黄芪药渣发酵开发的植物源动物用免疫增强剂 一、技术领域
本发明涉及黄芪药渣发酵开发的植物源动物用免疫增强剂，属于饲料技术领域，专用于黄芪药渣发酵开发的植物源动物用免疫增强剂。
二、背景技术
近年来，随着我国中药制药业的飞速发展，中药的提取加工能力不断提高，产品种类日益繁多，药渣的排出量逐年增加。据统计，中药制药企业每年将产生数千万吨的中药药渣，并且90％以上的生产厂家均将药渣作为废料垃圾，这在一定程度上造成了植物资源的巨大浪费，同时由于药渣未及时处理会对周边环境造成污染。
而药用真菌双向发酵技术是目前开发药渣最有希望的途径，药用真菌发酵技术是指以药用真菌为发酵菌种，利用中药药渣作为药性基质，两者共同构成发酵组合，双方相适应并在一定条件下进行固体发酵的技术，掺用药渣发酵，使发酵产物的免疫增强效果比单用其中的任何一种效果都有很明显的提高。经试验，以黄芪药渣为发酵培养基经蝉花菌发酵的产物经拌料饲喂后对动物免疫功能具有较强修复和增强作用，大大增强了动物对疾病的抵抗力。
我国药用真菌种类丰富，且应用病种面广，已涉及医院各重要病科与人体各有关系统。不少品种具有调节机体免疫功能的作用，已多研究用于抗癌、消炎等方面，近数年来对抗病毒作用、免疫增强作用备受关注，已有关于药用真菌产物对非典、艾滋、禽流感病毒等有效的报告，令人兴奋。蝉花菌在我国的研究历史悠久，其寄生竹蝉若虫后的复合体统称为蝉花，最早在南北朝雷斅的《雷公炮炙论》就有加工蝉花的记载。宋代唐慎微的《征类本草》，以及明朝李时珍的《本草纲目》及之后药典都有记载功效。随着近代研究的深入，发现蝉花含有丰富的肝糖、虫草酸、多种生物碱及麦角甾醇等，并从其中分离出大量的碱溶性蝉花多糖，多糖CI-5N、CI-P及CI-A。其生物学功能的研究主要集中于抗疲劳抗应激作用、镇静催眠作用、解热镇痛作用等，其中，蝉花的免疫调节作用尤其突出，经过对小鼠进行淋巴转化试验、Ea及E玫瑰花试验、特异性免疫玫瑰花试验(巨噬细胞吞噬试验、抗绵羊红细胞抗体效价试验)，结果表明蝉花多糖具有明显的提高免疫功能作用。本发明是在蝉花菌的发酵活性基础上，利用黄芪药渣作为培养基，采用固体发酵技术，发酵出效果显著的植物源动物免疫增强剂，国内外尚属首例。
三、发明内容
技术问题本研究的目的在于提供了一种安全、有效、经济、无公害、并能变废为宝的的植物源动物免疫增强剂及其制备方法，同时充分开发利用黄芪药渣资源。
技术方案
本发明是以黄芪药渣为主要培养基、用经筛选的真菌进行发酵而开发的植物源动物用免疫增强剂，是通过以下方法制备而成的：
使用黄芪药渣、玉米粉、麸皮、尿素为固体发酵培养基，其中黄芪药渣的质量分数为55％，玉米粉质量分数为30％，麸皮质量分数为10％，尿素5％。
最佳发酵条件为：发酵体系中料水比为1∶2，调PH为5.0，接种蝉花菌(Cordycepscicadae)，使其含量为≥7×106个/g，发酵过程中温度维持为25℃-30℃，发酵时间为240小时。发酵结束后所得产物经55℃烘干、粉碎、包装，然后用60Co γ射线进行辐照杀菌处理，辐照杀菌吸收剂量范围为5-10kGy，吸收剂量不均匀度＜1.38，即可得产品。
有益效果 本发明所提供的黄芪药渣开发的植物源动物免疫增强剂及其制备方法与现有技术相比，具有如下优点和积极效果：
(1)以中药生产中被废弃的黄芪药渣为原料，原料来源广，价格低廉，生产成本低，生产工艺简单，适合各种规模生产。
(2)免疫增强效果明显。试验证明，发酵产物经拌料饲喂后，能使受抑制的吞噬细胞和淋巴细胞功能恢复正常，并增强细胞免疫机能，促进体液免疫细胞的增殖、成熟和抗体产生，大大提高疫苗的免疫效果。
(3)生产中无环境污染，无残留，并变废为宝，同时应用效果明显，对人畜安全，是一种无公害植物源动物免疫增强剂。
(4)采用本发明中的辐照杀菌方法可显著降低产品中各种微生物的含量，细菌总数降低到1000cfu/g以下，大肠菌群降低到30MPN/100g以下，霉菌和沙门氏菌未检出，并能够保持产品中主要营养成分以及外观色泽和口感不变。该方法操作简便，快捷，成本低，可广泛应用。在常温下贮存，保质期可达1年以上。
【附图说明】
图1免疫增强剂对鸡新城疫HI抗体消长的影响
图2免疫增强剂对鸡ERFC形成率的影响
图3免疫增强剂对鸡ANAE阳性率的影响
图4发酵产物对断奶仔猪的外周血淋巴细胞转化率的影响(14天)
图5发酵产物对断奶仔猪的外周血淋巴细胞转化率的影响(28天)
图6发酵产物对断奶仔猪NK细胞的影响
图7发酵产物对断奶仔猪Th细胞的影响
图8发酵产物对断奶仔猪Tc细胞的影响
图9发酵产物对断奶仔猪T细胞总数的影响
图10发酵产物对断奶仔猪CD4+T细胞的影响
图11发酵产物对断奶资质CD8+T细胞地影响
图12发酵产物对断奶仔猪血液中猪瘟抗体的影响
【具体实施方式】
以蝉花菌(Cordyceps cicadae)为发酵菌种，利用黄芪药渣作为培养基，两者共同构成发酵组合并进行发酵，具体制备方案如下：
使用黄芪药渣、玉米粉、麸皮、尿素进行固体发酵基的配制，其中黄芪药渣的质量分数为55％，玉米粉质量分数为30％，麸皮质量分数为10％，尿素5％。
最佳发酵条件为：发酵体系中料水比为1∶2，调PH为5.0，接种真菌蝉花菌(Cordyceps cicadae，由中国农业微生物菌种保藏管理中心购买)，使其含量为≥7×106个/g，发酵过程中温度维持为25℃-30℃，发酵时间为240小时。发酵结束后所得产物经55℃烘干、粉碎、包装，用60Co γ射线进行辐照杀菌处理，辐照杀菌吸收剂量范围为5-10kGy，吸收剂量不均匀度＜1.38。产品中细菌总数降低到1 000cfu/g以下，大肠菌群降低到30MPN/100g以下，霉菌和沙门氏菌未检出，并能够保持产品中主要营养成分以及外观色泽和口感不变。在常温下贮存，保质期可达1年以上。
实施例1
1将40只14日龄健康罗曼雏鸡随机分成对照组和试验组，均按常规方法饲养，在试验前测定各组鸡的ND母源抗体并称重，并进行ND-Lasota疫苗接种，同时给试验组雏鸡在正常日粮中添加上述的药渣发酵产品，使发酵产品的质量分数为4％，持续添加30天，在试验后10、20、30和40d分别翅静脉采血，进行ND-HI抗体检测、ERFC试验、外周血T淋巴细胞ANAE形成率测定，在试验结束时，每组随机取10只鸡称重后，供水禁食24h，颈静脉放血致死，分别采集法氏囊和脾脏，进行囊体比、脾体比比较。
2.1鸡新城疫HI抗体检测试验前(14日龄)各组鸡ND-HI抗体效价测定结果组间差异不显著(P＞0.05)，免疫后10、20、30和40d试验组新城疫HI抗体滴度极显著高于对照组(P＜0.01)，证明此免疫增强剂能显著增强体液免疫功能，提高ND-HI抗体滴度，结果见表1。
表1免疫增强剂对鸡新城疫HI抗体消长的影响(log2)
注：同列数据肩标有**表示差异极显著(P＜0.01)。
2.2鸡新城疫ERFC形成试验试验前(14日龄)各组鸡新城疫ERFC形成率差异不显著(P＞0.05)，免疫后10、20、30和40d试验组新城疫ERFC形成率极显著高于对照组(P＜0.01)，证明免疫增强剂能显著增强细胞免疫功能，结果见表2。
表2免疫增强剂对鸡ERFC形成率的影响(％)
注：同列数据肩标有**表示差异极显著(P＜0.01)。
2.3鸡新城疫ANAE阳性率测定 试验前(14日龄)各组鸡新城疫ANAE阳性率差异不显著(P＞0.05)，试验后20、30、40d试验组ANAE阳性率极显著高于对照组(P＜0.01)，表明该免疫增强剂能有效促进T淋巴细胞的诱导，协同免疫刺激作用，可提高外周血T淋巴细胞百分率，结果见表3。
表3免疫增强剂对鸡ANAE阳性率的影响(％)
注：同列数据肩标有**表示差异极显著(P＜0.01)。
2.4免疫器官相对重量的比较免疫增强剂具有明显的促生长作用，经t检验差异极显著(P＜0.01)；对机体的囊体比和脾体比有一定的提高，但差异不显著(P＞0.05)，结果见表4。
表4免疫增强剂对鸡免疫器官相对重量的影响
注：同列数据肩标有**表示差异极显著(P＜0.01)。
实施例2
1 选择日龄为(28±3)d的长×大二元断奶仔猪80头(公母各半)，试验猪为普通级试验动物。
1)随机分成2个处理组，每个处理组设5个重复，每栏为1个重复小组，每栏8头仔猪。2个处理组分别为：对照组：饲喂基础日粮；处理组：基础日粮+200mg/kg发酵产品。试验在江宁秣陵种猪育种有限公司进行，全封闭式猪舍，屋顶排气扇通风，漏缝金属地板，网上平养，舍温保持在25~30℃。粉料饲喂、少量多次、自由采食饮水、常规饲养和免疫，试验期为30天。
2)分别在试验进行到第14和28天时，早上喂料前每个处理组采血5头，无菌前腔静脉采血分别注入真空EDTA抗凝管和真空生化管制成抗凝血和血清。采用MTT法测定外周血淋巴细胞转化率；采用流式细胞仪法测定外周血T淋巴细胞亚群分布情况(FITC标记鼠抗猪CD4α抗体，PE标记鼠抗猪CD8α抗体和SPRD标记的鼠抗猪CD3ε)。所有试验仔猪在25日龄进行等剂量猪瘟细胞疫苗免疫接种。在免疫接种后第7、14、21、28天每个处理组采血5头，用真空生化管前腔静脉采血，分离血清分装-80℃冻存，用美国IDEXX公司的猪瘟ELISA抗体试剂盒检测猪瘟抗体。
3)所有试验数据采用SPSS10·0软件进行ANO-VA统计处理。差异显著性进行Duncan氏比较。数据用平均值±标准差(Mean±SD)表示。P＜0.05确定为差异显著。
2发酵产物对断奶仔猪外周血淋巴细胞淋巴细胞转化率的影响
由表5可知，试验第14、28天，添加发酵产物组的外周血淋巴细胞转化率均极显著高于对照组(P＜0.01)。
表5发酵产物对断奶仔猪的外周血淋巴细胞转化率的影响
注：同列数据肩标有**表示差异极显著(P＜0.01)。
3发酵产物对断奶仔猪外周血淋巴细胞亚群数量的影响
由表6可知，添加发酵产物14天后，仔猪外周血T淋巴细胞(CD3+)、CD4+T细胞、CD8+T细胞、自然杀伤性(Natural kill cell，NK)细胞(CD3-CD4-CD8+)、Th细胞(CD3+CD4+CD8-)和Tc细胞数量(CD3+CD4-CD8+)均显著高于对照组(P＜0.05)。
表6发酵产物对断奶仔猪外周血淋巴细胞亚群数量的影响
4发酵产物对断奶仔猪血清中猪瘟抗体的影响
由表7可知，猪瘟疫苗免疫21天后呈现上升趋势。发酵产物可显著提高猪瘟疫苗免疫后21天的抗体水平(P＜0.05)。
表7发酵产物对断奶仔猪血液中猪瘟抗体的影响(阻断率)