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本发明涉及一种生物植入材料及其制备方法，该方法包括以下步骤：(i)用酒精处理源自动物或人的组织；(ii)使所述的组织在溶剂中与选自分散酶、DNA酶、RNA酶和胃蛋白酶的酶接触；(iii)用碱溶液处理由步骤(ii)获得的组织；以及(iv)用酸溶液处理由步骤(iii)获得的组织。

1.  一种生物植入材料的制备方法，其包括以下步骤：
(i)用酒精处理源自动物或人的组织；
(ii)使所述的组织在溶剂中与选自分散酶、DNA酶、RNA酶和胃蛋白酶的酶接触；
(iii)用碱溶液处理由步骤(ii)获得的组织；以及
(iv)用酸溶液处理由步骤(iii)获得的组织。

2.  根据权利要求1所述的方法，其中步骤(i)包括包括用体积百分比80到95％的酒精第一次处理所述的组织，以及用体积百分比40到75％的酒精第二次处理所述的组织。

3.  根据权利要求1所述的方法，其中步骤(ii)中所用的酶是胰蛋白酶。

4.  根据权利要求1所述的方法，其中所用的酶的浓度范围是0.02％-0.2％w/v。

5.  根据权利要求1所述的方法，其中步骤(ii)中所用的溶剂还含有0.01％-0.5％乙二胺四乙酸(EDTA)和0.05％-5％的氯化钠。

6.  根据权利要求1所述的方法，其中在进行步骤(ii)之前，用pH范围在9.0-11.4之间，含有0.01％-2％乙二胺四乙酸和0.05％-5％氯化钠的溶剂处理步骤(i)所获得的组织。

7.  根据权利要求1所述的方法，所述碱溶液的pH范围是10.5-11.4。

8.  根据权利要求1所述的方法，所述酸溶液的pH范围是1.7-2.3。

9.  根据权利要求1所述的方法，所述的源自动物或人的组织心包膜、心脏瓣膜、下小肠粘膜、韧带、血管、皮肤、骨头、筋膜和胞衣。

10.  根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤(iv)获得的组织还进一步包括进行如下处理：将至少2片组织放入2个模子之间，使每片组织吸附在模子上，冷冻干燥后进行交联反应。

11.  根据任一权利要求1-10的方法制备的生物植入材料。

12.  根据权利要求11所述的生物植入材料，其用途为创伤敷料、角膜上皮替代品、加固软组织植入体、重构腹膜植入体、脑膜替代品、耳鼓膜替代品、重构膀胱替代品，粘附保护剂或治疗尿失禁的植入体。

生物植入材料及其制备方法
发明领域
本发明涉及一种生物植入材料及其制备方法。
发明背景
生物植入材料是用化学药品处理来自人和动物的组织获得的针对缺损组织或器官的可植入医用假体和人造组织，它包括心脏瓣膜、血液、韧带、脑膜的替代品以及用于医治太阳灼伤的创伤敷料等。
皮肤是人体的主要器官，它能防止体液外流，保护身体免受诸如细菌等外在有害物质的侵害以及发挥体温调节功能。倘若皮肤被太阳灼伤，体液会外流，皮肤暴露于外在有害物质会引发感染，因此受损伤的皮肤必须尽可能免受外在有害物质侵害。因此，用于保护缺损皮肤的创伤敷料必须具有阻止外在有害物质、保护缺损皮肤以及维持适当的透水性等功能。
通常，诸如聚醚聚氨酯和多聚-L-亮氨酸聚合物等合成大分子材料被广泛地用作创伤敷料的材料。然而，合成大分子材料只是替代人体组织的外源物质，缺乏相应的生物功能。因此，有关新生物材料制备方法的研究已广泛开展，而这种新生物材料源自组织，用于人体植入，兼有生物亲和性以及生物包容性。上述研究已有相关报道，例如，利用牛胞衣作为人体植入的生物材料来治疗太阳灼伤，可以减少炎症，提高治愈效果；牛胞衣也可用作创伤敷料或修复缺损膀胱的替代品。
然而，在临床上使用牛胞衣作为人体植入的生物材料，必须去除来自牛的免疫原组分和病毒以确保安全。
在一篇商业文章中提到，将猪下小肠粘膜去除免疫原组分并用过乙酸灭活病毒后可作为人体植入的生物材料，用作创伤敷料或修复缺损软组织的替代品。虽然这一生物材料已有相当广泛的应用，然而由于体内钙化作用，它的寿命很短。
此外，Ginger A.Abraham的公开号为2006/0024380的美国专利披露了一种用酸、碱、螯合物和盐去除免疫原组分的方法。然而，此方法由于在碱处理时碱浓度过高(pH 12)从而会诱发诸如胶原蛋白等蛋白的修饰，且由于未用酶消化细胞基质，很难去除实质层等复杂结构中的细胞。
因此，人们需要一种改良的用于人体植入的生物材料，其完全去除免疫原组分来阻止炎症反应和病毒等感染源引起的感染，且抑制体内的钙化作用从而可长期植入体内。
相应地，本发明者发明了一种皮肤替代品，它是由胞衣和胶原海绵制成，具有治愈伤口效果(参见，韩国专利No.644078)。本发明者还发明了一种改良的用于人体植入的生物材料制备方法，该方法具有灭活病毒等感染源，抑制体内钙化作用和拥有生物包容性等特征。
发明概述
因此，本发明的一个目的提供一种生物植入材料及其制备方法。
依照本发明的一个方面，提供了一种生物植入材料及其制备方法，其包括以下步骤：
(i)用酒精处理源自动物或人的组织；
(ii)使所述的组织在溶剂中与选自分散酶、DNA酶、RNA酶和胃蛋白酶的酶接触；
(iii)用碱溶液处理由步骤(ii)获得的组织；以及
(iv)用酸溶液处理由步骤(iii)获得的组织。
附图说明
下面结合附图对本发明的上述及其他目的和特点进行具体的说明，图示如下：
图1a是牛胞衣组织的masson三色染色的显微照片；
图1b是在实施例1中制备的胞衣植入材料的masson三色染色的显微照片；
图2a和2b分别为将例1中制备的胞衣植入材料应用于几内亚猪组织2周和4周后用苏木素和曙红染色(H&E)处理的显微照片；
图3a和3b分别为将Surgisis^TM应用几内亚猪组织2周和4周后用苏木素和曙红染色(H&E)处理的显微照片；
图4a是用浸有1N NaOH的滤纸处理的狗模型的眼睛；
图4b是用碱灼伤的模型狗的角膜；
图4c显示用生理盐水清洗模型狗的眼睛以去除残留的NaOH；
图5a是未经任何治疗的碱灼伤组织在灼伤6天后的苏木素和曙红染色(H&E)的显微照片；
图5b是将例6中制备的加固胞衣植入材料应用于碱灼伤组织中，图5b是施用后6天的苏木素和曙红染色(H&E)的显微照片；
具体实施方式
在步骤(i)中，用酒精处理源自动物或人的组织以去掉脂肪、灭活病毒和抑制体内钙化作用。
组织可以是源自动物或人的心脏瓣膜、下小肠粘膜、血管、韧带、皮肤、骨头、筋膜和胞衣，优选是牛的筋膜和胞衣、猪的主动脉瓣、下小肠粘膜、心脏瓣膜，更优选地为牛的胞衣。
用于处理上述组织的酒精为80-95％(优选95％)v/v的酒精，该酒精处理的组织在4-10℃存放12小时以去掉组织中的脂肪(第一次处理)。然后，再用40％-80％酒精v/v(优选70％)处理该组织，并在4-10℃存放12小时以灭活病毒，抑制引发体内钙化作用的物质(第二次处理)。
在步骤(ii)中，由步骤(i)获得的组织用酶溶液消化以去除碱性成分和残余脂肪。
酶选自胰蛋白酶，DNAse酶，RNAse酶和胃蛋白酶，优选使用0.02-0.2％重量/体积的胰蛋白酶。用于该反应的溶液可进一步包括0.01-0.5％乙二胺四乙酸(EDTA)和0.05-5％氯化钠，酶反应的温度范围25℃-40℃(优选为37℃)，作用时间是10分钟-2小时(优选为1小时)。
此外，在进行步骤(ii)之前，可以用pH范围是9.0-11.4，含有0.01-0.5％乙二胺四乙酸(EDTA)和0.05-5％氯化钠的溶液预处理由步骤(i)获得的组织，这样可以去除可溶性的碱性杂质。
在步骤(iii)中，用碱溶液处理由步骤(ii)获得的组织，这样可以去除免疫原成分。
碱溶液可以由EDTA和氯化钠组成，它的pH范围是9.0-11.4，优选pH 11.0。
在步骤(iv)中，用酸溶液处理由步骤(iii)获得的组织。
酸溶液包含0.02-2％EDTA和盐酸，它的pH范围是1.7-2.3，优选pH 2。
在步骤(iii)或(iv)中，用氢氧化钠调pH达到11.5或盐酸调pH低于1.7都会引起组织修饰。
此外，可以将至少两片由步骤(iv)获得的生物植入材料放入2个模子中使每片生物植入材料吸附在模子上，再经过冷冻干燥和交联反应的处理，这样可以得到一种加固的生物植入材料，它比由步骤(iv)获得的生物植入材料在物质密度和机械强度方面具有更加牢固的特性。具体地，制备这种加固的生物植入材料可以将至少两片由步骤(iv)获得的生物植入材料放入2个由铜或铝制成的模子中，这种模子具有孔径大小为1-10cm的孔；施压将生物植入材料压向模子，压力范围是1-20mb，再经过冷冻干燥处理4至72小时(优选18小时)，温度范围是-20至-130℃(优选-40℃)，最后是常规的交联反应。
实施常规的交联反应可以有如下处理方法：用0.25％的戊二醛(GAD)处理；用33mM的1，3-碳二亚胺，6mM的N-羟基丁二酰亚胺和90％丙酮混合物处理；用33mM的1，3-碳二亚胺，6mM的N-羟基丁二酰亚胺和40％乙醇混合物处理；或UV交联和热交联(DHT)。
Ginger A.Abraham等的美国专利文献No.2003/0130747披露了一种用层流干燥来制备生物材料的方法。这种方法会造成组织收缩，原因在于水汽蒸发可在组织和水分子之间引发表面张力。与此相反，本发明所用的冷冻干燥方法能够抑制组织修饰，使组织维持一种理想的正常形式。
另外，Tooru Yui等的美国专利文献No.5,876,451披露了一种在胞衣中插入用胶原或明胶包被的网来制备生物材料的方法。这种方法可以提高整体的机械强度，但会降低长期使用的耐受力，原因在于组织和网之间的结合力比较弱。与此相反，本发明所用的冷冻干燥方法通过使用模子来加强组织之间的聚合性，进而提高了其长期使用的耐受力。
依照本发明所述的生物植入材料具有以下特征：
(a)提供了可以吸附活的上皮细胞、内皮细胞和神经细胞的整个基质；
(b)植入后没有体内免疫排斥反应，
(c)植入后没有体内钙化作用；
(d)胶原比例至少是95％，
(e)所制备的生物植入材料可以用作创伤敷料，角膜上皮的替代品，加固软组织的植入体，重构腹膜的植入体，脑膜的替代品，耳鼓膜的替代品，重建膀胱的替代品，粘附保护剂或治疗尿失禁的植入体。
下述实施例用于进一步说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：胞衣植入材料的制备
自牛胎盘收集的牛胞衣样品低温保存于无菌生理盐水中并运至实验室。将500cm²的收集样品在冷藏室用1升95％的乙醇处理过夜，这样可去除牛胞衣样品中的脂肪。用1L纯净水清洗样品，共三次，每次10分钟；用刮刀剔除样品中的基质层。上述样品用1升70％的乙醇低温处理以灭活病毒，再加入1升EDTA/氯化钠溶液(pH 11)，其中该溶液含0.2％ EDTA和0.9％氯化钠，以150rpm搅拌1小时以去除可溶性碱性杂质(步骤(i))。然后，再用含0.05％胰蛋白酶，0.02％EDTA和0.9％氯化钠的溶液(pH 7.4)进行酶消化反应，该反应在37℃搅拌1小时(步骤(ii))。所获得的胞衣样品用1升70％的乙醇处理，150rpm搅拌1小时以去除残留脂肪，再用步骤(i)所使的碱溶液(pH11)处理，150rpm搅拌1小时(步骤(iii))。最后用含0.2％ EDTA的酸溶液(pH2)处理，150rpm搅拌1小时，使所得的胞衣样品膨胀，再用1L纯净水150rpm清洗样品，共三次，每次30分钟(步骤(iv))。
依照本发明制备所得的胞衣植入材料在包装后，可有选择地通过冷冻干燥或以25kGy的γ放射来灭菌消毒。
为了在组织学上确定上述制备所得的胞衣植入材料以彻底去除细胞，对未处理的和依本发明的方法处理的胞衣组织进行masson三色染色，结果分别如图1a和1b所示。如图1b所示，与未处理的胞衣组织相比，处理的胞衣组织在胞衣基膜内没有上皮细胞，在基质层亦无细胞。
实施例2：脂肪和修饰胶原蛋白的含量
测定下述三种方法的效果，即实施例1方法，依照Ginger A.Abraham(美国公开专利No.2006/0024380)的方法(条件A)和依照Tooru Yui等(美国专利No.5,876,451)的方法(条件B)。根据条件A和B所建立的方法详述如下。
在条件A中，源自牛胎盘的胞衣基质被去除。每100cm2样品加入1升的0.1M EDTA/10mM NaOH溶液，200rpm搅拌18小时，再加入1升的1M HCl/10mM NaOH溶液，200rpm搅拌8小时。所得样品用1升的1M NaCl/10mM磷酸缓冲液(PBS)处理，搅拌18小时，在其中加入1L的10mM PBS搅拌2小时，在无菌纯净水中200rpm进一步搅拌1小时。
在条件B中，源自牛胎盘的胞衣基质被去除。样品用纯净水彻底清洗以去除类似酪蛋白的基质，加入2.5g叠氮化钠，0.5g无花果蛋白酶和5升0.2M PBS溶液，该溶液含有0.9％ NaCl(pH 7)；室温放置24小时后再用纯净水彻底清洗。然后样品被置于由丙烯制成，由夹子固定的2个框架中超声处理15分钟，再加入0.1％苯扎氯铵溶液。
为了测定实施例1，条件A和条件B方法的效果，测定了脂肪含量和修饰胶原蛋白含量。
脂肪会引起体内钙化作用，脂肪含量测定方法为硫-磷酸-香兰素反应(sulfo-phospho-vanillin reaction)(参见，[J.Microbiologicalmethod.55，411-418(2003)]).在每个试管中加入1mg样品和2ml硫磺酸，加热至100℃，然后再冷却；加入5mL磷酸香兰素，37℃搅拌15分钟。在530nm检测样品的光密度。结果如表1所示。
表1 脂肪含量