一株抗苜蓿病害灰黄链霉菌及其筛选方法 【技术领域】
本发明属微生物技术领域， 具体涉及一株抗苜蓿病害灰黄链霉菌及其筛选方法。背景技术 自上世纪 50 年代以来， 大量广泛使用化学农药造成病原菌对化学农药产生抗性， 高残留引起环境污染， 以及化学农药对人畜产生毒害等加速了人们寻求新的、 安全有效的 植物病害防治途径。 在防治植物病害的各种措施中， 生物防治具有对环境、 生态和人类健康 较为安全的优点， 因此， 世界各国十分的重视生防微生物研究的开展和利用。 生防微生物具 有不易使病原菌产生耐药性、 对环境安全、 生产工艺较简单以及不少微生物同时具有促进 作物生长的特点而引起人们的关注和重视， 它将在病害防治中发挥越来越重要的作用。利 用拮抗微生物对病原菌的抗生作用、 营养和空间竞争、 重寄生作用及其诱导植物产生的系 统抗病性等作用， 来防治植物病害是植物病害生物防治的一个最重要的组成部分。在植物 病害的生物防治中， 放线菌是众多拮抗微生物中最具竞争能力的生防菌之一， 放线菌由于 能产生化学结构多样的具有抗生素活性的代谢产物而广泛应用于农业生物防治中。
自 Cohn(1872) 发现放线菌至今， 已经报道了 69 个属 1687 种。 在已知的放线菌中， 半数以上发现具拮抗性， 其中应用于生物防治的主要是链霉菌属 Streptomyces 的一些种 类， 其次有诺卡菌属 Nocardia、 游动放线菌属 Actinoplanes、 小单孢菌属 Micromonospora 等。 近 10 年来从微生物中发现的新活性物质中放线菌产生占 70％以上， 生防放线菌的筛选 和应用已成为植物病理学领域的研究重点。
放线菌对靶标菌发挥生防作用一般通过两种途径 ： 在寄主体外通过抗生作用、 竞 争作用、 捕食和重寄生作用， 导致病原菌的致病性及侵染效率降低 ； 放线菌也可在寄主植物 组织内， 诱发其产生抗性或者产生抑菌物质， 影响病原菌的生长、 繁殖， 最后导致其死亡。
利用放线菌防治植物病害， 特别是土传病害已有许多成功事例。早在 1950 年， Cooper V E 就发现放线菌对甘蔗根腐病 Fusarium arrkenomnes 有显著的拮抗作用。 用放线 菌的孢子和菌丝制成的活细胞制剂， 具有无毒、 无残留、 不伤害非靶标微生物、 与环境兼容 性好、 防病持效期长等优点。 世界上已广泛应用的放线菌活体制剂 Mycostop， 就是由芬兰的 Kemira(1989) 从泥煤中分离到的灰绿链霉菌 S.griseovidis 的孢子和菌丝制成的活细胞 制剂， 主要用来防治镰孢菌 Fusarium sp.、 疫霉菌 Phytophthora sp. 和丝核菌 Rhizoctonia sp. 等一些常见的土传病原菌， 通过种子处理、 土壤喷洒或灌根等措施处理后， Mycostop 可 在植物根部定殖、 生长和繁殖， 阻止病原菌的侵入， 并可产生激素促进寄主植物的生长， 从 而提高作物的产量。 1953 年中国科学院用从我国陕西泾阳县苜蓿根土中分离获得的细黄链 霉菌 Streptomycesmicroflavus 制成的 “5406” 抗生菌推广的面积最大。通过拌种将其施 于田间， 具有防病、 保苗和增产的效应。
近年来， 国内外已对辣椒疫病、 棉花立枯病、 棉花枯萎病、 黄瓜枯萎病、 小麦全蚀 病、 香蕉枯萎病及大豆疫霉根腐病等土传病害的拮抗放线菌筛选与生防应用等进行了研 究。Mark A.Roberts(2001) 分离、 筛选出 700 株具有抑制和杀灭多种植物病原菌能力的放
线菌， 尤其对真菌引起的根部病害效果显著。易龙等从辣椒根际土壤中分离筛选出对辣椒 疫病有较强拮抗作用的放线菌 7 株， 其中菌株 CQ21-3 的温室盆栽控病效果达 73.2％ ； 宗兆 锋等从土壤中分离的 58 株放线菌筛选出了 2 株对棉花立枯病、 黄萎病有较好的防治作用 的几丁质酶产生菌 ； 潘荣光等从 208 株放线菌筛选出对黄瓜枯萎病菌有拮抗性菌株 12 株， 其中菌株 PM-1 的抑菌谱广， 对靶标菌菌丝有明显致畸作用 ； 乔宏萍等从新疆保护地蔬菜和 棉田采集的土样中分离筛选 12 株对小麦全蚀病具有拮抗作用的放线菌， 3 株抑菌效果达到 80％以上， 防病促生作用明显 ； 曹理想等 (2003) 对香蕉内生放线菌进行分析发现， 玫瑰浅 灰链霉菌对尖孢镰刀菌有明显的拮抗活性。
此外， 放线菌产生的抗生素广泛应用于工业、 农业和医学领域， 很大一部分在在农 作物病虫害防治方面也起着至关重要的作用， 并取得了巨大的社会效益、 经济效益和生态 效益。由于其具有无污染、 无残留、 可再生、 不易使有害生物产生抗药性、 成本低、 易于产业 化等特点已成为无公害农药的主体和未来农药的发展方向之一。 鉴于放线菌及其代谢产物 在防治病害、 促进作物的生长、 提高作物产量等方面的重要作用， 正越来越多地被人们开发 和应用。
苜蓿 Medicago sativa L. 是重要的优质豆科牧草， 被誉为 “牧草之王” ， 兼具改良 土壤、 减少水土流失等生态功能， 在我国西部生态建设中具有重要作用。近年来， 随着作物 布局、 气候条件与生态环境的变化， 以及苜蓿生产中的品种单一化与多年连作， 为病害的发 生与流行创造了条件。苜蓿根腐病普遍发生于各苜蓿栽培区， 由其引发的苜蓿草地衰退导 致其利用期缩短， 该病已成为苜蓿生产的主要限制因素之一。如何对该病害进行科学有效 的防治， 使苜蓿人工草地最大限度地发挥生产、 经济和社会效益， 已成为越来越迫切需要解 决的问题。对苜蓿根腐病的防治目前主要依靠选育抗性品种和化学药剂加以控制。但目前 生产中缺乏真正有效的抗病品种， 或者是抗病品种的抗病性极易丧失。化学杀菌剂的过量 应用易使病原菌抗药性， 草产品农药残留超标， 生态环境污染加重， 致使其应用受到局限。 因此符合环保、 健康要求的生物农药的研究与应用日益受到关注。
为开发拮抗放线菌杀菌剂， 需建立一套有效的筛选模型对大量的放线菌菌株进行 结果可靠的抗活性筛选。现有技术中， 大多只采用平板抑菌实验法 ( 如平板对峙法、 抑菌 圈法、 牛津杯法、 管碟法、 挖块法、 琼脂块法或滤纸片法 )、 孢子萌发法等单一离体筛选模型 对活性菌株进行筛选， 其筛选结果不可靠， 使得后续研究结果不能真正服务于农业生产。 因 此， 需要寻找更加有效的拮抗放线菌筛选方法。 发明内容 本发明的一个目的是提供一株灰黄链霉菌。
本发明所提供的灰黄链霉菌菌株为灰黄链霉菌 (Streptomyces griseoflavus) NMG6-3-9， 其保藏编号为 CGMCC No.3441。
该菌株已于 2009 年 11 月 12 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心 ( 简称 CGMCC， 地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所， 邮编 100101)， 保藏号为 CGMCC No.3441。该菌株的分类命名为灰黄链霉菌 (Streptomyces griseoflavus)， 菌株名称为 NMG6-3-9。
本发明的另一个目的是提供一种菌的拮抗剂。
本 发 明 所 提 供 的 菌 的 拮 抗 剂，其 活 性 成 分 为 灰 黄 链 霉 菌 (Streptomycesgriseoflavus)NMG6-3-9 CGMCC No.3441 ；
所 述 菌 为 苜 蓿 茄 镰 孢 菌 Fusarium solani、苜 蓿 尖 镰 孢 菌 Fusarium oxysporum、 燕 麦 镰 孢 菌 Fusarium avenaceum、 苜 蓿 匍 柄 霉 Stemphyllium botryosum、 立 枯 丝 核 菌 Rhizoctonia solani、禾 谷 镰 孢 菌 Peronospora aestivalis、半 裸 镰 刀 菌 Fusariumsemitectum、香 蕉 枯 萎 菌 Fusarium oxysporum f.sp.cubense、瓜 果 腐 霉 Pythiumaphanidermatum、苜 蓿 壳 针 孢 Septoria medicaginis、瓜 类 壳 二 孢 Ascochytacitrullina、 大 丽 轮 枝 孢 Verticillium dahlia、 禾 顶 囊 壳 Gaeumannomyces graminis、 胶 孢 炭 疽 菌 Colletotrichum gloeosporioides、 禾 弯 孢 霉 菌 Curvularia lunata、大 斑 突 脐 孢 Exserohilumleonard turcicum、辣 椒 疫 霉 菌 Phytophthora capsici、 灰 葡 萄 孢 Botrytis cinerea、 核 盘 菌 Sclerotinia sclerotiorum、 粉红聚端 孢 Trichothecium roseum、 丁 香 假 单 胞 菌 Pseudomonas syringae、 胡萝卜软腐欧文氏 菌 Erwinia carotovora var.carotovora、 苜 蓿 黄 单 胞 杆 菌 Xanthomonas campestris pv.alfalfae、 青 枯 雷 尔 氏 菌 Ralstonia solanacearum、 和 / 或燕麦嗜酸菌西瓜亚种 Acidovorax avenae subsp.citrulli、 和 / 或金黄色葡萄球菌 Staphylococcusaureaus。 上 述 拮 抗 剂 中，所 述 燕 麦 镰 孢 菌 Fusarium avenaceum 为 燕 麦 镰 孢 菌 Fusariumavenaceum ACCC 30065， 所述 立枯丝核菌 Rhizoctonia solani 为 立枯丝 核 菌 Rhizoctonia solani ACCC 30332， 所述禾谷镰孢菌 Peronospora aestivalis 为禾谷镰孢 菌 Peronospora aestivalis ACCC 30068， 所述半裸镰刀菌 Fusariumsemitectum 为半裸 镰刀菌 Fusarium semitectum ACCC 31945， 所述香蕉枯萎菌 Fusarium oxysporum f.sp. cubense 为 香 蕉 枯 萎 菌 Fusarium oxysporum f.sp.cubenseACCC 36369， 所述瓜果腐霉 Pythium aphanidermatum 为瓜果腐霉 Pythiumaphanidermatum ACCC 36125， 所述瓜类壳 二孢 Ascochyta citrullina 为瓜类壳二孢 Ascochyta citrullina ACCC 36440， 所述大丽 轮枝孢 Verticillium dahlia 为大丽轮枝孢 Verticillium dahlia ACCC 36109， 所述禾顶 囊壳 Gaeumannomycesgraminis 为禾顶囊壳 Gaeumannomyces graminis ACCC 30310， 所述 禾弯孢霉菌 Curvularia lunata 为禾弯孢霉菌 Curvularia lunata ACCC 36580， 所述辣 椒疫霉菌 Phytophthora capsici 为辣椒疫霉菌 Phytophthora capsici ACCC 36279， 所 述灰葡萄孢 Botrytis cinerea 为灰葡萄孢 Botrytis cinerea ACCC 30091， 所述核盘菌 Sclerotinia sclerotiorum 为核盘菌 Sclerotinia sclerotiorum ACCC30096， 所述粉红 聚端孢 Trichothecium roseum 为粉红聚端孢 Trichothecium roseumACCC 36459， 所述胡 萝卜软腐欧文氏菌 Erwinia carotovora var.carotovora 为胡萝卜软腐欧文氏菌 Erwinia carotovora var.carotovora ACCC 01443， 所述青枯雷尔氏菌 Ralstonia solanacearum 为 青枯雷尔氏菌 Ralstonia solanacearumACCC 01470， 所述金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureaus 为金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureaus ACCC 01336。
灰黄链霉菌 (Streptomyces griseoflavus)NMG6-3-9 CGMCC No.3441 在制备如下 菌中至少一种菌的拮抗剂中的应用也属于本发明的保护范围 ：
苜蓿茄镰孢菌 Fusarium solani、 苜蓿尖镰孢菌 Fusarium oxysporum、 燕麦镰孢 菌 Fusarium avenaceum、 苜蓿匍柄霉 Stemphyllium botryosum、 立枯丝核菌 Rhizoctonia solani、 禾 谷 镰 孢 菌 Peronospora aestivalis、 半 裸 镰 刀 菌 Fusariumsemitectum、 香
蕉 枯 萎 菌 Fusarium oxysporum f.sp.cubense、瓜 果 腐 霉 Pythiumaphanidermatum、 苜 蓿 壳 针 孢 Septoria medicaginis、 瓜 类 壳 二 孢 Ascochytacitrullina、 大丽轮枝孢 Verticillium dahlia、 禾顶囊壳 Gaeumannomyces graminis、 胶孢炭疽菌 Colletotrichum gloeosporioides、 禾 弯 孢 霉 菌 Curvularia lunata、 大 斑 突 脐 孢 Exserohilumleonard turcicum、 辣 椒 疫 霉 菌 Phytophthora capsici、 灰 葡 萄 孢 Botrytis cinerea、 核盘 菌 Sclerotinia sclerotiorum、 粉 红 聚 端 孢 Trichothecium roseum、 丁香假单胞菌 Pseudomonas syringae、 胡 萝 卜 软 腐 欧 文 氏 菌 Erwinia carotovora var.carotovora、 苜 蓿 黄 单 胞 杆 菌 Xanthomonas campestris pv.alfalfae、 青 枯 雷 尔 氏 菌 Ralstonia solanacearum、 和 / 或燕麦嗜酸菌西瓜亚种 Acidovorax avenae subsp.citrulli、 和 / 或金 黄色葡萄球菌 Staphylococcusaureaus。
上 述 应 用 中，所 述 燕 麦 镰 孢 菌 Fusarium avenaceum 为 燕 麦 镰 孢 菌 Fusariumavenaceum ACCC 30065， 所述 立枯丝核菌 Rhizoctonia solani 为 立枯丝 核 菌 Rhizoctonia solani ACCC 30332， 所述禾谷镰孢菌 Peronospora aestivalis 为禾谷镰孢 菌 Peronospora aestivalis ACCC 30068， 所述半裸镰刀菌 Fusariumsemitectum 为半裸 镰刀菌 Fusarium semitectum ACCC 31945， 所述香蕉枯萎菌 Fusarium oxysporum f.sp. cubense 为 香 蕉 枯 萎 菌 Fusarium oxysporum f.sp.cubenseACCC 36369， 所述瓜果腐霉 Pythium aphanidermatum 为瓜果腐霉 Pythiumaphanidermatum ACCC 36125， 所述瓜类壳 二孢 Ascochyta citrullina 为瓜类壳二孢 Ascochyta citrullina ACCC 36440， 所述大丽 轮枝孢 Verticillium dahlia 为大丽轮枝孢 Verticillium dahlia ACCC 36109， 所述禾顶 囊壳 Gaeumannomycesgraminis 为禾顶囊壳 Gaeumannomyces graminis ACCC 30310， 所述 禾弯孢霉菌 Curvularia lunata 为禾弯孢霉菌 Curvularia lunata ACCC 36580， 所述辣 椒疫霉菌 Phytophthora capsici 为辣椒疫霉菌 Phytophthora capsici ACCC 36279， 所 述灰葡萄孢 Botrytis cinerea 为灰葡萄孢 Botrytis cinerea ACCC 30091， 所述核盘菌 Sclerotinia sclerotiorum 为核盘菌 Sclerotinia sclerotiorum ACCC30096， 所述粉红 聚端孢 Trichothecium roseum 为粉红聚端孢 Trichothecium roseumACCC 36459， 所述胡 萝卜软腐欧文氏菌 Erwinia carotovora var.carotovora 为胡萝卜软腐欧文氏菌 Erwinia carotovora var.carotovora ACCC 01443， 所述青枯雷尔氏菌 Ralstonia solanacearum 为 青枯雷尔氏菌 Ralstonia solanacearumACCC 01470， 所述金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureaus 为金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureaus ACCC 01336。
本发明的最后一个目的是提供一种筛选拮抗苜蓿根腐病的放线菌的方法。
本发明所提供的筛选拮抗苜蓿根腐病的放线菌的方法， 包括如下步骤 ：
1) 从待分离样品中得到纯培养放线菌 ；
2) 用平板对峙法、 抑菌圈法、 牛津杯法、 管碟法、 挖块法、 琼脂块法或滤纸片法， 从 步骤 1) 中所述纯培养放线菌中筛选对靶标菌具有拮抗作用的放线菌菌株， 得到拮抗靶标 菌的放线菌菌株 ； 所述靶标菌为引起苜蓿根腐病的菌 ；
3) 用孢子萌发法， 从步骤 2) 中所述拮抗靶标菌的放线菌菌株中筛选抑制所述靶 标菌孢子萌发的放线菌菌株， 得到抑制所述靶标菌孢子萌发的放线菌菌株 ；
4) 用温室盆栽活体法对步骤 3) 得到的放线菌菌株进行检测， 得到拮抗苜蓿根腐 病的放线菌。上述方法中， 所述温室盆栽活体法包括如下步骤 ： a) 发酵培养所述抑制所述靶标 菌孢子萌发的放线菌菌株， 得到含有所述抑制所述靶标菌孢子萌发的放线菌菌株的发酵 液， 将所述含有所述抑制所述靶标菌孢子萌发的放线菌菌株的发酵液接种于土壤中， 得到 土壤和所述抑制所述靶标菌孢子萌发的放线菌菌株的混合物 ； b) 将苜蓿种子接种于步骤 a) 中所述混合物中， 培养 ； c) 待所述苜蓿种子出苗 30d 后， 用所述靶标菌的孢子悬浮液进行 伤根接菌， 继续培养， 检测防治率， 防治率大于等于 75％的放线菌菌株即为拮抗苜蓿根腐病 的放线菌。
上述方法中， 所述步骤 a) 中， 所述土壤和所述抑制所述靶标菌孢子萌发的放线菌 菌株的混合物中所述抑制所述靶标菌孢子萌发的放线菌菌株的浓度为 108cfu/g ；
和 / 或， 所述步骤 c) 中， 所述伤根接菌的接种量为 106cfu/g 土壤。
上述方法中， 所述步骤 3) 中所述抑制所述靶标菌孢子萌发的放线菌菌株为对所 述靶标菌孢子的萌发抑制率大于等于 80％的放线菌菌株。
上述方法中， 所述靶标菌为苜蓿根腐病菌 ； 所述苜蓿根腐病菌为苜蓿茄镰孢菌 Fusarium solani、 苜蓿尖镰孢菌 Fusarium oxysporum 或燕麦镰孢菌 Fusariumavenaceum ； 所述待分离样品为土壤。
平板抑菌实验中， 本发明菌株对靶标菌苜蓿茄镰孢菌 Fusarium solani 的抑 菌圈直径为 32.68mm ； 孢子萌发抑制实验中， 本发明菌株对靶标菌苜蓿茄镰孢根腐病菌 (F.solani) 的抑制率为 100 ％ ； 活体盆栽防病效果检测实验中， 本发明菌株作用组， 植株 病情指数为 16.35， 发病率为 39.68 ％， 防效为 81.50 ％， 效果显著好于对照组 ( 井岗霉 素、 发酵培养基、 清水 )。另外， 本发明菌株具有广谱的抗菌性， 对如下菌均具有很好的 拮抗性 ： 苜蓿茄镰孢根腐病菌 F.solani， 苜蓿尖镰孢根腐病菌 F.oxysporum， 燕麦镰孢菌 F.avenaceum， 苜蓿匍柄霉 Stemphyllium botryosum， 立枯丝核菌 Rhizoctonia solani， 禾谷镰刀菌 F.graminearum， 半裸镰刀菌 F.semitectum， 香蕉枯萎菌 F.oxysporum f.sp. cubense， 瓜果腐霉 Pythium aphanidermatum， 苜蓿壳针孢 Septoria medicaginis， 瓜类壳 二孢 Ascochyta citrullina， 大丽轮枝孢 Verticilliumdahlia， 禾顶囊壳 Gaeumannomyces graminis， 胶孢炭疽菌 Colletotrichumgloeosporioides， 禾弯孢霉菌 Curvularia lunata， 大斑突脐孢 Exserohilumleonardturcicum， 辣椒疫霉菌 Phytophthora capsici， 灰葡萄 孢 Botrytis cinerea， 核 盘 菌 Sclerotinia sclerotiorum， 粉 红 聚 端 孢 Trichothecium roseum ； 丁香假单胞菌 Pseudomonas syringae， 胡萝卜软腐欧文氏菌 Erwinia carotovora var.carotovora， 苜蓿黄单胞杆菌 Xanthomonas campestris pv.alfalfae， 青枯雷尔氏菌 Ralstoniasolanacearum， 燕麦嗜酸菌西瓜亚种 Acidovorax avenae subsp.citrulli， 金黄 色葡萄球菌 Staphylococcus aureaus。
因此， 本发明菌株对苜蓿根腐病病原菌具有非常好的拮抗作用， 能够用于生物防 治苜蓿根腐病及其它多种植物病害， 在生物防治病害领域具有广阔的应用前景。本发明 为苜蓿根腐病的生物防治奠定基础， 进而为该病生防放线菌制剂的研制与应用提供科学依 据。
本发明属植物病害生物防治技术领域。本发明将离体筛选模型 ( 平板抑菌实验 法、 孢子萌发法 ) 与活体筛选模型 ( 温室盆栽活体抑菌试验 ) 相结合， 建立了一套结果可靠 的抗放线菌的筛选方法。本发明方法包括平板抑菌法初筛活性菌株步骤、 孢子萌发法复筛活性菌株步骤， 及室内盆栽活体试验验证步骤。首先采用平板抑菌法初筛出对靶标菌 ( 苜 蓿根腐病菌 ) 抑菌效果较强的活性放线菌菌株 ； 其次用孢子萌发法复筛经初筛入选的活性 放线菌菌株， 筛出对靶标菌孢子萌发抑制率≥ 80％以上的活性放线菌菌株 ； 将孢子萌发法 筛选得到的活性放线菌菌株进行发酵培养， 将活性菌株的发酵液接种于灭菌育苗土壤， 在 盆栽供试苜蓿植株接种靶标菌 ( 苜蓿根腐病菌 ) 进行活体活性验证， 采用温室活体防效试 验筛选出防治效果好的抗苜蓿根腐病的放线菌。 本方法筛选出的具有较好抗苜蓿根腐病活 性的放线菌菌株， 入选菌株在抗离体及活体筛选模型上均具有高拮抗活性， 为进一步探讨 拮抗放线菌活性物质的分离、 提纯与应用提供了可靠结果。实验证明， 通过本发明的方法， 筛选到了一批具有较好抗活性的放线菌菌株， 入选菌株在离体及活体模型上均具有较好活 性， 为追踪分离活性化合物提供了可靠结果。本方法结果可靠、 还具有操作简便、 能快速有 效地筛选出防治苜蓿根腐病的放线菌等优点。 附图说明
图 1 为菌株 NMG6-3-9 气生菌丝形态 ( 光学显微镜下 200×)。
图 2 为菌株 NMG6-3-9 孢子形态 ( 扫描电镜下 10000×)。
图 3 为菌株 NMG6-3-9 孢子丝形态 ( 扫描电镜下 10000×)。 图 4 为依据 16S rDNA 基因序列构建的菌株 NMG6-3-9 的系统发育树。具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。
实施例 1、 菌株的分离与鉴定
一、 分离
高 氏 1 号 培 养 基 ：琼 脂 15g、可 溶 性 淀 粉 20g、 NaCl 0.5g、 KNO3 1g、 K2HPO4·3H2O0.5g、 MgSO4·7H2O 0.5g、 FeSO4·7H2O 0.01g、 蒸馏水 1000mL， pH7.2-7.4。
PDA 琼脂培养基 ： 马铃薯 ( 去皮 )200g、 蔗糖 ( 或葡萄糖 )20g、 蒸馏水 1000mL、 pH 值自然。
苜蓿茄镰孢菌 (Fusarium solani) ； ( 曹丽霞， 赵存虎， 白全江， 等 . 内蒙古中部地 区苜蓿根腐病病原研究 ( 英文 )[J]. 华北农学报， 2008， 23(6) ： 105-107.)
( 一 ) 从土壤中分离得到放线菌纯培养物
采用稀释平板分离法从采自内蒙古鄂尔多斯市境内毛乌素沙地土壤样品中分离 菌株。
采集土壤， 将采集的土样经自然风干， 过筛， 称重。采用琼脂平板稀释法获得土壤 中主要放线菌类群。具体方法 ： 将预处理的土壤样品用无菌水稀释成 10-1、 10-2、 10-3、 10-4、 10-5、 10-6 倍的悬浮液， 置 200r/min 摇床振荡 5min， 取 0.2mL 上清液， 用三角玻棒在制好在高 氏 1 号琼脂平板上涂抹均匀。置于 28℃恒温培养箱中培养 7-10d。观察菌落生长情况， 挑 取平皿中占优势的菌落于试管中纯化， 将纯化的单菌落转接到高氏一号斜面上培养后， 编 号保存， 共计得到 294 株纯培养放线菌。
( 二 ) 平板抑菌法初筛活性菌株苜蓿茄镰孢菌 (Fusarium solani) 的培养方法 ： 将苜蓿茄镰孢菌 (F.solani) 接种 于 PDA 培养基， 于 28℃恒温培养箱中培养 5-6d， 得到苜蓿茄镰孢菌菌饼。
将分离到的 294 株放线菌分别接种于高氏 1 号琼脂平板上于 28℃下培养 5d， 待 长好后用打孔器将菌苔打成直径 5mm 的菌饼， 并将放线菌菌饼置于 PDA 平板中心， 使带有 菌丝的一面贴在培养基表面， 3d 后在距中心 2.5cm 均匀反贴同样大小 4 块苜蓿茄镰孢菌 (F.solani) 菌饼， 对峙接于放线菌周边， 每个菌株重复 5 次， 25℃下培养， 观察是否产生抑 菌 ( 溶菌 ) 圈， 定期观察、 测量抑菌 ( 溶菌 ) 圈的直径。采用十字交叉法测量抑菌 ( 溶菌 ) 圈的直径。根据直径大小决定菌株的取舍。放线菌的拮抗性强度体现在其产生的抑菌 ( 溶 菌 ) 圈的直径大小。
放线菌的拮抗性强度统计标准 ： R 为拮抗圈直径， 分以下 4 个等级分类 ： 10mm ＜ R ≤ 20mm( 拮抗性极强 )， 5mm ＜ R ≤ 10mm( 拮抗性较强 )， 0mm ＜ R ≤ 5mm( 拮抗性弱 ) 和 R ＝ 0( 无拮抗性 )。在以上标准下， 选取拮抗性极强、 较强的放线菌进行后续筛选。
拮抗性即为放线菌对苜蓿根腐病菌的抗性。
结果表明， 此步骤中从 294 株菌中共筛选得到 8 株符合拮抗性要求的放线菌菌株， 其中 3 株为拮抗性极强， 5 株为拮抗性较强。
上述平板抑菌实验法初筛活性菌株采用常规的平板对峙法、 牛津杯法、 管碟法、 挖 块法、 琼脂块法或滤纸片法等均可。
( 三 ) 孢子萌发法复筛活性菌株
1. 苜蓿根腐病菌孢子悬浮液的制备
PDA 培养基 ： 马铃薯 200g、 葡萄糖 ( 或蔗糖 )10 ～ 20g、 琼脂 17 ～ 20g、 蒸馏水 1000mL， pH7.0。
将苜蓿茄镰孢菌 (Fusarium solani) 接种于 PDA 培养基， 于 28℃恒温培养箱中培 养 5-6d， 待菌丝长满培养基后用无菌水洗去气生菌丝， 400nto 日光灯照射下培养产孢， 待 2-3d 产孢后， 用无菌水洗下孢子， 经细菌过滤器无菌过滤除去菌丝并加入 0.02％ Tween-20 制成孢子悬浮液在 4℃下保存备用， 孢子悬浮液中孢子浓度为 106cfu/mL。
2. 拮抗放线菌的制备
(1) 放线菌菌株的制备
本实验中所用菌株为实验二中得到的 8 株菌。
斜面培养基 ： 高氏 1 号合成培养基。 琼脂 15g， 可溶性淀粉 20g， NaCl 0.5g， KNO31g， K2HPO4·3H2O 0.5g， MgSO4·7H2O 0.5g， FeSO4·7H2O 0.01g， 蒸馏水 1000mL， pH7.3。
种子培养基 ： 酵母膏 4g、 葡萄糖 10g、 蛋白胨 3g、 牛肉膏 3g、 CaCO3 4g、 蒸馏水 1000mL， pH7.2-7.4。
发酵培养基 ： 葡萄糖 5g、 甘油 5g、 可溶性淀粉 5g、 蛋白胨 5g、 酵母膏 5g、 黄豆粉 5g、 KH2PO4 0.5g、 CaCO3 0.5g、 NaCl 0.5g、 MgSO4 0.5g， 蒸馏水 1000mL， pH7.0-7.2。可溶性淀 粉购自内蒙古鸿之惠商贸有限公司， 产品目录号为 HX169 ； 蛋白胨购自内蒙古鸿之惠商贸 有限公司， 产品目录号为 SH0010 ； 酵母膏购自内蒙古鸿之惠商贸有限公司， 产品目录号为 SH0348 ； 黄豆粉购自超市。
1) 斜面培养 ： 分别将菌株接种于高氏 1 号斜面上， 在 28℃培养 5-6d ；
2) 种子培养 ： 从生长好的放线菌斜面接种于 100mL 种子培养基中， 220r/min、 28℃振荡培养 48h， 得到种子培养液 ；
3) 发酵培养 ： 按 10％ (v/v) 的接种量将种子培养液接种于 100mL 发酵培养基中， 220r/min、 28℃振荡培养 120h， 得到含有放线菌菌株的发酵液。
3. 拮抗放线菌的筛选
将上述方法 2 中制得的发酵液， 与上述方法 1 中制得的孢子悬浮液等体积混合， 取 一滴上述混合液滴加在表面用火棉胶处理过的盖玻片上， 每处理 5 个重复。在 25℃下保湿 培养 6h 后检查空白对照孢子的萌发， 当空白对照孢子的萌发率达到 85％后， 检查所有处理 的苜蓿根腐病菌孢子萌发率 ( 以孢子芽管长度大于孢子长度一半者为萌发 )。 空白对照组 ： 以无菌水与上述方法 1 中制得的孢子悬浮液等体积混合配制获得。试验重复 5 次。
按以下公式计算孢子萌发抑制率 ：
实验二中获得的 8 株拮抗放线菌与苜蓿根腐病菌的处理中， 苜蓿根腐病菌孢子萌 发抑制率依次为 33.85 ％、 49.46 ％、 62.72 ％、 68.98 ％、 76.45 ％、 81.36 ％、 84.60 ％、 100 ％ ； 选取孢子萌发抑制率大于 80％的菌株进行如下实验四， 共 3 株。
( 四 ) 温室盆栽活体试验
本实验对步骤三中筛选得到的 3 株菌进行进一步的筛选。
(1) 放线菌悬浮液制备 ： 将步骤三得到的 4 株放线菌菌株分别在发酵培养基中振 8 荡培养 7d， 制成浓度为 10 cfu/mL 的孢子悬浮液。
(2) 靶标菌孢子悬浮液的制备 ： 将指示菌株 (F.solani) 用燕麦片培养基于 28℃恒 温培养箱中培养 5-6d， 待菌丝长满培养基后， 交替培养 ( 黑暗 - 光照 )7d， 产生大量的分生 孢子， 用无菌水洗下孢子， 经细菌过滤器无菌过滤除去菌丝， 加入 0.02％ Tween-20 制成浓 6 度为 10 cfu/mL 的孢子悬浮液。
燕麦片培养基 ： 燕麦片 30g， 琼脂 17-20g， 蒸馏水 1000mL( 燕麦片 30g 加蒸馏水 1000mL， 在沸水浴上加热 1h， 纱布过滤后加水补足 1000mL， 加琼脂熔化后分装， 121℃灭菌 20min)。
(3) 温室盆栽防效试验
苜蓿 ( 中苜 1 号 ) 种子由国家种质牧草中期库提供， 产品目录号为 00068。
将苜蓿 ( 中苜 1 号 ) 种子进行消毒处理， 用 0.1％的新洁尔灭表面消毒 3min， 蒸馏 水冲洗 3 次， 在 25-28℃培养箱内催芽， 待种子露白时点播种。育苗土壤先经 121℃下高压 灭菌 2h， 而后用放线菌孢子悬浮液拌匀， 土壤中放线菌的接种量为 108cfu/g。出苗 30d 后 以靶标菌孢子悬浮液进行伤根接菌， 接种量为 106cfu/g， 以清水为对照 1(CK1)， 培养放线菌 所用的发酵培养基为对照 2(CK2)， 每处理重复 10 次。接种靶标菌 45d 后检查苜蓿苗发病 情况， 计算病情指数和防治率。 通过防效分析， 从复筛出的高活性菌株中筛选出室内防治率 ≥ 75％的抗活性菌株。
病情分级标准 ：
0 级 - 健株， 表观无症状 ；
1 级 - 根茎或主根局部有病斑， 但不连片 ；
2 级 - 主根、 侧根及根茎部有病斑且连片， 但不超过 1/3 ；
3 级 -1/3 ～ /2 根茎及根部被侵染变色， 侧根多被侵染变色， 且侧根明显减少 ； 4 级 - 根茎及根部变色， 局部腐烂， 维管束明显变褐， 植株生长受抑制且矮小枯黄 ； 5 级 - 根部 腐烂， 维管束变黑且植株萎蔫死亡。
发病率、 病情指数和防治效果的计算公式 ：
当计算出的防治效果 (％ ) ≥ 75％时， 可认为该菌株发酵液供试样品具有较好的 抗苜蓿根腐病活性， 该菌株即为目的菌株。
结果， 获得 1 株对苜蓿根腐病防治效果大于 75％的拮抗放线菌菌株， 将该菌株命 名为 NMG6-3-9。
二、 鉴定
( 一 ) 形态特征观察
将待鉴定的菌株作插片培养， 进行形态特征观察。将所观察到的气生菌丝形态进 行光学显微照相， 对孢子丝进行扫描电子显微镜照相。
菌株 NMG6-3-9 菌落呈灰色绒粉状， 经插片培养观察 ： NMG6-3-9 的菌丝较长， 气生 菌丝多分枝， 螺旋形 ( 图 1)。孢子圆形、 椭圆形或长柱形， 孢子丝直、 柔曲或呈松敞螺旋形， 其扫描电镜照片如图 2、 图 3 所示。
( 二 ) 培养特征观察
将待鉴定的菌株， 分别接种在高氏一号、 察氏、 葡萄糖 - 天冬素、 克氏一号、 马铃薯 浸汁、 葡萄糖酵母膏琼脂斜面上及马铃薯块培养基上， 置于 28℃培养， 观察其培养特征和颜 色变化。取稳定成熟的颜色特征作为其培养特征， 作为鉴定种的依据。观察记载气生菌丝 的颜色、 基质丝体的颜色和可溶性色素的颜色。结果记入鉴定表。此外， 尚应观察菌株的生 长状况， 如生长好坏， 气生菌丝呈现何等外貌 - 绒状、 粉状或絮状等作为参考特征。
菌株 NMG6-3-9 在大多数培养基上生长良好， 该菌在不同的培养基上的培养性状 特征如下表 1 ； 另外该菌除在察氏琼脂培养基上会产生可溶性色素外， 在其他几种供试培 养基上都不产生色素。
表 1 菌株 NMG6-3-9 的培养特征
注： 以最后一次观察结果为准。
( 三 ) 生理生化特性测定
明胶液化能力测定 ： 将菌株接种于柱形明胶培养基表面， 28 ℃下培养， 分别在 5、 10、 20、 及 30d， 各观察一次液化程度。观察前应将菌种管冷冻 20 ～ 30min。如明胶不液化 仍是固体状态， 若呈现液体即为液化。
牛奶凝固与胨化测定 ： 将待测定菌株接种于脱脂牛奶中， 28 ℃培养， 分别在第 3、 6、 10、 20、 及 30d 各观察一次。
淀粉水解测定 ： 将培养基熔化后， 冷却至 50℃倒成平板， 凝固后将菌种点种于平 板上， 适温培养 2 ～ 4d， 形成菌苔后在平板上滴加路哥氏碘液， 以铺满菌落周围为宜， 平板 呈蓝色， 而菌落周围有无透明圈出现说明淀粉是否被水解， 透明圈的大小能够说明水解淀 粉能力的大小。
纤维素水解试验 ： 配制适合放线菌生长而不含碳源的合成基础培养液， 分装试管 后， 以新华一号滤纸作纤维素 ( 碳源 )， 把它切成宽 1cm、 长 6cm 滤纸条， 加入试管中， 一半浸 在液内， 一半露在液外， 将鉴定菌株接种在液外一段滤纸条上， 置 28℃培养 30d 后观察。若 该菌能将滤纸条分解成一团松散的纤维， 或使之折断， 碎裂成质状者为阳性， 说明该菌株产 生纤维素酶使之水解。反之， 滤纸无变化者为阴性。
硫化氢产生试验 ： 将待测菌株接种到含柠檬酸铁的有机斜面上， 置 28℃培养 10d 左右 ( 视菌苔生长成熟为宜 ) 观察结果。 若培养基中出现黑褐色沉淀， 表示实验为阳性。 反 之， 不变色者为阴性。
碳源利用试验 ： 将待鉴定菌株的孢子悬浮液 1 ～ 2 滴， 接种在无碳源培养基上， 用 无菌涂布棒涂布均匀， 然后划线挖沟， 以沟为界， 把平板培养基分成若干小区， 每小区分别 加入一种碳源。 常用的碳源有 9 种 ： 阿拉伯糖、 半乳糖、 鼠李糖、 木糖、 果糖、 蔗糖、 山梨糖、 甘 露醇和肌醇等。每皿需设无糖对照区。置 28℃培养 7、 14d 后， 分别观察记载生长利用情况。
研究结果见表 2 ： 菌株 NMG6-3-9 能液化明胶， 不能使牛奶凝固， 也不能使其胨化， 淀粉水解较弱， 不利用纤维素， 硝酸盐还原， 不产生酪氨酸酶、 H2S。除对葡萄糖和肌醇利用 较差外， 对阿拉伯糖、 果糖、 蔗糖、 鼠李糖、 木糖、 甘露醇和半乳糖都能很好的利用。
表 2 菌株 NMG6-3-9 的生理生化特征
注： “-” 表示未反应， “+” 、 “++” 、 “+++” 分别表示反应的强弱。
( 四 ) 细胞壁化学组分的鉴定
纸层析法细胞壁氨基酸分析 ： 根据 G+ 细菌细胞壁肽聚糖分子中第 3 位氨基酸的种 类， 将放线菌划分为九个类群 ( 见表 3)。
表 3 放线菌细胞壁的主要类型
注： LL-DAP ： 外消旋二氨基酸基庚二酸 ； meso-DAP ： 内消旋二氨基庚二酸 ； DAB ： 1， 4- 二羟基丁酸。
主要步骤为 ：
(1) 菌体制备 ： 刮取培养好的菌株放入 1.5mL 的离心管中 ；
(2) 菌体水解 ： 在用于全细胞氨基酸分析的菌体中加入 6mol/L 的 HCl 100μL， 放 入灭菌锅中 120℃， 15min ；
(3) 点样 ： 取 4μL 用于氨基酸分析的水解液于新华 1 号滤纸上点样， 再分别取标 准氨基酸样品二氨基庚二酸 DAP( 含有 LL-DAP， Meso-DAP 和 DD-DAP)、 赖氨酸、 鸟氨酸、 天冬 氨酸、 甘氨酸、 谷氨酸、 丙氨酸各 1μL 依次在滤纸上间隔点样。
(4) 展层 ： 用于全细胞氨基酸水解液分析的展层系统为甲醇∶水∶ HCl(6N) ∶吡 啶＝ 16 ∶ 5.2 ∶ 0.8 ∶ 2， 展层 2 次 ；
(5) 显色 ： 氨基酸分析用 0.4％茚三酮丙酮溶液， 100 ～ 110℃加热 2 ～ 3min， 观察。
纸层析法细胞壁糖分分析 ： 根据放线菌细胞壁的化学组分和全细胞水解液糖型， 将放线菌划分为四个糖型 ( 见表 4)。
表 4 放线菌全细胞的主要糖型
主要步骤为 (1) 菌体制备刮取培养好的菌株放入 1.5mL 的离心管中 ； (2) 菌 体 水 解 ： 菌 体 中 加 入 0.25mol/L 的 HCl 100μL， 放 入 灭 菌 锅 中 120 ℃，15min ； (3) 点样 ： 取 4μL 用于氨基酸分析的水解液于新华 1 号滤纸上点样， 再分别取标 准糖样品 ： 木糖、 阿拉伯糖、 半乳糖、 葡萄糖、 鼠李糖、 甘露糖、 核糖各 1μL 依次在滤纸上间 隔点样。
(4) 展层 ： 用于全细胞氨基酸水解液分析的展层系统为正丁醇∶水∶吡啶∶甲醇 ＝ 10 ∶ 6 ∶ 6 ∶ 1， 展层 2 次 ；
(5) 显色 ： 显色剂 ： 邻苯二甲酸∶苯胺∶水饱和的正丁醇 (3.25 ∶ 2 ∶ 100)， 120℃ 加热 3min。
对菌株 NMG6-3-9 进行纸层析法细胞壁氨基酸分析， 结果如表 5 ：
表 5 菌株 NMG6-3-9 全细胞氨基酸分析结果
注： “-” 表示未反应， “+” 表示反应。 对菌株 NMG6-3-9 进行纸层层析法细胞壁糖分分析， 结果如表 6 ： 表 6 菌株 NMG6-3-9 的全细胞壁糖分注： “-” 表示未反应， “+” 表示反应。
综 合 表 5、 表 6 结果可知 ： 菌 株 NMG6-3-9 细 胞 壁 中 含 有 氨 基 酸 的 种 类 为 ： LL-DAP(LL- 二氨基庚二酸 )、 甘氨酸 (GLY) 和谷氨酸 (GLU)， 对照文中表 3 可知该菌株细胞 壁属于 I 型 ； 细胞壁中除含有葡萄糖外不含有表 4 中其它糖的种类， 无特征性糖， 该菌株糖 型为 C 型， 符合链霉菌 Streptomyces 的化学分类特性。
( 五 )16S rDNA 序列分析
DNA 膜板的制备 ：
DNA 提取 ：
纯化后的生防放线菌株 NMG6-3-9 接种于高氏一号培养皿中， 28℃培养至生长中 期， 备用。
提取的主要步骤如下 ：
(1) 皿内刮取少量菌体， 加 60μL 2×CATB 缓冲液， 冰浴研钵中研磨至浆液， 移入
1.5mL 离心管中 ( 每菌做 3 管 )。
(2) 加 500μL 溶菌酶处理液 ( 溶菌酶 2mg/mL， RNase 溶液 50μg/mL， 蔗糖 0.3M， Tris-HCl 1M， pH8.0) 置于 37℃保温 2h。
(3) 加入 250μL 20％ SDS 溶液， 震荡混合。
(4)55℃保温 60min。
(5) 加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇 (25 ∶ 24 ∶ 1) 充分摇匀， 4 ℃ Tris-HCl 1M， pH8.0 下离心 (8000rpm， 5min)。
(6) 取上清液移至另一离心管中， 加 10％ NaAC 液， 2.5 倍体积冰冻乙醇沉淀。
(7)4℃离心 (10,000rpm， 5min)， 弃上清液。
(8) 重复步骤 (5) ～ (7)1 次。
(9) 用 70％乙醇洗 2 ～ 3 次， 晾干， 加 TE 缓冲液 60μL， 充分溶解后取 3μL 检测 并 -20℃下保存。
PCR 扩增 16S rDNA ：
(1)PCR 仪 ： 型号 ： ALD-1244、 rev、 C.B
(2) 扩 增 引 物 ： 16S rDNA 通 用 引 物 (50 μ M) 正 向 Pf 为 5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ( 对 应 于 E.coli8 ～ 27 位 碱 基 )， 反 向 Pr 为 5’ -TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’ ( 对应于 E.coli1492 ～ 1514 位碱基 )， 由中科院微生物 所基因工程中心合成。
(3) 扩增体系 ：
表 716S rDNA PCR 扩增体系
注： 25μL 体系PCR 扩增参数及程序 ：
按扩增体系 ( 表 7) 依次加入各组分， 瞬时离心混匀， 加入 Taq 酶后瞬时离心混匀。 95℃预变性 5min， 进入循环 ： 94℃变性 1min， 50℃退火 1min， 72℃延伸 2min。35 个循环后， 72℃延伸 10min。扩增产物 -20℃储存。
PCR 扩增产物的电泳检查 ：
电泳条件为 0.8％的琼脂糖凝胶 ( 含 EB 0.5μg/mL)， 1×TAE 电泳缓冲液， 80V 电 压电泳 40min， PCR 产物上样量为 4μL， 与 2μL 上样缓冲液混匀后点样。
在 254nm 紫外下观察结果， 以 TaKaRa 公司 DNA Marker[DL2000] 为核酸标准分子 量参照物， 确定扩增片段长度。扩增产物带应在标准物 1500bp 左右位置上。
16S rDNA PCR 产物全序列测定 ：PCR 产物的纯化与序列测定由上海英骏生物技术有限公司进行。测序时以扩增引 物作为正反向引物， 由上海英骏生物技术有限公司用计算机引物设计软件， 根据所测出的 样品的序列搜索设计出中间引物并合成。
系统进化树的构建 ：
将所测的 16S rDNA 序列与 GenBank 基因库中已测定的原核生物的 16S rDNA 序列 进行比较， 调出与其序列同源性较高的菌株的 16S rDNA 序列。采用 CLUSTAL X 1.8 软件对 所测定的同源序列进行多匹配排列， 通过 Treeview 软件进行系统进化树的构建。与菌株 NMG6-3-9 序列同源性较高的菌株见表 8。 进一步采用分子生物学技术手段对菌株 NMG6-3-9 进行分子鉴定， 经 16S rDNA 基因测序分析， 共测定 1433 个有效碱基， 如序列表 1 所示， 构建 的系统进化树如图 4 所示。
与菌株 NMG6-3-9 序列同源性较高的菌株见表 8。由表 8 可以看出， 与供试菌株相 似性达 99％均为链霉菌属的菌株， 可得知菌株 NMG6-3-9 属于链霉菌属。通过 16SrDNA 序 列分析发现， 菌株 NMG6-3-9 与灰黄链霉菌 S.griseoflavus 亲缘关系比较近， 同源性达到了 99.90％， 且同在系统进化树一个单独的分支上。
表 8 构建系统发育树所用的 Streptomyces 16S rDNA GenBanK 登陆号
综 上， 由 形 态 特 征、 培 养 特 征、 生 理 生 化 特 性 和 细 胞 壁 成 分 分 析， 并 结 合 分 子 生 物 学 鉴 定 结 果， 最 后 将 菌 株 NMG6-3-9 定 为 链 霉 菌 属 灰 黄 链 霉 菌 (Streptomycesgriseoflavus)。
该菌株已于 2009 年 11 月 12 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心 ( 简称 CGMCC， 地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所， 邮编 100101)， 保藏号为 CGMCC No.3441。该菌株的分类命名为灰黄链霉菌 (Streptomyces griseoflavus)， 菌株名称为 NMG6-3-9。
四、 菌株 NMG6-3-9 的培养
斜面培养基 ： 高氏 1 号合成培养基。 琼脂 15g， 可溶性淀粉 20g， NaCl 0.5g， KNO31g， K2HPO4·3H2O 0.5g， MgSO4·7H2O 0.5g， FeSO4·7H2O 0.01g， 蒸馏水 1000mL， pH7.3。
种子培养基 ： 酵母膏 4g、 葡萄糖 10g、 蛋白胨 3g、 牛肉膏 3g、 CaCO3 4g、 蒸馏水 1000mL， pH7.2-7.4。
发酵培养基 ： 葡萄糖 5g、 甘油 5g、 可溶性淀粉 5g、 蛋白胨 5g、 酵母膏 5g、 黄豆粉 5g、 KH2PO4 0.5g、 CaCO3 0.5g、 NaCl 0.5g、 MgSO4 0.5g， 蒸馏水 1000mL， pH7.0-7.2。
可溶性淀粉购自内蒙古鸿之惠商贸有限公司， 产品目录号为 HX169 ； 蛋白胨购自 内蒙古鸿之惠商贸有限公司， 产品目录号为 SH0010 ； 酵母膏购自内蒙古鸿之惠商贸有限公 司， 产品目录号为 SH0348 ； 黄豆粉购自超市。
1) 斜面培养 ： 将菌株 NMG6-3-9 接种于高氏 1 号斜面上， 在 28℃培养 5-6d ；
2) 种子培养 ： 从生长好的放线菌斜面接种于 100mL 种子培养基中， 220r/min、 28℃ 振荡培养 48h， 得到种子培养液 ；
3) 发酵培养 ： 按 10％ (v/v) 的接种量将种子培养液接种于 100mL 发酵培养基中， 220r/min、 28℃振荡培养 120h， 得到发酵液。
实施例 2、 菌株 NMG6-3-9 的应用
一、 菌株 NMG6-3-9 的抗菌谱测定 ：
PDA 琼脂培养基 ： 马铃薯 ( 去皮 )200g、 蔗糖 ( 或葡萄糖 )20g、 蒸馏水 1000mL、 pH 自然。
将放线菌菌株 NMG6-3-9 接种于高氏 1 号琼脂平板上于 28℃下培养 5d， 得到菌苔 ； 用打孔器将菌苔打成直径 5mm 的菌饼， 并将菌饼置于 PDA 平板中央， 使带有菌丝的一面贴 在培养基表面， 30℃下培养 3d， 然后将同样大小靶标菌菌饼对峙接于菌株 NMG6-3-9 四周， 28℃下培养， 至靶标菌长满培养皿为止。采用十字交叉法测量抑菌 ( 溶菌 ) 圈的直径。
上述平板抑菌实验采用常规的平板对峙法、 牛津杯法、 管碟法、 挖块法、 琼脂块法 或滤纸片法等均可。
每种靶标菌重复 3 次， 结果取平均值。
结果表明， 菌株 NMG6-3-9 对 20 种不同类型的植物病原真菌都有不同程度的抑制 作用 ( 表 9)， 并且该菌株对 6 种细菌也有一定的抑制效果 ( 表 10)。证明菌株 NMG6-3-9 的 抑菌谱较广， 且对不同种类病原菌具有选择性。
表 9 菌株 NMG6-3-9 对 20 种植物病原真菌的抑菌效果
抑菌圈直径 靶标菌 (mm) 苜蓿茄镰孢菌 Fusarium solani 苜蓿尖镰孢菌 F.oxysporum 燕麦镰孢菌 F.avenaceum 苜蓿匍柄霉 Stemphylium botryosum 立枯丝核菌 Rhizoctonia solani 32.68 瓜类壳二孢 Ascochyta citrullina 大丽轮枝孢 Verticillium dahlia 禾顶囊壳 Gaeumannomyces graminis 胶孢炭疽菌 Colletotrichum gloeosporioides 禾弯孢霉菌 Curvularia lunata 靶标菌 (mm) 21.38 抑菌圈直径30.5420.8829.2420.3628.6019.9727.9619.2419101851597 A CN 101851598说抑菌圈直径明书16/19 页抑菌圈直径靶标菌 (mm) 禾谷镰孢菌 Peronospora aestivalis 27.45靶标菌 (mm) 大斑突脐孢 Exserohilumleonard turcicum 辣椒疫霉菌 17.65半裸镰刀菌 F.semitectum25.48 Phytophthora capsici17.08香蕉枯萎菌 F.oxysporum f.sp.cubense 瓜果腐霉 Pythium aphanidermatum 苜蓿壳针孢 Septoria medicaginis24.69灰葡萄孢 Botrytis cinerea16.5723.75核盘菌 Sclerotinia sclerotiorum15.4322.95粉红聚端孢 Trichothecium roseum11.05
表 10 菌株 NMG6-3-9 对 6 种细菌的抑菌效果抑菌圈直径 抑菌圈直径 靶标菌 (mm) (mm) 青枯雷尔氏菌 Ralstonia solanacearum 燕麦嗜酸菌西瓜亚种 Acidovorax avenae subsp. citrulli 18.56靶标菌丁香假单胞菌 Pseudomonas syringae 胡萝卜软腐欧文氏菌 Erwinia carotovora var. carotovora 苜蓿黄单胞杆菌 Xanthomonas campestris pv.alfalfae
23.1221.9616.7020.18金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureaus12.85表 9 和 10 中的下述菌株均购自中国农业微生物菌种保藏管理中心 ( 简称 ACCC) ： 燕 麦 镰 孢 菌 Fusarium avenaceum ACCC 30065、 立 枯 丝 核 菌 Rhizoctonia solaniACCC 30332、禾 谷 镰 孢 菌 Peronospora aestivalis ACCC 30068、半 裸 镰 刀 菌 Fusarium semitectum ACCC 31945、 香蕉枯萎菌 Fusarium oxysporum f.sp.cubense ACCC 36369、 瓜 果 腐 霉 Pythium aphanidermatum ACCC 36125、 瓜 类 壳 二 孢 Ascochyta citrullina ACCC 36440、 大 丽 轮 枝 孢 Verticillium dahliaACCC 36109、 禾 顶 囊 壳 Gaeumannomyces graminis ACCC 30310、禾 弯 孢 霉 菌 Curvularia lunata ACCC 36580、辣 椒 疫 霉 菌Phytophthora capsiciACCC 36279、 灰 葡 萄 孢 Botrytis cinerea ACCC 30091、 核盘菌 Sclerotiniasclerotiorum ACCC 30096、 粉红聚端孢 Trichothecium roseum ACCC36459、 胡萝卜软腐欧文氏菌 Erwinia carotovora var.carotovora ACCC 01443、 青枯雷尔氏菌 Ralstonia solanacearum ACCC 01470、 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureaus ACCC 01336。
苜蓿壳针孢 Septoria medicaginis( 侯天爵 . 我国北方草地病害调查及主要病害 防治 [J]. 中国草地， 1993， 3： 56-60.)( 中国农业科学院草原研究所 )
胶孢炭疽菌 Colletotrichum gloeosporioides( 刘正坪， 胡俊， 高翔， 等 . 枸杞炭 疽病菌生物学特性研究 [J]. 北京农学院学报， 2005， 20(3) ： 36-39.)( 中国农业科学院草原 研究所 )
大斑突脐孢 Exserohilummleonard turcicum( 周洪友， 刘正坪， 胡俊， 等 . 苏丹草 大斑病菌的生物学特性研究 [J]. 华北农学报， 2009， 24(1) ： 174-177.)( 中国农业科学院草 原研究所 )
丁香假单胞菌 Pseudomonas syringae( 侯天爵 . 我国北方草地病害调查及主要病 害防治 [J]. 中国草地， 1993， 3： 56-60.)( 中国农业科学院草原研究所 )
苜蓿黄单胞杆菌 Xanthomonas campestris pv.alfalfae( 侯天爵 . 我国苜蓿病害 发生现状及防治对策 [J]. 内蒙古草业， 1994， 3： 4-8.)( 中国农业科学院草原研究所 )
燕麦嗜酸菌西瓜亚种 Acidovorax avenae subsp.Citrulli( 胡俊， 黄俊霞， 刘双 平， 等 . 不同哈密瓜品种对细菌性果斑病抗病性及发展动态的研究 [J]. 华北农学报， 2006， 21(6) ： 107-110.)( 中国农业科学院草原研究所 )
苜蓿茄镰孢菌 Fusarium solani( 曹丽霞， 赵存虎， 白全江， 等 . 内蒙古中部地区苜 蓿根腐病病原研究 ( 英文 )[J]. 华北农学报， 2008， 23(6) ： 105-107.)( 中国农业科学院草 原研究所 )
苜蓿尖镰孢菌 Fusarium oxysporum( 曹丽霞， 赵存虎， 白全江， 等 . 内蒙古中部地 区苜蓿根腐病病原研究 ( 英文 )[J]. 华北农学报， 2008， 23(6) ： 105-107.)( 中国农业科学 院草原研究所 )
苜蓿匍柄霉 Stemphylium botryosum( 侯天爵 . 我国北方草地病害调查及主要病 害防治 [J]. 中国草地， 1993， 3： 56-60.)( 中国农业科学院草原研究所 )
二、 对靶标菌孢子的萌发抑制
1. 苜蓿根腐病菌孢子悬浮液的制备
PDA 培养基 ： 马铃薯 200g、 葡萄糖 20g、 琼脂 15g、 蒸馏水 1000mL， pH7.0。
将苜蓿茄镰孢菌 (Fusarium solani) 接种于 PDA 培养基， 于 28℃恒温培养箱中培 养 5-6d， 待菌丝长满培养基后用无菌水洗去气生菌丝， 400nto 日光灯照射下培养产孢， 待 2-3d 产孢后， 用无菌水洗下孢子， 经细菌过滤器无菌过滤除去菌丝并加入 0.02％ Tween-20 制成孢子悬浮液在 4℃下保存备用， 浓度为 106cfu/ml。
2. 拮抗放线菌的制备
(1) 菌株发酵液的制备
将菌株 NMG6-3-9 接入发酵培养基， 28 ℃下振荡培养 4-5d， 将发酵液离心取上清 液， 将上清液过滤， 收集滤液， 将滤液记作菌株 NMG6-3-9 发酵滤液， 菌株 NMG6-3-9 发酵滤液中的孢子浓度为 108cfu/mL。
3. 拮抗放线菌的筛选
将发酵滤液与上述实验 1 中制得的孢子悬浮液等体积混合， 取一滴上述混合液 滴加在表面用火棉胶处理过的盖玻片上， 每处理 5 个重复。在 25 ℃下保湿培养 6h 后检 查空白对照中苜蓿茄镰孢菌 (Fusarium solani) 孢子的萌发， 当空白对照中苜蓿茄镰孢 菌 (Fusarium solani) 孢子的萌发率达到 85％后， 检查所有处理苜蓿茄镰孢菌 (Fusarium solani) 的孢子萌发率 ( 以孢子芽管长度大于孢子长度一半者为萌发 )。试验重复 5 次。
按以下公式计算孢子萌发抑制率 ：
空白对照组方法 ： 方法与实验组一致， 只是将发酵液替换为无菌水。
实验设 3 次重复。
结果 ： 对 照 组， 有 85 ％ 的 孢 子 萌 发， 形成细长且均匀的菌丝 ； 实验组 ： 菌株 NMG6-3-9 对孢子萌发抑制率达 100％， 并且使孢子萌发速率降低， 并使分生孢子细胞及其 萌发出的芽管畸形， 进而可以降低其侵染寄主的能力。
三、 菌株 NMG6-3-9 对植物病害的生物防治
采用室内苗期灌根接种法对 NMG6-3-9 进行防治苜蓿根腐病试验。苜蓿根腐病是 由苜蓿茄镰孢菌 Fusarium solani 引起的。
苜蓿茄镰孢菌 Fusarium solani( 曹丽霞， 赵存虎， 白全江， 等 . 内蒙古中部地区苜 蓿根腐病病原研究 ( 英文 )[J]. 华北农学报， 2008， 23(6) ： 105-107.)( 中国农业科学院草 原研究所 )。
苜蓿 ( 中苜 1 号 ) 种子购自国家种质牧草中期库， 产品目录号为 00068。井岗 霉素购自农资商店 ； Czapek’ s 培养液 ( 蔗糖 30g、 NaNO3 2g、 KCl 0.5g、 K2HPO4·3H2O 1g、 MgSO4·7H2O 0.5g、 FeSO4·7H2O 0.01g、 蒸馏水 1000mL， pH 自然。
靶标菌孢子悬液的制备 ： 将病原菌用 Czapek’ s 培养液 28 ℃， 120r/min 摇瓶培 养 96h， 得到病原菌的孢子悬液， 用血球计数板计算孢子悬液浓度， 孢子悬液中孢子浓度为 6 10 cfu/mL。
菌株 NMG6-3-9 发酵滤液的制备 ： 将菌株 NMG6-3-9 接入发酵培养基， 28℃下振荡培 养 4-5d， 将发酵液离心取上清液， 将上清液过滤， 收集滤液， 将滤液记作菌株 NMG6-3-9 发酵 8 滤液， 菌株 NMG6-3-9 发酵滤液中的孢子浓度为 10 cfu/mL。
供试土样 ： 自然土灭菌后待用。灭菌后的土壤分装于不同的育苗杯中 ( 高 15cm， 直径 8cm)， 每杯装入灭菌土 200g， 放在边缘较高的搪瓷盘内。播种前两天沿盆边缘充分浇 水， 使其自然吸水。
苗期管理 ： 苜蓿种子用 0.1％新洁尔灭消毒 3min， 用清水冲洗干净， 放入 28-30℃ 温箱中， 待其露白后或芽长 0.5cm 时播种。 在人工气候室内育苗， 白天温度保持在 24-26℃， 夜间 15-18℃， 土壤湿度保持在 60％ -80％。
接种方法 ： 待苜蓿幼苗生长 30d 后 ( 将播种当天记作第 0 天 )， 将菌株 NMG6-3-9 的 8 发酵滤液 (10 cfu/mL) 灌于幼苗根部， 每株 10mL ； 3d 后同样将病原菌悬液 (106cfu/mL) 灌根
接种， 每株 10mL。以 5％井冈霉素水剂 ( 浓度为 50μg/mL) 灌根处理的植株为农药对照、 以 发酵培养基及清水灌根处理的植株作为空白对照。每 20 个育苗杯为一处理， 每杯 4 株， 每 处理 3 次重复。定期调查发病情况， 45d 后统计病情指数及相对防治效果。病害分级参照如 下标准进行 ：
病情分级标准 ：
0 级 - 健株， 表观无症状 ；
1 级 - 根茎或主根局部有病斑， 但不连片 ；
2 级 - 主根、 侧根及根茎部有病斑且连片， 但不超过 1/3 ；
3 级 -1/3 ～ 1/2 根及根茎部被侵染变色， 且侧根明显减少 ；
4 级 - 根及根茎部变色、 局部腐烂， 维管束明显变褐， 植株生长受抑制且矮小枯黄 ；
5 级 - 根部腐烂、 维管束变黑且植株萎蔫死亡。
上述计算公式中对照均指清水。
各级代表级值为 0、 1、 2、 3、 4、 5， 最高代表级值为 5。
试验结果 ( 表 11) 表明， 供试拮抗菌 NMG6-3-9 的发酵液可以降低苜蓿根腐病的发 病率和病情指数， 病情指数为 16.35， 相对防效达 81.50％， 高于 CK3(5％井岗霉素水剂 ) 的 处理防效 60.78％。 另外从表中结果可以看出 CK2( 发酵培养基 ) 的病情指数虽然比清水对 照的低， 但是差异很小， 其对植株的发病虽有影响却不是防病的主要因素， 防病的主要因素 为拮抗菌 NMG6-3-9 的代谢产物。在盆栽试验中， 拮抗菌能够有效减轻病情， 显示出较为理 想的应用潜力。
表 11 拮抗菌 NMG6-3-9 对苜蓿根腐病的盆栽防病效果
处理 CK1( 清水 ) CK2( 发酵培养基 ) CK3(5％井冈霉素水剂 ) NMG6-3-9发病率 (％ ) 93.56 76.76 53.34 39.68病情指数 88.39 85.70 34.67 16.35防治效果 (％ ) 3.03％ 60.78％ 81.50％23101851597 A CN 101851598序列 序列表表1/2 页<110> 中国农业科学院草原研究所 <120> 一株抗苜蓿病害灰黄链霉菌及其筛选方法 <160>1 <210>1 <211>1433 <212>DNA <213> 灰黄链霉菌 (Streptomyces griseoflavus) <400>1 tgctgcgggt gaacgggtga ggtctaatac caggatgagc gggtagccgg acgggaggca gtgagggatg ggtacctgca gcaagcgttg tgtgaaagcc aggggagatc tggcgaaggc caggattaga tccacgttgt aggctaaaac tcgacgcaac tgcccccctt tgttgggtta gggtgttggg caagtcatca gctgcgatac tgcaactcgagcttacacat gtaacacgtg cggatactga ccgcggccta cctgagaggg gcagtgggga acggccttcg gaagaagcgc tccgggaatt cggggcttaa ggaattcctg ggatctctgg taccctggta ccgtgccgca tcaaaggaat gcgaagaacc gtggtcggtg agtcccgcaa gactcacggg tgccccttat cgcgaggtgg ccccatgaaggcaagtcgaa ggcaatctgc tccgcttggg tcagcttgtt cgaccggcca atattgcaca ggttgtaaac cggctaacta attgggcgta ccccgggtct gtgtagcggt gccgatactg gtccacgccg gctaacgcat tgacgggggc ttaccaaggc tacaggtggt cgagcgcaac agaccgccgg gtcttgggct agcgaatctc tcggagtcgccgatgaacca cctgcactct catccaggcg ggtgaggtag cactgggact atgggcgaaa ctctttcagc cgtgccagca aagagctcgt gcagtcgata gaaatgcgca acgctgagga taaacggtgg taagtgcccc ccgcacaagc ttgacataca gcatggctgt ccttgtcccg ggtcaactcg gcacacgtgc aaaaagccgg tagtaatcgc24cttcggtggg gggacaagcc gttcgaaagc tggctcacca gagacacggc gcctgatgca agggaagaag gccgcggtaa aggcggcttg cgggcaggct gatatcagga gcgaaagcgt gcactaggtg gcctggggag ggcggagcat ccggaaagca cgtcagctcg tgttgccagc gaggaaggtg tacaatggcc tctcagttcg agatcagcatgattagtggc ctggaaacgg tccggcggtg aggcgacgac ccagactcct gcgacgccgc cgaaagtgac tacgtagggc tcacgtcggt agagttcggt ggaacaccgg ggggagcgaa tgggcaacat tacggccgca gtggcttaat ttagagatag tgtcgtgaga aagcccttcg gggacgacgt ggtacaatga gattggggtc tgctgcggtg60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320101851597 A CN 101851598序列表2/2 页aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacgtca cgaaagtcgg taacacccga agccggtggc ccaacccctt gtgggaggga gctgtcgaag gtgacgcgat ttc1380 1433