吡唑并N取代去甲去氢斑蝥素酰亚胺衍生物及其合成方法、活性测试方法与应用.pdf

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摘要
申请专利号:

CN201010118944.0

申请日:

2010.03.04

公开号:

CN101812066A

公开日:

2010.08.25

当前法律状态:

驳回

有效性:

无权

法律详情:

发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):C07D 491/22申请公布日:20100825|||实质审查的生效IPC(主分类):C07D 491/22申请日:20100304|||公开

IPC分类号:

C07D491/22; C12Q1/02; A61K31/4192; A61K31/498; A61P35/00

主分类号:

C07D491/22

申请人:

绍兴文理学院

发明人:

邓莉平

地址:

312000 浙江省绍兴市越城区环城西路508号绍兴文理学院

优先权:

专利代理机构:

绍兴市越兴专利事务所 33220

代理人:

方剑宏

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内容摘要

本发明公开了一种吡唑并N-取代去甲去氢斑蝥素酰亚胺衍生物及其合成方法、活性测试方法与应用,属于斑蝥素衍生物领域,其结构通式如式1所示:式1式中:R1为H、Cl、F、CH3、OCH3、OH或NO2;R2为2-苯基-2H-1,2,3-三唑-4-取代基或喹喔啉-2-取代基。本发明提供的这种新型的N-取代去甲去氢斑蝥素酰亚胺衍生物,它将五元杂环吡唑环引入去甲基斑蝥素取代芳胺结构中,并且具有良好的抗肿瘤活性。

权利要求书

1: 一种吡唑并N-取代去甲去氢斑蝥素酰亚胺衍生物,其结构通式如式1所示: 式中: R1为H、Cl、F、CH3、OCH3、OH或NO2; R2为2-苯基-2H-1,2,3-三唑-4-取代基或喹喔啉-2-取代基。
2: 一种权利要求1所述吡唑并N-取代去甲去氢斑蝥素酰亚胺衍生物的合成方法,包括以下步骤: (1)、去甲去氢斑蝥素的合成:将顺丁烯二酸酐研细,加入乙醚,室温条件下搅拌至溶解,滴入呋喃,室温搅拌24~48小时,呋喃与顺丁烯二酸酐发生Diels-Alder反应,制得去甲去氢斑蝥素; (2)、N-取代去甲去氢斑蝥酰亚胺的合成:将去甲去氢斑蝥素溶于丙酮溶剂中,在搅拌下滴加苯胺的丙酮溶液,反应1小时后加入醋酸锰、三乙胺和醋酐,升温溶解;在50-60℃下反应3~8小时;滤去不溶物,将滤液冷冻,倒入冰水混合物中,析出固体,过滤,滤饼用冰水洗涤,甲醇重结晶,真空干燥; (3)、在N-取代去甲去氢斑蝥酰亚胺的的C5和C6双键上,应用氯胺T的简易方法进行1,3[3+2]偶极环加成,引入五元杂环吡唑环结构,得到吡唑并N-取代去甲去氢斑蝥酰亚胺衍生物。
3: 一种权利要求1所述吡唑并N-取代去甲去氢斑蝥素酰亚胺衍生物的活性测试方法,包括以下步骤: (1)、将所培养的A549细胞用胰酶消化后离心,用新培养基悬浮重新后用液体分装仪mutidrop在384孔板的各孔中以50ul体积种植300个A549细胞; (2)、将步骤1的A549细胞在37℃、5%CO2条件下培养24h后,用自动化液体处理系统Bravo分装药物进行刺激,各种化合物的处理浓度有;16uM 8uM 4uM 2uM 1uM 0.5uM 0.25uM 0.125uM,每种处理有四个重复; (3)、将步骤2的A549细胞培养48h后,用CCK-8试剂盒对细胞的活性进行检测:每孔加入5ul CCK-8溶液,用酶标仪读取各孔波长在450nm处的吸收值;在细胞培养箱内继续孵育100min,用酶标仪再次读取波长在450nm处的吸收值,取两次吸收值的变化值除以未加化合物处理孔的吸收值变化,取每组四个重复的平均值即为孔内细胞活性。化合物对细胞的抑制效率=1-孔内细胞活性,将根据化合物浓度与细胞活性的梯度输入至http://bsmdb.tmd.ac.jp:3000/cbdb/ic50,计算最终得到IC50。
4: 一种权利要求1~2所述吡唑并N-取代去甲去氢斑蝥素酰亚胺衍生物在合成抗肿瘤药物上的应用。

说明书


吡唑并N-取代去甲去氢斑蝥素酰亚胺衍生物及其合成方法、活性测试方法与应用

    技术领域:

    本发明属于斑蝥素衍生物领域,更具体是涉及一种新型的吡唑并N-取代去甲去氢斑蝥素酰亚胺衍生物及其合成方法、活性测试方法与应用。

    背景技术:

    斑蝥素(cantharidin)是我国民间中药,是治疗恶性肿瘤药物的有效成份。现代研究证明,其对原发性肝癌有一定疗效,而且有升高白细胞,不抑制免疫系统等优点,因此,具有很高的药用研究价值,引起人们的广泛关注。但斑蝥素的毒性较大,合成很复杂,近来研究表明,去甲斑蝥素(norcantharidin)中少了2,3位的两个甲基,去甲斑蝥素不仅保持了较强的抗肿瘤活性和独特的升高白细胞作用,而且毒性大大降低,基本上消除了斑蝥素对泌尿系统毒刺激副作用。

    因此,与斑蝥素骨架修饰有关的一项具有重大意义的合成工作是去掉2,3位甲基取代。这一结构改变不会影响抗癌活性而毒性有所降低,并且,使得合成步骤简化。另一方面,斑蝥素衍生物的活性研究进展情况表明,斑蝥素的构效关系如下:1)双环[2.2.1]庚烷是斑蝥素的基本骨架环,除去2-C或3-C上的甲基不会影响其活性;1-C或4-C上引入取代基会使其活性降低,在1-C位具有绝对立体构型的斑蝥素衍生物对PP2B具有良好的抑制选择性;5-C或6-C上可以引入取代基,在5-C或6-C上引入取代基会相反地影响对PP1和PP2A的相互作用,同时加强对PP2B的抑制。5-C和6-C之间也可以是双键;7-氧桥键是必不可缺的,可能是氧原子能和PP1和PP2A形成氢键的缘故;2)酸酐环上酸酐部分还原则会失去对PP1和PP2A的抑制作用。

    对斑蝥素结构5-C或6-C的改造工作一般都只是引入取代基,但药理测试结果不够理想。

    发明内容:

    本申请人经研究发现,吡唑类杂环衍生物也具有强烈的生理和药理活性,如抗菌,抗痉挛消炎调节植物生长和抗血小板凝聚等作用,在医药和农药的生产中有重要用途。正是在这启示之下,鉴于不同活性杂环在同一分子中聚集能明显改善或增强化合物的生物活性这一特征,以及生物电子等排原理,申请人设计合成在去甲斑蝥素取代芳胺结构中5-C和6-C双键上进行1,3[3+2]偶极环加成引入五元杂环吡唑环,得到一系列含N-取代去甲去氢斑蝥酰亚胺的吡唑衍生物。

    由此,本发明的主要目的在于提供一种新型的吡唑并N-取代去甲去氢斑蝥素酰亚胺衍生物。

    本发明采取的技术方案如下,一种吡唑并N-取代去甲去氢斑蝥素酰亚胺衍生物,其结构通式如式1所示:

    

    式1

    式中:

    R1为H、Cl、F、CH3、OCH3、OH或NO2

    R2为2-苯基-2H-1,2,3-三唑-4-取代基或喹喔啉-2-取代基。

    本发明的次要目的是提供一种上述吡唑并N-取代去甲去氢斑蝥素酰亚胺衍生物的合成方法,包括以下步骤:

    (1)、去甲去氢斑蝥素的合成:将顺丁烯二酸酐研细,加入乙醚,室温条件下搅拌至溶解,滴入呋喃,室温搅拌24~48小时,呋喃与顺丁烯二酸酐发生Diels-Alder反应,制得去甲去氢斑蝥素;

    (2)、N-取代去甲去氢斑蝥酰亚胺的合成:将去甲去氢斑蝥素溶于丙酮溶剂中,在搅拌下滴加苯胺的丙酮溶液,反应1小时后加入醋酸锰、三乙胺和醋酐,升温溶解;在50-60℃下反应3~8小时;滤去不溶物,将滤液冷冻,倒入冰水混合物中,析出固体,过滤,滤饼用冰水洗涤,甲醇重结晶,真空干燥;

    (3)、在N-取代去甲去氢斑蝥酰亚胺的的C5和C6双键上,应用氯胺T的简易方法进行1,3[3+2]偶极环加成,引入五元杂环吡唑环结构,得到吡唑并N-取代去甲去氢斑蝥酰亚胺衍生物。

    反应的化学方程式如下:

    

    本发明的另一方面还提供一种上述吡唑并N-取代去甲去氢斑蝥素酰亚胺衍生物的活性测试方法,包括以下步骤:

    (1)、将所培养的A549细胞用胰酶消化后离心,用新培养基悬浮重新后用液体分装仪mutidrop在384孔板的各孔中以50ul体积种植300个A549细胞;

    (2)、将步骤1的A549细胞在37℃、5%CO2条件下培养24h后,用自动化液体处理系统Bravo分装药物进行刺激,各种化合物的处理浓度有:16uM 8uM 4uM 2uM 1uM 0.5uM 0.25uM 0.125uM,每种处理有四个重复;

    (3)、将步骤2的A549细胞培养48h后,用CCK-8试剂盒对细胞的活性进行检测:每孔加入5ul CCK-8溶液,用酶标仪读取各孔波长在450nm处的吸收值;在细胞培养箱内继续孵育100min,用酶标仪再次读取波长在450nm处的吸收值,取两次吸收值的变化值除以未加化合物处理孔的吸收值变化,取每组四个重复的平均值即为孔内细胞活性。化合物对细胞的抑制效率=1-孔内细胞活性,将根据化合物浓度与细胞活性的梯度输入至http://bsmdb.tmd.ac.jp:3000/cbdb/ic50,计算最终得到IC50。

    本发明还提供一种上述吡唑并N-取代去甲去氢斑蝥素酰亚胺衍生物在合成抗肿瘤药物上的应用。

    本发明与现有技术相比,具有如下有益效果:

    这是一种新型的N-取代去甲去氢斑蝥素酰亚胺衍生物,它将五元杂环吡唑环引入去甲基斑蝥素取代芳胺结构中,并且具有良好的抗肿瘤活性。

    下面结合具体实施例进一步说明本发明,且仅用于说明本发明,而不构成对本发明的限制。

    【具体实施方式】

    一、吡唑并N-取代去甲去氢斑蝥素酰亚胺衍生物的制备

    实施例1:内型-(3aR,4S,4aR,7aS,8S,8aR)-6-(苯基)-4,8-环氧-1-苯基-3-(2-苯基-2H-1,2,3-三唑-4-取代基)-4,4a,6,7a,8,8a-六氢吡咯并[3,4-f]吲唑并-5,7(1H,3aH)-二酮的合成。

    步骤1:去甲去氢斑蝥素的合成。

    在100mL的锥形瓶中,加入充分研磨细的4.00g(40mmol)顺丁烯二酸酐至15mL乙醚中;待完全溶解后,加入2.76g(40.5mmol)呋喃;充分搅拌,室温放置24-48小时后,减压过滤,得白色结晶5.51g,产率83.0%,熔点:118-119℃。

    步骤2:N-(4’-苯基)-7-氧杂双环[2,2,1]-5-烯-2,3-甲酰亚胺的合成。

    取步骤1中所制的去甲去氢斑蝥素3.20g(0.02mol)溶于30mL丙酮;搅拌下将含有1.86g(0.02mol)氨基苯的丙酮溶液滴入去甲去氢斑蝥素反应瓶中,反应放热并逐步有大量沉淀生成;室温反应1小时后,一次加入0.2g醋酸锰,14mL三乙胺和120mL醋酐;升温后,沉淀逐步溶解,在50-60℃下反应2-9小时;溶液逐渐澄清,滤去不溶物,将滤液冰冻,倒入100mL冰水混合物中,有白色固体析出,过滤,冰水洗涤2次,甲醇重结晶,真空干燥。得产物3.32g,产率68.8%。m.p.162-163℃;IR(KBr)v:3065,3020(ArH);1775,1708(C=O);1627(C=C);1186(C-O-C);714(=C-H)cm-1。1H NMR(DMSO-d6)δ:7.49(dd,J=7.3,7.3Hz,2H,ArH),7.42(dd,J=7.3,7.3Hz,1H,ArH),7.20(d,J=7.3Hz,2H,ArH),6.61(s,2H,C5-H,C6-H),5.25(s,2H,C1-H,C4-H),3.09(s,2H,C2-H,C3-H)。

    步骤3:目标终产物的合成。

    取步骤2所制的的化合物0.24g(1mmol)和2-苯基-4-((2-苯腙)甲基)-2H-1,2,3-三唑0.29g(1.1mmol)溶于20mL乙醇,加入0.34g(1.2mmol)氯胺T,加热回流3-8小时,TLC跟踪确定反应是否完全。终产物用蒸馏水(30mL)洗净,用二氯甲烷提取2次,每次15mL。真空干燥。甲醇重结晶,得产物0.44g,产率88.3%。m.p.278℃;IR(KBr)v:3473(N-C=O),3064(ArH),1714(C=O),1597(C=N),1189(C-O-C)cm-11H NMR(CDCl3)δ:8.53(s,1H,H-C=N),8.20-6.93(M,15H,Ar-H),5.51(s,1H,C4-H)5.34(s,1H,C1-H)4.65-4.62(d,J=9.60Hz,1H,C5-H),4.21-4.18(d,J=9.60Hz,1H,C6-H),3.41-3.39(d,J=7.20Hz,1H,C3-H),3.30-3.28(d,J=7.20Hz,1H,C2-H).ms(70ev):m/z 502(M+).元素分析C29H22N6O3:C,69.31;H,4.41;N,16.72.Found:C,69.30;H,4.43;N,16.71。

    实施例2~12,步骤同实施例1,区别在于原料选择,具体如表1所示:

    表1:新型吡唑类去甲基斑蝥素衍生物的理化数据

    

    

    二、吡唑并N-取代去甲去氢斑蝥素酰亚胺衍生物的活性测试。

    实验测试对象如表1所示:

    表1:实验测试对象

    

    

    

    实施例1;以cell counting kit-8分析该15种化合物对人肺腺癌细胞A549活性的影响。

    (1)将所培养的A549细胞用胰酶消化后离心,用新培养基悬浮重新后用液体分装仪mutidrop在384孔板的各孔中以50ul体积种植300个A549细胞;

    (2)在37℃,5%CO2条件下培养24h后,用自动化液体处理系统Bravo分装药物进行刺激,各种化合物的处理浓度有:16uM 8uM4uM 2uM 1uM 0.5uM 0.25uM 0.125uM,每种处理有四个重复;

    (3)48h后,用CCK-8试剂盒对细胞的活性进行检测:每孔加入5ul CCK-8溶液,用酶标仪读取各孔波长在450nm处的吸收值;在细胞培养箱内继续孵育100min,用酶标仪再次读取波长在450nm处的吸收值。取两次吸收值的变化值除以未加化合物处理孔的吸收值变化,取每组四个重复的平均值即为孔内细胞活性。化合物对细胞的抑制效率=1-孔内细胞活性,将根据化合物浓度与细胞活性的梯度输入至http://bsmdb.tmd.ac.jp:3000/cbdb/ic50,计算最终得到IC50。

    检测结果如表2所示;S3,S7对A549有一定的抑制效果,在16uM的浓度下对细胞的生长达到56%和30%的抑制效率,S3的IC50为13.2uM,S7的IC50为83.8uM;S15对A549有较高的抑制效果,在8uM和16uM的浓度时抑制效果分别达到66%和50%,其IC50为:6.6uM。

    表2:不同浓度的化合物处理细胞48h后剩余的细胞活力

        S1   S2   S3   S4   S5   S6   S7   16uM   0.814725   0.821256   0.444635   1.03487   1.135457   1.071987   0.700392   8uM   1.014536   1.008232   0.821285   1.049637   1.0416   0.929142   0.938996   4uM   0.983185   1.06111   0.952315   0.928546   1.10987   1.086669   0.901851   2uM   0.843549   0.898898   0.992244   1.031519   1.067982   1.097801   1.047734   1uM   1.135372   1.098312   1.028935   0.986166   1.016553   1.069062   1.0932   0.5uM   0.995765   0.932465   1.058725   0.994771   1.087492   1.03947   0.989631   0.25uM   1.060144   0.849996   0.995254   1.121712   0.915113   0.961772   1.009056   0.125uM   0.942347   0.908468   0.862406   0.983071   0.994402   0.936299   0.908922


       S8   S9   S10   S11   S12   S13   S14   S15   1.093115   0.858203   1.134407   0.974558   0.790413   0.80066   1.006012   0.338643   1.133129   1.032399   1.014451   0.964057   1.127937   0.996833   0.843276   0.503921   1.036034   1.074287   0.962312   0.927975   1.054731   1.028185   0.842717   0.927339


       0.94709   1.05029   1.025924   0.820112   1.128471   0.90626   1.033397   0.939595   1.033507   1.006244   1.033081   0.950631   1.019743   1.147999   1.008962   1.16529   1.097148   1.044099   1.082522   0.911498   0.92917   1.046645   0.949995   1.15789   1.049978   0.969468   0.948425   0.870128   0.897691   1.136989   1.114053   0.954369   0.89265   0.938769   0.953877   0.870306   0.845183   0.86222   0.846429   0.624066


    实施例3:以cell counting kit-8分析该15种化合物对人肺腺癌细胞A549活性的影响。

    实验步骤与实施例1相同。

    实验结果如表2所示:S3对A549有明显的抑制效果,在16uM和8uM浓度下达到68%和59%的抑制效果。S3的IC50为:5.7uM;S7的IC50为:21.1uM;S15对A549有较高的抑制效果,在8uM和16uM的浓度时抑制效果分别达到72%和63%,其IC50为:4.5uM。

    表3:不同浓度的化合物处理细胞48h后剩余的细胞活力

        S1   S2   S3   S4   S5   S6   S7   16uM   0.784299   0.740342   0.329786   0.869817   0.790093   1.032271   0.769966   8uM   0.574491   0.930634   0.412342   0.826993   0.77685   1.23476   0.982258   4uM   0.528399   0.844288   0.938388   1.150375   1.227964   1.015977   1.02517   2uM   0.755721   0.840977   1.073745   1.067123   1.248222   1.152423   0.989098   1uM   0.859449   0.89674   1.227703   1.070346   1.19015   1.240293   1.254931   0.5uM   0.87352   1.212455   1.006219   1.02456   1.316358   1.039546   1.298975   0.25uM   0.747879   1.023383   0.829825   1.048433   0.938214   1.140137   1.187318   0.125uM   0.778374   0.855005   0.960868   0.940305   1.151334   1.118529   0.939565


       S8   S9   S10   S11   S12   S13   S14   S15   1.021772   0.827167   0.870514   1.138345   0.914935   0.800124   0.816095   0.283655   1.098533   0.950456   0.891861   0.910587   1.226626   0.926602   1.163277   0.375396   1.238899   0.92484   0.956032   0.940887   1.073664   1.013952   0.936317   0.84604   1.156344   1.075008   1.043206   1.107868   0.881618   1.147439   1.035202   1.22676   1.197687   1.102323   0.950194   0.882506   1.058403   1.07393   1.185059   1.142825   1.044469   1.021989   1.086335   1.170463   1.384912   1.036932   1.128319   1.179114   0.991538   0.957905   0.916214   1.078411   1.228002   0.966307   1.065634   1.200098   1.069824   1.091432   1.082893   1.022514   0.906728   0.803496   0.915644   1.188075


    

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本发明公开了一种吡唑并N-取代去甲去氢斑蝥素酰亚胺衍生物及其合成方法、活性测试方法与应用,属于斑蝥素衍生物领域,其结构通式如式1所示:式1式中:R1为H、Cl、F、CH3、OCH3、OH或NO2;R2为2-苯基-2H-1,2,3-三唑-4-取代基或喹喔啉-2-取代基。本发明提供的这种新型的N-取代去甲去氢斑蝥素酰亚胺衍生物,它将五元杂环吡唑环引入去甲基斑蝥素取代芳胺结构中,并且具有良好的抗肿瘤活性。

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