一种清热利湿， 活血通淋中药组合物及制备方法和质量检 测方法 技术领域 ：
本发明涉及一种中药组合物及制备方法和质量检测方法， 特别涉及一种清热利 湿， 活血通淋的中药组合物及制备方法和质量检测方法。 背景技术 ：
前列腺疾病是男性泌尿生殖系常见病， 主要包括前列腺炎、 前列腺增生及前列腺 癌。男性的大多数一生都要不同程度的受到前列腺疾病的困扰， 其中尤以慢性前列腺炎为 多见。在 20-65 岁的男性中均有发现， 22-40 岁男子发病率高， 发病趋势呈年轻化发展。
现有治疗前列腺疾病的药物有些属于治标不治本， 有些使用价格昂贵的物质， 有 些在应用过程中由于疗效不确切而中断使用。本发明的目的是提供一种疗效确切、 安全方 便、 副作用小、 价格低廉的纯中药治疗前列腺疾病的药物组合物及其制备方法。 发明内容 ：
本发明第一个目的在于提供一种清热利湿， 活血通淋的中药组合物 ； 本发明的第 二个目的在于提供该中药组合物制剂的制备方法。 本发明的第三个目的在于提供该中药组 合物制剂的质量检测方法。
本发明目的是通过如下技术方案实现的 ：
本发明一种清热利湿， 活血通淋的本发明组合物制剂的原料组成为 ：
金 钱 草 300-500 重 量 份、 绵 萆 薢 300-500 重 量 份、 瞿 麦 150-300 重 量 份、 黄柏 150-350 重量份、 三七 30-60 重量份、 川楝子 150-350 重量份、 桃仁 150-300 重量份、 乌药 150-300 重量份、 牛膝 150-350 重量份。
本发明一种清热利湿， 活血通淋的本发明组合物制剂的原料组成优选为 ：
金钱草 420 重量份、 绵萆薢 420 重量份、 瞿麦 210 重量份、 黄柏 250 重量份、 三七 42 重量份、 川楝子 250 重量份、 桃仁 210 重量份、 乌药 210 重量份、 牛膝 250 重量份。
本发明一种清热利湿， 活血通淋的本发明组合物制剂的制备方法为 ：
三七粉碎成细粉。金钱草、 绵萆薢和黄柏加 50-90 ％乙醇回流提取 1-5 次， 每次 0.5-3.0 小时， 滤过， 合并滤液， 放置过夜， 滤过， 滤液备用。其余瞿麦等五味， 加水煎煮 1-5 次， 每次 0.5-2 小时， 合并煎液， 滤过， 滤液浓缩至相对密度为 1.10 ～ 1.30(50℃ )， 放冷， 加 乙醇使含醇量达 50-90％， 冷藏过夜， 滤过， 滤液与上述金钱草等醇提液合并， 干燥， 粉碎成 细粉， 加入上述三七细粉， 按照常规工艺， 制成临床或药学上可接受的剂型， 包括但不限于 片剂、 胶囊剂、 散剂、 软胶囊剂、 滴丸、 蜜丸、 丸剂、 颗粒剂、 蜜炼膏剂、 缓释制剂、 速释制剂、 控 释制剂、 口服液体制剂、 注射制剂或外用制剂。
本发明一种清热利湿， 活血通淋的中药组合物颗粒剂的制备方法优选为 ：
三七粉碎成细粉。金钱草、 绵萆薢和黄柏加 70％乙醇回流提取 2 次， 每次 1.5 小 时， 滤过， 合并滤液， 放置过夜， 滤过， 滤液备用。其余瞿麦等五味， 加水煎煮三次， 每次 1 小时， 合并煎液， 滤过， 滤液浓缩至相对密度为 1.15 ～ 1.20(50℃ )， 放冷， 加乙醇使含醇量达 70％， 冷藏过夜， 滤过， 滤液与上述金钱草等醇提液合并， 回收乙醇并浓缩至稠膏状， 干燥， 粉碎成细粉， 加入上述三七细粉及糊精适量， 甜菊素 15g， 混匀， 用乙醇适量制成颗粒， 干燥， 制成 1000g， 即得。
本发明一种清热利湿， 活血通淋的中药组合物胶囊剂的制备方法优选为 ：
三七粉碎成细粉。金钱草、 绵萆薢和黄柏加 70％乙醇回流提取 2 次， 每次 1.5 小 时， 滤过， 合并滤液， 放置过夜， 滤过， 滤液备用。其余瞿麦等五味， 加水煎煮三次， 每次 1 小 时， 合并煎液， 滤过， 滤液浓缩至相对密度为 1.15 ～ 1.20(50℃ )， 放冷， 加乙醇使含醇量达 70％， 冷藏过夜， 滤过， 滤液与上述金钱草等醇提液合并， 回收乙醇并浓缩至稠膏状， 干燥， 粉碎成细粉， 加入上述三七细粉及糊精适量， 甜菊素 15g， 混匀， 用乙醇适量制成颗粒， 装胶 囊， 即得。
本发明提供该中药组合物制剂的质量控制方法， 该方法包括步骤 ：
A、 鉴别 ： 取本发明组合物制剂 2-10g， 加乙醇 10-30ml， 置水浴上回流 15-60 分钟， 取上清液 2-15ml， 加盐酸 0.5-2ml， 加热回流 0.5-2 小时后浓缩至约 1-10ml， 加水 5-20ml， 用环己烷 5-30ml 振摇提取， 提取液蒸干， 残渣加三氯甲烷 1-3ml 使溶解， 作为供试品溶液。 另取绵萆薢对照药材 1-5g， 同法制成对照药材溶液。再取薯蓣皂苷元对照品， 加甲醇制成 每 1ml 含 1-10mg 的溶液， 作为对照品溶液。吸取供试品溶液、 对照药材及对照品溶液各 2-10μl， 分别点于同一硅胶 G 薄层板上， 以 (14-5 ∶ 2) 比例的环己烷 - 乙酸乙酯混合溶液 为展开剂， 展开， 取出， 晾干， 喷以磷钼酸试液， 在 105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱 中， 在与对照药材、 对照品色谱相应的位置上， 显相同颜色的斑点。 B 鉴别 ： 取本发明组合物制剂 2-4g， 加甲醇 10-30ml， 超声处理 5-45 分钟， 滤过， 滤 液浓缩至 1-4ml， 作为供试品溶液。另取黄柏对照药材 0.05-1g， 同法制成对照药材溶液。 再取盐酸小檗碱对照品， 加甲醇制成每 1ml 含 0.1-1mg 的溶液， 作为对照品溶液。吸取上述 三种溶液各 2μl， 分别点于同一硅胶 G 薄层板上， 以 (20-5 ∶ 4-8 ∶ 1 ∶ 1) 比例的乙酸乙 酯 - 丁酮 - 甲酸 - 水混合溶剂为展开剂， 展开， 取出， 晾干， 置紫外光灯 (365nm) 下检视。供 试品色谱中， 在与对照药材色谱相应的位置上， 显相同颜色的荧光斑点 ； 在与对照品色谱相 应的位置上， 显相同颜色的黄色荧光斑点。
C 鉴别 ： 取本发明组合物制剂 0.5-5g， 加甲醇 5-50ml， 超声处理 5-60 分钟， 静置， 取上清液 5-20ml， 蒸干， 残渣加水 10-50ml 使溶解， 加 10％氢氧化钠溶液 1-10ml， 摇匀， 用水 饱和正丁醇振摇提取 1-3 次， 每次 10-50ml， 合并正丁醇液， 加水洗涤 1-3 次， 每次 20-50ml， 弃去水液， 正丁醇液蒸干， 残渣加水 1-5ml 使溶解， 通过 D101 型大孔吸附树脂柱， 40 ～ 60 目， 湿法装柱， 内径 1cm， 长 25cm， 小玻璃柱内， 待树脂沉淀， 覆以脱脂棉少许， 再添加棉花 少许轻压， 用水冲洗并用水浸没备用。先用水 20-100ml 洗脱， 弃去水液， 再用 70 ％乙醇 10-50ml 洗脱， 收集洗脱液， 蒸干， 残渣加甲醇 0.5-2ml 使溶解， 作为供试品溶液。另取三七 对照药材 0.1-2g， 同法制成对照药材溶液。再取人参皂苷 Rg1 及三七皂苷 R1 对照品， 加甲 醇制成每 1ml 含 0.1-2mg 的溶液， 作为对照品溶液。吸取上述三种溶液各 1-10μl， 分别点 于同一硅胶 G 薄层板上， 以 (10-1 ∶ 1 ∶ 4-7) 比例的正丁醇 - 乙酸乙酯 - 水混合溶液的 上层溶液为展开剂， 展开， 取出， 晾干， 喷以 10％硫酸乙醇溶液， 在 105℃加热至斑点显色清 晰。供试品色谱中， 在与对照药材、 对照品色谱相应的位置上， 显相同颜色的斑点。
D 含量测定 ： 色谱条件与系统适用性试验， 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 ； 以 (30-60 ∶ 40-70) 比例的甲醇 -0.4％磷酸溶液混合溶剂为流动相 ； 检测波长为 330-380nm。 对照品溶液的制备 ： 精密称取槲皮素对照品及山奈素对照品适量， 加甲醇制成每 1ml 各含 槲皮素 5-25μg， 山奈素 10-30μg 的溶液， 即得。供试品溶液的制备 ： 取本发明组合物制 剂约 1-10g， 精密称定， 置具塞锥形瓶中， 精密加入 2％盐酸甲醇溶液 25-75ml， 密塞， 称定重 量， 加热回流 0.5-2 小时， 放冷， 再称定重量， 用 2 ％盐酸甲醇溶液补足减失的重量， 摇匀， 滤过， 取续滤液， 即得。测定法 ： 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 5-20μl， 注入 液相色谱仪， 测定， 即得。本发明组合物制剂每 1g 含金钱草以槲皮素 (C15H11O7) 和山奈素 (C15H10O6) 的总量计， 不得少于 0.20mg。
上述质量控制方法中优选包括如下鉴别法 ：
绵萆薢薄层鉴别 ： 取本发明组合物制剂 5g， 加乙醇 20ml， 置水浴上回流 40 分钟， 取上清液 10ml， 加盐酸 1ml， 加热回流 1 小时后浓缩至约 5ml， 加水 10ml， 用环己烷 20ml 振 摇提取， 提取液蒸干， 残渣加三氯甲烷 2ml 使溶解， 作为供试品溶液。另取绵萆薢对照药材 2g， 同法制成对照药材溶液。再取薯蓣皂苷元对照品， 加甲醇制成每 1ml 含 5mg 的溶液， 作 为对照品溶液。吸取供试品溶液 5μl、 对照药材及对照品溶液各 2μl， 分别点于同一硅胶 G 薄层板上， 以环己烷 - 乙酸乙酯 (8 ∶ 2) 为展开剂， 展开， 取出， 晾干， 喷以磷钼酸试液， 在 105℃加热至斑点显色清晰。 供试品色谱中， 在与对照药材、 对照品色谱相应的位置上， 显相 同颜色的斑点。 黄柏薄层鉴别 ： 取本发明组合物制剂 2g， 加甲醇 20ml， 超声处理 15 分钟， 滤过， 滤 液浓缩至 2ml， 作为供试品溶液。另取黄柏对照药材 0.1g， 同法制成对照药材溶液。再取盐 酸小檗碱对照品， 加甲醇制成每 1ml 含 0.5mg 的溶液， 作为对照品溶液。吸取上述三种溶液 各 2μl， 分别点于同一硅胶 G 薄层板上， 以乙酸乙酯 - 丁酮 - 甲酸 - 水 (10 ∶ 6 ∶ 1 ∶ 1) 为展开剂， 展开， 取出， 晾干， 置紫外光灯 (365nm) 下检视。供试品色谱中， 在与对照药材色 谱相应的位置上， 显相同颜色的荧光斑点 ； 在与对照品色谱相应的位置上， 显相同颜色的黄 色荧光斑点。
三七薄层鉴别 ： 取本发明组合物制剂 2g， 加甲醇 20ml， 超声处理 30 分钟， 静置， 取 上清液 10ml， 蒸干， 残渣加水 25ml 使溶解， 加 10％氢氧化钠溶液 5ml， 摇匀， 用水饱和正丁 醇振摇提取 2 次， 每次 30ml， 合并正丁醇液， 加水洗涤 2 次， 每次 40ml， 弃去水液， 正丁醇液 蒸干， 残渣加水 3ml 使溶解， 通过 D101 型大孔吸附树脂柱， 40 ～ 60 目， 湿法装柱， 内径 1cm， 长 25cm， 小玻璃柱内， 待树脂沉淀， 覆以脱脂棉少许， 再添加棉花少许轻压， 用水冲洗并用水 浸没备用。先用水 50ml 洗脱， 弃去水液， 再用 70％乙醇 25ml 洗脱， 收集洗脱液， 蒸干， 残渣 加甲醇 1ml 使溶解， 作为供试品溶液。另取三七对照药材 0.5g， 同法制成对照药材溶液。再 取人参皂苷 Rg1 及三七皂苷 R1 对照品， 加甲醇制成每 1ml 含 0.5mg 的溶液， 作为对照品溶 液。吸取上述三种溶液各 5μl， 分别点于同一硅胶 G 薄层板上， 以正丁醇 - 乙酸乙酯 - 水 (4 ∶ 1 ∶ 5) 的上层溶液为展开剂， 展开， 取出， 晾干， 喷以 10％硫酸乙醇溶液， 在 105℃加热 至斑点显色清晰。供试品色谱中， 在与对照药材、 对照品色谱相应的位置上， 显相同颜色的 斑点。
含量测定 ： 色谱条件与系统适用性试验， 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 ； 以 甲醇 -0.4％磷酸溶液 (48 ∶ 52) 为流动相 ； 检测波长为 360nm。 对照品溶液的制备 ： 精密称
取槲皮素对照品及山奈素对照品适量， 加甲醇制成每 1ml 各含槲皮素 15μg， 山奈素 20μg 的溶液， 即得。供试品溶液的制备 ： 取本发明组合物制剂约 5g， 精密称定， 置具塞锥形瓶中， 精密加入 2％盐酸甲醇溶液 50ml， 密塞， 称定重量， 加热回流 1 小时， 放冷， 再称定重量， 用 2％盐酸甲醇溶液补足减失的重量， 摇匀， 滤过， 取续滤液， 即得。 测定法 ： 分别精密吸取对照 品溶液与供试品溶液各 10μl， 注入液相色谱仪， 测定， 即得。
上述质量控制方法本发明组合物制剂为 ： 金钱草 420g、 绵萆薢 420g、 瞿麦 210g、 黄 柏 250g、 三七 42g、 川楝子 250g、 桃仁 210g、 乌药 210g、 牛膝 250g 的颗粒剂， 并通过如下方法 制备 ： 以上九味， 三七粉碎成细粉。金钱草、 绵萆薢和黄柏加 70％乙醇回流提取 2 次， 每次 1.5 小时， 滤过， 合并滤液， 放置过夜， 滤过， 滤液备用。其余瞿麦等五味， 加水煎煮三次， 每 次 1 小时， 合并煎液， 滤过， 滤液浓缩至相对密度为 1.15 ～ 1.20(50℃ )， 放冷， 加乙醇使含 醇量达 70％， 冷藏过夜， 滤过， 滤液与上述金钱草等醇提液合并， 回收乙醇并浓缩至稠膏状， 干燥， 粉碎成细粉， 加入上述三七细粉及糊精适量， 甜菊素 15g， 混匀， 用乙醇适量制成颗粒， 干燥， 制成 1000g， 即得。
本发明中药组合物具有很好的清热利湿， 活血通淋的作用， 本发明组合物制剂均 表现显著的抗炎、 消肿效应。 本发明中药组合物制剂的质量检测方法， 经实验证明 ： 本发明含量测定方法检测 专属性好、 稳定性高、 重现性好、 精密度高， 更加适合工业化的生产， 真正确保了临床用药的 安全、 有效、 可靠。
下面实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。
本发明所有实验例所选用的制剂均为根据本发明实施例 1 制得的本发明颗粒剂， 但是本发明实验结果并不仅限于该颗粒剂。
实验例 1 ： 本发明组合物制剂治疗前列腺炎的药效学研究
1、 实验材料 ： 本发明组合物制剂 ； 醋酸泼尼松片 (5mg/ 片 )， 使用时用 0.5％缩甲 基纤维素钠配成所需浓度的混悬液备用 ； 前列舒乐颗粒 (4g/ 袋 ) ； 0.9％ NaCl 注射液。试 剂： 二甲苯 ( 分析纯 ) ； 角叉菜胶 ； 伊文思兰 ； 冰醋酸。
动物 ： 昆明种小鼠 ( 二级 )， 雄性， 体质量 18 ～ 22g ； SD 大鼠 ( 二级 )， 体质量 180 ～ 200g ；
仪器 ： 722 光栅分光光度计， 上海第三分析仪器厂生产。FA2004 电子天平， 上海精 科天平 ； 大鼠足容积测量装置 ( 自制 )。
2、 实验方法 ：
2.1 对角叉菜胶致大鼠非细菌性前列腺炎的影响
将大鼠随机分为正常对照组、 模型对照组、 本发明组合物制剂小剂量组 (1.5g/kg， 相当于人临床用量的 3.5 倍 )、 本发明组合物制剂中剂量组 (3.0g/kg， 相当于人临床用量的 7 倍 )、 本发明组合物制剂大剂量组 (6.0g/kg， 相当于人临床用量的 14 倍 ) 及阳性药前列舒 乐颗粒组 (2.4g/kg， 相当于人临床用量的 14 倍 )， 每组 10 只， 各给药组大鼠连续灌胃给药 7d， 每日 1 次， 模型对照组给予等容量蒸馏水。末次给药后 30min， 将大鼠用乙醚麻醉， 无菌 条件下剖开腹腔， 在每鼠前列腺内注入灭菌的 1.5％角叉菜胶 0.05mL， 缝合切口， 24h 后断 头处死大鼠， 取致炎前列腺组织 50mg 加入 200μL 白细胞稀释液和 200μL 生理盐水中， 充 分混匀， 镜下记录白细胞数和卵磷脂小体密度。
2.2 对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响
将小鼠随机分为模型对照组、 本发明组合物制剂小剂量组 (2.0g/kg， 相当于人临 床用量的 4.5 倍 )、 本发明组合物制剂中剂量组 (4.0g/kg， 相当于人临床用量的 9 倍 )、 本 发明组合物制剂大剂量组 (8.0g/kg， 相当于人临床用量的 18 倍 ) 及阳性药醋酸泼尼松组 (8.0mg/kg， 相当于人临床用量的 9 倍 )， 每组 10 只， 给药组连续灌胃给药 7d， 每日 1 次， 容 量为 0.2mL/10g， 模型对照组给予等量蒸馏水。末次给药后 30min， 分别在小鼠右耳两面涂 以二甲苯 0.05mL/ 只， 左耳作对照， 15min 后处死动物， 用直径 6mm 的打孔器将双耳同部位切 下， 用 FA2004 电子天平称质量， 以左、 右耳片质量之差为肿胀度， 计算各组肿胀度。
2.3 对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响
将小鼠随机分为模型对照组、 本发明组合物制剂小剂量组 (2.0g/kg， 相当于人临 床用量的 4.5 倍 )、 本发明组合物制剂中剂量组 (4.0g/kg， 相当于人临床用量的 9 倍 )、 本 发明组合物制剂大剂量组 (8.0g/kg， 相当于人临床用量的 18 倍 ) 及阳性药醋酸泼尼松组 (8.0mg/kg， 相当于人临床用量的 9 倍 )， 每组 10 只， 给药组连续灌胃给药 7d， 每日 1 次， 容 量为 0.2mL/10g， 模型对照组给予等量蒸馏水。末次给药后 30min， 分别尾静脉注射 0.5％ 伊文思兰生理盐水 0.1mL/10g， 同时腹腔注射 0.6％醋酸 0.2mL/ 只。20min 后处死动物， 剪 开腹部皮肤肌肉， 用 6mL 生理盐水分 3 次洗涤腹腔， 吸管吸出洗涤液， 合并后加生理盐水至 10mL， 300r/min 离心 15min。取上清液于 590nm 处测吸光度 (OD， 表示渗入腹腔的染料量 )。
2.4 对角叉菜胶至大鼠足跖肿胀的影响
将大鼠随机分为模型对照组、 本发明组合物制剂小剂量组 (1.5g/kg， 相当于人临 床用量的 3.5 倍 )、 本发明组合物制剂中剂量组 (3.0g/kg， 相当于人临床用量的 7 倍 )、 本 发明组合物制剂大剂量组 (6.0g/kg， 相当于人临床用量的 14 倍 ) 及阳性药醋酸泼尼松组 (6.0mg/kg， 相当于人临床用量的 7 倍 )， 每组 10 只， 各给药组大鼠连续灌胃给药 7d， 每日 1 次， 模型对照组给予等容量蒸馏水， 末次给药后 30min， 在每鼠右后肢踝部皮下注入 1％角 叉菜胶 0.1mL 致炎， 于致炎前后不同时间点测量右后足跖容积， 计算肿胀度 ( 致炎后容积与 致炎前容积之差 )。
统计学处理 ： 采用 SPSS 10.0 统计软件处理， 组间比较采用 t 检验。
3 结果
3.1 对角叉菜胶致大鼠细菌性前列腺炎的影响 ：
模型对照组大鼠前列腺内白细胞数明显较正常对照组大鼠增多 (P ＜ 0.01)， 卵 磷脂小体明显较正常对照组大鼠减少 (P ＜ 0.01) ； 本发明组合物制剂 (1.5g/kg、 3.0g/kg、 6.0g/kg) 组大鼠前列腺内白细胞数明显较模型对照组大鼠减少 (P ＜ 0.01)， 卵磷脂小体明 显较模型对照组大鼠增多 (P ＜ 0.01)。见表 1。
表 1 各组大鼠前列腺内白细胞数及卵磷脂小体密度比较
** 与模型对照组比较 *p ＜ 0.05， p ＜ 0.01。
3.2 对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响 ：
模 型 对 照 组 小 鼠 耳 肿 胀 度 为 (9.8±1.23)mg， 本发明组合物制剂小剂量组为 (7.5±2.23)mg， 本发明组合物制剂中剂量组为 (6.8±2.14)mg， 本发明组合物制剂大剂量 组为 (6.7±2.16)mg， 醋酸泼尼松组为 (5.7±2.45)mg。各给药组与模型对照组均有显著性 差异 (P ＜ 0.05 或 0.01)。
3.3 对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响 ：
模 型 对 照 组 吸 光 度 为 0.434±0.0656， 本发明组合物制剂小剂量组为 0.367±0.0565， 本发明组合物制剂中剂量组为 0.365±0.0334， 本发明组合物制剂大剂量 组为 0.312±0.0465， 醋酸泼尼松组为 0.243±0.0454。各给药组小鼠吸光度均明显低于模 型对照组 (P ＜ 0.01)。
3.4 对 1％角叉菜胶致大鼠足跖肿胀的影响 ：
本发明组合物制剂 (1.5g/kg、 3.0g/kg、 6.0g/kg) 组大鼠足跖肿胀在致炎后 1h、 2h、 4h、 6h 均较对照组大鼠轻， 见表 2。
表 2 各组大鼠致炎后不同时间的肿胀度 (mL)
与模型对照组比较 *p ＜ 0.05。本实验证明 ： 本发明组合物制剂 (1.5g/kg、 3.0g/kg、 6.0g/kg) 可明显减少 1.5％ 角叉菜胶致非细菌性前列腺炎大鼠前列腺组织内白细胞数， 增加前列腺组织内卵磷脂小体 密度， 并可明显抑制棉球肉芽肿形成。本发明组合物制剂 (2.0g/kg、 4.0g/kg、 8.0g/kg) 对 二甲苯致小鼠耳肿胀均有明显抑制作用 ； 可明显抑制 0.6％醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通 透性的增加。
实验例 2 ： 绵萆薢薄层鉴别试验
本发明组合物制剂处方中含有绵萆薢， 主要有效成分为薯蓣皂苷类成分。本发明 利用薄层色谱鉴别制剂水解后的薯蓣皂苷元， 来鉴定制剂中的绵萆薢药材。
1、 薄层色谱方法的选择 ：
绵萆薢中的薯蓣皂苷元极性较弱， 故选择硅胶层析进行实验。
2、 供试品的制备 ：
2.1 供试品制备方法的选择 ：
通过实验确定是否需要将供试品水解后鉴别。
方法 1 ： 取本发明组合物制剂 5g， 加乙醇 20ml， 置水浴上回流 40 分钟， 取上清液 10ml， 加盐酸 1ml， 加热回流 1 小时后浓缩至约 5ml， 加水 10ml， 用环己烷 20ml 振摇提取， 提 取液蒸干， 残渣加三氯甲烷 2ml 使溶解， 作为供试品溶液 1。 取绵萆薢对照药材 2g， 同法制成对照药材溶液 1。
方法 2 ： 取本发明组合物制剂 5g， 加乙醇 20ml， 置水浴上回流 40 分钟， 取上清液 10ml， 减压浓缩至干， 加 2ml 乙醇溶解， 作为供试品溶液 2。
取绵萆薢对照药材 2g， 同法制成对照药材溶液 2。
取薯蓣皂苷元对照品， 加甲醇制成每 1ml 含 5mg 的溶液， 作为对照品溶液。
吸取供试品溶液 5μl、 对照药材及对照品溶液各 2μl， 分别点于同一硅胶 G 薄层 板上， 以环己烷 - 乙酸乙酯 (8 ∶ 2) 为展开剂， 展开， 取出， 晾干， 喷以磷钼酸试液， 在 105℃ 加热至斑点显色清晰。
实验结果如下 ：
在对照药材溶液 1 中没有观察到明显色谱斑点 ； 在对照药材溶液 2 中在薯蓣皂苷 元色谱相应位置上观察到明显色谱斑点， 且供试品溶液色谱中在其位置上也有明显色谱斑 点。
所以选择将供试品水解后鉴别其中的薯蓣皂苷元。
2.2 供试品溶液提取条件的优化 ：
采用 L93(4) 正交实验设计， 对供试品溶液提取条件进行优化。
精密称取本发明组合物制剂九份， 各 5g， 分别按照表格中条件进行提取。 样品提取 后均将体积调整至 20ml， 取上清液 10ml， 加盐酸 1ml， 加热回流 1 小时后浓缩至约 5ml， 加水 10ml， 用环己烷 20ml 振摇提取， 提取液蒸干， 残渣加三氯甲烷 2ml 使溶解， 作为供试品溶液 1-9
取薯蓣皂苷元对照品， 加甲醇制成每 1ml 含 5mg 的溶液， 作为对照品溶液。
吸取供试品溶液 5μl、 对照品溶液各 2μl， 分别点于同一硅胶 G 薄层板上， 以环己 烷 - 乙酸乙酯 (8 ∶ 2) 为展开剂， 展开， 取出， 晾干， 喷以磷钼酸试液， 在 105℃加热至斑点显 色清晰。
综合考虑确定供试品溶液最优提取方法为 ： 取本发明组合物制剂 5g， 加乙醇 20ml， 置水浴上回流 40 分钟。
2.3 供试品溶液水解条件的优化 ：
采用 L93(4) 正交实验设计， 对供试品溶液水解条件进行优化。
精密称取本发明组合物制剂九份， 各 5g， 加乙醇 20ml， 置水浴上回流 40 分钟， 取上 清液 10ml， 分别按照表格中实验条件进行水解， 样品水解浓缩后， 加水 10ml， 用环己烷 20ml 振摇提取， 提取液蒸干， 残渣加三氯甲烷 2ml 使溶解， 作为供试品溶液 1-9。
取薯蓣皂苷元对照品， 加甲醇制成每 1ml 含 5mg 的溶液， 作为对照品溶液。
吸取供试品溶液 5μl、 对照品溶液各 2μl， 分别点于同一硅胶 G 薄层板上， 以环己 烷 - 乙酸乙酯 (8 ∶ 2) 为展开剂， 展开， 取出， 晾干， 喷以磷钼酸试液， 在 105℃加热至斑点显 色清晰。
综合考虑确定供试品溶液提取方法为 ： 取本发明组合物制剂 5g， 加乙醇 20ml， 置 水浴上回流 40 分钟， 取上清液 10ml， 加盐酸 1ml， 加热回流 1 小时后浓缩至约 5ml。
2.4 供试品溶液萃取条件的优化 ：
采用 L93(4) 正交实验设计， 对供试品溶液水解条件进行优化。
精密称取本发明组合物制剂九份， 各 5g， 加乙醇 20ml， 置水浴上回流 40 分钟， 取上 清液 10ml， 加盐酸 1ml， 加热回流 1 小时后浓缩至约 5ml， 加水 10ml， 按表格中实验方法进行
萃取， 作为供试品溶液 1-9。
取薯蓣皂苷元对照品， 加甲醇制成每 1ml 含 5mg 的溶液， 作为对照品溶液。
吸取供试品溶液 5μl、 对照品溶液各 2μl， 分别点于同一硅胶 G 薄层板上， 以环己 烷 - 乙酸乙酯 (8 ∶ 2) 为展开剂， 展开， 取出， 晾干， 喷以磷钼酸试液， 在 105℃加热至斑点显 色清晰。
综合考虑确定供试品溶液提取方法为 ： 取本发明组合物制剂 5g， 加乙醇 20ml， 置 水浴上回流 40 分钟， 取上清液 10ml， 加盐酸 1ml， 加热回流 1 小时后浓缩至约 5ml， 加水 10ml， 用环己烷 20ml 振摇提取， 提取液蒸干， 残渣加三氯甲烷 2ml 使溶解， 作为供试品溶液。
3、 对照药材溶液的制备方法 ：
对照品溶液的制备方法同供试品溶液制备方法。
4、 供试品溶液、 对照药材溶液、 对照品溶液点样量的确定 ：
分别吸取供试品溶液 2、 5、 10ul， 对照药材、 对照品溶液 1、 2、 5ul 分别点于同一硅 胶 G 薄层板上， 以环己烷 - 乙酸乙酯 (8 ∶ 2) 为展开剂， 展开， 取出， 晾干， 喷以磷钼酸试液， 在 105℃加热至斑点显色清晰。
实验结果如下 ：
对照药材及对照品溶液点样量为 1μl 时， 斑点强度较低， 不宜观察 ； 点样量为 2μl 时， 四季红对照药材溶液薄层上荧光斑点清晰， 大小适中 ； 点样量为 5μl 时， 斑点太 大， 拖尾。
确定对照药材及对照品溶液的最佳点样量为 2μl。
供试品溶液点样量为 2μl 时， 在对照药材及对照品溶液相对应的位置上斑点强 度较低， 不宜观察 ； 点样量为 5μl 时， 在对照药材及对照品溶液相对应的位置上斑点明显， 斑点大小适中， 前后无干扰 ； 点样量为 10μl 时， 在对照药材及对照品溶液相对应的位置上 荧光斑点较大， 明显拖尾， 与前后荧光斑点相连。
确定供试品的最佳点样量为 5μl。
5、 展开剂条件的优选
薯蓣皂苷元极性较小， 因此选择环己烷和极性稍大的醋酸乙酯为展开剂， 通过实 验选择合适的比例， 使所需成分得到分离。
取缺绵萆薢的绵萆薢阴性制剂按供试品制备方法制备缺绵萆薢阴性对照溶液。
精密吸取供试品溶液、 缺绵萆薢阴性对照溶液 5μl， 对照药材及对照品溶液 2μl 点于同一硅胶 G 薄层板上， 反复五块薄层板。分别用以下展开剂展开， 取出， 晾干， 喷以磷钼 酸试液， 在 105℃加热至斑点显色清晰。试验结果如下 ：
方法 1 ： 展开剂为环己烷 - 乙酸乙酯 (20 ∶ 2)， 展开剂极性较小， 薯蓣皂苷元斑点 Rf 值接近 0.2， 供试品色谱中薯蓣皂苷元斑点与前后斑点未分开 ；
方法 2 ： 展开剂为环己烷 - 乙酸乙酯 (8 ∶ 2)， 极性适宜， 对照药材斑点 Rf 值接近 0.5， 供试品色谱中， 在与薯蓣皂苷元对照品溶液相对应的斑点， 分离良好， 前后无干扰 ；
方法 3 ： 展开剂为环己烷 - 乙酸乙酯 (2 ∶ 2)， 极性偏高， 供试品色谱中薯蓣皂苷元 斑点 Rf 值接近 0.85， 供试品色谱中薯蓣皂苷元斑点与前后斑点未分开 ；
确定分离本发明组合物制剂中薯蓣皂苷元的最优薄层展开剂为环己烷 - 乙酸乙 酯 (8 ∶ 2)。6、 显色剂的选择
薯蓣皂苷元薄层色谱斑点在日光下没有颜色， 需显色后观察。常用的显色剂为磷 钼酸试液、 10％的硫酸乙醇溶液以及碘蒸气。
按上述方法制备供试品溶液、 对照药材溶液。取三块硅胶薄层分别点样、 展开、 晾 干。
方法一 ： 喷以磷钼酸试液， 在 105℃加热至斑点显色清晰 ；
方法二 ： 喷以 10％的硫酸乙醇溶液， 105℃加热至斑点显色清晰 ；
方法三 ： 碘蒸气显色。
实验结果如下 ：
方法一 ： 薄层喷以磷钼酸试液， 在 105℃加热至斑点显色清晰后观察， 在薯蓣皂苷 元对照品相对应的位置上， 供试品溶液有明显相同颜色的斑点， 斑点清晰， 前后无干扰 ； 方 法二 ： 薄层在喷以 10％的硫酸乙醇溶液， 105℃加热至斑点显色清晰。在薯蓣皂苷元对照品 相对应的位置上， 供试品溶液色谱中斑点有干扰 ； 方法三， 碘蒸气熏后斑点较多。在四季红 对照药材相对应的位置上， 供试品溶液色谱中斑点供试品溶液与对照药材溶液色谱中没有 观察到颜色及 Rf 值一致的斑点。
确定最佳显色条件为喷以磷钼酸试液， 在 105℃加热至斑点显色清晰。
最后确定本发明组合物制剂中绵萆薢的薄层色谱鉴别条件为 ：
取本发明组合物制剂 5g， 加乙醇 20ml， 置水浴上回流 40 分钟， 取上清液 10ml， 加 盐酸 1ml， 加热回流 1 小时后浓缩至约 5ml， 加水 10ml， 用环己烷 20ml 振摇提取， 提取液蒸 干， 残渣加三氯甲烷 2ml 使溶解， 作为供试品溶液。另取绵萆薢对照药材 2g， 同法制成对照 药材溶液。再取薯蓣皂苷元对照品， 加甲醇制成每 1ml 含 5mg 的溶液， 作为对照品溶液。吸 取供试品溶液 5μl、 对照药材及对照品溶液各 2μl， 分别点于同一硅胶 G 薄层板上， 以环己 烷 - 乙酸乙酯 (8 ∶ 2) 为展开剂， 展开， 取出， 晾干， 喷以磷钼酸试液， 在 105℃加热至斑点显 色清晰。
实验例 3 ： 黄柏薄层鉴别试验
本发明组合物制剂中所含黄柏药材中的有效成分为以小檗碱类为代表的生物碱 类成分。本发明利用薄层色谱鉴别制剂中的盐酸小檗碱， 鉴定制剂中的黄柏药材。
1、 供试品溶液提取条件的优化 ：
采用 L93(4) 正交实验设计， 对提取供试品中的盐酸小檗碱实验条件进行优化。
精密称取本发明组合物制剂九份， 各 2g， 分别按照表中实验条件进行实验， 提取液 浓缩至 2ml， 作为供试品溶液 1-9
盐酸小檗碱对照品， 加甲醇制成每 1ml 含 0.5mg 的溶液， 作为对照品溶液。
吸取供试品溶液、 对照品溶液各 2μl， 分别点于同一硅胶 G 薄层板上， 以乙酸乙 酯 - 丁酮 - 甲酸 - 水 (10 ∶ 6 ∶ 1 ∶ 1) 为展开剂， 展开， 取出， 晾干， 置紫外光灯 (365nm) 下检视。
综合考虑， 确定供试品溶液提取方法为 ： 取本发明组合物制剂 2g， 加甲醇 20ml， 超 声处理 15 分钟， 滤过， 滤液浓缩至 2ml， 作为供试品溶液。
2、 供试品溶液点样量的考察 ：
分别吸取供试品溶液 1、 2、 5μl 点于同一硅胶 G 板上， 展开、 检识。
试验结果如下 ：
供试品溶液点样量为 1μl 时， 斑点强度较低， 不宜观察 ； 供试品溶液点样量为 2μl 时， 薄层上荧光斑点清晰， 大小适中， 无拖尾， 前后无干扰 ； 供试品溶液点样量为 5μl 时， 供试品溶液薄层上荧光斑点较大， 与前后荧光斑点相连。
确定供试品溶液的最佳点样量为 2μl。
最后确定本发明组合物制剂中黄柏的薄层色谱鉴别条件为 ：
取本制剂组合物 2g， 加甲醇 20ml， 超声处理 15 分钟， 滤过， 滤液浓缩至 2ml， 作为供 试品溶液。 另取黄柏对照药材 0.1g， 同法制成对照药材溶液。 再取盐酸小檗碱对照品， 加甲 醇制成每 1ml 含 0.5mg 的溶液， 作为对照品溶液。 吸取上述三种溶液各 2μl， 分别点于同一 硅胶 G 薄层板上， 以乙酸乙酯 - 丁酮 - 甲酸 - 水 (10 ∶ 6 ∶ 1 ∶ 1) 为展开剂， 展开， 取出， 晾干， 置紫外光灯 (365nm) 下检视。供试品色谱中， 在与对照药材色谱相应的位置上， 显相 同颜色的荧光斑点 ； 在与对照品色谱相应的位置上， 显相同颜色的黄色荧光斑点。 实验例 4 ： 三七薄层鉴别试验
本发明组合物制剂中所含三七药材中的有效成分为皂苷类成分。 本发明利用薄层 色谱鉴别制剂中的人参皂苷 Rg1 及三七皂苷 R1， 鉴定制剂中的三七药材。
1、 供试品溶液的提取、 纯化方法 ：
1.1 供试品溶液提取条件的优化 ：
采用 L93(4) 正交实验设计， 对制剂中的人参皂苷 Rg1 及三七皂苷 R1 提取实验条件进 行优化。
精密称取本发明组合物制剂九份， 各 2g， 分别按照表中实验条件进行考察， 各组取 一半提取液， 蒸干， 残渣加水 25ml 使溶解， 加 10％氢氧化钠溶液 5ml， 摇匀， 用水饱和正丁醇 振摇提取 2 次， 每次 30ml， 合并正丁醇液， 加水洗涤 2 次， 每次 40ml， 弃去水液， 正丁醇液蒸 干， 残渣加水 3ml 使溶解， 通过 D101 型大孔吸附树脂柱， 40 ～ 60 目， 湿法装柱， 内径 1cm， 长 25cm， 小玻璃柱内， 待树脂沉淀， 覆以脱脂棉少许， 再添加棉花少许轻压， 用水冲洗并用水浸
没备用。先用水 50ml 洗脱， 弃去水液， 再用 70％乙醇 25ml 洗脱， 收集洗脱液， 蒸干， 残渣加 甲醇 1ml 使溶解， 作为供试品溶液。浓缩至 2ml， 作为供试品溶液 1-9
取人参皂苷 Rg1 及三七皂苷 R1 对照品， 加甲醇制成每 1ml 含 0.5mg 的溶液， 作为对 照品溶液。
吸取上述三种溶液各 5μl， 分别点于同一硅胶 G 薄层板上， 以正丁醇 - 乙酸乙 酯 - 水 (4 ∶ 1 ∶ 5) 的上层溶液为展开剂， 展开， 取出， 晾干， 喷以 10 ％硫酸乙醇溶液， 在 105℃加热至斑点显色清晰。
综合考虑确定供试品溶液提取方法为 ： 取本发明组合物制剂 2g， 加甲醇 20ml， 超 声处理 30 分钟。
1.2 供试品溶液纯化方法的考察 ：
皂苷类成分常见的纯化方法为正丁醇萃取， 本发明采用正丁醇萃取的方法并结合 其他方法纯化制剂中的皂苷类成分。
1.2.1 水提液调节 pH 值 ：
取本发明组合物制剂 2g 三份， 分别加甲醇 20ml， 超声处理 30 分钟， 静置， 取上清液 10ml， 蒸干， 残渣加水 25ml 使溶解， 分别加入 10％氢氧化钠溶液 0、 5ml 摇匀， 用水饱和正丁 醇振摇提取 2 次， 每次 30ml， 合并正丁醇液， 加水洗涤 2 次， 每次 40ml， 弃去水液， 正丁醇液 蒸干， 残渣加水 3ml 使溶解， 通过 D101 型大孔吸附树脂柱， 40 ～ 60 目， 湿法装柱， 内径 1cm， 长 25cm， 小玻璃柱内， 待树脂沉淀， 覆以脱脂棉少许， 再添加棉花少许轻压， 用水冲洗并用水 浸没备用。先用水 50ml 洗脱， 弃去水液， 再用 70％乙醇 25ml 洗脱， 收集洗脱液， 蒸干， 残渣 加甲醇 1ml 使溶解， 作为供试品溶液 1-3。 取人参皂苷 Rg1 及三七皂苷 R1 对照品， 加甲醇制成每 1ml 含 0.5mg 的溶液， 作为对 照品溶液。
吸取上述三种溶液各 5μl， 分别点于同一硅胶 G 薄层板上， 以正丁醇 - 乙酸乙 酯 - 水 (4 ∶ 1 ∶ 5) 的上层溶液为展开剂， 展开， 取出， 晾干， 喷以 10 ％硫酸乙醇溶液， 在 105℃加热至斑点显色清晰。
实验结果如下 ：
供试品溶液 1 水提液中不加入氢氧化钠溶液， 色谱中人参皂苷 Rg1 及三七皂苷 R1 斑点受其他杂质干扰 ； 供试品溶液 2 水提液中加入氢氧化钠溶液 5ml 氢氧化钠溶液 5ml， 色 谱中参皂苷 Rg1 及三七皂苷 R1 斑点前后无干扰。
所以确定供试品水提液中需加入氢氧化钠溶液 5ml 调节 pH 值后萃取。
1.2.2 正丁醇萃取液的洗涤 ：
取本发明组合物制剂 2g 四份， 分别加甲醇 20ml， 超声处理 30 分钟， 静置， 取上清液 10ml， 蒸干， 残渣加水 25ml 使溶解， 分别加入 10％氢氧化钠溶液 5ml 摇匀， 用水饱和正丁醇 振摇提取 2 次， 每次 30ml， 合并正丁醇液， 加水洗涤 0、 1、 2、 3 次， 每次 40ml， 弃去水液， 正丁 醇液蒸干， 残渣加水 3ml 使溶解， 通过 D101 型大孔吸附树脂柱， 40 ～ 60 目， 湿法装柱， 内径 1cm， 长 25cm， 小玻璃柱内， 待树脂沉淀， 覆以脱脂棉少许， 再添加棉花少许轻压， 用水冲洗并 用水浸没备用。先用水 50ml 洗脱， 弃去水液， 再用 70％乙醇 25ml 洗脱， 收集洗脱液， 蒸干， 残渣加甲醇 1ml 使溶解， 作为供试品溶液 1-4。
取人参皂苷 Rg1 及三七皂苷 R1 对照品， 加甲醇制成每 1ml 含 0.5mg 的溶液， 作为对
照品溶液。
吸取上述溶液各 5μl， 分别点于同一硅胶 G 薄层板上， 以正丁醇 - 乙酸乙酯 - 水 (4 ∶ 1 ∶ 5) 的上层溶液为展开剂， 展开， 取出， 晾干， 喷以 10％硫酸乙醇溶液， 在 105℃加热 至斑点显色清晰。
实验结果如下 ：
供试品溶液 1 正丁醇萃取液不用水洗涤， 色谱中人参皂苷 Rg1 及三七皂苷 R1 斑点 受其他杂质干扰 ； 供试品溶液 2 正丁醇萃取液水洗涤 1 次， 色谱中参皂苷 Rg1 及三七皂苷 R1 斑点前后干扰较供试品溶液 1 改善 ； 供试品溶液 3 正丁醇萃取液水洗涤 2 次， 色谱中参皂苷 Rg1 及三七皂苷 R1 斑点前后无干扰 ； 供试品溶液 4 正丁醇萃取液水洗涤 3 次， 色谱结果同 供试品溶液 3。
确定供试品正丁醇萃取液水洗涤 3 次。
1.2.3 正丁醇萃取液的大孔树脂纯化 ：
方法 1 ： 正丁醇萃取液不使用大孔树脂纯化 ：
取本发明组合物制剂 2g 份， 加甲醇 20ml， 超声处理 30 分钟， 静置， 取上清液 10ml， 蒸干， 残渣加水 25ml 使溶解， 加入 10％氢氧化钠溶液 5ml 摇匀， 用水饱和正丁醇振摇提取 2 次， 每次 30ml， 合并正丁醇液， 加水洗涤 0、 1、 2、 3 次， 每次 40ml， 弃去水液， 正丁醇液蒸干， 甲 醇 1ml 使溶解， 作为供试品溶液 1。
方法 2 ： 正丁醇萃取液使用大孔树脂纯化 ：
取本发明组合物制剂 2g 份， 加甲醇 20ml， 超声处理 30 分钟， 静置， 取上清液 10ml， 蒸干， 残渣加水 25ml 使溶解， 加入 10％氢氧化钠溶液 5ml 摇匀， 用水饱和正丁醇振摇提取 2 次， 每次 30ml， 合并正丁醇液， 加水洗涤 0、 1、 2、 3 次， 每次 40ml， 弃去水液， 正丁醇液蒸干， 残 渣加水 3ml 使溶解， 通过 D101 型大孔吸附树脂柱， 40 ～ 60 目， 湿法装柱， 内径 1cm， 长 25cm， 小玻璃柱内， 待树脂沉淀， 覆以脱脂棉少许， 再添加棉花少许轻压， 用水冲洗并用水浸没备 用。先用水 50ml 洗脱， 弃去水液， 再用 70％乙醇 25ml 洗脱， 收集洗脱液， 蒸干， 残渣加甲醇 1ml 使溶解， 作为供试品溶液 2。
取人参皂苷 Rg1 及三七皂苷 R1 对照品， 加甲醇制成每 1ml 含 0.5mg 的溶液， 作为对 照品溶液。
吸取上述三种溶液各 5μl， 分别点于同一硅胶 G 薄层板上， 以正丁醇 - 乙酸乙 酯 - 水 (4 ∶ 1 ∶ 5) 的上层溶液为展开剂， 展开， 取出， 晾干， 喷以 10 ％硫酸乙醇溶液， 在 105℃加热至斑点显色清晰。
实验结果如下 ：
供试品溶液 1 不使用大孔树脂纯化 ： 色谱中人参皂苷 Rg1 及三七皂苷 R1 斑点受其 他杂质干扰 ； 供试品溶液 2 正丁醇萃取液使用大孔树脂纯化， 色谱中参皂苷 Rg1 及三七皂苷 R1 斑点前后无干扰。
确定供试品正丁醇萃取液使用大孔树脂纯化。
1.2.4 大孔树脂洗脱乙醇浓度的确定 ：
取本发明组合物制剂 2g 三份， 分别加甲醇 20ml， 超声处理 30 分钟， 静置， 取上清液 10ml， 蒸干， 残渣加水 25ml 使溶解， 加 10％氢氧化钠溶液 5ml， 摇匀， 用水饱和正丁醇振摇提 取 2 次， 每次 30ml， 合并正丁醇液， 加水洗涤 2 次， 每次 40ml， 弃去水液， 正丁醇液蒸干， 残渣加水 3ml 使溶解， 三份样品分别通过 D101 型大孔吸附树脂柱， 40 ～ 60 目， 湿法装柱， 内径 1cm， 长 25cm， 小玻璃柱内， 待树脂沉淀， 覆以脱脂棉少许， 再添加棉花少许轻压， 用水冲洗并 用水浸没备用。先用水 50ml 洗脱， 弃去水液， 三份样品分别用 30、 70、 95％乙醇 25ml 洗脱， 收集洗脱液， 蒸干， 残渣加甲醇 1ml 使溶解， 作为供试品溶液 1-3。
实验结果如下 ：
供试品溶液 1 使用 30％乙醇洗脱， 色谱中人参皂苷 Rg1 及三七皂苷 R1 斑点受其他 杂质干扰 ； 供试品溶液 2 使用 70％乙醇洗脱， 色谱中参皂苷 Rg1 及三七皂苷 R1 斑点前后无 干扰。供试品溶液 3 使用 95％乙醇洗脱， 色谱中人参皂苷 Rg1 及三七皂苷 R1 斑点受其他杂 质干扰 ；
确定供试品使用 70％乙醇将皂苷类成分从大孔树脂柱上洗脱。
2、 供试品溶液、 对照药材溶液、 对照品溶液点样量的确定 ：
分别吸取供试品溶液、 对照药材、 对照品溶液 2、 5、 10ul 分别点于同一硅胶 G 薄层 板上， 以正丁醇 - 乙酸乙酯 - 水 (4 ∶ 1 ∶ 5) 的上层溶液为展开剂， 展开， 取出， 晾干， 喷以 10％硫酸乙醇溶液， 在 105℃加热至斑点显色清晰。
实验结果如下 ：
对照药材及对照品溶液点样量为 2μl 时， 斑点强度较低， 不宜观察 ； 点样量为 5μl 时， 四季红对照药材溶液薄层上荧光斑点清晰， 大小适中 ； 点样量为 10μl 时， 斑点太 大， 拖尾。
确定对照药材及对照品溶液的最佳点样量为 5μl。
供试品溶液点样量为 2μl 时， 在对照药材及对照品溶液相对应的位置上斑点强 度较低， 不宜观察 ； 点样量为 5μl 时， 在对照药材及对照品溶液相对应的位置上斑点明显， 斑点大小适中， 前后无干扰 ； 点样量为 10μl 时， 在对照药材及对照品溶液相对应的位置上 荧光斑点较大， 明显拖尾， 与前后荧光斑点相连。
确定供试品的最佳点样量为 5μl。
3、 展开剂条件的优
取缺三七的三七阴性制剂按供试品制备方法制备缺三七阴性对照溶液。
精密吸取供试品溶液、 缺三七阴性对照溶液、 对照药材及对照品溶液 5μl 点于于 同一硅胶 G 薄层板上， 反复点于五块薄层板上。分别用以下展开剂展开， 取出， 晾干， 喷以 10％硫酸乙醇溶液， 在 105℃加热至斑点显色清晰。
试验结果如下 ：
方法 1 ： 展开剂为正丁醇 - 乙酸乙酯 - 水 (10 ∶ 1 ∶ 5) 的上层溶液， 展开剂极性 较小， 供试品色谱中在与人参皂苷 Rg1 及三七皂苷 R1 对照品溶液相对应的斑点与前后斑点 未分开。
方法 2 ： 展开剂为正丁醇 - 乙酸乙酯 - 水 (4 ∶ 1 ∶ 5) 的上层溶液， 极性适宜， 供 试品色谱中在与人参皂苷 Rg1 及三七皂苷 R1 对照品溶液相对应的斑点， 分离良好， 前后无干 扰；
方法 3 ： 展开剂为正丁醇 - 乙酸乙酯 - 水 (1 ∶ 1 ∶ 5) 的上层溶液， 极性偏高， 供 试品色谱中在与人参皂苷 Rg1 及三七皂苷 R1 对照品溶液相对应的斑点与前后斑点未分开 ；
确定分离本发明组合物制剂中三七皂苷成分的最优薄层展开剂为正丁醇 - 乙酸乙酯 - 水 (1 ∶ 1 ∶ 5) 的上层溶液。
最后确定本发明组合物制剂中三七的薄层色谱鉴别条件为 ：
取本制剂组合物 2g， 加甲醇 20ml， 超声处理 30 分钟， 静置， 取上清液 10ml， 蒸干， 残 渣加水 25ml 使溶解， 加 10％氢氧化钠溶液 5ml， 摇匀， 用水饱和正丁醇振摇提取 2 次， 每次 30ml， 合并正丁醇液， 加水洗涤 2 次， 每次 40ml， 弃去水液， 正丁醇液蒸干， 残渣加水 3ml 使溶 解， 通过 D101 型大孔吸附树脂柱， 40 ～ 60 目， 湿法装柱， 内径 1cm， 长 25cm， 小玻璃柱内， 待 树脂沉淀， 覆以脱脂棉少许， 再添加棉花少许轻压， 用水冲洗并用水浸没备用。先用水 50ml 洗脱， 弃去水液， 再用 70％乙醇 25ml 洗脱， 收集洗脱液， 蒸干， 残渣加甲醇 1ml 使溶解， 作为 供试品溶液。另取三七对照药材 0.5g， 同法制成对照药材溶液。再取人参皂苷 Rg1 及三七 皂苷 R1 对照品， 加甲醇制成每 1ml 含 0.5mg 的溶液， 作为对照品溶液。吸取上述三种溶液 各 5μl， 分别点于同一硅胶 G 薄层板上， 以正丁醇 - 乙酸乙酯 - 水 (4 ∶ 1 ∶ 5) 的上层溶液 为展开剂， 展开， 取出， 晾干， 喷以 10％硫酸乙醇溶液， 在 105℃加热至斑点显色清晰。
实验例 5 ： 金钱草含量测定方法
本发明制剂组合物处方中金钱草的有效成份为以槲皮素、 山奈素为母核的黄酮类 成分。本发明中通过测定本发明组合物中槲皮素、 山奈素的含量有助于控制本中成药制剂 的质量， 确保临床用药的安全、 有效。
1、 色谱柱考察 ：
为了保证色谱条件的广泛适用性， 考察不同品牌色谱柱对槲皮素、 山奈素的分离， 试验结果表明 ： Diamonsil C18(5μm， 250mm×4.6mm)、 Agilent ZORBAX Extend-C18(5μm， 250mm×4.6mm)、 Agilent ZORBAX Eclipse XDB(5μm， 250mm×4.6mm) 均对槲皮素、 山奈素 有良好的分离。
2、 本发明组合物片中槲皮素、 山奈素提取条件的考察 ：
为了确保测定结果真实、 准确， 本发明通过一系列考察， 确保制备供试品溶液时将 本发明组合物片中的槲皮素、 山奈素提取完全。
选择正交试验设计优选影响制剂中成分提取率的 3 个因素 ： 提取溶剂中盐酸浓 度、 提取溶剂量、 回流提取时间， 每个因素设置 3 个水平。试验设计如下 ：
按正交表 L9(34) 安排实验。实验方法如下 ：按表格中条件分别提取 9 份供试品溶液， 精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 10μl， 注入液相色谱仪， 测定。
对实验测定结果进行统计分析， 获得本发明组合物片中槲皮素、 山奈素的最优提 取条件 ：
取本发明组合物约 5g， 精密称定， 置具塞锥形瓶中， 精密加入 2 ％盐酸甲醇溶液 50ml， 密塞， 称定重量， 加热回流 1 小时， 放冷， 再称定重量， 用 2％盐酸甲醇溶液补足减失的 重量， 摇匀， 滤过， 取续滤液， 即得。
通过实验确定本发明组合物颗粒剂中槲皮素、 山奈素含量测定的色谱条件及对照 品和供试品制备方法为 ：
色谱条件与系统适用性试验 ： 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 ； 以甲醇 -0.4％ 磷酸溶液 (48 ∶ 52) 为流动相 ； 检测波长为 360nm。理论板数按槲皮素峰计算应不低于 2500。
对照品溶液的制备 ： 精密称取槲皮素对照品及山奈素对照品适量， 加甲醇制成每 1ml 各含槲皮素 15μg， 山奈素 20μg 的溶液， 即得。
供试品溶液的制备 ： 取本发明组合物， 取约 5g， 精密称定， 置具塞锥形瓶中， 精密 加入 2％盐酸甲醇溶液 50ml， 密塞， 称定重量， 加热回流 1 小时， 放冷， 再称定重量， 用 2％盐 酸甲醇溶液补足减失的重量， 摇匀， 滤过， 取续滤液， 即得。
实验例 6 ： 金钱草含量测定方法学验证
检测仪器 ( 室温检测 ) ： Agilent1100 型高效液相色谱仪
色谱柱 ： Agilent Zorbax C184.6×150mm， 5μm
流动相 ： 甲醇 -0.4％磷酸溶液 (48 ∶ 52)
检测波长 ： 360nm
对照品来源 ： 槲皮素和山奈素 ( 购于中国药品生物制品检定所 )
供试品批号 ： 02120401、 02120502、 02120603
供试品制备 ： 取本发明组合物， 取约 5g， 精密称定， 置具塞锥形瓶中， 精密加入 2％ 盐酸甲醇溶液 50ml， 密塞， 称定重量， 加热回流 1 小时， 放冷， 再称定重量， 用 2％盐酸甲醇溶 液补足减失的重量， 摇匀， 滤过， 取续滤液， 即得。
对照品溶液的制备 ： 精密称取槲皮素对照品及山奈素对照品适量， 加甲醇制成每 1ml 各含槲皮素 15μg， 山奈素 20μg 的溶液， 即得。
1. 含量测定方法考察 ：
1.1 线性关系考察 ：
分别精密吸取槲皮素、 山奈素对照品溶液 2、 6、 10、 14、 18μl 注入液相色谱仪， 记 录峰面积， 以峰面积积分值 A 为纵坐标， 以槲皮素和山奈素的含量 (μg) 为横坐标， 计算其 回归方程。
槲皮素回归方程 ：
Area ＝ 3.6027×104Amt+6.3193×103(r ＝ 0.9999)， 线性范围 ： 30-270μg。
山奈素回归方程 ：
Area ＝ 3.8393×104Amt+2.7966×104(r ＝ 0.9999)， 线性范围 ： 40-360μg。
1.2 稳定性试验 ：
对照品溶液， 分别于配制后 0、 2、 4、 6、 12、 24 小时， 依法测定。结果表明槲皮素、 山 奈素在 24 小时内基本稳定， RSD(％ ) 分别为 0.8、 1.3。
1.3 精密度试验 ：
精密吸取供试品溶液 ( 批号 ： 02120603)10μl， 重复进样 5 次， 求得相对标准偏差， 槲皮素、 山奈素 RSD(％ ) 分别为 0.5、 0.8， 均＜ 3％。
1.4 重现性试验 ：
取同一批号 ( 批号 ： 02120603) 样品五份， 对每份进行测定， 求得相对标准偏差。 槲 皮素、 山奈素 RSD(％ ) 分别为 1.5、 1.2， 均＜ 3％。
1.5 回收率试验 ：
精密称取已知含量的同一批号 ( 批号 ： 02120603) 的样品 2.5g， 分别精密加入一定 量槲皮素、 山奈素对照品， 测定其含量， 计算其回收率。槲皮素回收率为 101.0％， RSD(％ ) ＝ 1.8 ； 槲皮素回收率为 100.1％， RSD(％ ) ＝ 0.8。
2. 本制剂组合物测定结果见下表 ：
根据以上数据， 将含量限度定为 ： 本发明组合物制剂每 1g 含金钱草以槲皮素 (C15H11O7) 和山奈素 (C15H10O6) 的总量计， 不得少于 0.20mg。
具体实施方式
实施例 1
金钱草
黄柏
桃仁420g 250g 210g绵萆薢 三七 乌药420g 42g 210g21瞿麦 川楝子 牛膝210g 250g 250gCN 101856449 A
说明书18/19 页以上九味， 三七粉碎成细粉。金钱草、 绵萆薢和黄柏加 70％乙醇回流提取 2 次， 每 次 1.5 小时， 滤过， 合并滤液， 放置过夜， 滤过， 滤液备用。其余瞿麦等五味， 加水煎煮三次， 每次 1 小时， 合并煎液， 滤过， 滤液浓缩至相对密度为 1.15 ～ 1.20(50℃ )， 放冷， 加乙醇使 含醇量达 70％， 冷藏过夜， 滤过， 滤液与上述金钱草等醇提液合并， 回收乙醇并浓缩至稠膏 状， 干燥， 粉碎成细粉， 加入上述三七细粉及糊精适量， 甜菊素 15g， 混匀， 用乙醇适量制成颗 粒， 干燥， 制成 1000g， 即得。
【鉴别】
(1) 取本品 5g， 加乙醇 20ml， 置水浴上回流 40 分钟， 取上清液 10ml， 加盐酸 1ml， 加 热回流 1 小时后浓缩至约 5ml， 加水 10ml， 用环己烷 20ml 振摇提取， 提取液蒸干， 残渣加三 氯甲烷 2ml 使溶解， 作为供试品溶液。另取绵萆薢对照药材 2g， 同法制成对照药材溶液。再 取薯蓣皂苷元对照品， 加甲醇制成每 1ml 含 5mg 的溶液， 作为对照品溶液。照薄层色谱法试 验， 吸取供试品溶液 5μl、 对照药材及对照品溶液各 2μl， 分别点于同一硅胶 G 薄层板上， 以环己烷 - 乙酸乙酯 (8 ∶ 2) 为展开剂， 展开， 取出， 晾干， 喷以磷钼酸试液， 在 105℃加热至 斑点显色清晰。供试品色谱中， 在与对照药材、 对照品色谱相应的位置上， 显相同颜色的斑 点。 (2) 取本品 2g， 加甲醇 20ml， 超声处理 15 分钟， 滤过， 滤液浓缩至 2ml， 作为供试品 溶液。另取黄柏对照药材 0.1g， 同法制成对照药材溶液。再取盐酸小檗碱对照品， 加甲醇 制成每 1ml 含 0.5mg 的溶液， 作为对照品溶液。照薄层色谱法 ( 中国药典 2005 年版一部附 录 VI B) 试验， 吸取上述三种溶液各 2μl， 分别点于同一硅胶 G 薄层板上， 以乙酸乙酯 - 丁 酮 - 甲酸 - 水 (10 ∶ 6 ∶ 1 ∶ 1) 为展开剂， 展开， 取出， 晾干， 置紫外光灯 (365nm) 下检视。 供试品色谱中， 在与对照药材色谱相应的位置上， 显相同颜色的荧光斑点 ； 在与对照品色谱 相应的位置上， 显相同颜色的黄色荧光斑点。
(3) 取本品 2g， 加甲醇 20ml， 超声处理 30 分钟， 静置， 取上清液 10ml， 蒸干， 残渣加 水 25ml 使溶解， 加 10％氢氧化钠溶液 5ml， 摇匀， 用水饱和正丁醇振摇提取 2 次， 每次 30ml， 合并正丁醇液， 加水洗涤 2 次， 每次 40ml， 弃去水液， 正丁醇液蒸干， 残渣加水 3ml 使溶解， 通过 D101 型大孔吸附树脂柱， 40 ～ 60 目， 湿法装柱， 内径 1cm， 长 25cm， 小玻璃柱内， 待树 脂沉淀， 覆以脱脂棉少许， 再添加棉花少许轻压， 用水冲洗并用水浸没备用。先用水 50ml 洗 脱， 弃去水液， 再用 70％乙醇 25ml 洗脱， 收集洗脱液， 蒸干， 残渣加甲醇 1ml 使溶解， 作为供 试品溶液。另取三七对照药材 0.5g， 同法制成对照药材溶液。再取人参皂苷 Rg1 及三七皂 加甲醇制成每 1ml 含 0.5mg 的溶液， 作为对照品溶液。照薄层色谱法 ( 中国 苷 R1 对照品， 药典 2005 年版一部附录 VI B) 试验， 吸取上述三种溶液各 5μl， 分别点于同一硅胶 G 薄层 板上， 以正丁醇 - 乙酸乙酯 - 水 (4 ∶ 1 ∶ 5) 的上层溶液为展开剂， 展开， 取出， 晾干， 喷以 10％硫酸乙醇溶液， 在 105℃加热至斑点显色清晰。 供试品色谱中， 在与对照药材、 对照品色 谱相应的位置上， 显相同颜色的斑点。
【含量测定】
照高效液相色谱法 ： 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填 充剂 ； 以甲醇 -0.4％磷酸溶液 (48 ∶ 52) 为流动相 ； 检测波长为 360nm。 理论板数按槲皮素 峰计算应不低于 2500。
对照品溶液的制备 ： 精密称取槲皮素对照品及山奈素对照品适量， 加甲醇制成每
1ml 各含槲皮素 15μg， 山奈素 20μg 的溶液， 即得。
供试品溶液的制备 ： 取装量差异项下的本品， 研细， 取约 5g， 精密称定， 置具塞锥 形瓶中， 精密加入 2％盐酸甲醇溶液 50ml， 密塞， 称定重量， 加热回流 1 小时， 放冷， 再称定重 量， 用 2％盐酸甲醇溶液补足减失的重量， 摇匀， 滤过， 取续滤液， 即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 10μl， 注入液相色谱仪， 测 定， 即得。
本品每 1g 含金钱草以槲皮素 (C15H11O7) 和山奈素 (C15H10O6) 的总量计， 不得少于 0.20mg。
【功能与主治】 清热利湿， 活血通淋。用于慢性非特异性前列腺炎属湿热下注， 瘀血 阻滞证者， 症见尿频， 尿急、 尿道灼热涩痛， 尿浊， 尿道口滴白、 舌黯或红或有瘀点瘀斑， 苔薄 黄或黄腻等。
【用法与用量】 开水冲服。一次 1 袋， 一日 3 次。疗程 4 周。
【规格】 每袋装 8g
实施例 2
金钱草 360g 绵萆薢 460g 瞿麦 210g
黄柏 250g 三七 62g 川楝子 280g
桃仁 230g 乌药 180g 牛膝 250g
以上九味， 三七粉碎成细粉。金钱草、 绵萆薢和黄柏加 70％乙醇回流提取 2 次， 每 次 1.5 小时， 滤过， 合并滤液， 放置过夜， 滤过， 滤液备用。其余瞿麦等五味， 加水煎煮三次， 每次 1 小时， 合并煎液， 滤过， 滤液浓缩至相对密度为 1.15 ～ 1.20(50℃ )， 放冷， 加乙醇使 含醇量达 70％， 冷藏过夜， 滤过， 滤液与上述金钱草等醇提液合并， 回收乙醇并浓缩至稠膏 状， 干燥， 粉碎成细粉， 加入上述三七细粉及糊精适量， 甜菊素 15g， 混匀， 用乙醇适量制成颗 粒， 干燥， 制成 1000g， 即得。
实施例 3
金钱草 420g 绵萆薢 420g 瞿麦 210g
黄柏 250g 三七 42g 川楝子 250g
桃仁 210g 乌药 210g 牛膝 250g
三七粉碎成细粉。金钱草、 绵萆薢和黄柏加 70％乙醇回流提取 2 次， 每次 1.5 小 时， 滤过， 合并滤液， 放置过夜， 滤过， 滤液备用。其余瞿麦等五味， 加水煎煮三次， 每次 1 小 时， 合并煎液， 滤过， 滤液浓缩至相对密度为 1.15 ～ 1.20(50℃ )， 放冷， 加乙醇使含醇量达 70％， 冷藏过夜， 滤过， 滤液与上述金钱草等醇提液合并， 回收乙醇并浓缩至稠膏状， 干燥， 粉碎成细粉， 加入上述三七细粉及糊精适量， 甜菊素 15g， 混匀， 用乙醇适量制成颗粒， 装胶 囊， 即得。23