪枪针插入鱼体时，将胶针穿入鱼体内的肌肉中，插入点在鱼体头部(头部朝向操作人员)左眼后侧肌肉较多处，针要仔细地穿透肌肉组织，不要碰到骨头或静脉，用百多邦或红霉素药膏涂抹穿针的伤口处、胶针应留有长度2～8mm以供鱼体生长，调整标记使其呈45度角斜向鱼体后端，将标记的鱼安置在有充气设备的海水池中；标记后氟苯尼考药浴2小时，每天药浴一次，连续药浴三天。氟苯尼考药浴浓度为10ppm。
标记为标识牌：材料为贝迪牌白色聚酯复合纸，双层覆膜，形状为：长2厘米，宽0.8厘米，拴绳孔径为3.0毫米左右；在白色聚酯复合纸上打印标识码，为5位的标识符：第一位标识符为英文大写字母，第2-5位为阿拉伯数字，如：A0001-A9999。
本发明的特点是：
1、本发明操作简单，自动化高，对鱼体的损伤程度较小，标记的保留率90％以上，有效识别率90％以上，不影响大菱鲆的正常活动，能够满足大规模大菱鲆的选育育种标记的需要；
2、本发明对鱼幼体和成体都可以标记，标记对大菱鲆的生长无影响；
3、所用的大菱鲆个体标记成本非常低，每条鱼地成本为0.2元人民币，而且检测的鱼只需在幼体期标记一次，将可终身携带，既节约了成本，也减少了多次标记对鱼体的伤害。
附图说明：
图1：鱼类标识牌示意图；
图2：鱼类标记方法和过程：
A：将吊牌枪枪针插入肌肉组织；
B：调整标记使其呈45度角斜向鱼体后端。
具体实施方式：
下面通过实例结合附图对本发明技术进行详细叙述：
本实验是在山东省海阳市黄海水产有限公司海珍品场进行的，本发明其技术方法包括：1、标记前的准备；2、大菱鲆幼鱼的选择；3、苗体的标记。
1、标记前的准备：
选取一种小的、平头、呈“工”字型的胶针(10mm，型号：MUXP-25，材料为聚乙烯)、带枪针的吊牌枪(型号：SAGA 70L)。使用的标识牌：材料为贝迪牌白色聚酯复合纸，双层覆膜，形状为：长2厘米，宽0.8厘米，拴绳孔径为3.0毫米左右。在白色聚酯复合纸上打印标识码，为5位的标识符：：第一位标识符为英文大写字母，第2-5位为阿拉伯数字，如：A0001-A9999，见附图1。同时准备瓢网、毛巾、装有新鲜海水的池子和充气的气石，并用75％的酒精对吊牌枪、胶针、标识牌进行消毒。
2、大菱鲆幼鱼的选择：
取规格相近的大菱鲆家系活体幼鱼608条，体长在16cm左右，体重170g左右，其中304条准备标记，在培育水池先暂养几天，使试验鱼适应标记后生长环境；标记前对水池中暂养的鱼停食两天；为了减少和消除在标记过程中鱼体所受的胁迫以及由于胁迫致使鱼体过于剧烈运动造成的损伤，大菱鲆必须在标记前用毛巾将其头部整个包埋麻醉，之后对幼鱼进行标记。。
3、苗体的标记：
在同一养殖环境下对鱼类准确的检测，需要鱼体本身具有一种特有的识别标记。鱼体识别标记较多，包括附加物、插入物，或外部注射进鱼体。本方法在大菱鲆类育种技术中采用了体外挂牌的个体标记方法，独特地识别大数量检测鱼中的每一尾。
具体标记程序是：
1)、使鱼苗保持游泳的姿势；
2)、插入点在鱼体头部(头部朝向操作人员)左眼后侧肌肉较多处；
3)、在用吊牌枪枪针插入鱼体前，将百多邦(或红霉素药膏)涂抹消毒枪针，然后将标识牌套入到枪针上；
4)、将吊牌枪枪针插入在一个标度之下，针要仔细地插入肌肉组织，不要碰到骨头或静脉，见附图2的A图；
5)、直接将胶针插入鱼体肌肉中，用百多邦(或红霉素药膏)涂抹消毒穿针后的伤口；
6)、胶针应该留有5mm长，以供鱼体生长。其胶针的长度是根据被期望鱼体的最大生长(即依照收获的年龄或重量确定)来决定预留胶针的长度；
7)、调整标记使其呈45度角斜向鱼体后端，见附图2的B图，并且立刻将标记的鱼苗安置在有充气设备的海水池中；
8)、标记后用氟苯尼考10ppm(10％水溶性氟苯尼考粉)药浴2小时，每天药浴一次，连续药浴三天。
已标记组与对照组(未标记)各304条，放置到同一池中进行养殖，分别在初始、养殖30天和90天后测量其体长、体重生长指标，统计标记后的各项参数，并测量所有鱼生长性状指标。
在整个标记鱼与未标记鱼养殖期间，在304尾标记大菱鲆中，鱼的成活率为98.03％，未感染所占比例为96.05％，标记的保持率为94.08％，有效识别率100％。标记组和对照组的大菱鲆初始、30天和90天的平均体长和体重如表1所示。单因素方差分析的结果表明，标记组和对照组的大菱鲆在30、90天的生长中，体长和体重不存在显著差异。
表1标记大菱鲆与对照组的体长和体重(平均值±标准差)
从上述表中可看出，标记鱼与未标记鱼在平均体重、平均体长等生长性状的变化几乎无差别，从而通过对标记与不标记鱼的生长对比发现，标记对大菱鲆的生长无影响。
2007年和2008年在山东省海阳市黄海水产有限公司海珍品养殖场对本发明方法进行了大规模的应用，每年标记大菱鲆苗种2万以上，标记的保留率90％以上，有效识别率90％以上，而且不影响大菱鲆的正常活动。同时表明该发明操作简单，自动化高，对鱼体的损伤程度较小，能够满足大规模大菱鲆育种标记的需要。