纯化酶的方法和按此产生出的经纯化 的酶以及该酶的用途 应用领域
本发明涉及用于纯化至少一种在溶组织梭菌(Clostridiumhistolyticum)发酵上清液中含有的酶的方法，和按此生产经纯化的酶，以及酶用途。
现有技术
细菌溶组织梭菌在含有蛋白胨的营养培养基中培养时可形成细胞外的复合酶混和物，该复合酶混和物含有胶原酶、不同的蛋白水解酶以及低分子量的组分。具有65-125kD范围内的分子量和5-6.5等电点的I型和II型胶原酶(梭菌肽酶A，EC 3.4.24.3)作为主要组分已有描述(Bond，van Wart；Biochemistry，1984，23，3077-3085)。另外的主要组分为以异二聚体形式出现的SH-蛋白酶梭菌蛋白酶(梭菌肽酶B，EC 3.4.22.8)，其分子量为大约59kD，和未经很好描述的所谓的中性蛋白酶(酪蛋白酶)，用MALDI-TOF测得其分子量为34.5kD。
胶原酶是切割胶原纤维蛋白的肽键的酶。它们用于生物化学和医学之中，例如为了分离组织的细胞或细胞连结。I型和II型胶原酶的区别在于它们对于高分子量胶原和小地合成底物的活性。I型胶原酶优选地切割高分子量胶原，而II型胶原酶主要与合成底物反应，例如PZ-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg(Wünsch，Heidrich；Z.Physiol.Chem.333，1963，149-151)、His-Pro(Nordwig，Wünsch；Z.Physiol.Chem.316，1959，287)或Phe-Ala-Leu-Gly-Pro-Ala(van Wart，Steinbrink；Anal.Biochem.113，1981，356-365)。这两种类型的胶原酶也都可以通过反相层析(RPC)来明确地加以区分。
US 5,332,503描述了用于色谱层析纯化溶组织梭菌胶原酶的方法。该层析方法此外包括凝胶过滤步骤以及使用反应型红色琼脂糖凝胶的染料-配体亲和层析。该方法在依照GMP条件下生产用于药物目的的胶原酶时显示出明显的缺点。因此，在该过程中所使用的反应型红色琼脂糖凝胶带来了称之为层析材料渗漏和相关的毒理问题的风险。此外，凝胶过滤步骤基本上是消耗时间和昂贵的，而且较少提供有效的就地清理(cleaning-in-place，CIP)的可能性。这使得难以在工业规模上使用该方法。此外，该方法需要使用去污剂，因此必须需要高额费用来进行纯化确认，和可能发生不希望的终产品的变化。最后，该方法无法分离I型和II型胶原酶。
从文献US 5,830,741和US 5,952,215中，已知用于分离I型和II型胶原酶的纯化方法，其包括染料-配体亲和层析、阳离子交换层析和阴离子交换层析。此处也有亲和层析中所使用的染料渗漏的风险。此外，所使用的层析材料只允许相对较低的流速。此外，所有的层析步骤是通过梯度洗脱来进行的，由此结合在层析材料上的酶用线性盐浓度和/或pH梯度洗脱下来。因此，该已知的方法结果是非常消耗时间的。
任务、解决方案、优点
基于这一背景，本发明的任务为形成可用于分离和纯化至少一种溶组织梭菌的细胞外主酶的方法，其克服了所描述的现有技术的缺点。该任务是通过具有权利要求1中所提到的特征的方法完成的。因此，根据本发明的方法在于溶组织梭菌发酵上清液中的酶通过单阶段或优选多阶段的层析方法分离，该层析方法仅使用基于苯乙烯/二乙烯基苯和基于陶瓷羟磷灰石的层析材料，以实现非常快速和廉价的酶纯化，由此获得高纯度的酶。它们由于没有毒理上危险的物质从而特别适合在药学和生物化学中使用。本方法不需要任何产品接触步骤，这使得其在制药领域中的应用特别具有优势。其可用于生产无菌胶原酶。于此，将苯乙烯/二乙烯基苯理解为由与二乙烯基苯交联的聚苯乙烯构成的共聚体。通过用最不同的功能基团对该基质进行置换，使蛋白质与材料可能结合并因此造成其分离。依赖于功能基团的选择，可以使用不同的结合和分离机制，例如阳离子交换或阴离子交换机制。与此相反，羟磷灰石涉及到具有总分子式Ca10(PO4)6(OH)2的磷酸钙，其由于离子静电相互作用和较强的离子配位键而使得能够进行蛋白质的结合。可是，蛋白质结合于羟磷灰石上的机制细节还不被了解。
所使用的层析材料允许在良好分离特性下设置高流速，从而导致非常短的纯化时间。如果根据本发明的优选实施方案使用经烧结的(即陶瓷的)羟磷灰石是特别有效的。使用陶瓷羟磷灰石与非烧结的(结晶)羟磷灰石相比较具有这样的优点，即材料能够可再生性产生，并由于其孔结构而只产生非常低的反压，由此柱损坏的风险变得最小并且形成高的线性流速是可能的。从经烧结的羟磷灰石材料上的洗脱优选地以至少200cm/h的流速进行，特别是以至少300cm/h的流速。在苯乙烯/二乙烯基苯聚合物材料的情况下，至少500cm/h的流速甚至是优选的，特别是至少1000cm/h的流速。以这种方式，操作时间与已知的方法相比较可显著地缩短。
采用下面的方法可进一步操作时间的缩短以及操作费用的简化，即至少一个层析阶段，优选所有的层析阶段以分步洗脱的方式进行。与梯度洗脱相比较，由此可以进一步节省洗脱试剂和因此所需的昂贵的缓冲物质。此外，在该操作规模上梯度的产生是个问题。
根据本发明的有利的实施方案，层析材料以这样的方式进行选择，即单个的层析步骤仅基于静电相互作用和/或离子键和/或离子配位键。特别有利地，本方法包括至少一个阴离子交换层析阶段和/或至少一个阳离子交换层析阶段和/或至少一个羟磷灰石层析阶段。在一个三阶段层析方法中已经获得了特别好的结果，其中第一阶段在经烧结的羟磷灰石材料上进行，第二阶段在基于苯乙烯/二乙烯基苯的阴离子交换材料上进行，第三层析阶段在基于苯乙烯/二乙烯基苯的阳离子交换材料上进行，优选地以所述次序进行，可是其他次序也是可以的；阶段的数目也可以变化。
优选地，根据本发明的方法因此不包括任何消耗时间和成本的凝胶过滤步骤，经此将待分离的酶的自消化风险减至最小。而且，舍弃凝胶过滤使得能够在4-25℃的宽温度范围内进行层析阶段，即也可以在室温下进行。此外，该方法不包括任何亲和层析阶段，因此不存在层析材料上亲和配体的渗漏和由此将其洗掉的风险。最后，根据本发明的方法没有任何可能引起不希望的蛋白质结构变化的蛋白质沉淀步骤。因此，进一步存在这样的优点，即没有使用去污剂或离液序列高的物质(硫酸铵、聚乙二醇等等)，随后去除这些物质总是与高额操作费用联系在一起。
所使用的层析材料进一步具有这样的优点，即其在很宽的范围内是化学惰性的，从而能够用相对高浓度的碱液如3摩尔的氢氧化钠浓溶液来纯化。这保证了非常有效的纯化，和因此保证材料的功能性维护，以及保证了该方法的良好重复性。此外层析材料的高压稳定性使之能够在高压液相层析方法(HPCL)中使用。由于不存在由方法条件决定的毒理上有顾虑的物质如亲和配体或去污剂，因此根据本发明纯化出的蛋白质，尤其是I型和/或II型胶原酶和/或梭菌蛋白酶和/或中性蛋白酶(酪蛋白酶)能够特别有利地用于药物或生物化学目的。
本发明的进一步优选的实施方案提供其它在从属权利要求中所指明的特征。
此外，本发明涉及根据权利要求30和31所述的按照该方法经纯化的酶，以及根据权利要求32所述的按照该方法生产的酶的用途。
附图的简短描述
本发明借助于图1举例说明。
本发明的详细描述和实施本发明的最佳方式
在动物或植物来源的发酵培养基中进行溶组织梭菌的培养之后，例如通过离心或过滤从发酵上清液中分离出细胞和其他不溶解的组分。该发酵上清液中含有I型和II型胶原酶、梭菌蛋白酶和酪蛋白酶作为主要组分，其可在这些蛋白质的层析分离之前以通常的方式进行浓集。
在本发明的第一步骤中，将该发酵上清液泵压流经填充I型或II型陶瓷羟磷灰石材料(CHT)的层析柱，在此除了不同的其他成分之外所述酶与磷灰石结合。在4-25℃和6-9的pH值，采用＞300cm/h的线性流速并以分步洗脱的方式进行洗脱。于此，含有0-1000mM碱卤化物的磷酸缓冲液是适合的，由此磷酸盐浓度逐渐地由10mM增加至350mM磷酸盐。可选择地或附加地，缓冲液的pH值逐渐地由6增加至9。优选地进行三个洗脱阶段。在第一洗脱阶段获得的级分1仅仅含有低分子量的组分。第二洗脱阶段的级分2除了低分子量的成分之外还含有中性蛋白酶(酪蛋白酶)。第三洗脱阶段的级分3也含有低分子量的成分、全部的梭菌蛋白酶以及I型和II型胶原酶。
级分3将会通过例如超滤/透滤或纤滤或透析进行脱盐，并视需要进行浓集。然后，将经脱盐的溶液在第二层析步骤中经历阴离子交换层析。将基于苯乙烯/二乙烯基苯的层析材料用于此，其例如用四元的氨基团进行功能化。于此，可以使用商购可得的材料(例如Pharmacia公司的Source，PerSeptive公司的POROS，Biorad公司的Makroprep)。当将级分3上载到阴离子交换器上时，已经进行了阳离子或非离子低分子量组分的分离。于4-25℃在具有7-9.5的pH范围的缓冲体系中以分步洗脱的方式进行结合组分的洗脱，其线性流速为大于500cm/h，其中碱卤化物或碱土卤化物的浓度从1至1000mM逐渐变化，和/或pH值从9.5至6逐渐变化。优选地分离出两个级分，由此第一洗脱阶段的级分4含有梭菌蛋白酶和II型胶原酶，第二洗脱阶段的级分5也含有梭菌蛋白酶，以及I型胶原酶。
将级分4和5彼此分别在第三层析阶段中经历阳离子交换层析。于此，也使用基于苯乙烯/二乙烯基苯材料的柱填充物，可是其在此用阳离子结合基团例如SO3H进行功能化。上面提到的商业材料也可在此处使用。于4-25℃在具有5.7-7的pH范围的缓冲体系中以分步洗脱的方式进行阳离子交换剂的洗脱，其线性流速为至少500cm/h。于此，碱卤化物或碱土卤化物的浓度在洗脱缓冲液中于0-300mM之间逐渐调整，和/或pH值于5-7之间逐渐调整。洗脱优选地以两个阶段进行，由此在第一洗脱阶段获得各自的胶原酶，和在第二洗脱阶段获得梭菌酶。
实施例
根据标准方法，溶组织梭菌的培养物通过在液体培养中使用动物或植物营养培养基来进行发酵直至所希望的细胞密度。在用通常的方法例如离心或过滤分离细胞之后，将2000ml浓缩的发酵上清液以300cm/h的线性流速泵压流经用1700ml I型陶瓷羟磷灰石填充的层析柱上。于20-25℃用磷酸缓冲液采用300cm/h的线性流速并以三个阶段来洗脱与羟磷灰石柱结合的成分，其中磷酸盐浓度逐渐增加。在第一洗脱阶段中，用大约10CV(柱体积)的10mM磷酸缓冲液/100mM NaCl进行洗脱，由此获得级分1，其主要含有低分子量的组分。然后用大约3CV的60mM磷酸缓冲液/100mM NaCl进行洗脱，从而获得级分2，其含有酪蛋白酶且同样含有低分子量的成分。对于第三洗脱阶段，用大约5CV的200mM磷酸缓冲液/100mM NaCl进行洗脱。以这种方式收集的级分3含有梭菌蛋白酶和所有的I型和II型胶原酶。将级分2进行脱盐并冻干。最后视需要用标准方法来完成低分子量组分和酪蛋白酶的分离。
将级分3通过例如超滤/透滤或纤滤或透析进行脱盐，并视需要浓集。然后将级分3用适当的缓冲液(例如500mM Tris，pH9.0-9.3)调整至9.0-9.3的pH值。将经缓冲的溶液于20-25℃以大约1000cm/h的线性流速泵压流经作为阴离子交换器功能化的苯乙烯/二乙烯基苯柱(PerSeptive公司的POROS 50 PI)。然后用大约5CV Tris-缓冲液洗涤柱。于20-25℃和大约1000cm/h的线性流速在两个洗脱阶段中以增加的盐浓度来进行洗脱。通过使用40mM Tris-缓冲液/6mMCaCl2/30mM NaCl pH9.0-9.3进行洗脱而获得级分4，其含有梭菌蛋白酶，以及II型胶原酶。级分5也含有梭菌蛋白酶以及含有I型胶原酶，其是通过在第二洗脱阶段中使用40mM Tris/6mM CaCl2/70mM NaClpH9.0-9.3进行洗脱而获得的。
级分4和5例如通过逆50升H2O透析24小时进行脱盐，并用50mMMES缓冲液调整至5.9-6.1的pH值。这两个级分相互分别在基于苯乙烯/二乙烯基苯材料的阳离子交换柱(例如PerSeptive公司的POROS50HS)上进行层析。对于此目的，将这些级分以大约700cm/h的线性流速于20-25℃上载到柱上，并在相同的条件下进行洗脱。从级分4中洗脱II型胶原酶或者从级分5中洗脱I型胶原酶分别于20-25℃在用10mM MES缓冲液/20-40mM NaCl pH5.9-6.1的第一洗脱阶段中进行。两个级分的梭菌蛋白酶随后分别用10mM MES缓冲液/90-110mMNaCl pH5.9-6.1洗脱。合并含有梭菌蛋白酶的溶液。将所有的溶液进行脱盐，逆2mM CaAc2进行透析，然后冻干。
根据已知的方法(见表)来测定所获得的酶的每个酶活性。此外，用反相层析测定了I型胶原酶、II型胶原酶和梭菌蛋白酶的纯度。结果概括在下表中：
表： 活性 纯度eII型胶原酶 18100U/ga 大约82％I型胶原酶 5180U/gb 大约85％梭菌蛋白酶 322U/mgc 大约90％中性蛋白酶 1560U/mgd
a根据Wünsch E.，Heidrich H.-G.；Z.Physiol.Chem.333，149-151，1963测定；b根据Doi Shibata，Matoba；Anal.BioChem.118，173-184，1981测定；c根据Mitchel，Harrington；MethodsEnzymol.19，635-642，1970测定；d根据Moore，Stein；Biol.Chem.176，367，1948测定；e根据RPC测定。