一种珍珠水解液的制备方法 【技术领域】
本发明涉及一种水解液的制备方法，具体涉及珍珠水解液的制备方法。背景技术 珍珠是名贵的中药材，珍珠是母贝的外套膜和珍珠囊的表皮细胞所分泌的珍珠 质而形成的。 珍珠的主要成份是碳酸钙，约占总量的 82 ～ 93％，此外，珍珠还含有 4 ～ 14％的壳角蛋白质和 2 ～ 4％的水分，以及十几种氨基酸和 28 种微量元素，其中包括硒、 锗等抗衰物质。 壳角蛋白能在适当的条件下解离成氨基酸。 氨基酸是组成蛋白质的基本 单位，而蛋白质是我们机体的生命基础，是调节生理机能，供给热量所必需的物质。 李 时珍在 《本草纲目》 中记载 ：“( 珍珠 ) 定惊，清肝除翳，收敛生肌”，即可以清热解 毒，愈合创伤，助长皮肉，消炎明目。 现代医学发现珍珠中富含氨基酸，咖啡因和多种 人体必备的微量元素，能积极参与人体的新陈代谢，可以养颜美容，增白保湿，防止衰 老，以及治疗口腔溃疡、神经衰弱和癔症等。 目前已广泛应用于化妆品、保健品之中。
然而珍珠难溶于水，内食和外用，人体一般只能吸收极少量的部分。 目前 利用珍珠的有效成分主要是以珍珠水解液的形态进行，现有的珍珠水解液的制备方法 主要是用无机酸或有机酸将珍珠粉溶化，再加酶进行水解，得到水解液，如公开号为 CN1107335 的中国发明专利公开了一种一种酶解珍珠粉的产品及方法，该发明采用木瓜 蛋白酶在一定的反应条件下对壳角蛋白质进行酶解，使原来不易被人吸收的珍珠粉中的 壳角蛋白质酶解为人体可吸收的二十种氨基酸。 但该方法所得的珍珠水解液中各成分的 分子量均较大，不易被人体吸收，且产品的收率不高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种产品收率高的珍珠水解液的制备方法。 采 用这种方法制得的珍珠水解液中分子量小于 1000Da 的成分占 90％以上。
本申请中所出现的产品收率是指 ：以产品珍珠水解液中 0.2mg/ml 的含氮量为基 准，得到珍珠水解液的质量与得到该质量的水解液所投入的珍珠粉原料用量的比值。
本发明所述珍珠水解液的制备方法，包括以下步骤 ：
1) 取珍珠粉置于盐酸水溶液中，搅拌，直至反应完全，用氨水调节该混合液的 pH 值至中性，离心，得沉淀 A ；
2) 沉淀 A 用纯净水溶解，再以氨水调节其 pH 值为 7.5 ～ 8.5，离心，得沉淀 B ；
3) 沉淀 B 用纯净水溶解，加入酶进行酶解，酶解液离心，得上清液和沉淀 C ； 其中，
所述的酶为蜗牛蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合物，酶的加入量为沉淀 B 湿重的 0.3 ～ 1.05％，其中蜗牛蛋白酶和木瓜蛋白酶分别占酶总用量的 10 ～ 20％和 80 ～ 90％， 酶解的温度为 50 ～ 55℃，时间为 2 ～ 4 小时 ；
4) 将沉淀 C 用纯净水溶解加酶进行二次酶解，离心，收集上清液 ；其中，所述的酶为胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的混合物，酶的加入量为沉淀 B 湿重的 0.2 ～ 0.45％，其中胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶分别占酶总用量的 10 ～ 25％、15 ～ 20％和 60 ～ 70％，酶解的温度为 50 ～ 55℃，时间为 4 ～ 7 小时 ；
5) 合并上清液，煮沸，用孔径为 1 ～ 3nm 的纳滤膜过滤，即得。
上述方法采用特殊的酶解工艺，将胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和蜗牛 蛋白酶按照特定的搭配组合使用，使得对珍珠粉中的壳角蛋白质进行充分的溶解作用， 使水解液中的含氮量增加，提高了产品的收率 ；而且使得到的水解液中含有丰富的氨基 酸和小分子蛋白，其中分子量小于 1000Da 的成分占 90％以上，更利于人体的吸收。 对 由该方法制得的珍珠水解液中氨基酸的分析结果如下 ：
上述方法中，
步骤 1) 中，盐酸水溶液的体积用量 ( 升 ) 为珍珠粉重量 ( 千克 ) 的 8 ～ 10 倍， 其摩尔浓度为 2 ～ 4mol/L。
为说明本发明采用特殊的酶解工艺可得到更高的产品收率，申请人分别采用本 申请所述方法与现有技术 (CN1107335) 所述方法作了实验对比，具体实验条件及结果如 下：
( 一 )、按公开号为 CN1107335 的中国发明专利所述方法进行实验 ：
取乳酸 3.2 升，加入蒸馏水 42 升，充分混匀后成为乳酸溶液，将 1 千克珍珠粉分 次加入乳酸溶液中，边搅拌边加入，待反应完成后，离心，得上清液和不溶部分，上清 液即为珍珠活性钙及微量元素部分，不溶部分即为珍珠壳角蛋白质。取湿的壳角蛋白质 1 千克，加入蒸馏水 10 升在 38℃条件下，加入 15 克 ( 相当于壳角蛋白质重量的 1.5％ ) 木 瓜蛋白酶，1 克盐酸半胱氨酸，1 克乙二桉四乙酸二钠盐，在 38℃条件下酶解 5 小时，离 心，得酶解珍珠液，灭菌后即为产品。
经检测上述酶解珍珠液的收率为 23.29％。
所得酶解珍珠液中含有的氨基酸、12 ～ 13 肽物质以及分子量 ≥5000 的多肽，对 所得酶解珍珠液中氨基酸的分析结果如下 ：
将上述所得的酶解珍珠液用膜孔径为 1 ～ 3nm 的纳滤膜过滤，所得滤液用 MALDI-TOF MS 法进行分子量检测，其中分子量小于 1000Da 的成分只占 15％。
( 二 )、按本申请所述方法进行实验 ：
1) 取 1 千克珍珠粉置于 8 升摩尔浓度为 4mol/L 的盐酸水溶液中，搅拌，直至反 应完全，用氨水调节该混合液的 pH 值至中性，离心，得沉淀 A ；
2) 沉淀 A 用纯净水溶解，再以氨水调节其 pH 值为 8，离心，得沉淀 B ；
3) 取 1 千克湿的沉淀 B 用纯净水溶解，加入总量为 10.5 克的酶 ( 其中蜗牛蛋白 酶和木瓜蛋白酶各占酶总量的 20％和 80％ ) 在温度为 50℃条件下酶解 2 小时，离心，得 上清液和沉淀 C ；
4) 将沉淀 C 用纯净水溶解，加入总量为 4.5 克的酶 ( 其中胰蛋白酶、木瓜蛋白 酶和中性蛋白酶各占酶总量的 20％、15％和 65％ ) 在温度为 50℃条件下酶解 4 小时，离 心，收集上清液 ；
5) 合并上清液，浓缩至原体积的 1/10，煮沸，用膜孔径为 1 ～ 3nm 的纳滤膜过 滤，即得。
经检测上述珍珠水解液的收率为 42.84％。
所得酶解液中含有丰富的氨基酸及小分子蛋白，用 MALDI-TOF MS 法进行分子 量检测，水解液中分子量小于 1000Da 的成分占 90％以上，具体分子量的分布图如图 1 所 示。
对所得珍珠水解液中氨基酸的分析结果如下 ：
( 三 )、实验结果比较在上述两项实验中，本申请所述方法中酶的总用量与现有技术方法中酶的用相 同，不同的是酶的种类搭配及酶解的温度和时间，从上述实验数据可以看出，本申请所 述方法通过将酶进行特殊的组合搭配使用且进行二次酶解，使得产品的收率将近为现有 技术方法所得收率的 2 倍，所得产品中分子量小于 1000Da 的成分占 90％以上。 与现有 技术相比，本申请所述方法操作简单、易控，大大提高了产品的收率，所得产品中各成 分分子量小，更易于被人体吸收。 附图说明
图 1 为进行对比实验时按本申请所述方法得到的珍珠水解液的分子量分布图。具体实施方式
下面用实施例更详细地说明本发明，应理解为实施例在任何方面不对本发明范 围限制。
实施例 1
1) 取珍珠粉置于相当于其重量 10 倍体积 ( 升 / 千克，下同 ) 的摩尔浓度为 4mol/ L 的盐酸水溶液中，搅拌，直至反应完全，用氨水调节该混合液的 pH 值至中性，离心， 得沉淀 A ；
2) 沉淀 A 用纯净水溶解，再以氨水调节其 pH 值为 7.5，离心，得沉淀 B ；
3) 取 1 千克湿的沉淀 B 用纯净水溶解，加入总量为 7 克的酶 ( 其中蜗牛蛋白酶 和木瓜蛋白酶各占酶总量的 10％和 90％ ) 在温度为 55℃条件下酶解 4 小时，离心，得上 清液和沉淀 C ；
4) 将沉淀 C 用纯净水溶解，加入总量为 2 克的酶 ( 其中胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和 中性蛋白酶各占酶总量的 10％、20％和 70％ ) 在温度为 50℃条件下酶解 4 小时，离心， 收集上清液 ；5) 合并上清液，浓缩至原体积的 1/10，煮沸，用膜孔径为 1 ～ 3nm 的纳滤膜过 滤，即得。
经检测上述珍珠水解液的收率为 45.60％。
所得酶解液中含有丰富的氨基酸及小分子蛋白，对其进行分子量检测，发现 其中分子量小于 1000Da 的成分占 90％以上，对所得珍珠水解液中氨基酸的分析结果如 下：
实施例 2
1) 取珍珠粉置于相当于其重量 9 倍体积的摩尔浓度为 2mol/L 的盐酸水溶液中， 搅拌，直至反应完全，用氨水调节该混合液的 pH 值至中性，离心，得沉淀 A ；
2) 沉淀 A 用纯净水溶解，再以氨水调节其 pH 值为 8，离心，得沉淀 B ；
3) 取 1 千克湿的沉淀 B 用纯净水溶解，加入总量为 3 克的酶 ( 其中蜗牛蛋白酶 和木瓜蛋白酶各占酶总量的 15％和 85％ ) 在温度为 52℃条件下酶解 3 小时，离心，得上 清液和沉淀 C ；
4) 将沉淀 C 用纯净水溶解，加入总量为 3 克的酶 ( 其中胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和 中性蛋白酶各占酶总量的 25％、15％和 60％ ) 在温度为 55℃条件下酶解 7 小时，离心， 收集上清液 ；
5) 合并上清液，浓缩至原体积的 1/10 倍，煮沸，用膜孔径为 1 ～ 3nm 的纳滤膜 过滤，即得。
经检测上述珍珠水解液的收率为 35.78％。
所得酶解液中含有丰富的氨基酸及小分子蛋白，对其进行分子量检测，发现 其中分子量小于 1000Da 的成分占 90％以上，对所得珍珠水解液中氨基酸的分析结果如 下：
实施例 31) 取珍珠粉置于相当于其重量 8 倍体积的摩尔浓度为 2mol/L 的盐酸水溶液中， 搅拌，直至反应完全，用氨水调节该混合液的 pH 值至中性，离心，得沉淀 A ；
2) 沉淀 A 用纯净水溶解，再以氨水调节其 pH 值为 8.5，离心，得沉淀 B ；
3) 取 1 千克湿的沉淀 B 用纯净水溶解，加入总量为 9 克的酶 ( 其中蜗牛蛋白酶 和木瓜蛋白酶各占酶总量的 12％和 88％ ) 在温度为 50℃条件下酶解 2 小时，离心，得上 清液和沉淀 C ；
4) 将沉淀 C 用纯净水溶解，加入总量为 4 克的酶 ( 其中胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和 中性蛋白酶各占酶总量的 15％、18％和 67％ ) 在温度为 55℃条件下酶解 5 小时，离心， 收集上清液 ；
5) 合并上清液，浓缩至原体积的 1/5 倍，煮沸，用膜孔径为 1 ～ 3nm 的纳滤膜 过滤，即得。
经检测上述珍珠水解液的收率为 40.96％。
所得酶解液中含有丰富的氨基酸及小分子蛋白，对其进行分子量检测，发现 其中分子量小于 1000Da 的成分占 90％以上，对所得珍珠水解液中氨基酸的分析结果如 下：