葡萄属植物提取物及方法和作为抗菌药物增效剂的新用途 技术领域：
本发明涉及一种植物提取物，尤其是涉及从葡萄属植物果、皮、根、藤、叶、籽不同部位所获得的提取物；同时，本发明还涉及该提取物的制备方法及其作为抗菌药物增效剂的新用途。
背景技术：
自1929年Fleiming发现青霉素，1940年Waksman发现链霉素以来，人们不断从微生物次级代谢产物中找到了众多有效的抗生素，并由此开发出许多半合成抗生素，这对防治细菌性感染起到了重要的作用。由于抗生素的长期大量使用，使得细菌耐药性逐年增加，曾经有效的抗生素不能再抑制或杀死细菌，成为抗生素药物疗效下降的主要原因之一。近年来，耐药性问题引起国际社会和医学界的极大关注，各国除继续致力于筛选对耐药菌有效的作用机制的抗生素之外，开始寻找能提高抗生素效能、拮抗细菌耐药性的物质，如灭活酶抑制剂、药物渗透促进剂、外输泵抑制剂、细菌生物被膜抑制剂、抗菌药物增强剂及耐药质粒消除剂。
我国学者曾研究报道某些中草药如大蒜、山楂、紫草、车前子、金银花等提取物具有消除细菌耐药性质粒的作用，但消除率比较低，效果不够理想。受此启发，我们设想从中国西部高原植物中筛选和寻找具有消除细菌耐药性作用的植物，经过10余年的探索与研究，最终发现葡萄科葡萄属植物具有显著的消除细菌耐药性的作用，并能够使多种抗菌药物增强疗效。
葡萄科植物有15属，其中浆果可以食用的仅限于葡萄属(Vitis)。葡萄属全世界有70余种，分布于温带或亚热带，我国有37种，其中葡萄(Vitis Vinifernl)又称蒲桃、草龙珠、山葫芦，为葡萄科葡萄属落叶植物葡萄地成熟果实，是著名的水果和酿酒原料，也作为药材被药典收载。
葡萄的用途很广，除主要酿造不同类型的葡萄酒外，还大量用以鲜食、加工成葡萄干、葡萄汁、葡萄罐头等，同时，在传统医学中，常将葡萄作为药材收载、具有滋补强壮、软坚驱寒、补肝利胆等作用。《神农本草经》记载，葡萄可主筋骨利湿弊、益气倍力、强志，令人肥健耐饥，忍风寒，久食轻身不老延年；《随息居饮食谱》记载，葡萄补气、滋肾液、益阴肝、强筋骨、止渴等，例如：红葡萄干与骆驼蓬子合用，可止咳平咳，对支气管哮喘有较好疗效；绿葡萄干与核桃、红枣合用，具有消热解毒、凉血通脉、降压及滋阴作用，对动脉硬化、高血压等有较好的疗效。
现代医学研究发现葡萄含有多种活性物质，且存在于葡萄属植物果、根、藤、叶、籽的不同部位，对防治贫血、肝炎、降低血脂和软化血管等十分有益。
虽然近年来葡萄的医疗保健作用日益受到世界各国学者的关注，对其化学成分、药理作用及开发应用进行了较为广泛的研究，但至今为止，却未见有关葡萄属植物提取物作为抗菌药物增效剂的研究与应用。
发明内容：
本发明的目的之一在于提供一种葡萄属植物果、皮、根、藤、叶、籽的提取物，该提取物不含任何有害物质，除具有改善心脑血管循环、抗氧化、抗衰老、抗病毒和增强免疫等多方面的医疗保健功能外，还具有显著消除细菌耐药性的作用。
本发明的目的之二在于提供一种葡萄属植物提取物的制备方法，该方法结合了现代化学与生物技术，根据葡萄属植物的不同部位，选择了多种提取分离方法，其工艺过程简单，产品收率高。
本发明的目的之三在于提供一种葡萄属植物提取物作为抗菌药物增效剂的新用途。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种葡萄属植物提取物，它是采用水提法、乙醇提取法及甘油提取法分别对葡萄的果实、葡萄的根、藤和叶以及葡萄的皮、葡萄的籽进行分离提取得到提取液，经过离心交换法、层析法纯化后，再将分别得到的提取液混匀后，最后经过浓缩干燥、喷雾干燥和冷冻干燥得到含一种或多种有效成分的粉末状提取物。
所述的有效成份包括葡萄双芪、白藜芦醇、齐墩果酸、β-谷甾醇、没食子酸及黄酮类化合物。
所述的葡萄双芪Vinifeuin，分子式及分子量C28H22O6、454.48，存在于葡萄科葡萄属植物(Vitis vinifera)叶子中。
[结构式]
所述的白藜芦醇Resveratrol，Res，化学名为芪三酚(3、4、5-trihydroxystilbene)
分子式及分子量C14H12Q3、228.25，存在于葡萄科(Vitis)植物的果、藤、叶子中。
[结构式]
所述的齐墩果酸Oleanolic acid OA，化学名为3β-hydroxy-olea-12-en-oid acid，分子式及分子量：C30H4O3、456.71，存在于葡萄科葡萄属植物果肉和果皮中。
[结构式]
所述的β-谷甾醇Sitosterol，分子式及分子量C29H5OO，414.72，存在于葡萄科葡萄属植物种子中。
[结构式]
所述的没食子酸Gall acid，分子式及分子量GH6O6，170.13，存在于葡萄科葡萄属(Vitis vinifera)的果实、藤和种子中。
[结构式]
所述的黄酮类化合物Flavonoids，主要是指本母核为2-苯基色原酮类化合物，现泛指两个苯环通过中央三碳链相互连接而成的一系列化合物，葡萄籽中总黄酮含量为130.6mg/g。
一种葡萄属植物提取物的制备方法，其特征在于包括如下工艺步骤：
一、分离提取
A、将无核葡萄干用蒸馏水浸泡25～35分钟，再在100℃的温度下水煎25～35分钟，过滤去渣后，再经树脂吸附分离纯化活性物质，最后在100℃的高温下灭菌10分钟即得到提取液1；
B、将葡萄根、藤、叶粉碎后，加入乙醇，过滤去渣，再经树脂吸附分离纯化活性物质，最后过滤除菌即得到提取液2；
C、将葡萄皮用蒸馏水浸泡后，加入酸性乙醇，过滤去渣，再经硅胶柱层析分离纯化活性物质，最后过滤除菌即得到提取液3；
D、将葡萄种子粉碎后，加入甘油于150℃的温度下提取，过滤去渣，再经树脂吸附分离纯化活性物质，最后过滤除菌即得到提取液4。
二、活性成份的测定
A、采用HPLC法测定白藜芦醇的含量；
B、采用分光光度法、气质联用法及薄层扫描法测定黄酮类化合物、齐墩果酸、β-谷甾醇化合物、没食子酸的含量。
三、提取液的干燥
将提取液1、提取液2、提取液3及提取液4混匀后，分别进行浓缩干燥、喷雾干燥和冷冻干燥，即得到粉末状的葡萄属植物提取物。
一种葡萄属植物提取物，其特征在于作为抗菌药物增效剂的新用途。
在本发明制得的单位剂量为80-100毫克的粉末状的葡萄属植物提取物中，还可加入药用辅剂制成医学上可接受的医药制剂，配合抗菌药物使用，达到提高抗菌药物疗效的目的。
本发明的优点在于：
1、原料易得，所得提取物不含任何有害物质，具有改善心脑血管循环、抗氧化、抗衰老、抗病毒和增强免疫等多方面的医疗保健功能。
2、结合了现代化学与生物技术，根据葡萄属植物的不同部位，选择了多种提取分离方法，其工艺过程简单，产品收率高。
3、具有显著消除细菌耐药性的作用，配合抗菌药物使用，可使71种药物敏感性平均提高27.76％，从而大大增强了抗菌药物的杀菌效力。
附图说明：
图1为本发明的工艺流程图
图2为本发明加入葡萄属植物提取物前后抗菌药物的药敏变化曲线图
具体实施方式：
实施例1
一种葡萄属植物提取物，它是采用水提法、乙醇提取法及甘油提取法分别对葡萄的果实、葡萄的根、藤和叶以及葡萄的皮、葡萄的籽进行分离提取纯化得到提取液，再将分别得到的提取液混匀后，最后经过浓缩干燥、喷雾干燥和冷冻干燥得到含葡萄双芪、白藜芦醇、齐墩果酸、β-谷甾醇、没食子酸及黄酮类化合物的粉末状提取物。
实施例2分离提取
将葡萄干果实用蒸馏水浸泡30分钟，再在100℃的温度下水煎30分钟，过滤去渣后，再经树脂吸附分离纯化活性物质，最后在100℃的高温下灭菌10分钟即得到提取液1；将葡萄根、藤、叶粉碎后，加入乙醇，过滤去渣，再经树脂吸附分离纯化活性物质，最后过滤除菌即得到提取液2；将葡萄皮用蒸馏水浸泡后，加入酸性乙醇，过滤去渣，再经硅胶柱层析分离纯化活性物质，最后过滤除菌即得到提取液3；将葡萄种子粉碎后，加入甘油于150℃的温度下提取，过滤去渣，再经树脂吸附分离纯化活性物质，最后过滤除菌即得到提取液4。
实施例3活性成份的测定
采用HPLC法测定白藜芦醇的含量；采用分光光度法、气质联用法及薄层扫描法测定黄酮类化合物、β-谷甾醇化合物、没食子酸的含量。
实施例4提取液的干燥
将提取液1、提取液2、提取液3及提取液4混匀后，分别进行浓缩干燥、喷雾干燥和冷冻干燥，即得到粉末状的葡萄属植物提取物。
实施例5葡萄属植物提取物消除细菌耐药性的作用与作为抗菌药物增效剂的效果：
采用药敏纸片法和最小抑菌浓度法(Mic)，观察葡萄活性物质作用国际标准大肠菌ATCC-25922，48小时后，78种药物敏感性增加百分比，结果在检测的78种抗菌药物中，有71种药物敏感性平均增加27.76％，有7种药物敏感性未见增加，这7种药物是：阿奇霉素、克拉霉素、罗红霉素、红霉素、壮观霉素、青霉素G、克林霉素，见表1。
表1，葡萄活性物质作用国际标准菌ATCC-25922，48小时后，观察78种抗菌药物敏感性增加百分率％，有71种药物敏感性平均增加27.76％，有7种药物未见增加。抗菌药物 增幅％抗菌药物 增幅％抗菌药物 增幅％羧苄青霉素 21.74苯唑西林 3.33美洛西林 29.17阿洛西林 45.00哌拉西林 29.17哌拉西林/他唑巴坦 28.00阿莫西林 35.30阿莫西林/舒巴坦 16.70氨苄西林 15.00氨苄西林/舒巴坦 25.00替卡西林/克拉维酸 17.86氨曲南 29.63头孢哌酮 15.15头孢哌酮/舒巴坦 11.76头孢噻吩 33.33头孢他美 22.22头孢吡肟 25.00头孢克肟 21.74头孢匹胺 18.52头孢唑肟 27.27头孢拉定 26.08头孢克罗 34.78头孢地嗪 22.22头孢美唑 29.63头孢氨苄 15.00头孢曲松 23.33头孢呋新 21.74头孢他啶 25.00头孢他定/克拉维酸 22.58头孢噻肟 32.14头孢噻肟/克拉维酸 31.03萘啶酸 25.00吡哌酸 25.93甲氟哌酸 18.75罗美沙星 20.59左旋氧氟沙星 22.86氧氟沙星 25.00环丙沙星 13.51司氟沙星 20.00诺氟沙星 24.24氟罗沙星 33.33依诺沙星 18.18加替沙星 23.53芦氟沙星 26.92阿米卡星 11.11依替米星 17.86萘替米星 21.43庆大霉素 15.38磺胺甲基异恶唑 42.86复方新诺明 28.00链霉素 11.11氯霉素 3.13四环素 11.54二甲胺基四环素 22.73妥布霉素 8.00呋喃妥因 22.72卡那霉素 15.38强力霉素 30.00痢特灵 52.63乙酰螺旋霉 83.33多粘菌素B 26.66利复平 25.00小诺霉素 15.38麦迪霉素 100.00磷霉素 6.66新霉素 12.50交沙霉素 6.25麦白霉素 30.77奥格门丁 29.63甲硝唑 83.00替硝唑 95.00红霉素 0无效壮观霉素 0无效罗红霉素 0无效阿奇霉素 0无效克拉霉素 0无效青霉素G 0无效克林霉素 0无效
实施例6葡萄活性物质对大肠杆菌消除耐药性研究结果：
选择国际标准大肠杆菌(ATCC-25922株)、出血性大肠杆菌标准株(0157株)、临床分离侵袭性大肠杆菌(90240株)临床分离产素性大肠杆菌(91003株)的受试菌株，经过活性物质作用24小时后，观察菌株对6类(58种)抗菌药物的药敏变化，6类抗菌药物：青霉素类(13种)、头孢类(20种)、喹诺酮类(12种)、氨基糖苷类(8种)、四环素类(3种)、磺胺类(2种)。结果显示6类(58种药物)，见表2。
表2，葡萄活性物质作用大肠杆菌24小时6类(58种)抗菌药物敏感性平均增加百分率％。
实施例7葡萄活性物质作用不同时间及去除葡萄活性物质后细菌药敏变化的研究
试菌选择标准大肠杆菌(ATCC-259922)，标准肺炎克雷伯氏(GY2000)和标准出血性大肠杆菌(0157)。活性物质对菌株分离作用24小时、48小时、120小时，然后去除活性物质，使菌株在无活性物质压力下继续培养24小时、48小时、120小时，观察检测在这个过程中3株细菌对78种抗菌药物的药敏变化，进而分析研究消耐作用的规律、结果发现活性物质作用于菌株24小时药敏平均增加20％左右，到48小时肺炎克雷伯氏菌达到顶峰30％左右，120小时2株大肠杆菌达到顶峰35-40％，当去除活性物质24小时后药敏迅速下降至10％左右，以后下降比较缓慢，但始终仍比消耐前菌株敏感，见说明书附图2。
实施例8葡萄活性物质在动物体内消除细菌耐药性的研究
设出血性大肠杆菌0157作受试菌。0157菌侏通过口腔、胃、肠道感染实验动物(昆明种小白鼠)，再灌喂葡萄活性物质，从动物体内分离活性物质作用后的0157菌株与未灌喂活性物质动物体内分离的0157菌株作对比研究，检测实验菌株和对照菌株对78种抗菌药物的药敏性，结果显示：消耐因子在动物体内环境下消除细菌耐药性同样有效，在动物体内作用12小时可使0157菌株对78种抗菌药物敏感性平均增加15％，作用24小时平均增加24％。
实施例9葡萄活性物质消除细菌耐药性机理研究
A、葡萄活性物质对产生β-内酰胺酶细菌作用的研究：经过活性物质对30株临床常见致病菌(致病性大肠杆菌、痢疾杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌)作用后，检测细菌β-内酰胺酶，结果证实：活性物质对细菌产生的β-内酰胺酶无抑制作用。
B、葡萄活性物质消除细菌耐药质粒的研究：经过质粒检测，受试的30株临床致病菌携带分子量大小不同的质粒1-8条带，活性物质作用后，质粒丢失率为60-90％。研究结果显示活性物质能够有效的消除细菌质粒。
C、葡萄活性物质对细菌耐药基因作用的研究：因为各种抗菌药物对细菌作用靶点不同，会诱导细菌产生多种不同的耐药基因，所以研究植物活性物质对细菌耐药基因的作用是一项艰巨的工作，根据细菌产生的药性的机理和本发明研究结果进行初步分析判断，活性物质作用的基因位点很可能在细菌的胞膜和细菌R质粒。常见的耐药性突变基因gyr或Parc，常常发生于称为“喹诺酮耐药决定区”(QRDR)的部位。目前放为，许多常见致病菌都存在与耐药性有关的外输泵，如大肠杆菌、枯草杆菌、肠球菌等，大肠杆菌膜上存在有AcrAB AcrEF EmrAB Emrol NorA QacB等主动外输系统，其中染色体DNA上AcrAB基础编码的AcrAB蛋白是最主要的。本研究证实葡萄活性物质能够明显抑制NorA外输蛋白的活性。