一种兽用沃尼妙林及其盐的脂质体新剂型及其制备方法 【技术领域】
本发明属于兽用抗生素制剂领域，涉及沃尼妙林及其盐的脂质体新剂型及其制备方法。
背景技术
沃尼妙林(valnemulin)及其盐是新一袋截短侧耳素类半合成抗生素，属二萜烯类，与泰妙菌素属同一类药物，是动物专用抗生素，主要用于防治猪、牛、羊及家禽的支原体病和革兰氏阳性菌感染。1999年由欧共体批准用于预防与治疗由猪痢疾短螺旋体感染引起的猪痢疾和由肺炎支原体感染引起的猪地方性肺炎，它是第一个全欧洲批准的兽用药物预混剂，被列为兽用处方药。
沃尼妙林的普通制剂，如：预混剂、注射液等，用药后药物在血液及组织中均匀分布，没有靶向性，且药物进入血液循环后，要与蛋白结合，经受多种酶、组织、器官的代谢和排泄等，只有少量药物能够达到靶部位。如果要提高靶区的药物浓度，就必须增加剂量，这不仅增加成本，造成药物的浪费，也增大了药物的毒副作用和药物在动物体内的残留，增加了产生耐药性的可能性。
脂质体(liposomes)是新型药物载体，是由脂质双分子层形成的微型囊泡。近年来脂质体作为药物载体的研究愈来愈受到重视，研究进展非常迅速，对脂质体的研究领域逐渐扩大和不断深入。但是，国内外兽用脂质体制剂的相关研究较少，且兽用脂质体制剂的研究主要以抗寄生虫、微量元素、营养药物为主，品种数量上偏少，尤其是缺少抗生素类和消化系统类药物脂质体制剂的研究。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种兽用沃尼妙林(valnemulin)及其盐的脂质体，将沃尼妙林及其盐制成脂质体，提高了药物的组织选择性，提高了药物的疗效，对细胞内细菌及支原体感染亦有效；肺靶向脂质体使药物靶向于肺部，对于肺部感染效果更显著；长循环脂质体显著提高了脂质体在体内的循环时间，使药物更长期更有效的发挥药效。
本发明的另一目的在于提供沃尼妙林及其盐的脂质体的制备方法。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
本发明提供一种兽用沃尼妙林及其盐的脂质体，其特征在于以沃尼妙林或沃尼妙林盐为原料药，以磷脂和胆固醇为膜材。
本发明的沃尼妙林及其盐的脂质体可制备成沃尼妙林或沃尼妙林盐的普通脂质体、肺靶向脂质体或长循环脂质体，制备过程中可根据需要用辅料进行表面修饰。
其中，本发明所述的沃尼妙林盐为沃尼妙林的盐酸盐、磷酸盐或酒石酸盐，所述的磷脂为天然磷脂、合成磷脂或上述二者的混合物。
本发明的沃尼妙林及其盐的脂质体中，沃尼妙林或沃尼妙林盐与磷脂的重量比为2∶1～1∶110。
进一步，沃尼妙林或沃尼妙林盐与磷脂的重量比优选范围为1∶5～1∶50。
其中，沃尼妙林或沃尼妙林盐的肺靶向脂质体的粒径范围为7-30μm，用于进行表面修饰的辅料为N-乙酰氨基甘露糖、氨基甘露糖醇、氨基脱氧甘露糖醇中的任一种；沃尼妙林及其盐的长循环脂质体中用于表面修饰的辅料包括聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、壳聚糖中的任一种。
本发明的肺靶向脂质体中用于进行表面修饰的辅料与磷脂的重量比为1∶5～1∶200；长循环脂质体中用于进行表面修饰的辅料与磷脂的重量比为：1∶5～1∶200。
本发明还提供了该兽用沃尼妙林及其盐的脂质体的制备方法，其步骤如下：
1)将磷脂、胆固醇和/或用于表面修饰的辅料溶于氯仿，置于圆底烧瓶中，旋转蒸发干燥至呈干燥薄层；
2)将沃尼妙林或其盐溶于PBS溶液中；
3)将沃尼妙林或其盐的PBS溶液加到烧瓶中，进行振荡水化，即得沃尼妙林或其盐的脂质体。
本发明的兽用沃尼妙林及其盐的脂质体的制备方法，其制备也可按如下步骤进下：
1)将磷脂、胆固醇和/或用于表面修饰地辅料溶于氯仿或乙醚，置于圆底烧瓶中；
2)将沃尼妙林或其盐溶于PBS溶液中；
3)将沃尼妙林或其盐的PBS溶液加到烧瓶中，进行超声乳化，然后进行减压蒸发，达到胶态后，滴加PBS溶液，继续减压蒸发，即得沃尼妙林或其盐的脂质体。
本发明的兽用沃尼妙林及其盐的脂质体的制备方法，其制备还可按如下步骤进下：
1)将磷脂、胆固醇和/或用于表面修饰的辅料溶于乙醚，置于烧杯中；
2)将沃尼妙林或其盐溶于PBS溶液中；
3)在60℃加热搅拌下，注射入沃尼妙林或其盐的PBS溶液，继续搅拌至挥尽乙醚，即得沃尼妙林或其盐的脂质体。
如进一步将制得的脂质体经过钴60射线灭菌，可制备成沃尼妙林及其盐的脂质体注射液；或将脂质体进行冷冻干燥，即得沃尼妙林及其盐的脂质体冻干粉针。
本发明的沃尼妙林及其盐的脂质体可以降低普通沃尼妙林注射液的毒副作用，提高药效；肺靶向脂质体可以使药更有效的浓集于肺部，显著提高沃尼妙林治疗肺部感染的效果，且毒副作用更低；长循环脂质体能够延长沃尼妙林在体内循环时间，明显延长药物的作用时间，减少给药次数。
通过下列实施例将更具体的说明本发明，但是应理解所述实施例仅是为了说明本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。
【具体实施方式】
实施例1盐酸沃尼妙林脂质体的制备
1)将卵磷脂1000mg、胆固醇100mg溶于20ml氯仿，置于圆底烧瓶中，在旋转蒸发器上，真空蒸发干燥至呈干燥薄层；
2)将150mg盐酸沃尼妙林溶于25ml PBS中；
3)将盐酸沃尼妙林PBS溶液加到烧瓶中，进行振荡水化，即得盐酸沃尼妙林脂质体。
实施例2沃尼妙林脂质体的制备
1)将卵磷脂2000mg、胆固醇100mg溶于20ml氯仿-乙醚(1∶1，V/V)，置于圆底烧瓶中；
2)将40mg沃尼妙林溶于20ml PBS溶液中；
3)将沃尼妙林的PBS溶液加入烧瓶中，进行超声乳化3min，然后进行减压蒸发，达到胶态后，滴加5ml PBS溶液，继续减压蒸发，即得沃尼妙林脂质体。
实施例3磷酸沃尼妙林脂质体的制备
1)将大豆磷脂1000mg、胆固醇150mg溶于30ml乙醚，置于烧杯中；
2)将2000mg磷酸沃尼妙林溶解于25mlPBS溶液中；
3)在60℃加热搅拌下，注射入磷酸沃尼妙林的PBS溶液，继续搅拌至挥尽乙醚，即得磷酸沃尼妙林脂质体。
实施例4酒石酸沃尼妙林脂质体的制备
1)将大豆卵磷脂1100mg、胆固醇100mg溶于20ml氯仿，置于圆底烧瓶中，在旋转蒸发器上，真空蒸发干燥至呈干燥薄层；
2)将酒石酸沃尼妙林10mg溶于25ml PBS中；
3)将沃尼妙林PBS溶液加到烧瓶中，进行振荡水化，即得酒石酸沃尼妙林脂质体。
实施例5盐酸沃尼妙林肺靶向脂质体的制备
1)将大豆磷脂1000mg、胆固醇100mg、N-乙酰氨基甘露糖100mg溶于20ml氯仿-乙醚(1∶1，V/V)，置于圆底烧瓶中；
2)将150mg盐酸沃尼妙林溶解于20ml PBS溶液中；
3)将盐酸沃尼妙林的PBS溶液加入烧瓶中，进行超声乳化3min，然后进行减压蒸发，达到胶态后，滴加5ml PBS溶液，继续减压蒸发，即得盐酸沃尼妙林肺靶向脂质体。
实施例6盐酸沃尼妙林长循环脂质体的制备
1)将大豆磷脂750mg、胆固醇100mg、聚乙二醇-2000120mg溶于乙醚，置于烧杯中；
2)将150mg盐酸沃尼妙林溶解于25mlPBS溶液中；
3)在60℃加热搅拌下，注射入盐酸沃尼妙林的PBS溶液，继续搅拌至挥尽乙醚，即得盐酸沃尼妙林长循环脂质体。
实施例7磷酸沃尼妙林长循环脂质体的制备
1)将大豆磷脂1500mg、胆固醇100mg、聚乙二醇-4000 300mg溶于乙醚，置于烧杯中；
2)将50mg磷酸沃尼妙林溶解于25mlPBS溶液中；
3)在60℃加热搅拌下，注射入磷酸沃尼妙林的PBS溶液，继续搅拌至挥尽乙醚，即得磷酸沃尼妙林长循环脂质体。
实施例8沃尼妙林长循环脂质体的制备
1)将大豆磷脂800mg、胆固醇100mg、聚乙烯吡咯烷酮k30 160mg溶于20ml氯仿中，置于圆底烧瓶中，在旋转蒸发器上，真空蒸发干燥至呈干燥薄层；
2)将沃尼妙林100mg溶于25ml PBS中；
3)将沃尼妙林PBS溶液加到烧瓶中，进行振荡水化，即得沃尼妙林长循环脂质体。
实施例9盐酸沃尼妙林长循环脂质体的制备
1)将大豆磷脂1000mg、DMPC(二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱)200mg、胆固醇100mg、聚乙烯吡咯烷酮k17100mg溶于20ml氯仿，置于圆底烧瓶中，在旋转蒸发器上，真空蒸发干燥至呈干燥薄层；
2)将盐酸沃尼妙林100mg溶于25ml PBS中；
3)将盐酸沃尼妙林PBS溶液加到烧瓶中，进行振荡水化，即得盐酸沃尼妙林长循环脂质体。
实施例10盐酸沃尼妙林长循环脂质体的制备
1)将DPPC(合成二棕榈酰磷脂酰胆碱)2000mg、胆固醇200mg、聚乙烯醇10mg溶于20ml氯仿-乙醚(1∶1，V/V)，置于圆底烧瓶中；
2)将300mg盐酸沃尼妙林溶解于20ml PBS溶液中；
3)将盐酸沃尼妙林的PBS溶液加入烧瓶中，进行超声乳化3min，然后进行减压蒸发，达到胶态后，滴加5ml PBS溶液，继续减压蒸发，即得盐酸沃尼妙林脂质体。
实施例11磷酸沃尼妙林长循环脂质体的制备
1)将大豆磷脂1500mg、DPPC(合成二棕榈酰磷脂酰胆碱)200mg、胆固醇100mg、聚丙烯酰胺100mg溶于30ml乙醚，置于烧杯中；
2)将150mg磷酸沃尼妙林溶解于25mlPBS溶液中；
3)在60℃加热搅拌下，注射入磷酸沃尼妙林的PBS溶液，继续搅拌至挥尽乙醚，即得磷酸沃尼妙林长循环脂质体。
实施例12酒石酸沃尼妙林长循环的脂质体的制备
1)将大豆磷脂1500mg、胆固醇100mg、壳聚糖50mg溶于乙醚，置于烧杯中；
2)将150mg酒石酸沃尼妙林溶解于25mlPBS溶液中；
3)在60℃加热搅拌下，注射入酒石酸沃尼妙林的PBS溶液，继续搅拌至挥尽乙醚，即得酒石酸沃尼妙长循环林脂质体。
实施例13磷酸沃尼妙林肺靶向脂质体的制备
1)将大豆磷脂1200mg、胆固醇100mg、氨基甘露糖醇240mg溶于20ml氯仿-乙醚(1∶1，V/V)，置于圆底烧瓶中；
2)将150mg磷酸沃尼妙林溶解于20mlPBS溶液中；
3)将磷酸沃尼妙林的PBS溶液加入烧瓶中，进行超声乳化3min，然后进行减压蒸发，达到胶态后，滴加5ml PBS溶液，继续减压蒸发，即得磷酸沃尼妙林肺靶向脂质体。
实施例14酒石酸沃尼妙林肺靶向脂质体的制备
1)将大豆磷脂1600mg、胆固醇150mg、氨基脱氧甘露糖醇8mg溶于20ml氯仿-乙醚(1∶1，V/V)，置于圆底烧瓶中；
2)将150mg盐酸沃尼妙林溶解于20ml PBS溶液中；
3)将酒石酸沃尼妙林的PBS溶液加入烧瓶中，进行超声乳化3min，然后进行减压蒸发，达到胶态后，滴加5ml PBS溶液，继续减压蒸发，即得酒石酸沃尼妙林肺靶向脂质体。
实验例1实施例1和实施例6制备的沃尼妙林脂质体的药代动力学研究
实验方法：取15只健康大鼠，随机分成3组，即盐酸沃尼妙林注射液组、盐酸沃尼妙林普通脂质体组、盐酸沃尼妙林长循环脂质体组。实验前禁食一夜，分别股静脉注射相当于10mg/kg沃尼妙林剂量的盐酸沃尼妙林注射液、盐酸沃尼妙林普通脂质体、盐酸沃尼妙林长循环脂质体。给药后0.25、0.5、1、2、4、8、12、24、48h从大鼠眼眶取血0.5ml，离心分离血浆，测定血浆中沃尼妙林的含量。
实验结果：实施例1和实施例6制备的沃尼妙林脂质体的药代动力学实验结果见表1。
表1实施例1和实施例6制备的沃尼妙林脂质体的药代动力学研究
实验例2实施例5制备的沃尼妙林脂质体的肺靶向性研究
实验方法：1、取健康小鼠96只，随机分成两组，即盐酸沃尼妙林注射液组与盐酸沃尼妙林肺靶向脂质体组。实验前禁食一夜，分别静脉注射相当于10mg/kg沃尼妙林剂量的盐酸沃尼妙林注射液和盐酸沃尼妙林肺靶向脂质体，于注射0.5、1、2、4、8、12、24小时，每组随机选取6只小鼠眼眶取血0.5ml，离心分离血浆。断头处死小鼠，剖腹，取出肺，用生理盐水漂洗残留血，滤纸吸干水分，精密称量组织重量，制备成0.5g/ml的肺组织匀浆，检测沃尼妙林含量。
实验结果：实施例5制备的沃尼妙林脂质体的肺靶向研究结果见表2。
表2实施例5制备的沃尼妙林脂质体的肺靶向研究结果
实验例3实施例1制备的盐酸沃尼妙林脂质体的临床药效试验
实验方法：1、选取体重20-30kg，诊断为气喘病的猪60头，随机分为三组，分别为A、B、C组，每组20头。A组静脉注射相当于10mg/kg沃尼妙林剂量的盐酸沃尼妙林注射液，每天注射一次，连用三天。B组静脉注射相当于6mg/kg沃尼妙林剂量的沃尼妙林脂质体，第一天和第三天每天注射一次，共注射两次。C组为阴性对照组不给药。
2、疗效判断。治愈：用药数天后，食欲、呼吸恢复正常，咳嗽、喘气完全消失，停药后10天内不复发者，称为治愈；好转：临床症状有所减轻，或临床症状暂时消失，但停药后10天内又复发者，称为好转。
实验结果：实施例1制备的盐酸沃尼妙林脂质体的临床药效试验结果见表3。
表3按照实施例1制备的盐酸沃尼妙林脂质体的临床药效试验结果
组别 治愈数 (头) 治愈率 (％) 好转数 (头) 好转率 (％) 无效数 (头) 无效率 (％) A组 15 75 5 25 0 0 B组 19 95 1 5 0 0 C组 0 0 2 10 18 90