一种棉花脱水素类似基因及其应用 技术领域 本发明涉及植物基因工程领域， 尤其涉及一种棉花脱水素类似基因以及其构建的 植物表达载体及其在耐旱、 耐寒、 耐盐碱转基因植物研制方面的应用。
背景技术 在自然界， 植物暴露在各种各样的环境条件下， 水分亏缺， 冷和冻， 热， 盐和氧匮乏 是影响植物生长的主要环境因子。大多数农作物对不良环境条件是敏感的， 经常会由于环 境胁迫而产生减产。 在胁迫发生期间， 植物体内会产生一系列生理生化变化， 如糖， 脂， 蛋白 质和核酸以及光合作用， 固氮作用和呼吸作用等以适应胁迫。 植物生长的不同阶段， 包括种 子萌发， 种子成熟和衰老都不同程度受胁迫条件的影响。
植物不能依靠自身的运动趋利避害， 所以在长期的进化过程中形成了一系列主动 适应外界环境变化以保护自身的机理。 在逆境条件下， 植物细胞会发生诸如可溶性蛋白、 糖 类、 有机酸、 脯氨酸、 ABA 含量的增加， 新的蛋白异聚体的出现， 膜脂成分的改变等相应变化。 同样在盐分胁迫和干旱条件下也可以诱发植物细胞启动保护机制， 以减少水分丧失。同时 在植物种子形成过程为了保证能适应各种逆境和长期保存， 也存在一个脱水过程。在这些 过程中， 涉及到一些与植物脱水有关的基因及其产物， 脱水素 (dehydrin) 就是其中较重要 的一种， 它们主要功能是保护植物细胞中的大分子在脱水过程中不受伤害， 使植物对干旱、 盐碱、 寒冷等水分胁迫相关的非生物逆境表现出更好的耐受能力。
脱水素的一个重要结构特征是它具有 3 类非常保守的区域 ： K、 S 和 Y 片段， 其中 K 片段是所有脱水素都具有的。K 片段富含赖氨酸， 通常位于 C 端， 可具有 1 到 12 个重复， 一 般由 15 个氨基酸残基组成 (EKKGIMDKIKEKLPG)， 其中也可能存在某些单核苷酸的置换或结 构上的修饰。K 片段能形成双亲性的 α2 螺旋， 这是脱水素的重要功能结构。许多脱水素还 含有由丝氨酸残基组成的 S 片段。有证据表明 S 片段的磷酸化可以使脱水素在信号肽的引 导下进入细胞核。很多脱水素的 N 端还具有另一类保守区域 ： Y 片段。它的序列为 DEYGNP， 与植物和细菌分子伴侣的核酸结合位点有同源性。除了以上 3 个保守区域外， 脱水素还具 有另外一些保守性稍差的区域， 这些区域富含甘氨酸和极性氨基酸 ( 特别是苏氨酸 )， 称作 S 片段， 它们通常分布于 K 片段之间。
基于 3 种保守区域组成的不同， 可将脱水素分为 5 种类型 ： YnSK2、 Kn、 SKn、 KnS 和 Y2Kn。YnSK2 型脱水素是最丰富的一类， 含有 1 到 3 个 Y 片段、 1 个 S 片段和 2 个 K 片段， 是 一类碱性或中性蛋白质， 能被干旱或脱落酸 (abscisic acid， ABA) 诱导， 但不被低温诱导。 Kn 型脱水素含有 2 到 9 个 K 片段， 而不含有 Y 片段和 S 片段， 是一类酸性或中性蛋白质， 能 被低温、 干旱和 ABA 诱导， 并且被低温诱导的能力要强于干旱和 ABA。SKn 型脱水素含有 1 个 S 片段和 2 到 3 个 K 片段， 是一类酸性蛋白质， 它们优先被低温诱导。KnS 型脱水素的 K 片段与其它类脱水素有所不同， 起始序列为 KEG( 其它类的起始序列为 EKKG)， 它们能被低 温和干旱诱导。Y2Kn 型脱水素含有 2 个 Y 片段和 1 到 2 个 K 片段， 是一类酸性蛋白质。
发明内容
本发明的目的在于提供一种棉花脱水素类似基因， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 1所示。 本发明的第二个目的在于提供棉花脱水素类似基因的 cDNA 序列， 其核苷酸序列 如 SEQ ID NO ： 2 所示。
本发明的第三个目的在于提供一种棉花脱水素类似蛋白， 由 SEQ ID NO ： 1 所示核 苷酸序列编码， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 3 所示。
本发明的第四个目的在于提供含有所述棉花脱水素类似基因的植物表达载体。
本发明的第五个目的在于提供用所述植物表达载体转化的植物细胞、 组织或植 株。
本发明的第六个目的在于所述棉花脱水素类似基因在可提高对水分胁迫相关非 生物逆境耐受能力的植物品种中的应用。
本发明的技术路线为 ：
1) 干旱处理棉花幼苗 ；
2) 从经干旱处理的的棉花幼苗上取叶片， 并从叶片提取总 RNA ；
3)mRNA 差异显示分析， 得到差异表达的 cDNA 片段 ； 4) 根据差异表达的 cDNA 片段， 用 RACE 方法获得棉花脱水素类似基因， 命名为 ：GhDh1 ； 6) 构建 GhDh1 植物表达载体， 用农杆菌介导转化烟草， 获得转 GhDh1 基因烟草， 采 用干旱模拟实验验证转 GhDh1 基因烟草， 比对照烟草具有更强的耐旱能力。
本发明克隆了一种棉花棉花脱水素类似基因 GhDh1， 构建 GhDh1 基因植物表达载 体， 用根癌农杆菌介导转化烟草， 获得转 GhDh1 基因烟草， 采用干旱模拟实验验证转 GhDh1 基因烟草， 比对照烟草具有更强的耐旱能力， 且 GhDh1 基因在烟草中的表达能在一定程度 上提高烟草种子在萌发过程中对干旱胁迫的抵抗能力。
附图说明 图 1 是棉花总 RNA 琼脂糖凝胶电泳图 ；
图 2 是差异片段的反向 Northern Dot blot 图 ；
图 3 是棉花脱水素类似蛋白 GhDh1 亲水性分析图 ；
图 4 是植物表达载体 pBI121-GhDh1 构建流程图 ；
图 5 是转 GhDh1 基因烟草 GhDh1 基因 Southern 杂交检测图 ；
图 6A、 6B 和 6C 是转基因烟草和非转基因烟草 PEG 模拟干旱胁迫实验结果示意图 ；
图 7 是烟草幼苗干旱模拟实验结果示意图 ；
图 8 是烟草幼苗干旱处理后重新浇水实验结果示意图 ；
图 9A 是转空载体 pBI121 和转 GhDh1 基因烟草 T1 代种子萌发状况对比图 ； 和 9B 是转空载体 pBI121 烟草 T1 代种子萌发状况图示 ； 图 9C 是转 GhDh1 基因烟草 T1 代种子萌发状况图示。 具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的技术路线做进一步详细说明。
实施例 1 棉花脱水素类似基因 GhDh1 的克隆 一、 棉花材料的处理 鄂杂棉 11 号 F1 代种子萌发 15 天， 取整株材料干旱诱导 8 小时， 冻存于 -70 度冰箱。 二、 棉花总 RNA 的提取
A. 取 0.1g 棉花叶片液氮研磨后， 加 0.5ml 植物 RNA 提取液 ( 购自 invitrogen)， 振荡至彻底混匀。
B. 室温放置 5 分钟。
C.4℃ 12,000rpm 离心 1 分钟， 上清转入新的无 RNase 离心管。
D. 加入 0.1ml 5M NaCl， 温和混匀。
E. 加入 0.3ml 氯仿， 上下颠倒混匀。
F.4℃ 12,000rpm 离心 10 分钟， 取上层水相转入新的无 RNase 离心管。
G. 加与所得水相等体积的异丙醇， 混匀， 室温放置 10 分钟。
H.4℃ 12,000rpm 离心 10 分钟。弃掉上清， 注意不要倒出沉淀。加 1ml 75％乙 醇。
I.4℃ 5,000rpm 离心 3 分钟。 倒出液体， 剩余的少量液体短暂离心， 然后用枪头吸 出， 室温晾干 2-3 分钟。
J. 加 50μl 无 RNase 水， 反复吹打、 混匀， 充分溶解 RNA。
提取的总 RNA 用 1％琼脂糖凝胶检测完整性， 电泳结果如图 1 所示。
三、 RNA 样品中 DNA 污染的去除
A. 在 RNase-free 的 Eppendorf 管中依次加入 16μl 总 RNA、 2μl 10×Buffer、 1μlRnaseOUT、 1μl RNase-free DNaseI(2U/μl) ；
B. 室温放置 15min ；
C. 加入 2μl 25mM EDTA， 65℃保温 15min。
四、 mRNA 差异显示分析
依据 GENOMYX 公司 fluoroDD Kit System 进行操作 ：
( 一 ) 逆转录 ：
1、 在 0.2mltube 中， 加入下列成分 ：
总 RNA(0.1ug/ul) 2.0ul
HIEROGLPH T7(dT12)AP anchored primer(2uM) 2.0ul
2、 70℃水浴 10 分钟。立即放置在冰浴中。
3、 加入下列成分： 2.0ul 10×SuperScriptII RT buffer ； 2.0ul 250uM dNTP mix ； 2.0ul100mM DTT ； 9.8ul DEPC·H2O ； 0.2ul 200U/ul SuperScriptII RT。
4、 进行下列循环 ：
42℃ 5 分钟 ； 50℃ 50 分钟 ； 70℃ 15 分钟 ； 4℃保存
( 二 )DDRT-PCR ：
1、 向 0.2ml tube 中加入下列成分 ：
1.0ul RT mix(unlabeled 3’ AP) ； 1.0ul 10×PCR buffer ； 1.5ul 25mM MgCl2 ； 2.0ul250uM dNTP ； 1.75ul 2uM 5’ ARP ； 0.7ul 5uM 3’ TMR-AP(flurescent 3’ AP) ；
1.75ulH2O ； 0.1ul AmpliTaq(5U/ul)
2、 进行下列循环 ：
95℃ 2 分钟 ； 92℃ 15 秒， 50℃ 30 秒， 72℃ 2 分钟共 4 个循环 ； 92℃ 15 秒， 60℃ 30 秒， 72℃ 2 分钟共 30 个循环 ； 4℃
3、 取 4.0ul DDRT-PCR 产物， 加入 1.5ul fluoro loading buffer， 95℃变性 5 分 钟， 冰浴， 上样。
( 三 ) 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ：
1、 清洗 33×61cm 的低荧光玻璃和 250 微米 spacer 及梳子
2、 配制 5.6％序列胶 ：
取 70ml 5.6％ denaturing HR-1000gel(FL407)， 560ul 10％ APS， 56ul TEMED 混 匀， 铺胶， 使胶聚合 1 小时
3、 上槽加入 0.5×TBE， 下槽加入 1×TBE
4、 上样， 两侧加入 4.0ul DNA standard marker 和 1.5ul fluoroDD loading dye
5、 电压 3000V， 5 小时
6、 蒸馏水多次冲洗序列胶 7、 GenomyxSC Fluorescent Imaging Scanner 扫描呈像
( 四 )DDRT-PCR 产物的第二次 PCR ：
1、 将所切的胶条放入含有 30ulTE buffer 的 0.5ml tube 中， 37℃， 温育 1-2 天
2、 在 0.2ml tube 中加入下列成分 ：
2ul 胶溶液 ； 2ul 10×PCR buffer ； 1.2ul 25mM MgCl2 ； 0.3ul 100mM dNTP ； 2ul2uM M13reverse primer ； 2ul 2uM T7 Promoter primer ； 0.5ul Taq。
3、 循环参数 ：
95℃ 2 分钟 ； 92℃ 15 秒， 50℃ 30 秒， 72℃ 2 分钟共 4 个循环 ； 92℃ 15 秒， 60℃ 30 秒， 72℃ 2 分钟共 30 个循环 ； 4℃
4、 取 10ul 电泳检测
( 五 ) 反向 Northern 杂交， 克隆和序列分析
为 降 低 差 异 显 示 中 的 假 阳 性， 进 行 了 两 次 反 向 Northern 杂 交。 在 克 隆 片 段 之 前 进 行 第 一 次 反 向 Northern 杂 交， 取 6ul 扩 增 的 片 段 同 时 点 在 两 张 Hybond-N+(AmershamPharmarcia， U.S.A) 尼龙膜上， 用地高辛标记的 dUTP 分别以干旱诱导 和未诱导的棉花总 RNA 为模板标记总 cDNA。在预杂交液中， 65℃进行 2-3 小时的预杂交， 过夜进行杂交。阳性的 cDNA 片段被克隆到 pGEM-T Easy 载体 (Promega， USA) 上， 每一条 片段选择 6 个克隆， 进行第二次反向 Northern 杂交。选择阳性 cDNA 片段进行测序。反向 Northern 的结果如图 2 所示， 其中 A 代表干旱诱导后的总 cDNA 探针， B 代表干旱诱导前的 总 cDNA 探针， 1-8 代表 mRNA 差异显示出差异片段。
将经过反向 Northern Dot blot 鉴定的 mRNA 差异显示片段 2 号用引物 T7 和 M13 扩增， 回收后连入 -T Vector， 筛选到阳性克隆后， 进行序列分析， 其核苷酸序列 如 SEQ ID NO ： 4 所示。该序列全长为 579bp， 经 BLAST 搜索， 未发现与 dehydrin 家族基因 同源性很高。按三个读码框翻译出氨基酸序列， 最大的读码框为 405bp， 编码的 135 个氨基 酸， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 5 所示。
五、 用 RACE 方法获得棉花脱水素类似基因 GhDh1 全长 cDNA
依据已知部分 cDNA 序列， 按照设计两条基因特异性引物， 序列如下 ：
GSP1 ： 5’ CTGTTGCCGCCTCATCGCAC 3’
GSP2 ： 5’ GGGACTGCACTGTCCTCTTC 3’
以干旱诱导的总 RNA 为模板， 用 GSP1 进行逆转录， 随后用 GSP2 和 AAP 进行 PCR 扩 增， 具体操作如下 ：
A 逆转录 ：
1、 在 0.5ml 离心管中加入以下成分 ：
1ul 10uM GSP1 ； 12.5ul(1-5ug)Total RNA ； 13.5ul DEPC·H20
2、 混匀， 70℃变性 10 分钟， 置于冰浴中至少 2 分钟， 离心
3、 按下表加入以下成分 ：
2.5ul 10×PCR buffer ； 2.5ul 0.1M DTT ； 1.25ul RNaseOUT(40U/ul) ； 3ul25mMMgCl2 ； 1.25ul 10mM dNTP， 以上各种成分可在另一管中混匀， 在 45℃预热
4、 混匀各种成分， 离心， 42℃温育 1-2 分钟
5、 加入 1ul SuperscriptII RT 混匀， 42℃ 10 分钟， 50℃ 1-1.5 小时 6、 70℃ 15 分钟， 以终止反应
7、 离心 10-20 秒， 37℃温育， 加入 1ul RNase Mix 混匀， 37℃ 30 分钟
8、 离心， 冰浴
B 纯化 cDNA 单链 ：
1、 将 binding solution 平衡至室温
2、 取 100ul ddH2O 70℃温育
3、 将 120ul binding solution(6M NaI) 加入到第一链合成混合物中， 混匀
4、 将 cDNA/NaI 混合物转移到 GlassMAX 离心柱中， 13000g 离心 20s
5、 从管中取出柱子， 将滤过液转移至另一干净离心管中， 保存此管直至 cDNA 纯化 完成， 将离心柱放回原来的离心管中
6、 将 0.4ml 冷 1×wash buffer 加入到柱子中， 13000g 离心 20 秒， 弃滤过液重复 3 次
7、 用 0.4ml 冷 70％乙醇洗 2 次柱子
8、 13000g 离心 1 分钟， 以彻底除去残留的乙醇
9、 将柱子转移到另一个离心管中， 加入 50ul 65℃预热的 ddH2O， 13000g 离心 20 秒
C cDNA 加尾 ：
1、 在 0.5ml 离心管中加入以下成分 ：
5.0ul 5×tailing buffer ； 2.5ul 2mM dCTP ； 16.5ul cDNA sample ； 24.0ul H2O
2、 94℃ 3 分钟， 置于冰上 1 分钟， 离心
3、 加入 1ul TdT， 混匀， 37℃ 10 分钟
4、 65℃加热 10 分钟， 离心， 冰浴保存
D 加尾 cDNA PCR 扩增 ：
1、 在冰上， 向 0.2ml 离心管中加入以下成分 ：
5ul 10×PCR buffer ； 3.0ul 25mM MgCl2 ； 1.0ul 10mM dNTP ； 2.0ul 10uM GSP2 ；
2.0ul 10uM AAP ； 5.0ul dC-tailed cDNA ； 31.5ul ddH2O。
2、 94℃变性 5 分钟
3、 加入 0.5ul Taq 酶， 混匀
4、 循环参数 ：
94℃ 5 分钟 ； 94℃ 30 秒， 55℃ 30 秒， 72℃ 2 分钟 30 个 ； 72℃ 7 分钟 ； 5℃
5、 取 5-20ul 电泳检测
E 巢式 PCR ：
1、 取 5ul 第一轮 PCR 产物加入 495ul TE buffer
2、 在冰上， 向 0.2ul 离心管中， 加入以下成分 ：
5ul 10×PCR buffer ； 3.0ul 25mM MgCl2 ； 1.0ul 10mM dNTP ； 2.0ul 10uM GSP2 ； 2.0ul 10uM AAP ； 5.0ul dC-tailed cDNA ； 31.5ul ddH2O。
3、 94℃ 5 分钟
4、 加入 0.5ul Taq 酶， 混匀
5、 循环参数 ：
94℃ 5 分钟 ； 94℃ 30 秒， 55℃ 30 秒， 72℃ 2 分钟 30 个 ； 72℃ 7 分钟 ； 5℃ 将第二轮 PCR 获得的片段克隆至 pGEM-T-easy 载体上测序获得基因 5’ 端序列， 其 核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 6 所示。
根据已知序列设计引物进行 RT-PCR 扩增并将获得片段克隆至 pGEM-T-easy 载体 上测序， 获得 GhDh1 cDNA 全长序列如 SEQ ID NO ： 2 所示。
根 据 已 知 序 列 设 计 引 物 进 行 PCR 扩 增 基 因 组 DNA 并 将 获 得 片 段 克 隆 至 pGEM-T-easy 载体上测序， 获得 GhDh1 基因组 DNA 全长序列如 SEQ ID NO ： 1 所示。
该 GhDh1 基因的 cDNA 全长为 909bp， 包含一个 600bp 的开放读码框， 编码 299 个氨 基酸， 从第 312 个碱基开始含有一个 95bp 的内含子。它的 5’ 端非翻译区长为 87bp， 3’ 端 非翻译区长为 219bp。
GhDh1 编码的蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 3 所示， 该基因编码的 299 个氨基 酸序列具有脱水素蛋白的明显特征， 含有一个 S 片段和两个 K 片段。
将推导出的氨基酸全序列在 NCBI Genebank 上进行 Blast 搜索， 同源性最高的几 个搜索结果如下 ：
gb|AAN78125.1|dehydrin[Citrus x paradisi] 138 3e-31
gb|AAC02689.1|cold regulated LTCOR18[Lavatera thuringiaca] 120 6e-26
ref|XP_002285919.1|PREDICTED ： hypothetical protein[Vitis vi... 108 3e-22
emb|CAN66038.1|hypothetical protein[Vitis vinifera] 108 3e-22
gb|AAP56259.1|dehydrin[Citrus sinensis] 102 3e-20
gb|ABC68275.1|dehydrin[Coffea canephora]
2e-19
g b | A A T 0 6 6 0 0 . 2 | d e h y d r i n [ L u p i n u s a l b u s ] 96.7 1e-18
gb|ABS12348.1|dehydrin[Populus x canadensis] 95.9 2e-18
ref|NP_850947.1|ERD10(EARLY RESPONSIVE TO DEHYDRATION 10). 95.9 2e-18
gb|ABS12346.1|dehydrin[Populus maximowiczii] 95.5 2e-18
emb|CAA78515.1|dehydrin-cognate[Pisum sativum] 94.4 5e-18
用软件 DNAMAN 计算 GhDh1 蛋白的 pI ＝ 5.48， 预测的分子量是 22.420kD， 分析 GhDh1 蛋白氨基酸残基的亲水性， 如图 3 所示， 可见它是一个亲水性很强的蛋白。
实施例 2 GhDh1 基因植物表达载体的构建
请 参 阅 图 4， 将 PCR 扩 增 得 到 的 GhDh1 基 因 cDNA 用 T4DNA 连 接 酶 连 接 至 pGEM-TEasy 上得到质粒 pGEM-GhDh1， 用 BamH1 和 SacI 同时双酶切 pGEM-GhDh1 和 pBI121， 分别获得 GhDh1 片段和线性 pBI121 载体， 用 T4DNA 连接酶将 GhDh1 片段和线性 pBI121 载 体连接， 得到 GhDh1 基因植物表达载体 pBI121-GhDh1。
实施例 3 利用农杆菌介导的方法转化法获得转 GhDh1 基因烟草
1、 根癌农杆菌 LBA4404 感受态细胞的制备
1) 挑取新鲜的 LBA4404 单菌落接种于含适量抗生素的 LB 液体培养基中， 28℃培养 至对数生长期 ；
2)4℃， 8000rpm 离心 5 分钟， 收集菌体于小离心管中 ；
3) 用 600μl 冰预冷的 500mM CaCl2 重悬洗涤细胞 ；
4)4℃， 8000rpm 离心 5 分钟， 细胞沉淀中加入 100μl 冰预冷的 500mM CaCl2， 混 匀后备用 (24-48 小时后使用效果最佳 )。
2、 根癌农杆菌 LBA4404 的转化
1) 加入 1μl 植物表达载体质粒 DNA 至农杆菌感受态细胞中， 轻轻混匀， 于液氮中 速冻 5 分钟， 37℃温浴 5 分钟 ；
2) 加入 600μl LB 液体培养基， 28℃轻摇 4-6 小时， 室温， 6000rpm 离心 3 分钟， 富 集菌体 ；
3) 保留 50-200μl 菌液， 混匀， 均匀涂布于含适量抗生素的 LB 选择平板上， 28℃倒 置培养两天。
4) 挑取新鲜菌落， 进行 PCR 鉴定， 筛选阳性克隆。
3、 烟草的遗传转化及植株再生
采用叶盘法转化烟草， 将经 PCR 法鉴定的阳性植株移栽到土壤中， 烟草生长正常。
4、 转基因烟草植株的 Southern 检测
用 SDS 法提取烟草叶片总 DNA， EcoR I 消化后走 1％琼脂糖凝胶电泳， 以 DIG 标记 的 GhDh1 基因为探针进行 Southern 杂交， 表明 GhDh1 已经整合到烟草中， 杂交结果如图 5999.所示， 1 号泳道为正对照、 2 号泳道为未转基因烟草负对照， 3 号和 4 号泳道为转 GhDh1 基因 烟草。
5、 GhDh1 基因功能鉴定及转 GhDh1 基因烟草的干旱耐受实验
(1)PEG 模拟干旱胁迫实验
请参阅图 6A， 将卡那抗性烟草置于含 3％ PEG4000 的生根培养基上进行培养， 20 天 后观察， 植株生根， 图 6B 和 6C 为对照烟草 ( 即非转基因植株 ) 置于含 3％ PEG4000 的生根 培养基上进行培养， 20 天后观察， 不生根， 叶缘黄化， 表现出较重的干旱胁迫的症状。
(2) 转 GhDh1 基因烟草干旱耐受实验
以未转基因烟草作为对照， 将移栽到土壤后 10 天的的烟草进行干旱处理， 结果显 示， 转 GhDh1 基因烟草干旱胁迫条件下生长状况明显好于对照， 如图 7 所示， 1 为非转基因 对照植株、 2 为第 6 号转基因株系、 3 为第 15 号转基因株系 ； 重新浇水进行复苏后转基因植 株与对照组相比受干旱影响较小， 如图 8 所示， 1 为非转基因对照植株、 2 为第 6 号转基因株 系、 3 为第 15 号转基因株系。
(3) 转 GhDh1 基因烟草 T1 代种子萌发实验
请参阅图 9A、 9B 和 9C， 9A 中 A 代表转 GhDh1 基因 T1 代种子， CK 代表转 PBI121 载 体 T1 代种子。 分别选取转 GhDh1 基因烟草各 6 个株系的 T1 代种子， 以转空载体 pBI121 的烟草 ( 图 9B) 做为对照， 在附加 13％ PEG 的 MS 培养基上进行萌发试验。结果发现， 转 GhDh1 基 因烟草第 11 号株系的种子萌发明显快于转空载体的烟草种子 ( 图 9C)， 而且在萌发后的生 长速度也比对照快。这说明 GhDh1 基因在烟草中的表达能在一定程度上提高烟草种子在萌 发过程中对干旱胁迫的抵抗能力。
SEQUENCE LISTING
<110> 创世纪转基因技术有限公司
<120> 一种棉花脱水素类似基因及其应用
<160>6
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>720
<212>DNA
<213> 棉花
<400>1
gaagtgatcc acaatcttga tacggtaata cgttaggtag ttttcagcat acttgttttg 60
agtttagtgg ttgtagataa agaaaaaatg gctgaggagc ataccaaggt tggtggtgag 120
gaagcagtgg cgagcaagga gcgagggatg tttgatttct tggggaagaa agaagaggag 180
aagcctcaac ctcaagagga ggtggtgtcc acccagtttg agaaagtcaa gatagaagag 240
gaacataagg aagatgagaa gaaacacagt ctcctggaca agcttcaccg atccaatagc 300
agctccagct cttctagtga cgaggaagaa ggtgaaggtg aaggcggaga gaagaagaag 360
aagaaaaagg agaagaaggg aaagaaagaa gaggacagtg cagtcccagt ggagaagtgc 420
gatgaggcgg caacagttca ccactcagag acgccggaaa agaagggttt catggagaag 480
10102080088 A CN 102080091
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说明书Ser Ser Ser Asp Glu 75 Lys Lys Lys Lys Glu 95 Pro Val Glu Lys Cys 110 Pro Glu Lys Lys Gly 125 Gln His Lys Lys Asp 140 Ala Pro Thr Glu Asn 155 Gly Phe Leu Glu Lys 175 Thr Glu Asp Glu Lys 19010/11 页Lys Leu His Arg Ser 65 Glu Gly Glu Gly Glu 85 Lys Gly Lys Lys Glu 100 Glu Ala Ala Thr Val 115 Met Glu Lys Ile Lys 130 Glu Val Thr Thr Pro 145 His His Glu Gly Glu 165 Lys Glu Lys Ile ProAsn Ser Ser Ser Ser 70 Gly Gly Glu Lys Lys 90 Glu Asp Ser Ala Val 105 His His Ser Glu Thr 120 Asp Lys Leu Pro Gly 135 Pro Pro Ala Ala Ala 150 Thr Lys Glu Lys Lys 170 Gly Tyr His Ser Lys 185Glu 80 Lys Asp Phe Glu Asp 160 Ile Glu180 Lys Glu Thr Thr Ala Pro His 195 <210>4 <211>579 <212>DNA <213> 棉花 <400>4 cttctctccg ccttcaccta tccaatagca gtgaaggcgg agagaagaag aagaagaaga gtgcagtccc agtggagaag tgcgatgagg aaaagaaggg tttcatggat aagatcaaag aagaggacac cacccaacca ccagctgctg gagggacaaa agagaagaag ggatttttgg actccaaaac agaggacgag aaggaaaaag taatgcattt caagtaaaag atgtgtagag tctgctctct gtttttcttt ttggggttgc cctgcttgta agttaaaaaa gaaaaaaaaa <210>5 <211>135 <212>PRT <213> 棉花 <400>5gctccagctc aaaaggagaa tagcaacagt acaaactccc ctgccccaat tgaaaatcaa agaccactgc attgtgtggt atacatcata aaaaaaaaattctagtgac gggaaagaaa tcaccactca aggacagcat tgagaacgac ggagaaaatt tcccaattaa ttatcaattt taaatttctggaggaagaag gaacaggaca gagacgccgg aagaaagatg caccatgaag cctggttacc tgaatcaata gttggaactg cgtctgtttt60 120 180 240 300 360 420 480 540 57912102080088 A CN 102080091
说明书Ser Ser Ser Ser Ser 10 Lys Lys Lys Lys Lys 25 Ala Val Pro Val Glu 45 Glu Thr Pro Glu Lys 60 Pro Gly Gln His Lys 75 Ala Ala Ala Pro Ile 90 Lys Lys Gly Phe Leu 105 Ser Lys Thr Glu Asp 12511/11 页Ser Leu Arg Leu His Leu Ser Asn 1 5 Glu Glu Glu Gly Glu Gly Gly Glu 20 Lys Gly Lys Lys Glu Gln Asp Ser 35 40 Glu Val Ala Thr Val His His Ser 50 55 Met Asp Lys Ile Lys Asp Lys Leu 65 70 Glu Asp Thr Thr Gln Pro Pro Ala 85 His His Glu Gly Gly Thr Lys Glu 100 Lys Glu Lys Ile Pro Gly Tyr His 115 120 Lys Glu Thr Thr Ala Pro Asn 130 135 <210>6 <211>407 <212>DNA <213> 棉花 <400>6 gaagtgatcc acaatcttga tacggtaata agtttagtgg ttgtagataa agaaaaaatg gaagcagtgg cgagcaagga gcgagggatg aagcctcaac ctcaagagga ggtggtgtcc gaacataagg aagatgagaa gaaacacagt agctccagct cttctagtga cgaggaagaa aagaaaaagg agaagaaggg aaagaaagaaSer Ser Asp 15 Lys Lys Glu 30 Lys Cys Asp Lys Gly Phe Lys Asp Glu 80 Glu Asn Asp 95 Val Lys Ile 110 Glu Lys Glucgttaggtag gctgaggagc tttgatttct acccagtttg ctcctggaca ggtgaaggtg gaggacagtgttttcagcat ataccaaggt tggggaagaa agaaagtcaa agcttcaccg aaggcggaga cagtcccacttgttttg tggtggtgag agaagaggag gatagaagag atccaatagc gaagaagaag60 120 180 240 300 360 407