一种双层仿生软骨组织工程用支架制备方法 【技术领域】
本发明涉及软骨组织工程用支架制备技术领域，特别涉及一种双层仿生软骨组织工程用支架制备方法。
背景技术
关节软骨由于其在生物体中所处的特殊位置和功能作用，发生损伤是常见的，而软骨的自我修复能力差，损伤如持续发展会引起功能障碍，严重影响生活质量。目前临床上关节软骨的治疗普遍采用自体或异体软骨移植，但自体软骨移植对病人损伤大，而异体软骨移植来源有限且具有潜在的病毒传染和免疫排斥的问题。组织工程方法的快速发展为软骨缺损的修复提供了新的方法，而支架材料在组织工程中起着至关重要的作用。天然软骨具有分层结构，浅表层内的软骨细胞较小，呈梭形，长轴与关节软骨表面相平行，中间层细胞呈圆形或卵圆形，排列不规则，深层的软骨细胞圆形，柱状排列，与软骨表面垂直，各层细胞及其细胞外基质在形貌上有很大的区别。因此制备具有仿生结构的软骨支架一直受到关注。
Zehbe等在Biomed Mater Eng上发表的论文Short‑term humanchondrocyte culturing on oriented collagen coated gelatine scaffoldsfor cartilage replacement中采用电化学水溶液分解及冷冻干燥的方法制备的具有垂直取向的孔道结构的胶原/明胶纤维支架，接种软骨细胞体外培养3天后细胞在支架表层呈与表面平行排列生长，在支架内部呈纵向排列生长，类似于天然关节软骨的细胞排列结构，说明了仿生结构对软骨细胞培养的影响。但该文献提供的方法需要使用电解设备，工序相对较复杂，并且其表面仅依靠浸泡覆盖一层胶原，仿生程度较低。
目前已经有一些关于制备仿生结构软骨支架的专利，但人的关节软骨厚度在3mm以下，真正在软骨厚度内的仿生支架通常都不同时具有垂直孔和圆孔结构，而同时具有垂直孔和圆孔结构的仿生支架多见于厚度较厚的骨软骨支架。然而，从软骨的天然结构可以看出同时具有垂直孔和圆孔的结构是一种理想的软骨仿生结构。
【发明内容】
为了克服上述现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种双层仿生软骨组织工程用支架制备方法，利用挥发性有机物作为衬底在软骨厚度范围内制备具有垂直孔和圆孔结构的仿生软骨支架。该方法操作简单，稳定性高，可方便简便地制备骨软骨支架，并保证其中的软骨层依然具备双层仿生结构。
为了达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种双层仿生软骨组织工程用支架制备方法，该方法包括如下步骤：
一、取纯1，4环氧六环加入模具中，将模具放入液氮中使1，4环氧六环1‑10分钟冷冻成固态，将冷冻好的固态1，4环氧六环置入‑20℃冰箱中放置1‑2h，得到衬底；
二、在1‑2％的醋酸水溶液中，加入壳聚糖或胶原，或将壳聚糖和胶原按任意比例一起加入1‑2％的醋酸水溶液中，所加的壳聚糖或胶原或壳聚糖和胶原混合物与1‑2％的醋酸水溶液的比例为：1‑4g∶100ml，将所得的复合溶液浇注入到步骤一中所得的衬底表面上，浇注厚度为1‑3mm，在‑20℃预冻4‑6h后，再在‑50℃、低于100Pa冷冻干燥48h，成型得到衬底及衬底表面1‑3mm厚的双层仿生软骨支架；
三、成型后用5％‑10％浓度的NaOH溶液浸润衬底表面的双层仿生软骨支架，从衬底上剥离即得到双层仿生软骨支架。
本发明关于衬底的制备还有另外两种方法，所以本发明还有另外两套方案可以制得。
一种双层仿生软骨组织工程用支架制备方法，该方法包括如下步骤：
一、取聚乳酸PLA溶于1，4环氧六环中搅拌24‑48小时得到6％‑10％的聚乳酸PLA溶液，取所得溶液加入模具中，置入‑20℃冰箱中冷冻2‑6h，得到衬底；
二、在1‑2％的醋酸水溶液中，加入壳聚糖或胶原，或将壳聚糖和胶原按任意比例一起加入1‑2％的醋酸水溶液中，所加的壳聚糖或胶原或壳聚糖和胶原混合物与1‑2％的醋酸水溶液的比例为：1‑4g∶100ml，将所得的复合溶液浇注入到步骤一中所得的衬底表面上，浇注厚度为1‑3mm，在‑20℃预冻4‑6h后，再在‑50℃、低于100Pa冷冻干燥48h，成型得到衬底及衬底表面1‑3mm厚的双层仿生软骨支架；
三、成型后用5％‑10％浓度的NaOH溶液浸润衬底表面的双层仿生软骨支架，从衬底上剥离即得到双层仿生软骨支架。
一种双层仿生软骨组织工程用支架制备方法，该方法包括如下步骤：
一、取聚乳酸PLA溶于1，4环氧六环中搅拌24‑48小时得到6％‑10％的聚乳酸PLA溶液，向聚乳酸PLA溶液中加入与聚乳酸PLA等量的骨粉搅拌24‑48小时混合均匀，取所得溶液放入模具中，置入‑20℃冰箱中冷冻2‑6h，得到衬底；
二、在1‑2％的醋酸水溶液中，加入壳聚糖或胶原，或将壳聚糖和胶原按任意比例一起加入1‑2％的醋酸水溶液中，所加的壳聚糖或胶原或壳聚糖和胶原混合物与1‑2％的醋酸水溶液的比例为：1‑4g∶100ml，将所得的复合溶液浇注入到步骤一中所得的衬底表面上，浇注厚度为1‑3mm，在‑20℃预冻4‑6h后，再在‑50℃、低于100Pa冷冻干燥48h，成型得到衬底及衬底表面1‑3mm厚的双层仿生软骨支架；双层仿生软骨支架与衬底中的聚乳酸PLA/骨粉形成的骨材料一起组成骨软骨支架；
三、用5％‑10％浓度的NaOH溶液浸润衬底表面的双层仿生软骨支架，从衬底上剥离即得到双层仿生软骨支架。
本发明制备的双层仿生软骨支架同时具有垂直孔和圆形孔结构，厚度最小可达到1.5mm，其中垂直孔结构的厚度在1‑3mm。圆形孔孔径为100‑200μm，垂直孔径向宽度为100‑300μm。
本发明的优点和积极效果：本发明操作简单，稳定性高，制备的双层仿生软骨支架厚度薄，力学性能良好，利于临床使用；支架一次成型，垂直孔与圆形孔之间连接紧密，不存在相互脱离的问题；支架结构接近天然软骨结构，有望更好地维持软骨细胞表型和提高软骨损伤修复效果。软骨支架可直接与含聚乳酸PLA/骨粉的衬底结合形成骨软骨支架，用于骨软骨同时缺损的修复，软骨层部分依然具有双层结构。
【附图说明】
图1是实例1双层仿生软骨支架的SEM照片。
图2是普通冷冻干燥方法制备的胶原壳聚糖复合材料支架与实例1方法制备的支架的XRD对照图。
图3是实例1双层仿生软骨支架的拉伸断裂曲线。
图4是实例2双层仿生软骨支架的SEM照片。
图5是实例3制备的骨软骨支架过渡层的SEM照片。
图6是实例3制备的骨软骨支架骨层的SEM照片。
【具体实施方式】
下面结合实施例进一步说明本发明。
实施例一
本实施例包括以下步骤：
一、取聚乳酸PLA溶于1，4环氧六环中搅拌24小时得到7.4％的聚乳酸PLA溶液，取所得溶液加入模具中，置入‑20℃冰箱中冷冻4h，得到衬底；
二、在2％的醋酸水溶液中，将壳聚糖和胶原按质量比20∶1的比例一起加入2％的醋酸水溶液中，所加壳聚糖和胶原混合物与2％的醋酸水溶液的比例为：2.1g∶100ml，将所得的复合溶液浇注入到步骤一中所得的衬底表面上，浇注厚度为2.5mm，在‑20℃预冻6h后，再在‑50℃、80Pa冷冻干燥48h，成型得到衬底及衬底表面2.5mm厚的双层仿生软骨支架；
三、成型后用5％浓度的NaOH溶液浸润双层仿生软骨支架，从衬底上剥离即得到双层仿生软骨支架。
图1为该实施例双层仿生软骨支架的SEM照片，圆孔孔径在100‑200μm之间，垂直孔径向宽度为100‑300μm之间，垂直孔厚度为1‑1.2mm，整个支架的厚度为2.4‑2.6mm。从照片中可以看出，圆孔结构与垂直孔结构为一体化的结构，结合紧密，不存在相互脱离的问题。
图2为普通冷冻干燥方法制备的胶原壳聚糖复合材料支架与该实施例方法制备的支架的XRD对照。从XRD图中看出，两者的峰位，峰的强度以及半高宽基本相同，说明采用本发明的方法制备支架，衬底不会破坏材料原有的化学结构。
图3为该实施例双层仿生软骨支架的拉伸断裂曲线，测试尺寸为长5mm，宽10mm，高2mm。(a)为干燥状态下，(b)为湿润状态下。从曲线上可以看出，支架在湿润状态下拉伸断裂强度降低，但断裂伸长长度明显增加，断裂伸长率达到原长的两倍。
实施例二
本实施例包括如下步骤：
一、取纯1，4环氧六环加入模具中，将模具放入液氮中使1，4环氧六环10分钟冷冻成固态，将冷冻好的样品置入‑20℃冰箱中放置1h，得到衬底；
二、在1.5％的醋酸水溶液中，将壳聚糖和胶原按质量比20∶1的比例一起加入1.5％的醋酸水溶液中，所加壳聚糖和胶原混合物与1.5％的醋酸水溶液的比例为：1.5g∶100ml，将所得的复合溶液浇注入到步骤一中所得的衬底表面上，浇注厚度为2.5mm，在‑20℃预冻6h后，再在‑50℃、80Pa冷冻干燥48h，成型得到衬底及衬底表面2.5mm厚的双层仿生软骨支架；
三、成型后用10％浓度的NaOH溶液浸润衬底表面的双层仿生软骨支架，从衬底上剥离即得到双层仿生软骨支架。
图4为该实施例双层仿生软骨支架的SEM照片，从照片中可以看出其总体结构与实施例一方法制备的支架相似，但由于衬底在冷冻干燥过程中也完全挥发，使支架处于悬空的状态，因此其结构不如实施例一方法制备的支架，主要表现在圆形孔孔径分布范围变广，垂直孔倾斜程度变大，支架整体存在一定的扭曲。
实施例三
本实施例包括如下步骤：
一、取聚乳酸PLA溶于1，4环氧六环中搅拌48小时得到6.4％的聚乳酸PLA溶液，向聚乳酸PLA溶液中加入与聚乳酸PLA等量的骨粉搅拌48小时混合均匀，取所得溶液放入模具中，置入‑20℃冰箱中冷冻4h，得到衬底；
二、在2％的醋酸水溶液中，加入壳聚糖或胶原，或将壳聚糖和胶原按任意比例一起加入2％的醋酸水溶液中，所加的壳聚糖或胶原或壳聚糖和胶原混合物与2％的醋酸水溶液的比例为：3.5g∶100ml，将所得的复合溶液浇注入到步骤一中所得的衬底表面上，浇注厚度为3mm，在‑20℃预冻4h后，再在‑50℃、90Pa冷冻干燥48h，成型得到衬底及衬底表面3mm厚的双层仿生软骨支架；双层仿生软骨支架与衬底中的聚乳酸PLA/骨粉形成的骨材料一起组成骨软骨支架；
三、用5％‑10％浓度的NaOH溶液浸润衬底表面的双层仿生软骨支架，从衬底上剥离即得到双层仿生软骨支架。
图5为该实施例制备到步骤二时得到的产物即骨软骨支架过渡层的SEM照片，从照片中可以看出软骨层依然由圆形孔和垂直孔组成，软骨层与骨层之间自然贴合。
图6为该实施例制备到步骤二时得到的产物即骨软骨支架的SEM照片，从照片中可以看出骨层也为多孔的结构，孔径在50‑100μm之间。
实施例四
本实施例包括以下步骤：
一、取聚乳酸PLA溶于1，4环氧六环中搅拌24小时得到10％的聚乳酸PLA溶液，取所得溶液加入模具中，置入‑20℃冰箱中冷冻4h，得到衬底；
二、在1％的醋酸水溶液中，将壳聚糖加入1％的醋酸水溶液中，所加壳聚糖与1％的醋酸水溶液的比例为3g∶100ml，将所得的复合溶液浇注入到步骤一中所得的衬底表面上，浇注厚度为2mm，在‑20℃预冻4h后，再在‑50℃、90Pa冷冻干燥48h，成型得到衬底及衬底表面2mm厚的双层仿生软骨支架；
三、成型后用5％浓度的NaOH溶液浸润双层仿生软骨支架，从衬底上剥离即得到双层仿生软骨支架。
实施例五
本实施例包括如下步骤：
一、取纯1，4环氧六环加入模具中，将模具放入液氮中使1，4环氧六环6分钟冷冻成固态，将冷冻好的样品置入‑20℃冰箱中放置2h，得到衬底；
二、在2％的醋酸水溶液中，加入胶原，所加胶原与2％的醋酸水溶液的比例为2.5g∶100ml，将所得的复合溶液浇注入到步骤一中所得的衬底表面上，浇注厚度为1mm，在‑20℃预冻5h后，再在‑50℃、80Pa冷冻干燥48h，成型得到衬底及衬底表面1mm厚的双层仿生软骨支架；
三、成型后用10％浓度的NaOH溶液浸润衬底表面的双层仿生软骨支架，从衬底上剥离即得到双层仿生软骨支架；
实施例六
本实施例包括如下步骤：
一、取聚乳酸PLA溶于1，4环氧六环中搅拌36小时得到9％的聚乳酸PLA溶液，向聚乳酸PLA溶液中加入与聚乳酸PLA等量的骨粉搅拌36小时混合均匀，取所得溶液放入模具中，置入‑20℃冰箱中冷冻4h，得到衬底；
二、在2％的醋酸水溶液中，加入壳聚糖，所加的壳聚糖与2％的醋酸水溶液的比例为：3g∶100ml，将所得的复合溶液浇注入到步骤一中所得的衬底表面上，浇注厚度为1.5mm，在‑20℃预冻4h后，再在‑50℃、70Pa冷冻干燥48h，成型得到衬底及衬底表面1.5mm厚的双层仿生软骨支架；双层仿生软骨支架与衬底中的聚乳酸PLA/骨粉形成的骨材料一起组成骨软骨支架；
三、用5％浓度的NaOH溶液浸润衬底表面的双层仿生软骨支架，从衬底上剥离即得到双层仿生软骨支架。