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1、10申请公布号CN102100916A43申请公布日20110622CN102100916ACN102100916A21申请号200910202016X22申请日20091222A61K48/00200601A61K9/127200601A61K47/34200601A61P35/00200601A61P15/14200601A61K39/4420060171申请人上海抗体药物国家工程研究中心有限公司地址201203上海市浦东新区张江高科技园区李冰路399号3幢72发明人郭亚军陈建明高洁孙靖李博华谈珉54发明名称一种冻干脂质体、其制备方法和用途57摘要本发明属于生物医药领域，本发明公开了一种内。
2、包裹SIRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体FAB片段的冻干脂质体、其制备方法和用途；本发明公开的冻干脂质体具有良好的HER2细胞靶向性、基因沉默活性和转染效率，可以用于制备抗肿瘤药物，特别是特异性靶向结合HER2抗原高表达的肿瘤细胞，如乳腺癌等疾病。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图5页CN102100919A1/1页21一种内包裹SIRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体FAB片段的冻干脂质体。2权利要求1所述的内包裹SIRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体FAB片段的冻干脂质体，为内包裹SIRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体。
3、FAB片段的冻干的PEG化的DCCHOL/DOPE脂质体。3权利要求2所述的内包裹SIRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体FAB片段的冻干脂质体，其中DCCHOL/SIRNA的质量比为10。4权利要求13任一所述的内包裹SIRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体FAB片段的冻干脂质体，其中PEG含量在总脂质中的摩尔比为154。5权利要求4所述的内包裹SIRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体FAB片段的冻干脂质体，其中PEG含量在总脂质中的摩尔比为25。6权利要求15所述的任一内包裹SIRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体FAB片段的冻干脂质体的制备方法，包括A用薄膜分散法和抗体连接技术制。
4、备人源化抗HER2单克隆抗体FAB片连接的脂质体并进行冻干得到冻干脂质体，B将SIRNA和冻干脂质体孵育后得到内包裹SIRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体FAB片段的冻干脂质体。7权利要求6所述的内包裹SIRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体FAB片段的冻干脂质体的制备方法，其中步骤A中冻干步骤包括预冻过程和冷冻干燥两个过程，预冻过程在低于40下冷冻，时间不少于60MIN；冷冻干燥过程温度按从40按5逐渐升高至室温，每个阶段干燥时间为30MIN180MIN，真空度为50MTORR200MTORR。8权利要求15所述的任一内包裹SIRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体FAB片段的冻干脂质。
5、体在制备抗肿瘤药物中的用途，其中肿瘤为特异性靶向结合HER2抗原高表达的肿瘤细胞。9权利要求8所述的用途，其中肿瘤为乳腺癌。权利要求书CN102100916ACN102100919A1/5页3一种冻干脂质体、其制备方法和用途技术领域0001本发明涉及医药技术领域，更具体地说，本发明公开了包裹SIRNA和连接人源化抗HER2单克隆抗体的脂质体、其制备方法和用途。背景技术0002目前，由3NN，N二甲氨基乙基氨甲酰基胆固醇DCCHOL和二油酰磷脂酰乙醇胺DOPE组成的阳离子脂质体DCCHOL/DOPE脂质体由于具有生物相容性和低细胞毒性而被认为是最有效的基因递送系统之一。但是，DCCHOL/DOP。
6、E脂质体的进一步发展因其低转染效率，低血清稳定性和短循环寿命而受到严重阻碍。0003阳离子脂质体的短循环寿命可用通过在其表面连接聚乙二醇PEG来克服。SIRNA是一种有2123个碱基对的双链RNA分子，可以特异性的沉默相关基因的表达，从而对肿瘤等基因突变性疾病进行治疗。由于单纯的SIRNA分子并不能进入细胞中，需要和阳离子脂质体等基因载体复合后才能进入细胞。然而，阳离子脂质体进行PEG化后，将严重的阻碍SIRNA内吞和内涵体逃逸，导致转染效率大大降低。因此，需要优化阳离子脂质体的PEG程度，来克服SIRNA的释放障碍。发明内容0004为了解决上述问题，本发明的申请人进行了大量的实验，利用纳米技。
7、术和抗体偶联技术制备成了一种内包裹SIRNA外连接抗HER2抗体FAB片段的冻干脂质体。0005本发明公开了00061、外连接人源化抗HER2单克隆抗体FAB片段内包裹SIRNA的冻干脂质体；00072、制备上述脂质体的方法，包括000821用薄膜分散法和抗体连接技术制备人源化抗HER2单克隆抗体FAB片段连接的冻干脂质体；000922将SIRNA和冻干脂质体孵育后得到内包裹SIRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体FAB片段的冻干脂质体。00103、上述冻干脂质体在制备治疗和或预防高表达HER2抗原的乳腺癌药物中的用途。0011本发明选择具有良好的生物相容性的脂质材料作为制备脂质体的生物相容。
8、性脂质材料。0012类似地，利用本发明公开的方法，还可以得到内包裹了SIRNA外部连接其它人源化抗体其它的片段也可以的冻干脂质体，这些人源化抗体可以为重组人源化抗HER1单克隆抗体RHUMABHER1等等。0013在本发明中，如没有特别说明，LPIL指的是连接人源化抗HER2单克隆抗体FAB片段的冻干脂质体，PIL为连接人源化抗HER2单克隆抗体FAB片段的未冻干脂质体，LPL指的是未连接人源化抗HER2单克隆抗体FAB片段的冻干脂质体，PL为未连接人源化抗HER2说明书CN102100916ACN102100919A2/5页4单克隆抗体FAB片段的未冻干脂质体。0014本发明还公开了上述内包。
9、裹SIRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体FAB片段的冻干脂质体的制备方法，包括以下两个步骤0015I用薄膜分散法制备人源化抗HER2单克隆抗体FAB片段连接的脂质体0016PEG化的DCCHOL/DOPE免疫脂质体PIL的制备方法由DCCHOL3NN，N二甲氨基乙基氨甲酰基胆固醇，DOPE二油酰磷脂酰乙醇胺，MALPEGDSPE马来酰亚胺化聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和MPEGDSPE甲氧基化聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺以摩尔比49505X49505X1XX代表MPEGDSPE在总脂质中的摩尔比05X3组成的多室脂质体通过脂质薄膜水化法制备ZHENGX，LUJ，DENGL，XIONGY，C。
10、HENJPREPARATIONANDCHARACTERIZATIONOFMAGNETICCATIONICLIPOSOMEINGENEDELIVERYINTJPHARM2009；366211217，脂质膜用10MM的磷酸盐缓冲液PBS，PH74水化来形成多室脂质，形成的多室脂质体通过室温手握式挤出器AVESTIN，OTTAWA挤出形成单室纳米级脂质体，挤出过程是通过逐渐减小膜的孔径大小从200，100和80NMNUCLEOPORE，WHATMAN来进行的，每个孔径循环挤出十次。另外，抗HER2FAB通过与亚氨基噻吩盐酸盐2IMINOTHIOLANE以摩尔比10012IMINOTHIOLANEFA。
11、B进行巯基化，抗HER2FAB的巯基个数通过ELLMANS法测定。然后，巯基化的抗HER2FAB与制备好的包含马来酰胺基团的脂质体即上述的单室纳米级脂质体以摩尔比1/10抗HER2FAB/MALPEGDSPE相混合，混合物在有氮气的情况下室温孵育2小时得到PIL。接着，未结合的抗HER2FAB通过用PBS作为洗脱液的葡聚糖凝胶G75PHARMACIA，UPPSALA，SWEDEN的凝胶层析方法去除。最后得到的PIL收集在外水体积部分，用022M滤膜除菌，4保存。非靶向PEG化的DCCHOL/DOPE脂质体PL通过和PIL相同的方法制备，除了MALPEGDSPE用MPEGDSPE市场购得代替。磷。
12、脂浓度通过硫氢铁铵方法测定，DC胆固醇浓度通过相应的磷脂浓度计算。低压冻干PILLPIL或冻干PLLPL，冻干的具体步骤为DC胆固醇浓度为08G/L的PIL或PL与54G/L蔗糖蔗糖终浓度为9，重量/体积比混合，ADVANTAGETMBENCHTOPFREEZER冻干机冻干1618小时，整个冻干过程包括预冻过程和冷冻干燥过程，预冻过程在低于40下冷冻，时间不少于60MIN；冷冻干燥过程温度按从40按5逐渐升高至室温，每个阶段干燥时间为30MIN180MIN，真空度为50MTORR200MTORR。0017II将SIRNA和脂质体孵育后得到内包裹SIRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体FAB片。
13、段的冻干脂质体0018SIRNA溶解在DEPC焦碳酸二乙酯处理过的双蒸水中，终浓度为20M。然后，SIRNA溶液9L用DEPC处理水稀释到一定体积990L。对于冻干脂质体，LPL或LPIL含有7272GDC胆固醇用一定量的SIRNA稀释液990L重新水化，室温静置20分钟就可以得到内包裹SIRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体FAB片段的冻干脂质体。对于非冻干脂质体，PL或PIL990L，包含7272GDC胆固醇与相同体积990L的SIRNA稀释液混合，室温静置20分钟。包埋过程在使用前立即进行。0019利用本发明得到内包裹SIRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体FAB片段的冻干脂质体进行。
14、了一系列实验，实验结果表明内包裹SIRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体FAB片段的冻干脂质体具有良好的HER2细胞靶向性、基因沉默活性和转染效率，达到了本说明书CN102100916ACN102100919A3/5页5发明的目的。0020本发明得到的内包裹SIRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体FAB片段的冻干脂质体可以用于制备抗肿瘤药物，特别是特异性靶向结合HER2抗原高表达的肿瘤细胞，如乳腺癌等。附图说明0021图1，内包裹SIRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体FAB片段的冻干脂质体的制备过程示意图。0022图2，图21连接人源化抗HER2单克隆抗体FAB片段的脂质体和HER2F。
15、AB分子筛分离图；图22未连接人源化抗HER2单克隆抗体FAB片段的脂质体和HER2FAB分子筛分离图；图23蛋白质电泳证实连接人源化抗HER2单克隆抗体FAB片段脂质体的HER2FAB连接。0023图3，图3125PEGLPIL的转染效率；图324PEGLPIL的转染效率。0024图4，图41不同PEG含量的LPIL和PIL的转染效率；图42不同PEG含量的LPIL和PIL的基因沉默效率。具体实施方式0025下面结合附图及实施例对本发明进行详细描述，但本发明的实施不仅限于此。0026人源化抗HER2单克隆抗体通过LIB，WANGH，ZHANGD，ETALCONSTRUCTIONANDCHAR。
16、ACTERIZATIONOFAHIGHAFFINITYHUMANIZEDSM51MONOCLONALANTIBODYBIOCHEMBIOPHYSRESCOMMUN2007；35749516中提供的方法，用PROTEINA柱对表达人源化HER2单克隆抗体的CHO细胞中国仓鼠卵巢癌细胞的细胞上清进行亲和层析后得到。抗HER2FAB片段通过GAOJ，KOUG，WANGH，ETALPE38KDELLOADEDANTIHER2NANOPARTICLESINHIBITBREASTTUMORPROGRESSIONWITHREDUCEDTOXICITYANDIMMUNOGENICITYBREASTCANCER。
17、RESTREAT2008；1152941提供的方法得到。0027FAMSIRNA、NCSIRNA、HER2SIRNA均购自上海吉玛制药公司0028其他原料和试剂未标明来源的均为市售。0029实施例1内包裹SIRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体FAB片段的冻干脂质体的制备0030PEG化的DCCHOL/DOPE免疫脂质体PIL的制备DCCHOL，DOPE，MALPEGDSPE和MPEGDSPE以摩尔比49505X49505X1XX代表MPEGDSPE在总脂质总脂质的量为8MOL中的摩尔比，X的值取05，1，15，2，25，3，则总PEG的含量占总脂质的15，2，25，35，4组成的多室脂质体。
18、通过脂质薄膜水化法制备，首先将将8MOL的总脂质加入到2ML的氯仿之中，37水浴旋蒸3035MIN，成膜后用N2吹尽痕量氯仿，得到干燥的脂质薄膜。脂质膜用1ML的10MM的磷酸盐缓冲液PBS，PH74水化来形成多室脂质体，形成的多室脂质体通过室温手握式挤出器AVESTIN，OTTAWA挤出形成单室纳米级脂质体，挤出过程是通过逐渐减小膜的孔径大小从200，100和80NMNUCLEOPORE，WHATMAN来进行的，每个孔径循环挤出十次。另外，抗HER2FAB通过与亚氨基噻吩盐酸盐2IMINOTHIOLANE以摩尔比10012IMINOTHIOLANEFAB进行巯基化，说明书CN10210091。
19、6ACN102100919A4/5页6抗HER2FAB的巯基个数通过ELLMANS法来测定。然后，巯基化的抗HER2FAB与制备好的包含马来酰胺基团的脂质体以摩尔比1/10抗HER2FAB/MALPEGDSPE，包含马来酰胺基团的脂质体即上述的单室纳米级脂质体相混合，混合物在有氮气的情况下室温孵育2小时得到PIL。未结合的抗HER2FAB用PBS作为洗脱液的葡聚糖凝胶G75PHARMACIA，UPPSALA，SWEDEN的凝胶层析方法去除。得到的PIL收集在外水体积部分，用022M滤膜除菌，4保存。非靶向PEG化的DCCHOL/DOPE脂质体PL通过和PIL相同的方法制备，除了MALPEGDS。
20、PE用MPEGDSPE代替。磷脂浓度通过硫氢铁铵方法测定。DC胆固醇浓度通过相应的磷脂浓度计算。低压冻干PILLPIL或冻干PLLPL，冻干的具体步骤为DC胆固醇浓度为08G/L的PIL或PL与54G/L蔗糖蔗糖终浓度为9，重量/体积比混合，ADVANTAGETMBENCHTOPFREEZER冻干机冻干1618小时，整个冻干过程包括预冻过程和冷冻干燥过程。预冻过程在低于40下冷冻，时间不少于60MIN；冷冻干燥过程温度按从40按5逐渐升高至室温，每个阶段干燥时间为30MIN180MIN，真空度为50MTORR200MTORR。制备示意图见图1。SIRNA可以为FAMSIRNA或NCSIRNA或。
21、HER2SIRNA溶解在DEPC处理过的双蒸水中，终浓度为20M。然后，SIRNA溶液9L用DEPC处理水稀释到一定体积990L。对于冻干脂质体，LPL或LPIL含有7272GDC胆固醇用一定量的SIRNA稀释液990L重新水化，室温静置20分钟就可以得到内包裹SIRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体FAB片段的冻干脂质体。对于非冻干脂质体，PL或PIL990L，包含7272GDC胆固醇与相同体积990L的SIRNA稀释液混合，室温静置20分钟。包埋过程在使用前立即进行。通过ZETASIZER3000HS粒径仪测量PIL的粒径为150NM。0031实施例2脂质体表面HER2FAB的测定试验0。
22、032HER2FAB连接到脂质体表面后，用SDSPAGE十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法验证其表面的连接量和完整性。凝胶在160V恒压条件于TRIS甘氨酸十二烷基磺酸钠缓冲液中进行电泳，然后用考马斯亮蓝染色、脱色，最后干胶。0033结果如图21和22所示，两峰完全分离开来，说明PIL或PL能够分离出游离HER2FAB抗体由于拖尾峰包含游离HER2FAB抗体，而PIL相比PL而言，拖尾峰更低，结果表明HER2FAB抗体确实通过MALPEGDSPE连接到脂质体上。此结果是针对含25PEG的PL和PIL而言的，而对于含15PEG、2PEG、25PEG、3PEG、35PEG、4PEG分别和实施例1中。
23、X取值05、1、15、2、25、3相对应而言均得到相似的结果。HER2FAB抗体在脂质体表面的连接量和完整性通过SDSPAGE得到验证结果见图23，对比未做处理的HER2FAB抗体泳道13，PIL表面的HER2FAB抗体的分子量更大些泳道49，可以得出结论，HER2FAB抗体通过MALPEGDSPE连接到脂质体上后在凝胶中泳动速率变慢，LPIL也得到相似的结果，表明了冻干程序并没有破坏HER2FAB抗体的连接，但是HER2FAB抗体并没有连接到不含马来酰胺连接键的PL或LPL上。0034利用包裹SIRNA后的PIL、PL、LPIL实施例产品进行试验，结合也和以上结果相同。0035实施例3体外转。
24、染试验0036转染效率的分析实验按下述步骤进行SKBR3细胞购自美国ATCC，ATCC号HTB30于48孔板中以6104个细胞/孔的密度培养过夜，将实施例1得到的内包裹说明书CN102100916ACN102100919A5/5页7FAMSIRNA的脂质体与细胞每孔04UGSIRNA，SIRNA最终浓度为100NM孵育6小时后用胰蛋白酶消化，洗涤，用流式细胞仪进行荧光计数。0037基因沉默效率的分析实验按以下步骤进行SKBR3细胞于48孔板中以6104个细胞/孔的密度培养过夜，将实施例1得到的内包裹NCSIRNA或HER2SIRNA的脂质体与细胞每孔04UGSIRNA，SIRNA最终浓度为10。
25、0NM孵育6小时后更换新鲜的细胞培养液，48小时后，用胰蛋白酶消化细胞，洗涤后加入C225抗体药物国家工程研究中心提供终浓度为5UG/UL于4共孵育45MIN，洗涤细胞，加入FITC标记的羊抗人IGGHL于4共孵育30MIN，洗涤细胞，FCM检测细胞表面HER1表达。由于HER1在HER2过表达的SKBR3细胞表面适度表达，并且能够用FCM很容易检测蛋白表达，故HER1常在基因沉默分析中作为一个理想的靶点C225的作用来源于此。0038另外，SIRNA用LIPO2000按照生产化标准步骤进行转染，所有SIRNA的转染除特殊说明外均用含10FBS细胞培养液进行。0039结果显示，不同DCCHOL。
26、/SIRNA质量比下脂质体的转染效率为了获得最好的脂质体转染效率，应该对阳离子脂质和SIRNA的质量比或摩尔比进行优化，之所以选择一系列的DCCHOL/SIRNA的质量比是因为比例太低导致不稳定的脂质体SIRNA复合物形成且转染效率低，当比例太高时形成了过量的复合物也呈现下降的转染效率，如图3所示，LPIL的转染效率在每一个比例时均高于PIL，这表明冻干再水化法能显著的提高PIL的转染效率。LPIL和PIL的转染效率均高于各自的对照LPL和PL，这表明连有HER2FAB抗体能显著提高脂质体与过表达HER2抗原细胞的亲和力。而且所有脂质体的转染效率并不随着DCCHOL/SIRNA的质量比的增加而。
27、增加，并且在DCCHOL/SIRNA的质量比为10时达到最大，因此，包封SIRNA的LPIL，PIL，LPL，PL如无特别说明均是以DCCHOL/SIRNA的质量比为10为标准制备的。PEG化程度对脂质体基因沉默的影响对脂质体进行PEG化是能够延长半衰期的较为实际的方法，但是PEG化同时也能强烈的降低转染效率。为此，我们制备了不同PEG含量的脂质体考察PEG化程度对转染效率的影响，结果显示PEG化LPIL的转染效率并没有降低图41，含3PEGLPIL转染效率最低，但是，35PEG和4PEGLPIL的转染效率逐渐增加，PIL的转染效率比LPIL的要低。如图42所示，25PEGLPIL有最高的HE。
28、R1基因沉默效率，其它PEG含量的LPIL也显示出了较高的沉默效率。这些结果表明了对于25PEGLPIL能够获得更好的基因沉默效率，冻干再水化法、HER2FAB抗体、优化PEG含量均是不可缺少的。说明书CN102100916ACN102100919A1/5页8图1说明书附图CN102100916ACN102100919A2/5页9图21图22说明书附图CN102100916ACN102100919A3/5页10图2说明书附图CN102100916ACN102100919A4/5页11图3说明书附图CN102100916ACN102100919A5/5页12图4说明书附图CN102100916A。