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本发明提供一种用于治疗老年性痴呆症的细胞因子，即聚乙二醇修饰的粒细胞集落刺激因子(PEG-GCSF)在制备预防和/或治疗老年痴呆症的药物中的用途。本发明发现与G-CSF相比，PEG-GCSF在预防和/或治疗老年痴呆症方面的疗效有显著的提高。采用PEG-GCSF治疗老年痴呆症不但能够更有效地预防和/或治疗老年痴呆症，同时还具有活性蛋白的半衰期长，使用方便，不良反应少等优点。

1.  聚乙二醇修饰的粒细胞集落刺激因子在制备预防和/或治疗哺乳动物老年痴呆症的药物中的用途。

2.  聚乙二醇修饰的粒细胞集落刺激因子在制备降低哺乳类动物大脑皮层和/或海马中淀粉样蛋白沉积的药物中的用途。

3.  聚乙二醇修饰的粒细胞集落刺激因子在制备逆转哺乳类动物认知障碍的药物中的用途。

4.  根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其特征在于，所述聚乙二醇选自单甲氧基聚乙二醇5000，单甲氧基聚乙二醇10000，单甲氧基聚乙二醇20000和单甲氧基聚乙二醇40000中的一种或多种。

5.  根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其特征在于，所述聚乙二醇为单甲氧基聚乙二醇20000。

6.  根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其特征在于，所述聚乙二醇修饰的粒细胞集落刺激因子为C端经聚乙二醇修饰的粒细胞集落刺激因子。

7.  根据权利要求1至6中任一项所述的用途，其特征在于，所述粒细胞集落刺激因子为天然粒细胞集落刺激因子和/或重组粒细胞集落刺激因子。

8.  根据权利要求1至7中任一项所述的用途，其特征在于，所述药物为注射剂。

9.  根据权利要求1至8中任一项所述的用途，其特征在于，所述哺乳动物为人。

一种用于治疗老年痴呆症的细胞因子
技术领域
本发明涉及一种用于治疗老年痴呆症的细胞因子，具体涉及一种用于治疗老年痴呆症的粒细胞集落刺激因子及其在制备药物中的用途。
背景技术
老年痴呆症，又称阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)，是发生在老年期及老年前期的一种原发性退行性脑病，是指一种持续性高级神经功能活动障碍，即在没有意识障碍的状态下，记忆、思维、分析判断、视空间辨认、情绪等方面的障碍。其特征性病理变化为大脑皮层萎缩，并伴有β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)沉积，神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFT)，大量记忆性神经元数目减少，以及老年斑(senileplaque，SP)的形成。
目前已经进入临床试验或者临床应用的治疗老年痴呆症的方法很多。基本上来说，能降低脑中Aβ沉积/水平的方法都可以提高认知功能。比如用不同形式的Aβ片段对转基因动物进行主动和被动免疫，不仅降低了脑中Aβ的水平，而且也提高了动物的认知能力(F.Bard et al，Peripherallyadministered antibodies against amyloid beta-peptide enter the central nervoussystem and reduce pathology in a mouse model of Alzheimer disease，Nat Med6(2000)，pp.916-919)。还有临床正在使用的多种乙酰胆碱酯酶抑制剂，从天然植物中提取的小分子化合物，如姜黄素，或者能够抑制Aβ合成的小分子抑制剂。但这些方法都有各种不足，或者副作用太大，如乙酰胆碱酯酶抑制剂，或者临床效果不明显，或者价格过于昂贵。
粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是一种造血生长因子，其主要作用在于促进中性粒细胞系造血细胞的增殖、分化和活化；另外，它还具有刺激成熟中性粒细胞从骨髓中释放并激活中性粒细胞的功能。G-CSF由上皮细胞，巨噬细胞和其他一些免疫细胞分泌。曾有报道发现海马神经再生区域的神经元和神经前体细胞表达G-CSF和它的受体(A.Schneider et al，Thehematopoietic factor G-CSF is a neuronal ligand that counteracts programmedcell death and drives neurogenesis，J Clin Invest 115(2005)，pp.2083-2098)。虽然G-CSF主要用作各种白细胞减少症的治疗，因为它可以使干细胞和前体细胞从骨髓转移，并且用于治疗由于各种化学疗法引起的粒细胞减少症，但是早在2003年的动物实验结果就表明G-CSF还可以减少中风带来的脑部损伤(W.R.Schabitz et al，Neuroprotective effect of granulocytecolony-stimulating factor afler focal cerebral ischemia，Stroke 34(2003)，pp.745-751；I.Six et al，Beneficial efffect of pharmacological mobilization ofbone marrow in experimental cerebral ischemia，Eur J Pharmacol 458(2003)，pp.327-328；I.Solaroglu et al，Neuroprotective effect of granulocyte-colonystimulating factor，Front Biosci 12(2007)，pp.712-724)。G-CSF除了对粒细胞分化和干细胞迁移有一定的调节作用外，还可能有神经保护作用(如抗凋亡和神经营养作用)(W.R.Schabitz et al，Neuroprotective effect ofgranulocyte colony-stimulating factor after focal cerebral ischemia，Stroke 34(2003)，pp.745-751；C.L.Gibson et al，G-CSF suppresses edema formationand reduces interleukin-1beta expression after cerebral ischemia in mice，JNeuropathol Exp Neurol 64(2005)，pp.763-769；Solaroglu，T.et al，Anti-apoptotic effect of granulocyte-colony stimulating factor after focalcerebral ischemia in the rat，Neuroscience 143(2006)，pp.965-974)。
虽然粒细胞集落刺激因子用于临床已有近20年的时间，在治疗粒细胞减少症方面作用显著，但是由于其半衰期短，需要每天静脉或皮下注射，周期长达两周，降低了病人的耐受性，也增加了对医务工作者的需求。而聚乙二醇修饰很大程度上减少了粒细胞集落刺激因子通过肾脏的清除(粒细胞集落刺激因子的体内清除机制主要有中性粒细胞集落刺激因子受体介导的清除和肾脏清除)，因此聚乙二醇修饰的粒细胞集落刺激因子(PEG-GCSF)的半衰期大大延长(约为粒细胞集落刺激因子的10倍左右)，从而减少了注射频率，同时也提高了病人对药物的耐受性。但是临床研究进一步表明，尽管PEG修饰可以延长G-CSF的半衰期，但是却往往导致其治疗活性降低，限制了PEG-GCSF的应用范围和效果。
J.SANCHEZ-RAMOS等人(J.SANCHEZ-RAMOS et al，Granulocytecolony stimulating factor decreases brainamyloid burden and reversescognitive impairment in Alzheimer’s mice，Neuroscience 163(2009)，pp.55-72)报道了G-CSF具有降低APPPS1老鼠(老年痴呆转基因老鼠模型)大脑中Aβ沉积和Aβ水平的作用，具有降低脑淀粉样沉积和逆转认知障碍的作用。但是研究表明G-CSF治疗老年痴呆症的疗效有待于进一步提高，而且其在连续使用中还会产生一定的副作用。
发明内容
因此，本发明的目的在于提供一种更有效地用于预防和/或治疗老年痴呆症且副作用更低的药物。
用于实现上述目的的技术方案如下：
聚乙二醇修饰的粒细胞集落刺激因子(PEG-GCSF)在制备预防和/或治疗哺乳动物老年痴呆症的药物中的用途。
聚乙二醇修饰的粒细胞集落刺激因子在制备降低哺乳动物大脑皮层和/或海马中淀粉样蛋白沉积的药物中的用途。
聚乙二醇修饰的粒细胞集落刺激因子在制备逆转哺乳动物认知障碍的药物中的用途。
在上述用途中，所述聚乙二醇可以选自单甲氧基聚乙二醇5000，单甲氧基聚乙二醇10000，单甲氧基聚乙二醇20000和单甲氧基聚乙二醇40000中的一种或多种，优选为单甲氧基聚乙二醇20000。更优选地，上述聚乙二醇修饰的粒细胞集落刺激因子为C端经聚乙二醇修饰的粒细胞集落刺激因子。
在上述用途中，所述粒细胞集落刺激因子为天然粒细胞集落刺激因子和/或重组粒细胞集落刺激因子。
在上述用途中，所述药物可以为注射剂。
本发明出人预料地发现，相对于G-CSF而言，PEG修饰的G-CSF在预防和/或治疗老年痴呆症的活性方面有了显著的提高，PEG-GCSF能够更明显地降低淀粉样斑块的形成，降低Aβ的含量，并逆转记忆损伤。实验表明对老年痴呆老鼠模型(APPPS1转基因老鼠)皮下注射G-CSF和PEG-GCSF均能够逆转认知损伤。短短三周治疗之后，注射GCSF或PEG-G-CSF的转基因老鼠的大脑皮层和海马区域的斑块均明显降低，病理学特征减少。然而在注射剂量相同的条件下，PEG-GCSF在逆转记忆损伤和减少淀粉样斑块(淀粉样斑块与认知能力的下降有明显关系)方面的效果都明显好于G-CSF。究其原因就在于Aβ的累积会破坏神经回路，并且间接影响整体突触的功能，PEG-GCSF更有效地减少或清除Aβ斑块，促进神经元功能的恢复。
此外，G-CSF是一个19.6KDa的糖蛋白，已被用于治疗粒细胞减少症等，其受体G-CSFR(～140KDa)在多种组织包括脑中都有表达，重组人粒细胞集落刺激因子也已广泛应用于临床。但由于G-CSF的生物利用度通常受其血浆半衰期的限制，并且对蛋白酶敏感，所以未经修饰的G-CSF在临床上治疗白细胞减少状态的持续期间通常需要一天给药一次以上，给病人带来很大痛苦。增加蛋白循环半衰期的一个有效途径就是降低蛋白的清除率，尤其是降低肾脏的清除率和受体介导的清除率。本发明将PEG与蛋白药物G-CSF相结合降低了其免疫原性并延长了半衰期。例如，将PEG的C端经20KD的单甲氧基聚乙二醇(Mpeg)化学修饰，修饰的蛋白被人体内蛋白酶接触和酶解的机会减少，血浆清除率减小，半衰期明显延长达46～62小时，还具有使用方便，不良反应少等优点。
需要特别强调的是，本发明惊喜地发现与G-CSF相比，PEG-GCSF在预防和/或治疗老年痴呆症方面的疗效有显著的提高，这是根据已有技术无法预期的，甚至是与已有技术的启示截然相反的。根据本发明，采用PEG-GCSF治疗老年痴呆症不但能够更有效地预防和/或治疗老年痴呆症，同时还具有活性蛋白的半衰期长，使用方便，不良反应少等优点。
附图说明
图1显示了给予G-CSF或PEG-GCSF的转基因老鼠在水迷宫实验中到达平台的错误数。
图2显示了给予G-CSF或PEG-GCSF的转基因老鼠在水迷宫实验中到达平台的潜伏期。
图3显示了给予G-CSF或PEG-GCSF减少了转基因老鼠大脑皮层中的淀粉样斑块的数量(Thioflavin-S染色)。
图4显示了给予G-CSF和PEG-G-CSF减少了转基因老鼠海马中的淀粉样斑块的数量(Thioflavin-S染色)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
1、GSF和PEG-GCSF：
G-CSF：购自杭州九源基因工程有限公司，商品名为吉粒芬。即通过人的G-CSF基因在大肠杆菌中表达，并对表达产物进行纯化得到的非糖基化蛋白质，其由175个氨基酸残基组成，具有与天然G-CSF相同的生物学特性。本品为无色透明无菌溶液，可供皮下(SC)或静脉(IV)注射用；
PEG-GCSF：在G-CSF的C端进行单甲氧基聚乙二醇20000修饰并纯化得到。具体修饰和纯化方法参见“聚乙二醇定点修饰重组人类粒细胞集落刺激因子突变体的研究”，黄岩山、金荣等，生物工程学报，2007年第23卷5期。
2、试验方法
动物模型：APPPS1转基因老鼠；年龄：7-9个月。本发明中使用的APPPS1老鼠在5-6个月的时候其大脑皮层和海马就有明显的β-淀粉样斑块，而这些斑块与认知障碍之间有着密切的联系(J.R.Cracchiolo，et al，Enhanced cognitive activity  over and above social or physical activity-isrequired to protect Alzheimer′s mice against cognitive impairment，reduceAbeta deposition，and increase synaptic immunoreactivity，Neurobiol LearnMem 88(2007)，pp.277-294)。因此，本发明使用的动物为7个月的该种老鼠，可以代表人老年痴呆中期的记忆损伤情况。
试剂：葡聚糖(dextran)，G-CSF，PEG-GCSF。
用量与注射频率：200μg/kg；隔天注射一次，注射两周。
实验模型：本发明中所使用的水迷宫实验是非常常用的检测短期记忆的一种方法(G.W.20)。水迷宫试验是近二十几年建立起来的判断动物学习记忆的重要实验方法，正成为神经药理学、神经生理学、神经心理学、老年病学等的常用研究手段。通过动物找到水池中央平台的时间和错误率来判断其记忆损伤的程度。
Thioflavin-S显色：Thioflavin-S是最常用的鉴定淀粉样斑块的方法。Thioflavin-S通过特异性与β-片层结构结合而显色(激发波长488nm)。
3、实验过程及实验结果
1)G-CSF和PEG-GCSF显著提高了转基因老鼠水迷宫实验的成绩，如图1所示。测量参数是老鼠到达平台的错误数。比较的是在注射葡聚糖，G-CSF或者PEG-GCSF之前一天和注射一周之后的老鼠到达平台的错误数。注射葡聚糖的老鼠在注射前后没有明显的变化，而注射G-CSF或者PEG-G-CSF的老鼠的水迷宫测试成绩则有明显的提高。其中注射G-CSF的错误数减少了35％，而PEG-GCSF减少了约49％。每组实验动物5只。*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。
2)G-CSF和PEG-GCSF显著提高了转基因老鼠水迷宫实验的成绩，如图2所示。测量参数是老鼠到达平台的潜伏期。比较的是在注射葡聚糖，G-CSF或者PEG-GCSF之前一天和注射一周之后的老鼠到达平台的潜伏期。注射葡聚糖的老鼠在注射前后没有明显的变化，而注射G-CSF或者PEG-G-CSF的老鼠的水迷宫测试成绩则有明显的提高。其中注射G-CSF的潜伏期缩短了30％，而PEG-GCSF注射组的老鼠的潜伏期则减少了55％。每组实验动物5只。*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。
3)G-CSF和PEG-GCSF减少了转基因老鼠大脑皮层中的淀粉样斑块的数量，如图3所示。Thioflavin-S是一种最为常用的检测淀粉样斑块的方法。水迷宫实验之后，老鼠用PBS灌注，然后用多聚甲醛固定。切片后进行Thioflavin-S染色。与注射葡聚糖的老鼠相比，经过G-CSF和PEG-GCSF治疗的老鼠不仅斑块的数量减少，而且平均尺寸也降低了很多。
4)G-CSF和PEG-GCSF减少了转基因老鼠海马中的淀粉样斑块的数量，如图4所示。Thioflavin-S是一种最为常用的检测淀粉样斑块的方法。水迷宫实验之后，老鼠用PBS灌注，然后用多聚甲醛固定。切片后进行Thioflavin-S染色。与注射葡聚糖的老鼠相比，经过G-CSF和PEG-G-CSF治疗的老鼠不仅斑块的数量减少，而且平均尺寸也降低了很多。