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反式西红花酸的制备方法
    【技术领域】

    本发明属于医药领域，具体涉及一种制备西红花酸的方法，是从天然植物中提取转化得到反式西红花酸，该反式西红花酸具有治疗脂肪肝的显著功效。 

    背景技术

    西红花酸是西红花苷的苷元，是从一种鸢尾科番红花属植物‑西红花中分离提取出的一种有效成分之一。它具有多不饱和共轭烯酸结构，属类胡萝卜素物质。西红花酸在栀子和西红花等天然植物中含量较高；栀子、西红花等天然植物中除了含有西红花酸外还含有大量的西红花苷，即西红花酸和糖的复合物，如西红花苷1、2、3、4。在一定的条件下水解西红花苷的糖苷键，脱去糖配体就可生成西红花酸。 

    研究发现，西红花酸具有抗氧化、保护心脑血管、提高免疫功能和抗肿瘤等多种生理活性，在抗心血管系统疾病、抗动脉粥样硬化、防治糖尿病并发症等方面有明确的生物活性。西红花酸具有抗肿瘤活性，可以有效地抑制癌细胞的增殖，在胰腺癌、肺癌、胶质细胞瘤、乳腺癌的相关实验中都有证明。已有研究证明西红花酸对于肝脏脂质代谢有重要的调节作用，可以有效改善肥胖大鼠的胰岛素抵抗情况。其对于黄曲霉素B1以及各种急性的肝中毒损伤也具有一定的保护作 用。 

    非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种无过量饮酒史，病变主体在肝小叶，以肝细胞弥漫性脂肪变性和脂肪贮积为主的临床病理综合征。NAFLD所指的脂肪肝一系列的病变状态，依照其严重程度可分为脂肪肝、脂肪性肝炎(Non‑alcoholicsteatohepatitis，NASH)、肝硬化。其中，NASH伴随有较明显的肝脂肪变性，肝纤维化等病理特征。据统计NAFLD在北美地区的患病率高达20％‑30％，在亚洲，患病率约有12％～24％，且这一数字也在呈不断的上升趋势。 

    由于人们生活状态的改变，过营养现象变得越来越普遍。日渐减少的体力活动加上生活中无处不在的高脂肪含量食物，肥胖、2型糖尿病、代谢综合征已经成为了NAFLD常见的并发症。目前普遍认为NAFLD是代谢综合征和胰岛素抵抗的一种肝脏表现。长期的NAFLD一旦经过恶化，就会由单纯的肝脂肪变性，诱发成为肝炎，肝纤维化，最后导致肝硬化、肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，对人类生命健康造成极大的威胁。关于NAFLD的发病机制研究中，Day所提出的“二次打击学说”已得到学术界普遍认可。所谓2次打击学说，即指第一次打击为肥胖、2型糖尿病、脂代谢紊乱等导致的胰岛素抵抗、游离脂肪酸增加、肝脏脂肪代谢障碍，从而使肝细胞合成甘油三脂(TG)增加而输出减少，导致肝细胞脂肪变性；第二次打击是指在第一次打击的基础上再加重损伤，从而使单纯性脂肪肝发展至非酒精性脂肪性肝炎(NASH)甚至肝纤维化。导致第2次打击可有多种因素，而其 中氧化应激和脂质过氧化起到了重要的作用。 

    在探讨西红花酸所起到的各种作用的同时，不容忽视的是它的抗氧化功效。研究发现，西红花酸对于H₂O₂产生的羟自由基(OH·)有很好的清除作用，可有效降低自由基对红细胞和亚细胞膜性结构的破坏作用，同时也能显著抑制自由基对DNA的损伤。 

    中国专利申请200710001116.7公开了一种从栀子中提取制备西红花酸的方法，即将栀子粉碎经蒸馏水或乙醇溶液超声强化提取，提取液过滤后浓缩，水提取的浓缩液乙醇沉淀后再浓缩或经大孔树脂分离栀子苷类物质，将西红花苷洗脱液浓缩后酸碱水解，离心得到西红花酸粗品进一步纯化后得高纯度西红花酸；该文件提供了一种西红花酸的批量生产方法。但是，这种方法在提取中均要采用乙醇提取或乙醇沉淀，且超声强化提取的方法受限于设备而不适于大规模生产，且其先提取后浓缩或上大孔树脂后洗脱液浓缩以后再进行酸碱水解的工艺繁琐、存在多次浓缩过程，消耗大量能源不利于环保。 

    【发明内容】

    本发明旨在提供一种反式西红花酸的制备方法，在天然植物原料提取过程中将西红花苷转化为西红花酸。 

    本发明还提供了上述反式西红花酸在制备治疗脂肪肝的药物方面的应用。 

    本发明采用稀碱提取，将提取浓缩和水解过程合而为一，在提取 浓缩过程中将西红花苷进行水解转化成西红花酸。即将原料粉碎，用碱性稀醇溶液进行转化提取，提取液用酸调节至pH7～9，减压浓缩，过滤或离心去除沉淀杂质，清液调节至pH2～5，过滤或离心收集红色沉淀，用弱酸性水或稀乙醇溶液洗涤沉淀，干燥，得西红花酸含量高于50％的西红花酸粗品；西红花酸粗品重结晶纯化后得到含量高于95％的高纯度反式西红花酸，具体方法如下： 

    (1)将植物原料过5～100目筛粉碎，用8～16倍原料重量、含醇量0～60wt％的稀醇水溶液提取，过滤或离心得提取液；所述的稀醇水溶液用碱将pH调节为10～14； 

    (2)提取液用酸调节至pH 7～9，并将提取液减压浓缩得到浓缩液，所得到的浓缩液体积与原料植物重量比为1∶1～5L/Kg； 

    (3)将浓缩液过滤或离心去除沉淀，得浓缩清液； 

    (4)用酸调节浓缩清液至pH 2～5，静置0.5～12小时，离心或过滤得到西红花酸粗品； 

    (5)西红花酸粗品重结晶1～3次，即得反式西红花酸，其中反式西红花酸的含量在95％以上； 

    重结晶的工艺为：将西红花酸粗品用2～20倍重量份、pH 7～10的醇溶液溶解，再缓缓加入酸调节至pH 2～4析出沉淀，静置0.5～12小时，离心或过滤得沉淀； 

    所述的醇溶液为质量浓度50～100％的甲醇或乙醇溶液，且用氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠或碳酸氢钠调节pH值； 

    所述的用于调节pH的酸为盐酸、硫酸、磷酸、醋酸、柠檬酸或 草酸。 

    步骤(1)采用的植物原料可选用栀子果实或西红花(Crocussativus)的雌蕊，其中栀子果实包括栀子(Gardenia jasminodes Ellis)、水栀子(Gardenia jasminodes Ellis f.longiarpa Z.W.Xie et Okada)或大花栀子(Gardenia jasminodes Ellis var.fortuniana(Lind1)Ham)的果实。 

    步骤(1)所述的提取方法为回流、浸渍或渗漉。 

    步骤(1)中所述的碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙或碳酸氢钙。 

    步骤(2)和(4)中所述用于调节pH的酸为盐酸、硫酸、磷酸、醋酸、柠檬酸或草酸。 

    步骤(1)中所述的醇为甲醇或乙醇。 

    本发明采用稀碱提取，将提取和水解过程合而为一，即在提取过程中将西红花苷进行水解转化成西红花酸，使提取与转化一步完成，方法简便、快速、成本大幅降低。 

    在建立脂肪肝细胞模型基础上，通过西红花酸干预，结合对自由基代谢和相关生化指标进行了的测定，证明一定浓度的反式西红花酸干预，通过降低氧化水平确能改善脂肪肝细胞的作用。通过细胞水平的实验证明该反式西红花酸和含有该反式西红花酸的脂质体具有显著抗氧化活性和防治脂肪肝的功效。 

    【附图说明】

    图1为实施例7脂肪肝细胞加入西红花酸前后用油红染色后镜下观察脂变细胞的比例 

    图2为实施例7脂肪肝细胞加入西红花酸前后的油红染色照片 

    图3为实施例7反式西红花酸干预前后脂肪肝细胞内相对于正常细胞的TG含量变化 

    图4为实施例7反式西红花酸干预前后脂肪肝细胞内相对于正常细胞的ROS含量变化 

    图5为实施例7反式西红花酸干预前后脂肪肝细胞内相对于正常细胞的MDA含量变化 

    图6为实施例7反式西红花酸干预前后脂肪肝细胞内相对于正常细胞的NADPH变化 

    图7为实施例7反式西红花酸干预前后脂肪肝细胞内相对于正常细胞的GSH含量变化 

    图8为实施例7反式西红花酸干预前后脂肪肝细胞内SOD活性变化图1、3～8中，柱状图依次为空白组、FFA组和FFA+不同浓度反式西红花酸和反式西红花酸脂质体，黑色柱为FFA+反式西红花酸组，白色柱为FFA+反式西红花酸脂质体组；纵坐标为10⁶细胞中各项指标相对于空白组的值；FFA的浓度为0.5mmol/L。^*表示反式西红花酸组与FFA组相比p＜0.05，^**表示反式西红花酸脂质体组与西红花酸组相比p＜0.05。 

    【具体实施方式】

    实施例1 

    (1)栀子(Gardenia jasminodes Ellis)果实10kg，粉碎过40目筛，分别用60L、40L30％稀乙醇溶液(用氢氧化钠调节pH＝12)回流提取两次，第一次3小时、第二次1.5小时，过滤得到提取液； 

    (2)提取液用盐酸调节pH＝8，减压浓缩至约5L； 

    (3)过滤，取滤液得到浓缩清液； 

    (4)浓缩清液中慢慢滴加盐酸溶液，调节pH＝3，静置4小时，过滤得砖红色沉淀，用pH＝5的盐酸稀乙醇溶液(乙醇浓度为20％)洗涤沉淀2次，纯水洗涤1次，干燥，即得西红花酸粗品，其中反式西红花酸含量为81.4％。 

    实施例2 

    (1)水栀子果实10kg，粉碎过5目筛，用80L 60％稀甲醇溶液(用氢氧化钾调节pH 10)渗漉提取，离心得到提取液； 

    (2)提取液用醋酸调节pH＝7，减压浓缩至2L； 

    (3)过滤，取滤液得到浓缩清液； 

    (4)浓缩清液中慢慢滴加醋酸溶液，调节pH至5，静置0.5小时，过滤得砖红色沉淀，pH＝4的醋酸稀醇(乙醇浓度为40％)洗涤沉淀2次，纯水洗涤2次，干燥，即得西红花酸粗品，其中反式西红花酸含量为86.2％。 

    实施例3 

    (1)西红花的雌蕊1kg，粉碎过100目筛，分别用7L、5L、4L水(用氢氧化钾调节pH＝14)浸渍提取三次，过滤，合并滤液，得到提取液； 

    (2)提取液用盐酸调节pH＝9，减压浓缩至1L； 

    (3)过滤，取滤液，得到浓缩清液； 

    (4)浓缩清液中慢慢滴加盐酸溶液，调节pH至2，静止12小时，过滤得砖红色沉淀，用pH＝6稀醇(乙醇浓度为30％)的洗涤沉淀1次，纯水洗涤1次，干燥，即得西红花酸粗品，其中反式西红花酸含量为80.5％。 

    实施例4 

    将实施例1的西红花酸粗品重结晶1次，得到西红花酸。重结晶的步骤为：取实施例1的西红花酸粗品100g溶解于500ml 50wt％乙醇水溶液(pH7.5，用碳酸氢钠调节)，过滤，滤液调节至pH＝3，过滤得深红色沉淀，纯水洗涤至中性，即得西红花酸，其中反式西红花酸含量为91.2％。 

    实施例5 

    将实施例1的西红花酸粗品重结晶2次，得到西红花酸。重结晶的步骤为：取实施例1的西红花酸粗品100g溶解于1000ml 70wt％的甲醇溶液(pH7.5，用碳酸氢钠调节)，5000转离心10分钟，上清液调节至pH＝2，过滤得深红色沉淀，纯水洗涤至中性；再将上述步 骤重复一次，即得西红花酸，其中反式西红花酸含量为97.2％。 

    实施例6 

    将实施例1的西红花酸粗品重结晶3次，得到西红花酸。重结晶的步骤为：取实施例1的西红花酸粗品100g溶解于1000ml 95wt％的甲醇溶液(pH9.0，，用NaOH调节)，5000转离心10分钟，上清液调节至pH＝2，过滤得深红色沉淀，纯水洗涤至中性；再重复上述步骤2次，即得西红花酸，其中反式西红花酸含量为98.4％。 

    实施例7  西红花酸抗氧化干预脂肪肝细胞的研究 

    (1)材料和仪器 

    材料 

    L02人肝细胞株(浙江大学自由基生命科学研究中心馈赠)，RPMI‑1640培养液(GIBCO公司)，小牛血清(北京元亨圣马生物技术研究所)，反式西红花酸(按实施例4的方法制备得到)，油酸(国药集团化学试剂有限公司)，磷钨酸、棕榈酸、二甲亚砜(国药集团化学试剂有限公司)，油红O染色剂(复旦大学组织胚胎学系馈赠)，苏木素(复旦大学组织胚胎学系馈赠)，50％异丙醇(上海化学试剂有限公司)TG试剂盒、GSH试剂盒(南京建成公司)，ROS试剂盒、GSH试剂盒(碧云天生物技术研究所)，烟酰胺、鲁米诺、TBA、MTT、6PD、G6P(SIGAMA公司)，TRIS(博大泰克公司)，Triton X‑100，EDTA(华美生物工程公司)。 

    仪器 

    电子分析天平，超净工作台，倒置相差显微镜(OLYMPUSCK40)，多功能酶标仪(ELX 800.BIO‑TEK INSTRUMENTS)，Panasonic DMC‑FX3照相机，752s紫外分光光度计，荧光分光光度计(HITACHI F‑2500)，722s分光光度计，生物化学发光仪(SHG‑1，上海检测技术研究所) 

    (2)方法 

    (a)细胞培养：LO2细胞在含10％的小牛血清的RPMI‑1640培养液内，在37℃，5％CO₂培养箱内培养。 

    (b)脂肪肝细胞模型的建立：培养液内加入0.5mmol/L脂肪酸混合液FFA(由油酸和棕榈酸按2∶1的比例配置而成)，培养48小时。 

    (c)药物处理：细胞贴壁生长至70％‑80％后由胰酶消化，接种于6孔板内，每孔细胞数为10⁵个/ml。分为①空白组(正常培养液培养72小时)，②脂肪酸(FFA)组(接种24小时后，加入0.5mmol/L的FFA混合液培养48小时)，③加药组(接种12小时后加入反式西红花酸和含有反式西红花酸的脂质体，使反式西红花酸的终浓度为2.5μmol/L、5μmol/L和10μmol/L，培养12小时后再加入0.5mmol/L的FFA混合液，培养48小时)。脂质体处理采用薄膜分散法。(d)细胞活性的测量：四甲基偶氮唑盐法(MTT法)：待测96孔板，每孔加入20μl MTT，培养箱里培养4小时。弃上清，每孔加入150μl二甲亚砜，震荡10min。选择490nm波长，在酶联免疫检测仪测定各管吸 光度。细胞存活率＝实验组吸光度/对照组吸光度×100％。 

    (e)细胞油红O染色：细胞接种于6孔板(每孔放有盖玻片)中，加有脂肪酸培养2天后，PBS冲洗3次(每次5min)，50％的异丙醇固定1min，油红O染液染色10min，蒸馏水冲洗3分钟，苏木素染色5min，分色，返蓝，相机收集图像。 

    (f)细胞内甘油三酯(TG)测量：细胞消化，离心收集后，‑70℃和37℃快速冻融两次，镜鉴，若细胞破碎不完全，再冻融一次。震荡混匀，离心10000rpm，5min。吸取上清，利用甘油三酯试剂盒(南京建成公司)进行测定。 

    (g)细胞内活性氧族(ROS)测量：按照ROS试剂盒内说明书操作，荧光检测 

    (h)细胞内GSH的测量：待测细胞消化收集后，按照GSH试剂盒的说明书上的操作执行。 

    (i)细胞内NADPH测量：参照Zhiquan Zhang等人提出的检测方法。细胞消化，加入缓冲液重悬，2次冻融破碎细胞。离心，收集上清，立即进行NADP、NADPH的测定。 

    (j)细胞内SOD的测量：采用连苯三酚自氧化方法。细胞消化后收集，快送冻融两次。取干净测定管，分别加入CBS(pH≈10)，鲁米诺，最后加入连苯三酚(1mmol/L)，反应20s后开始测定其放光值。细胞内SOD活性由相对于连苯三酚自氧化产生的自由基基线ROS水平的抑制率值表示。 

    (k)细胞内脂质过氧化物(MDA)的测量：采用硫代巴比妥酸(TBA) 荧光法。取细胞悬液，分别加入H₂SO₄、磷钨酸后，室温下混匀，离心，弃上清。然后加入1％TBA，混匀；沸水浴1h，流水冷却；加入正丁醇，振荡混匀；离心，取上层液测定；发射光(EM)为553nm，激发光(EX)为515nm测定。 

    (3)结果 

    (a)不同浓度反式西红花酸干预对脂肪肝细胞脂滴含量的影响 

    脂肪肝细胞加药前后用油红染色后，镜下观察脂变细胞的比例，结果如图1所示)。加入FFA的细胞，脂变细胞比率为28.7％，加入低浓度西红花酸后脂变细胞比率下降为16％，并随干预浓度的增加脂变细胞下降幅度增大。加入低浓度脂质体反式西红花酸后脂变细胞比率下降幅度增大，低浓度时差异更明显。 

    图2为油红染色照片，结果显示，空白组细胞(A)边缘清晰，核大，细胞内少见染色脂滴。单加脂肪酸组(B)可见大部分细胞内含较多脂滴。低浓度西红花酸组(C)细胞内可见染色脂滴数比仅加脂肪酸组少，大多细胞内只存有少数几个脂滴，细胞状态也显示似空白组。脂质体反式西红花酸干预组(D)细胞内的脂滴数更少。加药干预组相对于单纯FFA组的脂滴数明显减少，进一步说明反式西红花酸可在细胞水平上预防由混合脂肪酸引起的细胞脂肪化。反式西红花酸的脂质体可进一步改善细胞的脂肪化。 

    (b)反式西红花酸干预后脂肪肝细胞内TG含量的变化 

    甘油三酯TG是细胞内脂含量的重要指标，图3显示的是各组相对于正常组细胞内TG的含量。FFA处理后，导致细胞内TG的含量明显上升，增加了363％；而低反式西红花酸干预后可使已上升的TG含量显著降低，相对于正常细胞TG值仅上升了230％；随反式西红花酸干预浓度的增加TG下降幅度明显增大。说明一定浓度的反式西红花酸处理能够明显改善细胞内脂肪的堆积。而加入脂质体处理的反式西红花酸后，TG的下降幅度比单纯反式西红花酸明显增大，低浓度时差异更明显。说明反式西红花酸脂质体还可使西红花酸抗脂肪肝作用提高。 

    (c)反式西红花酸干预后脂肪肝细胞内氧化应激水平的变化 

    ROS及MDA含量是反映细胞内自由基水平的重要指标。ROS的高低一定程度上也代表细胞氧化水平的高低，图4可以看出，加入FFA后，ROS明显增高，升高了44％，说明在脂肪酸诱导脂肪肝的过程中，细胞的氧化水平增高；加入低浓度反式西红花酸后细胞的ROS含量降低，随反式西红花酸干预浓度的增加ROS下降幅度明显增大，中浓度反式西红花酸干预相对于正常细胞ROS值仅上升了11％，说明反式西红花酸具有清除自由基、改善细胞内氧化水平的作用。当加入脂质体处理的反式西红花酸后，ROS的下降幅度比单纯反式西红花酸干预组增大，低浓度时差异更明显。 

    MDA是脂质过氧化物的产物，能促进自由基链锁反应，进而可使蛋白质、核酸、脂类等发生损伤，使生物膜变性，从而导致细胞突变、 衰老或死亡，MDA的变化也能反映出机体内脂质过氧化的程度，即可间接反映出细胞氧化损伤的程度。当加入西红花酸后细胞内的MDA含量比脂肪酸细胞组降低(图5)。西红花酸干预呈现剂量效应，随着西红花酸浓度的增加MDA下降也增加。表明西红花酸药物干预能够减轻细胞内脂质过氧化的水平，从而减轻脂肪肝细胞的氧化损伤。当加入脂质体处理的西红花酸后，MDA的下降幅度比单纯西红花酸干预组增大，低浓度时差异更明显。 

    (d)反式西红花酸干预后脂肪肝细胞内抗氧化水平的变化 

    NADPH也反映体内可调节抗氧化系统的重要指标，图5显示NADPH相对于空白组的含量，加入FAA造模后，细胞内的NADPH含量比空白组明显降低(下降30％)，加入西红花酸后细胞的NADPH含量比FAA组升高，中高浓度反式西红花酸干预组已接近或超过正常水平。说明反式西红花酸对肝细胞脂化进程除了具一定抑制作用，并具调节细胞内氧化还原系统的平衡。当加入脂质体处理的反式西红花酸后，NADPH的上升幅度比单纯反式西红花酸干预组也增大，低浓度时差异更明显。 

    图6显示细胞内还原型谷胱甘肽(GSH)的含量，GSH的含量变化可反映细胞内一些系统的还原水平状态，以及清除脂质过氧化的能力。FFA处理细胞后，细胞内GSH显著下降，降到只有原来的11％，这进一步印证了脂肪酸在诱导的脂肪肝细胞的过程中，会使胞内氧化水平提高。而低浓度反式西红花酸组的GSH水平比FFA组明显上升 (为空白组的65％)，而中高浓度反式西红花酸组GSH含量已接近或超过正常组。当加入脂质体处理的反式西红花酸后，对维持胞内GSH还原水平效果更明显。 

    还原型谷胱甘肽(GSH)可称谓是抵抗ROS生成的第一道屏障，在组织中起着细胞防御因子的作用。因而GSH水平变化作为评价外源性物质对氧化损伤具防护作用的指标而被广泛应用。超氧化物歧化酶(SOD)是一种生物体内主要的抗氧化酶，能清除超氧化物自由基，可以特异的清除超氧阴离子，从而减少羟自由基等更具毒素作用的物质产生，在防御氧的毒性、抑制老年疾病以及预防衰老等方面起着重要作用。实验结果显示FFA处理的细胞类SOD活性降为原来的71％，反式西红花酸组干预组的SOD水平比FFA组明显上升，并随干预浓度的增加SOD水平增加。加入反式西红花酸干预后，SOD活性回复甚至超过正常，反式西红花酸的脂质体可使细胞内的SOD抗氧化酶水平进一步提高。见图8。 

    本实验表明，脂肪肝细胞模型中GSH和SOD含量明显降低，细胞抗氧化能力相对较弱，氧化应激水平较高。而采用本方法制备的反式西红花酸干预组则可以改善这一氧化还原不平衡状态，从而可提高细胞的存活率。脂质体处理后可使反式西红花酸干预效果加强。通过改变反式西红花酸干预时间，即在诱导脂肪肝细胞模型前后不同的时间干预，表明西红花酸对于脂肪肝诱发具有一定的预防和控制作用。 

    实验数据采用平均值±标准偏差(mean±SD)，组间比较采用T检验，p＜0.05表示差异有显著性。 

    实验结果证明本方法制备的反式西红花酸通过其抗氧化的功效可有效改善脂肪肝细胞的氧化应激状态。也提示本方法制备的反式西红花酸对于脂肪肝变化具有一定的防治作用。 

    根据脂肪肝的“二次打击学说”，在第二次打击中，氧化应激和脂质过氧化物发挥了主要作用。脂质过氧化作用主要是指在多不饱和脂肪酸中发生的一种自由基链式反应，它主要是由自由基引发产生的，它的特点是链式的产生脂质过氧化物，破坏组织结构和功能。伴随着线粒体受损，肝输送脂肪功能也显著下降，这些变化能诱导编码脂肪代谢酶的基因改变，使得脂肪酸过氧化和甘油三酯堆积从而进一步造成肝损伤。持续过剩的ROS过剩积累能使体内抗氧化剂逐趋耗竭，从而形成自由基链式反应的恶性循环。这些生物化学过程使致炎细胞因子激活，导致肝细胞发生炎症浸润、坏死，甚至进展为肝纤维化、肝硬化。 

    丙二醛(MDA)是脂质过氧化的产物，它可以直接反映自由基引起脂质过氧化的损伤程度。脂肪肝模型中，ROS、MDA含量的显著升高也验证了脂肪肝细胞中的高水平的氧化应激状态使肝组织内的氧化还原平衡被严重破坏。而而本方法制备的西红花酸干预却可有效降低氧化应激水平，从而防止“第二次打击”的发生。 

    本实验通过建立脂肪肝细胞模型，在细胞水平上研究本方法制备的反式西红花酸对脂肪肝细胞状态的作用，为利用天然植物抗氧化成分防治脂肪肝病变提供了理论依据，也为临床应用研究提供了实验基础。