使用包含超极化13C-丙酮酸盐的成像介质使肿瘤分级的MR方法 【技术领域】
本发明涉及使用包含超极化13C-丙酮酸盐的成像介质使肿瘤分级的MR方法。
背景技术
前列腺癌是男性中除皮肤癌外最常见类型的癌症，并且是癌症死亡的第二个主要原因。危险因素包括年龄；发病率在超过65岁的男性中增加。它在西方世界更流行，并且10％的病例可以与家族史相关。前列腺癌是连续体，通过局部化、局部晚期、晚期和激素难治阶段进展。一般而言它是缓慢发展的癌症，其一般在激素即睾酮的控制下。治疗的选择依赖于疾病病期，并且如果早期检测且适当治疗，那么存活率极佳。
前列腺癌的呈现征和症状根据其在腺中的起始位点及其牵涉程度而变。大多数癌症在周围区中出现，并且在早期发展阶段中不产生症状。在周围区中出现或在尿道上扩大且侵入的那些可能产生踌躇，尿流力中的减少、间歇现象和排泄后渗漏。然而，所有这些症状可能由于其他原因而发生，并且不存在可以阳性表征前列腺癌的诊断症状或排泄模式。由于改善的公众警觉和筛选技术，前列腺癌在较早的发展阶段中被诊断，通常在缺乏症状或无症状的男性中。
目前使用的筛选程序是PSA(前列腺特异性抗原)测量。PSA是由前列腺分泌的酶，并且它用作用于前列腺疾病的标记。如果不用于筛选，那么将通常作为鉴定某人可能具有前列腺癌的过程的部分来测定PSA。特别地太小而在直肠指该(DRE)上无法触及的肿瘤仅可在PSA测试上被怀疑。
为了证实DRE/PSA的任何发现，通常使用经直肠超声检查(TRUS)和TRUS指导的针吸活组织检查。然而，特别对于在前列腺中的小局部化肿瘤，发现可能是假阴性或假阳性的：用TRUS获得的低回声(hypoechogenic)图像的仅20-25％病例证实是前列腺癌。另一方面，25％前列腺肿瘤是等回声(isoechogenic)的。在活组织检查中，通常获取来自前列腺的不同区域的5-8个平均间隔的样品。在小肿瘤的情况下，活组织检查针可能完全“错过”肿瘤。
在WO-A-2006/011810中，公开了体内MR成像方法，其允许区分健康和肿瘤组织，特别是前列腺肿瘤组织。在该方法中使用包含超极化13C-丙酮酸盐的成像介质。
丙酮酸盐是甚至在高浓度也由人体非常良好地耐受的内源化合物。作为柠檬酸循环中的前体，丙酮酸盐在人体中起重要的代谢作用。丙酮酸盐转化成不同化合物：它的转氨基作用导致丙氨酸，经由氧化脱羧作用，丙酮酸盐转化成乙酰辅酶A和碳酸氢盐，丙酮酸盐的还原导致乳酸盐且其羧化导致草酰乙酸盐。
超极化13C-丙酮酸盐代谢转化成其代谢物超极化13C-乳酸盐、超极化13C-碳酸氢盐(仅在13C1-丙酮酸盐、13C1，2-丙酮酸盐或13C1，2，3-丙酮酸盐的情况下)和超极化13C-丙氨酸可以用于人体中的代谢过程的体内MR研究。13C1-丙酮酸盐在人全血中于37℃具有约42秒的T1弛豫，然而，已发现超极化13C-丙酮酸盐转化成超极化13C-乳酸盐、超极化13C-碳酸氢盐和超极化13C-丙氨酸足够快速，以允许来自13C-丙酮酸盐母体化合物及其代谢物的信号检测。丙氨酸、碳酸氢盐和乳酸盐的量依赖于在研究下的组织的代谢状态。超极化13C-乳酸盐、超极化13C-碳酸氢盐和超极化13C-丙氨酸的MR信号强度与这些化合物的量和在检测时剩下的极化程度相关，从而通过监控超极化13C-丙酮酸盐至超极化13C-乳酸盐、超极化13C-碳酸氢盐和超极化13C-丙氨酸的转化，可能通过使用非侵袭性MR成像或MR波谱学，研究在人或非人动物体内的体内代谢过程。
已发现起于不同13C-丙酮酸盐代谢物的MR信号振幅且因此信号强度依赖于组织类型而改变。丙氨酸、乳酸盐、碳酸氢盐和丙酮酸盐的信号强度的独特MR代谢模式可以用作用于在检查下的组织的代谢状态的指纹，并且因此允许区分健康组织和肿瘤组织。超极化13C-丙酮酸盐及其代谢物采集的13C-MR图像中的肿瘤组织由最高的乳酸盐信号或高加权乳酸盐超过丙酮酸盐或乳酸盐超过丙氨酸信号指示，如WO-A-2006/011810中详细描述的。
磁共振(MR)检测例如MR成像(MRI)和MR波谱学(MRS)可以是用于检测前列腺癌地有价值的工具，并且这些工具已变得对医生特别有吸引力，因为它们允许以非侵袭性方式获得患者身体或其部分的图像，并且无需使患者和医护人员暴露于潜在有害的辐射例如X射线。因为它的高品质图像和良好的空间和时间分辨率，MRI是软组织和器官的有利的成像技术。
目前已发现前列腺癌使用包含超极化13C-丙酮酸盐的成像介质的体内MR成像和/或MR波谱学可能不仅用于区分健康和肿瘤组织，而且还用于评估前列腺肿瘤侵占性，即肿瘤分级。
前列腺癌的组织学分级是评估疾病的后果或预后的重要部分。前列腺癌的准确分级可以帮助预测疾病的行为和侵占性以及对于患者可能的后果。
分级系统可以评估细胞退行发育(尺寸、形状和染色性质中的变化)和分化的程度，即分化细胞在肿瘤中如何良好。在早期癌症病期中，细胞通常是分化良好的，并且以类似于它们起于其的组织的方式起作用。随着癌症进展，细胞变得较不分化，并且开始看起来且表现得不同于其祖先。
各种分级系统已得到开发，但最广泛用于前列腺癌的一种是Gleason系统。Gleason分级系统基于肿瘤细胞排列成可识别的腺结构的程度和细胞分化水平。Gleason系统鉴定增加疾病侵占性的5个水平，其中1级是最小侵占性的，并且5级是最大侵占性的癌症。
因为大多数前列腺癌是异质的，即具有处于不同Gleason级别的细胞的混合物，所以将2个最占优势的级别加在一起以产生Gleason得分。这个得分提供有用的预后信息，并且连同其他参数一起用于做出关于前列腺癌治疗的决定。Gleason得分超过4与更快速的疾病进展危险，转移潜力增加和存活减少相关。
尽管Gleason分级是在客观定量上的尝试，但组织学分级由于其性质是主观的。样品由衍生自肿瘤的活组织检查样品的细胞制备，其随后由熟练的病理学家进行显微镜术检查。重要问题是在阅读相同样品中观察者间(interobserver)和观察者内(intraobserver)的变异性程度。可能变得需要获得几个病理学家的观点以达到关于个体肿瘤级别的一致意见。同样，Gleason分级需要前列腺组织样品用于分析，所述前列腺组织样品必须通过(TRUS指导的)活组织检查获得。如较早提及的，来自活组织检查的结果可能是假阴性的，因为特别是在小肿瘤的情况下，活组织检查针可能完全“错过”肿瘤。
因此需要比前列腺组织的活组织检查样品的现在主观病理学分析更一致地预示前列腺癌的侵占性的方法。
如较早描述的，前列腺组织的代谢状态可以通过前列腺的体内MR成像进行评估，其中使用包含超极化13C-丙酮酸盐的成像介质。肿瘤组织的特征在于比健康组织更高的代谢活性，并且可以观察到增加的丙酮酸盐至乳酸盐转化，这导致在此种肿瘤组织中的高13C-乳酸盐信号，从而使得可能区分肿瘤组织与健康组织且因此鉴定肿瘤组织。
【发明内容】
令人惊讶地，我们目前已发现超极化13C-丙酮酸盐及其代谢物的MR信号可以用于评估前列腺癌侵占性和恶性程度，并且因此可以用于分级前列腺癌。然而，这些发现并不限于前列腺癌，而是还可以转移给其他癌症类型。因此通过使用包含超极化13C-丙酮酸盐的成像介质的MR检测，不仅可能鉴定肿瘤组织，而且还可以做出所述肿瘤的侵占性和恶性程度的预测，即，使用完全非侵袭性方法分级肿瘤。
因此在第一个方面，本发明提供了测定肿瘤级别的方法，所述方法包括
a)使用包含超极化13C-丙酮酸盐的成像介质MR检测受试者中的肿瘤，其中检测13C-丙酮酸盐及其含13C代谢物丙氨酸、乳酸盐和任选地碳酸氢盐的信号；
b)使用所述信号和任选地总碳信号，以产生肿瘤的代谢概况；
c)使步骤b)中产生的肿瘤的代谢概况与特定级别肿瘤的已知代谢概况相比较；和
d)基于所述肿瘤的代谢概况和所述已知代谢概况之间的相似性和差异测定肿瘤的级别。
我们已发现早期原发性肿瘤(低级别肿瘤)、晚期原发性肿瘤(高级别肿瘤)和转移灶的确具有特征性代谢概况，即当用包含超极化13C-丙酮酸盐的成像介质MR检测时，13C-丙酮酸盐及其含13C代谢物丙氨酸、乳酸盐和任选地碳酸氢盐的信号的特征模式。因此通过使其代谢概况与已知代谢概况相比较，可能测定肿瘤的级别。当肿瘤从早期原发性肿瘤进展至晚期原发性肿瘤时，与早期肿瘤相比较，乳酸盐信号、总碳信号(乳酸盐加丙氨酸加丙酮酸盐和任选地加碳酸氢盐的信号总和)和——至较少程度——丙氨酸信号在晚期肿瘤中显著更高。此外，校正的乳酸盐信号，即乳酸盐对丙酮酸盐、乳酸盐对丙氨酸和乳酸盐对总碳在晚期肿瘤中也显著高于早期肿瘤中。就乳酸盐信号和总碳信号而言，关于转移灶的发现在早期和晚期肿瘤中观察到的那些之间的某处。由于这些特征发现，通过使其代谢概况与特定级别肿瘤的已知代谢概况相比较，即早期原发性肿瘤的已知代谢概况、晚期原发性肿瘤的已知代谢概况或转移灶的已知代谢概况，可能测定肿瘤的级别，即早期原发性肿瘤或晚期原发性肿瘤或转移灶。
本发明中还包含了同时鉴定肿瘤且测定其级别的方法。该方法基于上文描述的方法，并且检查怀疑具有肿瘤的受试者。通过使疑似肿瘤的代谢概况与特定级别肿瘤的已知代谢概况相比较，可以测定受试者究竟是否具有肿瘤，并且如果肿瘤存在，那么测定所述肿瘤的级别。
本发明的方法一般可以用于测定肿瘤的级别。对于许多类型的癌症，存在确立的特定分级系统，并且级别通常在数字上和/或叙述地评价。肿瘤可以以在数字上和/或叙述地评价的5级到2级等级中进行分级，这依赖于癌症的类型。作为例子，乳腺癌通过Scarff-Bloom-Richardson(S-B-R)系统进行传统分级，并且当在乳腺肿瘤处分级时，使用S-B-R系统的病理学家注意3个结构特征：核多形性(1)、有丝分裂指数(2)和导管腺(ductoglandular)分化(3)。肿瘤通过各自标准分开地分级，其中I是最正常的(分化的)，并且III是最异常的(未分化的)。3个标准的得分对于最终肿瘤级别相加。因此，得分可以是3-5(分化良好的)至6-7(中等分化的)和8-9(分化不良的)。作为另一个例子，前列腺癌通过如较早描述的Gleason系统进行分级。Gleason系统鉴定增加疾病侵占性的5个水平，其中1级是最小侵占性的，并且5级是最大侵占性的癌症。为了补偿肿瘤异质性，将2个最占优势的肿瘤级别加在一起以产生Gleason得分。
对于在其结果中比仅使它们分组在2级(低对高级别肿瘤)或3级(低对中间对高级别肿瘤)分级系统中更详细的分级系统，优选使用简化比较步骤c)和级别测定步骤d)的本发明的实施方案。
因此，本发明的另一个方面是测定肿瘤级别的方法，所述方法包括
a)使用包含超极化13C-丙酮酸盐的成像介质MR检测受试者中的肿瘤，其中检测13C-丙酮酸盐及其含13C代谢物丙氨酸、乳酸盐和任选地碳酸氢盐的信号；和
b)使用所述信号和任选地总碳信号，以由此种信号对肿瘤级别的标准曲线测定肿瘤的级别。
该方法基于一个标准曲线或几个标准曲线的使用，所述标准曲线使超极化13C-丙酮酸盐及其含13C代谢物丙氨酸、乳酸盐和任选地碳酸氢盐的信号与肿瘤的组织病理学级别关联。所述一个或多个标准曲线是统计学上显著的标准曲线，其可以得自具有特定癌症类型的患者群体。
作为例子，患者群体可以是具有前列腺癌的患者群体，即患者具有在前列腺中的肿瘤，并且这些肿瘤具有不同级别的侵占性/恶性。所述患者群体经历前列腺的MR检查，在检查中施用包含超极化13C-丙酮酸盐的成像介质，并且其中随后检测且记录13C-丙酮酸盐及其含13C代谢物丙氨酸、乳酸盐和任选地碳酸氢盐的MR信号。这个患者群体中的肿瘤也由病理学家使用Gleason系统进行组织病理学分级，并且将2个最占优势的肿瘤级别加在一起以产生Gleason得分。在患者中测定的Gleason得分与其MR检查结果关联。本领域已知的各种不同的统计学方法可以用于做出这种关联。为了获得统计学上显著的标准曲线，对于统计学上相关数目的患者即患者群体执行所述关联。
定义
在本发明上下文中的术语“肿瘤级别”指察觉到的所述肿瘤的侵占性和/或恶性程度。
术语“MR检测肿瘤[......]，其中检测13C-丙酮酸盐及其含13C代谢物丙氨酸、乳酸盐和任选地碳酸氢盐的信号”意指检测13C-丙酮酸盐的信号和/或检测其含13C代谢物丙氨酸的信号和/或检测其含13C代谢物乳酸盐的信号和任选地检测其含13C代谢物碳酸氢盐的信号。这意指检测所有信号，即母体化合物13C-丙酮酸盐和所有其含13C代谢物的信号，或仅检测单个化合物，即母体化合物13C-丙酮酸盐或其含13C代谢物之一的信号，或检测更多但并非所有化合物，即例如13C-丙酮酸盐和13C-乳酸盐、13C-丙酮酸盐和13C-丙氨酸或13C-乳酸盐和13C-丙氨酸的信号。上述术语包括13C-丙酮酸盐及其含13C代谢物的信号的所有组合。
在本发明上下文中的术语“受试者”指任何活或非活的脊椎动物，优选活或非活的哺乳动物如人或非人哺乳动物，优选活的哺乳动物和最优选活的人。
术语“超极化”在下文中与术语“极化”可互换使用，并且指超过0.1％、更优选超过1％和最优选超过10％的核极化水平。
在本发明上下文中的术语“信号”指MR波谱中关于峰噪声的MR信号振幅或积分或峰面积，其代表13C-丙酮酸盐和/或其含13C代谢物丙氨酸、乳酸盐和任选地碳酸氢盐。在一个优选实施方案中，信号强度是峰面积。
在本发明上下文中的术语“总碳信号”指13C-丙酮酸盐、13C-乳酸盐、13C-丙氨酸和任选地13C-碳酸氢盐的信号总和。
在本发明上下文中的术语“肿瘤的代谢概况”意指13C-丙酮酸盐和/或其含13C代谢物丙氨酸和/或其含13C代谢物乳酸盐和任选地其含13C代谢物碳酸氢盐的信号的特征模式。这意指在一个实施方案中，所有信号，即母体化合物13C-丙酮酸盐和所有其含13C代谢物的信号都用于产生肿瘤的代谢概况，并且在另一个实施方案中，仅单个化合物，即母体化合物13C-丙酮酸盐或其含13C代谢物之一的信号用于产生肿瘤的代谢概况。在另外一个实施方案中，2个或更多信号用于产生肿瘤的代谢概况，例如母体化合物13C-丙酮酸盐的信号和13C-乳酸盐的信号，或13C-丙酮酸盐和13C-丙氨酸的信号，或13C-丙酮酸盐、13C-乳酸盐和13C-丙氨酸的信号。上述代谢概况可以使用13C-丙酮酸盐及其含13C代谢物的信号的所有组合来产生。根据本发明“肿瘤的代谢概况”还可以包括或使用处理的信号数据产生，例如信号比、校正信号、或由多重MR检测的信号模式推导的动力学或代谢率常数信息，即波谱或图像。
在本发明上下文中的术语“特定肿瘤级别的已知代谢概况”意指特定级别肿瘤的13C-丙酮酸盐和/或其含13C代谢物丙氨酸、乳酸盐和任选地碳酸氢盐的信号的特征模式，所述特定级别肿瘤例如早期原发性肿瘤(低级别肿瘤)、晚期原发性肿瘤(高级别肿瘤)或转移灶，并且其中所述特征模式已如先前段落中“肿瘤的代谢概况”的定义中所述产生。
在本发明上下文中的术语“肿瘤病期”指癌症随着时间过去的进展，并且意指早期原发性肿瘤、晚期原发性肿瘤或转移灶。转移灶可能接近原发性肿瘤发生，例如在局部淋巴结中，或在远离原发性肿瘤的位点处，例如在非局部淋巴结、骨或其他位点中。
术语“肿瘤的组织病理学级别”指在用显微镜术检查例如得自肿瘤活组织检查的肿瘤部分后，由病理学家给出的肿瘤级别。
术语“信号的标准曲线”指13C-丙酮酸盐和/或其含13C代谢物丙氨酸、乳酸盐和任选地碳酸氢盐的信号对肿瘤级别的统计学上显著的标准曲线。它通过使13C-丙酮酸盐和/或其含13C代谢物丙氨酸、乳酸盐和任选地碳酸氢盐的信号与肿瘤的组织病理学级别关联而获得。尽管以单独形式书写，但它可以涉及单个标准曲线或一个或多个标准曲线。
术语“特定肿瘤级别”指其级别已知的肿瘤。
除非另有说明，术语“超极化13C-丙酮酸盐”、“13C-丙酮酸盐”和“丙酮酸盐”在下文中可互换使用。以相同方式，除非另有说明，术语“超极化13C-乳酸盐”、“13C-乳酸盐”和“乳酸盐”，术语“超极化13C-丙氨酸”、“13C-丙氨酸”和“丙氨酸”，以及术语“超极化13C-碳酸氢盐”、“13C-碳酸氢盐”和“碳酸氢盐”在下文中可互换使用。
发明详述
如较早提及的，在第一个方面，本发明提供了测定肿瘤级别的方法，所述方法包括
a)使用包含超极化13C-丙酮酸盐的成像介质MR检测受试者中的肿瘤，其中检测13C-丙酮酸盐及其含13C代谢物丙氨酸、乳酸盐和任选地碳酸氢盐的信号；
b)使用所述信号和任选地总碳信号，以产生肿瘤的代谢概况；
c)使步骤b)中产生的肿瘤的代谢概况与特定级别肿瘤的已知代谢概况相比较；和
d)基于所述肿瘤的代谢概况和所述已知代谢概况之间的相似性和差异测定肿瘤的级别。
在步骤a)中，通过MR检测受试者、优选活的哺乳动物、更优选活的人或非人哺乳动物、最优选活的人中的肿瘤。
在一个实施方案中，所述MR检测是MR成像或MR波谱学或组合的MR成像和MR波谱学，即MR波谱学成像。在另一个实施方案中，所述MR检测是在各个时间点时的MR波谱学成像，以测定母体化合物13C-丙酮酸盐和/或其含13C代谢物的改变率。在另外一个实施方案中，所述MR检测设计为推导代谢率常数、动力学或肿瘤进展的其他特征。在优选实施方案中，对于13C-MR波谱学图像中的每个空间点获得来自乳酸盐、丙酮酸盐和丙氨酸的分辨信号的波谱域积分。在另一个优选实施方案中，来自特定含13C代谢物的图像的强度用于产生本发明方法的步骤b)中的代谢概况。
在本发明的MR检测中，使用包含超极化13C-丙酮酸盐的成像介质。
在本发明方法中使用的所述成像介质中的超极化13C-丙酮酸盐的同位素富集优选是至少75％、更优选至少80％和特别优选至少90％，超过90％的同位素富集是最优选的。理想地，富集是100％。在本发明方法中使用的所述成像介质中的13C-丙酮酸盐可以在下述位置处进行同位素富集：C1位(在下文中命名为13C1-丙酮酸盐)、C2位(在下文中命名为13C2-丙酮酸盐)、C3位(在下文中命名为13C3-丙酮酸盐)、C1和C2位(在下文中命名为13C1，2-丙酮酸盐)、C1和C3位(在下文中命名为13C1，3-丙酮酸盐)、C2和C3位(在下文中命名为13C2，3-丙酮酸盐)、或C1、C2和C3位(在下文中命名为13C1，2，3-丙酮酸盐)。在C1位处的同位素富集是优选的，因为13C1-丙酮酸盐在人全血中于37℃(约42秒)具有比在其他C位处同位素富集的13C-丙酮酸盐更高的T1弛豫。
同位素富集的13C-丙酮酸盐是商购可得的，例如作为13C-丙酮酸钠。可替代地，它可以如由S.Anker，J.Biol.Chem.176，1948，133-1335所述进行合成。
几种超极化技术公开于WO-A-99/35508中，其引入本文作为参考，并且其中之一是动态核极化(DNP)技术，其优选用于13C-丙酮酸盐的超极化。在DNP中，待极化的化合物即样品中的MR活性核的极化受极化试剂或所谓的DNP试剂——包含不成对电子的化合物影响。在DNP过程中，提供了正常以微波辐射形式的能量，其将最初激发DNP试剂。在衰变成基态后，存在极化从DNP试剂的不成对电子到样品的NMR活性核的转移。一般地，在DNP过程中使用中等或高磁场和非常低的温度，例如通过在液氦和约1T或以上的磁场中执行DNP过程。可替代地，可以采用中等磁场和在其下达到足够的极化富集的任何温度。DNP技术例如在WO-A-98/58272和WO-A-01/96895中进一步描述，所述2个专利申请包括在本文中作为参考。
为了通过DNP方法使样品极化，制备所述样品即待极化的化合物和DNP试剂的混合物，其随后进行冷冻且插入DNP极化器内用于极化。在极化后，通过使其熔化或通过使其溶解于合适的溶解介质中，将包含超极化样品的混合物快速转变成液态。溶解是优选的，并且包含DNP极化化合物的冷冻混合物的溶解过程和合适的装置因此在WO-A-02/37132中详细描述。熔化过程和用于熔化的合适装置例如在WO-A-02/36005中描述。
为了获得高极化样品，样品和DNP试剂在DNP过程期间需处于紧密接触中。如果包含样品和DNP试剂的混合物在冷冻或冷却后结晶，那么情况不是这样。为了避免结晶，需要在混合物中存在玻璃形成体，或需要选择用于极化的化合物，其在冷冻后不结晶而是形成玻璃。
为了通过DNP方法获得超极化13C-丙酮酸盐，13C-丙酮酸或13C-丙酮酸盐适当地用作原材料。
用于合成13C1-丙酮酸的几种方法是本领域已知的。简言之，Seebach等人，Journal of Organic Chemistry 40(2)，1975，231-237描述了合成途径，其依赖于含羰基原材料作为S，S-缩醛的保护和活化，例如1，3-二噻烷或2-甲基-1，3-二噻烷。二噻烷是金属化的(metallated)，并且与含甲基化合物和/或13CO2反应。通过使用如这个参考文献中概述的合适的同位素富集的13C-组分，可能获得13C1-丙酮酸盐、13C2-丙酮酸盐或13C1，2-丙酮酸盐。羰基官能随后通过使用文献中描述的常规方法得到释放。不同的合成途径从乙酸开始，这首先转化成乙酰溴，然后与Cu13CN反应。获得的腈经由酰胺转化成丙酮酸(参见例如S.H.Anker等人，J.Biol.Chem.176(1948)，1333或J.E.Thirkettle，Chem Commun.(1997)，1025)。此外，13C-丙酮酸可以通过使商购可得的13C-丙酮酸钠质子化而获得，例如通过美国专利6,232,497中描述的方法或通过WO-A-2006/038811中描述的方法。13C-丙酮酸盐是商购可得的化合物。
13C-丙酮酸通过DNP的超极化在WO-A1-2006/011809中详细描述，所述专利申请引入本文作为参考。简言之，13C-丙酮酸可以直接用于DNP，因为当冷冻时它形成玻璃。在DNP后，冷冻的超极化13C-丙酮酸需要液化，例如溶解且中和，即转化成13C-丙酮酸盐。对于转化，需要强碱。此外，因为13C-丙酮酸是强酸，所以需要选择在这种强酸中稳定的DNP试剂。
可替代地，13C-丙酮酸盐，即13C-丙酮酸的盐可以用于DNP。优选的盐是那些13C-丙酮酸盐，其包含来自NH4+、K+、Rb+、Cs+、Ca2+、Sr2+和Ba2+的无机阳离子，优选NH4+、K+、Rb+或Cs+，更优选K+、Rb+、Cs+，且最优选Cs+，如WO-A2-2007/111515中详细描述且引入本文作为参考的。这些优选13C-丙酮酸盐的合成也公开于WO-A2-2007/111515中。
进一步优选的盐是有机胺或氨基化合物的13C-丙酮酸盐，优选TRIS-13C1-丙酮酸盐或葡甲胺-13C1-丙酮酸盐，如WO-A2-2007/069909中详细描述且引入本文作为参考的。这些优选13C-丙酮酸盐的合成也公开于WO-A2-2007/069909中。
超极化(核极化)水平可以例如通过在固体例如冷冻超极化样品中的NMR活性核的固态NMR测量进行测定。对于13C-丙酮酸盐，超极化样品中的NMR活性核是13C，并且因此可以采集13C-丙酮酸盐或13C-丙酮酸的固态13C-NMR。固态13C-NMR测量优选由使用低倾倒角的简单脉冲-采集NMR序列组成。使NMR波谱中超极化样品的信号强度与在其超极化前采集的NMR波谱中的样品信号强度相比较。随后由超极化前和后的信号强度比计算极化水平。
以相似方式，关于以液态(溶解的或在给定温度下是液体)超极化样品的极化水平可以通过液体超极化样品中的NMR活性核的液态NMR测量进行测定。再次，使溶解的超极化样品的信号强度与溶解样品在其超极化前的信号强度相比较。随后由样品在超极化前和后的信号强度比计算极化水平。
在本发明方法中使用的包含超极化13C-丙酮酸盐的成像介质优选如WO-A1-2006/011809中所述进行配制，所述专利申请还公开了合适的施用规程和剂量。
在成像介质施用后小于400秒时，优选小于120秒，更优选在施用后小于60秒，特别优选在施用后20-50秒，并且最优选在施用后30-40秒，应用MR成像序列，其以组合频率和空间选择方式编码目的体积即肿瘤，并且采集所述目的体积的直接13C-MR图像和/或MR波谱，以获得13C-丙酮酸盐及其代谢物13C-乳酸盐、13C-丙氨酸和任选地13C-碳酸氢盐的信号强度。
在优选实施方案中，专用的射频线圈优选专用的13C-线圈用于MR检测。所使用的线圈类型当然依赖于肿瘤位置/癌症类型。作为例子，鸟笼式线圈可以用于脑中肿瘤的MR检测，并且直肠内(endorectal)线圈可以用于前列腺中肿瘤的MR检测。
在本发明方法的步骤b)中，上述13C-丙酮酸盐及其代谢物13C-乳酸盐、13C-丙氨酸和任选地13C-碳酸氢盐的信号和任选地总碳信号用于产生肿瘤的代谢概况。
在一个实施方案中，13C-丙酮酸盐及其代谢物13C-乳酸盐、13C-丙氨酸和任选地13C-碳酸氢盐(在下文中表示为“13C-丙酮酸盐及其代谢物”)的波谱信号强度用于产生肿瘤的代谢概况。在另一个实施方案中，13C-丙酮酸盐及其代谢物的波谱信号积分用于产生肿瘤的代谢概况。在另一个实施方案中，来自13C-丙酮酸盐及其代谢物的分开图像的信号强度用于产生肿瘤的代谢概况。在另外一个实施方案中，在2个或更多时间点上获得信号强度，以计算13C-丙酮酸盐和/或其代谢物的变化比。
在一个实施方案中，所有信号都用于产生肿瘤的代谢概况，即13C-丙酮酸盐以及13C-乳酸盐和13C-丙氨酸和任选地13C-碳酸氢盐的信号。此外，总碳信号，即13C-乳酸盐、13C-丙氨酸、13C-丙酮酸盐和任选地13C-碳酸氢盐的信号总和可以用于产生肿瘤的代谢概况。在另一个实施方案中，一种或多种选择的信号用于产生肿瘤的代谢概况。因此，在优选实施方案中，乳酸盐信号和/或丙氨酸信号和/或总碳信号用于产生肿瘤的代谢概况。在进一步优选的实施方案中，乳酸盐信号和/或总碳信号用于产生肿瘤的代谢概况。
在另一个实施方案中，肿瘤的代谢概况包括或使用处理的信号数据产生，例如信号比、校正信号、或由多重MR检测的信号模式推导的动力学或代谢率常数信息，即波谱或图像。因此，在一个优选实施方案中，校正的乳酸盐信号，即乳酸盐对丙氨酸信号和/或乳酸盐对丙酮酸盐信号和/或乳酸盐对总碳信号用于产生肿瘤的代谢概况。在另一个优选实施方案中，处理的信号导致对于所述每个图像点的代谢概况特征性的关于每个图像点的数。
在本发明方法的步骤c)中，使步骤b)中获得的肿瘤代谢概况与特定级别肿瘤的已知代谢概况相比较。
特定级别肿瘤的已知概况优选基于统计学上显著数目的具有特定类型癌症的患者的MR检查。作为例子，统计学上显著数目的具有前列腺癌的患者，即具有在前列腺中的肿瘤的患者用于产生特定级别的前列腺肿瘤的已知概况。在一个实施方案中，将包含超极化13C-丙酮酸盐的成像介质施用于患者，并且随后检测且记录13C-丙酮酸盐及其含13C代谢物丙氨酸、乳酸盐和任选地碳酸氢盐的MR信号。这些信号和任选地总碳信号用于以先前段落中描述的方式产生每个患者的肿瘤的代谢概况。这些患者中的肿瘤也由病理学家使用Gleason系统进行组织病理学分级，并且将2个最占优势的肿瘤级别加在一起以产生Gleason得分。合并具有相同Gleason得分的患者的代谢概况，并且通过本领域已知的统计学方法产生这些与给定Gleason得分关联的合并概况的“平均”代谢概况。此种“平均”代谢概况是特定级别肿瘤的已知代谢概况。
在一个实施方案中，已知代谢概况包含所有信号，即13C-丙酮酸盐以及13C-乳酸盐和13C-丙氨酸和任选地13C-碳酸氢盐的信号。此外，它可以包含总碳信号，即乳酸盐、丙氨酸、丙酮酸盐和任选地碳酸氢盐的信号总和。在另一个实施方案中，已知代谢概况包含一种或多种选择的信号。因此，在优选实施方案中，乳酸盐信号和/或丙氨酸信号和/或总碳信号存在于所述已知代谢概况中。在进一步优选的实施方案中，乳酸盐信号和/或总碳信号存在于所述已知代谢概况中。
在另一个进一步优选的实施方案中，已知代谢概况包含处理的信号数据，例如信号比、校正信号、或由多重MR检测的信号模式推导的动力学或代谢率常数信息，即波谱或图像。因此，在优选实施方案中，已知代谢概况包含校正的乳酸盐信号，即乳酸盐对丙氨酸信号和/或乳酸盐对丙酮酸盐信号和/或乳酸盐对总碳信号。在另一个优选实施方案中，处理的信号导致对于所述每个图像点的代谢概况特征性的关于每个图像点的数。
已知代谢概况可以以表格的形式，即显示关于上述一种或多种信号的信号值。在另一个实施方案中，此种已知概况可以以图表的形式。在另外一个实施方案中，此种已知概况可以以数据集的形式，并且所述数据集存储在计算机可读介质上。
在其最简单的实施方案中，比较可以通过本发明方法的步骤b)中产生的肿瘤代谢概况与特定级别肿瘤的已知代谢概况的视觉比较来完成。在另一个实施方案中，比较以自动化方式完成，例如通过使用比较2个代谢概况的合适软件。在一个实施方案中，使步骤b)中产生的肿瘤代谢概况与特定级别肿瘤的单个已知代谢概况相比较。作为例子，使步骤b)中产生的肿瘤例如前列腺肿瘤的代谢概况与具有Gleason得分4(2+2)的前列腺肿瘤的单个已知代谢概况相比较。如果在检查下的前列腺肿瘤的代谢概况和具有Gleason得分4(2+2)的前列腺肿瘤的已知代谢概况是高度相似的，那么将不存在使所述代谢概况与具有其他Gleason得分(例如Gleason得分8(4+4))的前列腺肿瘤的其他已知代谢概况相比较的立即需要。然而，通常使步骤b)中产生的肿瘤代谢概况与几个特定级别肿瘤的几个已知代谢概况相比较。在优选实施方案中，步骤b)中获得的代谢概况显示为在解剖图像上的参数图像重叠，其中使用与肿瘤级别相关的颜色和/或数字。通过这样做，获得的图像重叠提供了关于肿瘤级别和肿瘤病期，即肿瘤的程度和位置的组合信息。在另一个优选实施方案中，肿瘤面积以解剖图像例如质子解剖图像定义，并且这个肿瘤面积与其在步骤b)中获得的代谢概况随后构成用于自动化计算肿瘤级别的基础。同样，分级依赖于表格、数据库等中级别的自动化查找。
在本发明方法的步骤b)中，在检查下的肿瘤级别基于肿瘤的代谢概况和特定级别肿瘤的已知代谢概况之间的相似性和差异进行测定。以简化方式，已知代谢概况和在检查下的肿瘤代谢概况之间的相似性越高，在检查下的肿瘤具有与已知代谢概况所基于的肿瘤相同级别的可能性越高。显而易见的是存在本领域众所周知的统计学方法，以评估且计算肿瘤代谢概况和特定级别肿瘤的已知代谢概况之间的相似性或差异程度，并且此种统计学方法的使用是优选的。
在本发明的第二个方面是测定肿瘤级别的方法，所述方法包括
a)使用包含超极化13C-丙酮酸盐的成像介质MR检测受试者中的肿瘤，其中检测13C-丙酮酸盐及其含13C代谢物丙氨酸、乳酸盐和任选地碳酸氢盐的信号；和
b)使用所述信号以由此种信号对肿瘤级别的标准曲线测定肿瘤的级别。
如较早提及的，上述方法基于一个标准曲线或几个标准曲线的使用，所述标准曲线使13C-丙酮酸盐及其含13C代谢物的信号与肿瘤的组织病理学级别关联。所述一个或多个标准曲线是统计学上显著的标准曲线，其可以以如这个申请中较早描述的方式得自具有特定癌症类型的患者群体。
上述方法特别适合于具有确立的分级系统的癌症类型，所述分级系统在其结果中比仅使这些结果分组在2级(低对高级别肿瘤)或3级(低对中间对高级别肿瘤)分级系统中更详细。在一个优选实施方案中，上述方法用于分级前列腺癌，即前列腺中的肿瘤的分级。
上述方法的步骤a)等同于本发明第一个方面的方法的步骤a)，并且因此对于在本发明第一个方面的方法的步骤a)描述且在其背景中的所有实施方案和优选实施方案也应用于本发明第二个方面的方法的步骤a)。
在上述方法的步骤b)中，13C-丙酮酸盐及其代谢物13C乳酸盐、13C丙氨酸和任选地13C碳酸氢盐的信号用于由此种信号对肿瘤级别的标准曲线测定肿瘤级别。
因此，在一个实施方案中，13C-丙酮酸盐及其代谢物13C-乳酸盐、13C-丙氨酸和任选地13C-碳酸氢盐(在下文中表示为“13C-丙酮酸盐及其代谢物”)的波谱信号强度用于由此种信号对肿瘤级别的标准曲线测定肿瘤级别。在另一个实施方案中，使用13C-丙酮酸盐及其代谢物的波谱信号积分。在另一个实施方案中，使用来自13C-丙酮酸盐及其代谢物的分开图像的信号强度。在另外一个实施方案中，在2个或更多时间点上获得信号强度，以计算13C-丙酮酸盐和/或其代谢物的变化比。
在一个实施方案中，所有信号都用于由此种信号对肿瘤级别的标准曲线测定肿瘤级别，即13C-丙酮酸盐以及13C-乳酸盐和13C-丙氨酸和任选地13C-碳酸氢盐的信号。此外，可以使用总碳信号，即乳酸盐、丙氨酸、丙酮酸盐和任选地碳酸氢盐的信号总和。在另一个实施方案中，一种或多种选择的信号用于由此种信号对肿瘤级别的标准曲线测定肿瘤级别。因此，在优选实施方案中，使用乳酸盐信号和/或丙氨酸信号和/或总碳信号。在进一步优选的实施方案中，使用乳酸盐信号和/或总碳信号。
在另一个实施方案中，处理的信号数据，例如信号比、校正信号、或由多重MR检测的信号模式推导的动力学或代谢率常数信息，即波谱或图像，用于由此种信号对肿瘤级别的标准曲线测定肿瘤级别。因此，在优选实施方案中，校正的乳酸盐信号，即乳酸盐对丙氨酸信号和/或乳酸盐对丙酮酸盐信号和/或乳酸盐对总碳信号用于由此种信号对肿瘤级别的标准曲线测定肿瘤级别。在另一个优选实施方案中，处理的信号导致对于所述每个图像点的代谢概况特征性的关于每个图像点的数。
在其最简单的实施方案中，标准曲线可以是信号和组织病理学肿瘤级别或得分例如对于Gleason分级系统之间的线性关联。在此种实施方案中，步骤b)的测定可以“手工”完成，这通过使用检测的信号或得自处理这些信号的数据，并且使它们与标准曲线中的相应信号相比较实现，所述相应信号构成所述标准曲线的一个轴。通过使用标准曲线，相应的肿瘤级别或得分可以在另一个轴上发现。
在另一个实施方案中，预期标准曲线以算法的形式，所述算法以自动化方式基于在步骤a)中检测的信号执行肿瘤级别或肿瘤得分的测定。算法可以进一步包含其他统计学分析，其允许评估肿瘤级别测定的置信水平。
在第三个方面，本发明提供了包含如上所述用于测定特定癌症类型的肿瘤级别的算法和使用说明书的试剂盒。
【附图说明】
图1显示取自正常小鼠前列腺的代表性T2加权的轴图像(A)，具有显示对应于选择的病理学的0.135cm3超极化13C波谱的重叠格栅的T2加权图像(B)，相应波谱(C)和H&E(苏木精和伊红)染色的组织学切片(D)。
图2显示取自具有早期原发性肿瘤(低级别肿瘤)的TRAMP小鼠前列腺的代表性T2加权的轴图像(A)，具有显示对应于选择的病理学的0.135cm3超极化13C波谱的重叠格栅的T2加权图像(B)，相应波谱(C)和H&E染色的组织学切片(D)。
图3显示取自具有晚期原发性肿瘤(高级别肿瘤)的TRAMP小鼠前列腺的代表性T2加权的轴图像(A)，具有显示对应于选择的病理学的0.135cm3超极化13C波谱的重叠格栅的T2加权图像(B)，相应波谱(C)和H&E染色的组织学切片(D)。
图4显示取自具有晚期原发性肿瘤(高级别肿瘤)和淋巴结转移灶区域的TRAMP小鼠前列腺的代表性T2加权的轴图像(A)，具有显示对应于选择的病理学的0.135cm3超极化13C波谱的重叠格栅的T2加权图像(B)，相应波谱(C)和H&E染色的组织学切片(D)。
图5概括伴随TRAMP模型中的前列腺肿瘤的发展和进展发生的代谢和组织学变化，并且使这些与正常鼠前列腺组织的代谢概况和组织学相比较。
图6显示正常鼠前列腺、TRAMP小鼠早期前列腺肿瘤、TRAMP小鼠晚期前列腺肿瘤和淋巴结转移灶的超极化13C1-丙酮酸盐与噪声比及其含13C代谢物丙氨酸和乳酸盐与噪声比的条形图。
图7显示乳酸盐信号与噪声比对组织类型的框图，所述组织类型即正常鼠前列腺组织、TRAMP小鼠早期前列腺肿瘤组织、TRAMP小鼠晚期前列腺肿瘤组织和淋巴结转移灶。
图8显示乳酸盐信号与噪声比对关于各种组织类型的总超极化的碳的图表，所述组织类型即正常鼠前列腺组织、TRAMP小鼠早期前列腺肿瘤组织和TRAMP小鼠晚期前列腺肿瘤组织。
【具体实施方式】
实施例
转基因小鼠前列腺腺癌(Transgenic Adenocarcinoma of MouseProstate)(TRAMP)模型具体用于研究伴随前列腺癌发展和进展发生的代谢变化，因为TRAMP小鼠展示模仿人疾病的组织病理学疾病进展和相关的代谢变化。下述研究显示伴随TRAMP小鼠中前列腺癌进展的超极化13C1-丙酮酸盐代谢中变化的定量，其中使用切除的恶性组织的组织病理学作为参考标准。
MR检测
在由UCSF Institutional Animal Care and Utilization Committee批准的规程下，执行所有正常(N＝5)和TRAMP(N＝4个早期原发性肿瘤(低级别肿瘤)、N＝5个晚期原发性肿瘤(高级别肿瘤))小鼠研究。(1)。对于这个研究中包括的所有小鼠，在超极化MR研究前至少一天，将从其颈背侧表面延伸的28g通道通过外科手术植入其颈静脉之一内。在MR实验时，小鼠用1-1.5％异氟烷进行麻醉，并且使用硬塑料连接器(Strategic Applications，Libertyville，IL)，使90cm长、24g延长管与颈静脉通道连接。这个专门的延长管使得可能在人MR扫描仪内部快速注射超极化试剂，同时维持管中的低死体积。接下来，将小鼠置于充满水的、温度控制的垫上，所述垫借助于循环水加热至约37℃，并且放置在定制的双重调谐的质子-碳T/R线圈内部。线圈设计由具有5cm内径、8cm长度的1H正交线圈内的正交13C线圈和在顶面上的开放槽组成，以允许目视监控在线圈内时的小鼠。整个设置置于患者台上，并且放置在配备多核波谱学包的3T人GE扫描仪的孔中。
使用具有6cm FOV、128×128矩阵、无切片间间隔的1.5mm切片厚度、和TE＝102ms/TR＝4s的T2加权的快速自旋回波序列，以矢状、轴向和冠状视图采集1H-MR图像。一旦13C1-丙酮酸盐如WO-A-2006/011809中所述进行超极化(21.7±2.0％)且溶解(7.9±0.2)，溶液就快速转运至MR扫描仪，并且将350±50μL 79mM超极化丙酮酸盐穿过12秒时间间隔注射入小鼠内。注射随后紧为150μL盐水冲洗，以从颈静脉导管和管中清除超极化丙酮酸盐。在丙酮酸盐注射入6只TRAMP小鼠(3只早期和3只晚期肿瘤)的颈静脉内开始后35秒，具有小倾倒角激发、绝热再聚焦和倒转回波平面读数轨道的双重自旋回波脉冲序列用于采集体内3D超极化13C-MRSI数据(1-2)。使用140/215的TE/TR、8×8×16矩阵、40mm×40mm×86.4mm FOV(0.135cm3分辨率)和14秒采集时间，从小鼠的腹部采集3D-MRSI数据。
为了使病理学与TRAMP小鼠的质子图像关联，在解剖过程中使矢状、冠状和轴向图像显示在便携式计算机上。在解剖过程中，获得数字照片和视频，并且立即将切除的组织固定在10％缓冲的福尔马林中。固定的组织样品随后移动到70％乙醇内，并且在石蜡块内进行处理。组织块在Leica切片机上以5微米厚度进行切片。切片在玻璃载玻片上干燥，并且使用标准的苏木精和伊红规程进行染色。正常、分化良好(WD)、中等分化良好(MWD)和分化不良(PD)的％用于将肿瘤分成早期(低级别)和晚期(高级别)分类(表1)。还记录％坏死(表1)。
表1
数据分析和肿瘤代谢概况的产生
MRI/13C MRSI数据使用定制软件进行处理和比对。在相应的高空间分辨率解剖图像上追踪在病理学上鉴定的前列腺癌的原发区和转移区。在对于每种代谢物的预定频率范围上积分与目的组织类型相关的每个体积元(voxel)。所有积分都通过由不包含任何代谢物的波谱区域计算的噪声进行排列。对于导致一个代射概况的每个研究，对于给定代谢物和组织类型排列的积分一起求平均值，即关于每个研究的乳酸盐、丙氨酸和丙酮酸盐数集合。来自各种研究的平均值使用JMP进行统计学比较，以执行关于数据的方差分析。如果发现统计学上显著的差异，那么4个组织类型以逐对方式进行比较，其中使用t检验与Tukey校正用于多重比较。此外，将随机效应模型掺入所有统计学检验内，以校正可能已通过包括来自相同动物的多次研究引入数据内的任何关联。
结果
图1-4显示取自正常小鼠前列腺(图1)、TRAMP小鼠前列腺中的早期原发性肿瘤(图2)、晚期原发性肿瘤(图3)和淋巴结转移灶区域(图4)的代表性T2加权的轴图像(A)，具有显示对应于选择的病理学的0.135cc超极化13C波谱的重叠格栅的T2加权图像(B)，相应波谱(C)以及H&E染色的组织学切片(D)。如图1中可见，正常鼠类前列腺是非常小的(约0.022cc)器官，并且必须小心以选择包含鼠前列腺的体积元，同时使来自周围组织的波谱贡献降到最低。通过体积元移动零填充波谱数据(虚线框，真实分辨率是实线)直至它最大限度重叠鼠前列腺，在后处理中完成这点(1B)。相应超极化13C波谱(1C)展示了关于丙酮酸盐(173ppm)及其代谢产物乳酸盐(185ppm)和丙氨酸(178ppm)的共振。丙酮酸盐共振是最大的，随后为乳酸盐、丙氨酸和关于丙酮酸盐水合物的小共振。类似于健康人前列腺，鼠前列腺是腺器官，其中腺上皮细胞周围导管通过基质组织结合在一起，如H&E切片中所示(1D)。
伴随TRAMP小鼠中的早期前列腺肿瘤的发展(图2)，前列腺的大小显著增加，从而允许2个或更多0.135cc体积元完全放置在肿瘤内(2B)。在相应的超极化13C波谱中，存在乳酸盐中的急剧增加至等于或大于丙酮酸盐的水平，以及相对于正常小鼠前列腺，丙酮酸盐和丙氨酸共振的峰面积对噪声中的增加。相应组织病理学(2C)展示较小的腺细胞数目中的特征性增加和导管体积的丧失以及与前列腺癌相关的基质增厚。
在晚期原发性疾病(图3)中，肿瘤变得非常大，并且在病理学上显示为具有不规则核和核周围非常少细胞质的多形细胞的退行发育片以及导管形态学的几乎完全丧失和坏死面积(3D)。可能获得来自这些肿瘤的超极化13C波谱的阵列，并且波谱展示非常高水平的乳酸盐，其中乳酸盐与丙酮酸盐比变得显著高于早期(3.4对1.2)疾病。还存在这些大肿瘤中的代谢异质性，其中乳酸盐/丙酮酸盐比中的变异性以及坏死区域中减少很多的代谢物水平(3C)。
图4显示在晚期肿瘤中淋巴结转移灶的代表性病例。就超极化乳酸盐、丙氨酸和丙酮酸盐水平而言，关于淋巴结转移灶的超极化代谢发现在早期和晚期肿瘤中观察到的那些之间的某处。这可以是由于与原发性晚期肿瘤相比较，淋巴结转移灶的大异质性(表1)。
图5概括伴随TRAMP模型中癌症的发展和进展发生的代谢和组织学变化。图6显示在正常、早期、晚期和淋巴结转移灶之间超极化代谢物与噪声比的条形图。早期肿瘤展示乳酸盐中的显著增加和总体超极化碳信号(超极化乳酸盐、丙氨酸和丙酮酸盐的总和)中的增加。当肿瘤从早期原发性肿瘤进展至晚期原发性肿瘤时，超极化乳酸盐信号与噪声比、总超极化碳信号再次显著增加。更重要的是，图7中乳酸盐S/N对组织类型的框图展示在正常、早期和晚期组织之间个别乳酸盐值的最低限度重叠，尽管在早期和淋巴结转移灶之间存在重叠。通过描绘超极化乳酸盐对总超极化碳而获得正常、早期和晚期肿瘤的最佳分离(图8)。仅一个正常研究与早期肿瘤重叠，并且这个正常研究具有比其他正常更高的乳酸盐和总超极化碳。