抑肝散的生物测定方法 【技术领域】
本发明涉及抑肝散的测定方法， 更详细而言， 涉及一种测定方法， 该测定方法利用 对谷氨酸受体的作用， 能定量地评价中药制剂抑肝散的生理活性值 ( 药理活性值 )。背景技术
中药是将生药混合而成的药品， 其活性成分并没有完全确定。 此外， 由于并不限于 仅以单一的活性成分发挥效果， 有时也共同起作用， 因此为了保证其品质， 需要能够对中药 整体进行评价的测定方法 ( 专利文献 1、 专利文献 2)。
在该测定方法中， 有测定个别的成分后对它们进行综合性评价的方法和采用生物 材料来评价生理活性的生物测定。而且在生物测定中， 有生物体内 ( 体内， in vivo) 试验 和试管内 ( 体外， in vitro) 试验， 但生物体内试验的体系在试验设施、 试验动物、 处理能力 等方面存在各种限制， 用于中药的品质评价时伴随有困难。
另一方面， 在试管内试验的体系中， 由于不需要特殊的设施， 且短时间内能获得 稳定的试验结果， 因此寻求利用该体系来建立生物测定法， 实际上关于肌肉生长抑制素 (Myostatin) 的生物测定法已有报道 ( 专利文献 3)。但是， 对于自身由包含多种有效成分 的生药组合而成的中药来说， 还没有发现通常适用的生物测定体系， 因而期待建立该生物 测定体系。
例如， 中药制剂抑肝散通常为具有以下组成的生药混合物或其提取物， 进而根据 需要含有赋形剂等药用载体、 其他制剂上可使用的成分， 但关于该制剂， 也还没有发现合适 的生物测定体系， 为了保证更佳的品质， 期望开发出其生物测定体系。
[ 表 1]
专利文献 1 ： 日本特表 2000-512621 专利文献 2 ： 日本特表 2001-521876专利文献 3 ： 日本特表 2005-520486发明内容 发明要解决的问题
因此， 本发明的课题在于发现能够保证抑肝散的更高品质的、 利用试管内试验的 生物测定体系。
用于解决问题的方案
本发明人等对抑肝散的作用进行了深入研究， 结果认识到， 抑肝散具有与谷氨酸 受体的结合活性， 且该结合活性依赖于抑肝散的用量。 此外， 认识到抑肝散的构成生药即柴 胡、 川芎、 当归、 甘草等也具有与谷氨酸受体的结合活性， 且对于每种谷氨酸受体而言， 引起 结合活性的生药不相同。 并且发现， 应用该见解， 能够建立抑肝散、 或柴胡、 川芎、 当归、 甘草 或者含有这些生药的待测试样的生物测定方法， 从而完成了本发明。
即本发明为一种抑肝散的生物测定方法， 其特征在于， 使标记配体和抑肝散竞争 性作用于表达谷氨酸受体的细胞或细胞膜， 从而测定抑肝散的结合活性， 并由该值评价抑 肝散的药理活性值。
此外本发明为一种至少含有柴胡、 川芎、 当归或甘草的待测试样的生物测定方法， 其特征在于， 使标记配体和至少含有柴胡、 川芎、 当归或甘草的待测试样竞争性作用于表达 谷氨酸受体的细胞或细胞膜， 从而测定待测试样的受体结合活性， 并由该值评价待测试样 的药理活性值。
发明的效果
根据本发明的生物测定方法， 能够不受试验设施、 试验动物、 处理能力等的限制， 通过试管内试验简便且稳定地求出抑肝散或含有作为抑肝散等的构成生药的柴胡、 川芎、 当归、 和甘草的待测试样的生理活性值 ( 药理活性值 )。
附图说明
图 1 是表示抑肝散的各谷氨酸受体的结合活性的图。其中， 非选择性结合是指对 离子通道型受体和代谢型受体这两者的非选择性结合。
图 2 是表示构成抑肝散的 7 种生药的各谷氨酸受体结合活性的图。 具体实施方式
本发明的抑肝散的生物测定方法通过使用表达谷氨酸受体的细胞或细胞膜来测 定该受体和抑肝散的结合活性， 从而评价抑肝散的药理活性值。
具体而言， 能够利用以下方法 ： 使标记配体和抑肝散竞争性作用于表达谷氨酸受 体的细胞或细胞膜， 由结合的标记配体量来测定抑肝散的结合活性。
更具体而言， 使标记配体和抑肝散竞争性地与在细胞或细胞膜中表达的谷氨酸受 体反应， 由仅存在标记配体时的特异性结合量和竞争后的标记配体结合量之差来测定抑肝 散的结合活性值。
本发明中使用的谷氨酸受体， 可以根据药理学的标准进行分类。 即， 已知谷氨酸介 由离子通道型受体和代谢型受体这两种主要的受体来传递其作用。而且， 离子通道型受体可以根据受体的药理学和功能性质进一步分类。
上述离子通道型受体主要是 ： N- 甲基 -D- 天门冬氨酸 ( 以下称为 “NMDA” ) 受体、 红藻氨酸受体和 α- 氨基 -3- 羟基 -5- 甲基异噁唑 -4- 丙酸 ( 以下称为 “AMPA” ) 受体。进 而， NMDA 受体可分为具有谷氨酸结合部位、 甘氨酸结合部位、 苯环己哌啶结合部位、 和多胺 结合部位的受体。
另一方面， 代谢型受体已知有 8 个不同的成员， 它们被分为三组。即， mGluR1 和 mGluR5 属于组 I， mGluR2 和 mGluR3 属于组 II， 而 mGluR4、 mGluR6、 mGluR7 和 mGluR8 属于 组 III。
另外， 本申请发明中的对谷氨酸受体的非选择性结合是指， 对离子通道型和代谢 型这两者均具有结合性的结合。
作 为 本 发 明 方 法 中 使 用 的 表 达 谷 氨 酸 受 体 的 细 胞 膜， 例如可列举出根据 Matthew A.Sills 等 的 论 文 (Matthew A.Sills， et al.， 1991， [3H]CGP39653 ： a new N-methyl-D-asparate antagonist redioligand with low nanomolar affinity in rat brain， Eur.J.Pharmacol.， 192， 19-24) 等所记载的方法从 Wistar 系大鼠等实验动物的脑 组织中采集的脑膜部分。根据谷氨酸受体的种类， 为得到脑膜部分而使用的脑组织的部位 不同， 例如， 在对谷氨酸受体的非选择性结合试验中可以从 Wistar 系大鼠的脑采集， 在对 AMPA 受体和 NMDA 受体的结合试验中可以从 Wistar 系大鼠的大脑皮质采集， 在对红藻氨酸 受体的结合试验中可以从 Wistar 系大鼠的脑 ( 除去小脑后的脑 ) 采集。
此外， 作为本发明方法中使用的表达谷氨酸受体的细胞， 可以列举出通过基因操 作而导入了谷氨酸受体基因的细胞。例如， 表达作为谷氨酸受体基因的 mGluR5 的细胞， 可 以列举出通过 Aramori I. 等的方法 (Aramori I.et al.， 1992， Signal transduction and pharmacological characteristics of a metabotropic glutamate receptor， mGluR1， in transfected CHO cells， 8， 757-765) 导入了人重组谷氨酸受体表达基因而制作的细胞， 具 体而言， 可列举出表达 mGluR5 的 CHO 细胞、 HEK-293 细胞等。另外， 为获得表达 mGluR5 的 细胞膜， 可列举出将上述表达 mGluR5 的细胞通过匀浆等方法破坏、 并通过高速离心分离等 方法分离细胞膜部分的方法。另外， 可以利用作为市售品而可获得的 mGluR5 表达细胞膜部 分。
另外， 作为针对谷氨酸受体的标记配体， 可列举出用放射性同位素、 荧光、 酶等标 3 3 3 记的配体， 作为其例子可列举出 [ H]L- 谷氨酸、 [ H]AMPA、 [ H] 红藻氨酸 (Kainic acid)、 3 3 3 3 [ H]CGP-39653、 [ H]MDL-105519、 [ H]TCP、 [ H] 艾 芬 地 尔 (Ifenprodil)、 [3H] 使 君 子 酸 (Quisqualic acid)， 可根据各谷氨酸受体区分使用。
作为本申请发明的生物测定方法的实施方式的一种， 例如可列举出以下方法， 该 方法是从 Wistar 系大鼠采集表达了规定的谷氨酸受体的脑组织， 然后， 通过上述方法等获 得脑膜部分， 由放射配体等标记配体和抑肝散的竞争性反应求出结合活性。此时的反应体 系优选为 4 ～ 37℃左右， 抑肝散的结合活性的测定， 只要在向脑膜部分中添加标记配体和 抑肝散后 20 ～ 120 分钟左右后进行即可。另外， 抑肝散的结合活性能够由仅存在标记配体 时的特异性结合量和竞争性反应后的配体结合量之差来测定。
另外， 作为本申请发明的其他的实施方式， 可列举出以下方法， 该方法利用通过基 因操作导入了谷氨酸受体基因的细胞或该细胞的细胞膜， 由放射配体等标记配体和抑肝散的竞争性反应求出结合活性。具体而言， 可举出以下方法， 该方法使用表达 mGluR5 的 CHO 3 细胞膜等， 由 [ H] 使君子酸和抑肝散的竞争性反应求出结合活性。此时的反应体系优选为 25 ～ 37℃左右， 抑肝散的结合活性的测定只要在向细胞膜等中添加标记配体和抑肝散后 30 ～ 120 分钟左右后进行即可。另外， 抑肝散的结合活性能够由仅存在标记配体时的特异 性结合量和竞争性反应后的配体结合量之差来测定。
本申请发明的生物测定方法中， 通常优选同时对含有已知浓度的抑肝散的试样进 行多个点、 优选为 3 个点以上的测定， 由此来定量待测试样中的抑肝散的药理活性 ( 结合活 性 ) 值， 但如果条件基本没有改变， 则也可以使用已经由含有已知浓度的抑肝散的试样制 作的标准曲线来测定。
如上述那样， 能够评价待测试样中的抑肝散的药理活性值， 该作用机制被认为如 下。 即， 抑肝散与谷氨酸受体结合， 但本发明中， 该成分和标记的各配体发生竞争性反应， 从 而相应于前述成分量， 与谷氨酸受体结合的标记配体减少。 通过测定该减少的标记配体量， 能够评价抑肝散的结合活性。
根据以上说明的本发明的生物测定法， 通过对临床上已确认作为抑肝散的药理效 果的标准制剂和待测制剂在同一条件下评价药理活性值， 并比较标准制剂和待测制剂， 从 而能够对制剂的品质同等性进行评价。 进而， 在以上说明的生物测定法中， 对于除抑肝散以外的、 柴胡、 川芎、 当归、 甘草 或含有它们的待测试样 ( 以下称为 “生药试样” )， 也能与抑肝散同样地评价品质同等性。
在此， 作为除抑肝散以外的含有柴胡的待测试样， 可列举出柴胡加龙骨牡蛎汤、 柴 胡桂枝干姜汤、 加味归脾汤、 抑肝散加陈皮半夏等中药配方或含有柴胡的植物提取物制剂 等。 另外， 作为除抑肝散以外的含有川芎的待测试样， 可列举出七物降下汤、 十全大补汤、 酸 枣仁汤等中药配方或含有川芎的植物提取物制剂等。另外， 作为除抑肝散以外的含有当归 的待测试样， 可列举出当归芍药散、 加味逍遥散、 人参养荣汤等中药配方或含有当归的植物 提取物制剂等， 再另外， 作为除抑肝散以外的含有甘草的待测试样， 可列举出芍药甘草汤、 温经汤、 四逆散等中药配方或含有甘草的植物提取物制剂等。
上述含有柴胡等的待测试样的生物测定， 基本上能与已对抑肝散所进行的说明同 样地实施， 由于各种生药试样对每种谷氨酸受体的反应性不同， 因此优选预先使用规定浓 度的生药试样进行试验、 并制作标准曲线。
通过以上说明的本发明的生物测定法， 对多个制剂批次进行药理活性值的评价， 将由其平均值等导出的上下限的范围进行标准化， 通过判断待测试样的药理活性值是否符 合该范围， 也能够评价品质同等性。
实施例
下面列举出实施例和参考例， 对本发明进行更详细的说明， 但本发明不受这些实 施例等的任何限定。
参考例 1
待测药物溶液的调制 ：
称 量 20mg 的 待 测 药 物 (TJ-54 或 构 成 生 药 提 取 物 )， 加 入 蒸 馏 水， 调制成 20mg/125μL( 在构成生药提取物的情况下， 为 20mg/100μL)， 进而用 DMSO 稀释 2 倍， 以得 到的溶液作为原液。用该溶液稀释至各浓度。
实施例 1
根据下述 (1) 到 (8) 的方法求出各种浓度的抑肝散 (TJ-54 ； 株式会社津村制 ) 对 谷氨酸受体的结合活性 (％ )。其结果示于图 1。
(1) 待测药物对谷氨酸受体的非选择性结合试验 ：
向从 Wistar 系大鼠采集的脑组织中加入 20mL/g 的 50mM Tris-HCl 缓冲液， 匀浆 后， 重复进行 3 次离心分离 (39,000×g、 15 分钟、 4℃ )， 从而得到膜部分。向 1mL 的管中加 入 200μL 所得到的膜部分溶液 (5-20mg/mL)、 20μL 的 [3H]L- 谷氨酸 ( 最终浓度 ： 3.75nM) 和各种浓度的待测药物溶液 2μL， 在 37℃下孵育 30 分钟。 作为对照组， 加入 DMSO 溶液 ( 最 终浓度 0.5％ )， 同样地进行孵育。
孵育结束后， 用细胞收集器 (Brandel MLR-48、 Skatron micro-96、 PerkinElmer) 过滤到玻璃纤维滤器 (Whatman 1821-915 GF/B、 Whatman)， 用 50mMTris-HCl 缓冲液洗涤 3-6 次后， 用液体闪烁计数器 (Wallac Counter、 PerkinElmer) 测定玻璃纤维滤器的 [3H] L- 谷氨酸的放射活性。非特异性结合由 50μM 的非标记 L- 谷氨酸存在下的 [3H]L- 谷氨酸 的放射活性测得。总结合由待测药物非存在下的 [3H]L- 谷氨酸的放射活性测得。另外， 待 测药物的结合活性由以下的结合抑制率 (％ ) 算出。 结合抑制率 (％ ) ＝ [1-(c-a)/(b-a)]×100
a： 非特异结合的平均 cpm
b： 总结合的平均 cpm
c： 待测药物存在下的 cpm
另外， 本实验的各种条件如下。
细胞膜部分的来源 ： Wistar 系大鼠的脑
对照 ： 0.5％ DMSO
反应缓冲液 ： 含有 CaCl22.5mM 的 50mM Tris-HCl(pH7.4)
反应时间及温度 ： 30 分钟、 37℃ 3
配体 ： 3.75nM 的 [ H]L- 谷氨酸 (PerkinElmer)
非特异性配体 ： 50μM 的 L- 谷氨酸 (Sigma)
Kd ： 0.293μM
Bmax ： 36pmol/mg 蛋白质
特异性结合 ： 90％
(2) 待测药物对 AMPA 受体的结合试验 ：
向从 Wistar 系大鼠采集的大脑皮质的组织中添加 20mL/g 的 50mM Tris-HCl( 含 有 200mM KSCN) 缓冲溶液， 匀浆后， 重复进行 3 次离心分离 (48,000×g、 15 分钟、 4℃ )， 从而 得到膜部分。向 1mL 的管中加入 500μL 所得到的膜部分溶液 (5-20mg/mL)、 20μL 的 [3H] AMPA( 最终浓度 ： 5nM) 和各种浓度的待测药物溶液 5.25μL， 在 4℃下孵育 90 分钟。作为对 照组， 加入 DMSO 溶液 ( 最终浓度 0.5％ )， 同样地进行孵育。
孵育完成后， 用细胞收集器 (Brandel MLR-48、 Skatron micro-96、 PerkinElmer) 过滤到玻璃纤维滤器 (Whatman 1821-915 GF/B、 Whatman)， 用 50mM Tris-HCl 缓冲溶液洗 涤 3-6 次后， 用液体闪烁计数器 (Wallac Counter、 PerkinElmer) 测定玻璃纤维滤器的 [3H] AMPA 的放射活性。非特异性结合由 1000μM 的非标记 L- 谷氨酸存在下的 [3H]AMPA 的放射
活性测得。总结合由待测药物非存在下的 [3H]AMPA 的放射活性测得。另外， 待测药物的结 合活性由前述算式的结合抑制率评价。
另外， 本实验的各种条件如下。
细胞膜部分的来源 ： Wistar 系大鼠的大脑皮质
反应液 ： 含有 KSCN200mM 的 50mM Tris-HCl(pH7.4)
对照 ： 0.5％ DMSO
反应时间及温度 ： 90 分钟、 4℃ 3
配体 ： 5nM 的 [ H]AMPA(PerkinElmer)
非特异性配体 ： 1000μM 的 L- 谷氨酸 (Sigma)
Kd ： 0.018μM(Kd1)、 0.99μM(Kd2)
Bmax ： 0.62pmol/mg 蛋白质 (Bmax1)、
17pmol/mg 蛋白质 (Bmax2)
特异性结合 ： 90％
(3) 待测药物对红藻氨酸 (Kainate) 受体的结合试验 ：
向从 Wistar 系大鼠采集的除去小脑的脑组织中加入 20mL/g 的 50mM Tris-HCl 缓 冲溶液， 匀浆后， 重复进行 3 次离心分离 (48,000×g、 15 分钟、 4℃ )， 从而得到膜部分。向 3 1mL 的管中添加 500μL 的膜部分溶液 (5-20mg/mL)、 20μL 的 [ H] 红藻氨酸 ( 最终浓度 ： 5nM) 和各种浓度的待测药物溶液 5.25μL， 在 4℃下孵育 60 分钟。作为对照组， 加入 DMSO 溶液 ( 最终浓度 0.5％ )， 同样地进行孵育。
孵育完成后， 用细胞收集器 (Brandel MLR-48、 Skatron micro-96、 PerkinElmer) 过滤到玻璃纤维滤器 (Whatman 1821-915 GF/B、 Whatman)， 用 50mM Tris-HCl 缓冲溶液洗 涤 3-6 次后， 用液体闪烁计数器 (Wallac Counter、 PerkinElmer) 测定玻璃纤维滤器的 [3H] 红藻氨酸的放射活性。非特异性结合由 1000μM 的非标记 L- 谷氨酸存在下的 [3H] 红藻氨 酸的放射活性测得。总结合由待测药物非存在下的 [3H] 红藻氨酸的放射活性测得。另外， 待测药物的结合活性由前述算式的结合抑制率评价。
另外， 本实验的各种条件如下。
细胞膜部分的来源 ： Wistar 系大鼠的脑组织 ( 除去小脑 )
反应缓冲液 ： 50mM Tris-HCl(pH7.4)
对照 ： 0.5％ DMSO
反应时间及温度 ： 60 分钟、 4℃ 3
配体 ： 5nM 的 [ H] 红藻氨酸 (PerkinElmer)
非特异性配体 ： 1000μM 的 L- 谷氨酸 (Sigma)
Kd ： 0.012μM
Bmax ： 0.35pmol/mg 蛋白质
特异性结合 ： 80％
(4) 待测药物对 NMDA 受体的谷氨酸 (Glutamate) 结合部位的结合试验 ：
向从 Wistar 系大鼠采集的大脑皮质的组织中添加 20mL/g 的 50mM Tris-HCl 缓冲 溶液， 匀浆后， 离心分离 (1,000×g、 10 分钟、 4℃ )。收集其上清液， 离心分离 (20,000×g、 20 分钟、 4 ℃ ) 从而得到颗粒。将该颗粒用缓冲液再悬浮， 离心分离 (8,000×g、 20 分钟、4℃ )。收集上清液， 离心分离 (48,000×g、 20 分钟、 4℃ )， 从而得到颗粒。将该颗粒用缓冲 液再悬浮， 进行 3 次 (20 分钟、 10 分钟、 10 分钟 ) 离心分离 (48,000×g、 4℃ )， 从而得到膜 3 部分。向 1mL 的管中加入 500μL 的膜部分溶液 (5-20mg/mL)、 20μL 的 [ H]CGP-39653( 最 终浓度 ： 2nM) 和各种浓度的待测药物溶液 5.25μL， 在 4℃下孵育 20 分钟。作为对照组， 加 入 DMSO 溶液 ( 最终浓度 0.5％ )， 同样地进行孵育。
孵育完成后， 用细胞收集器 (Brandel MLR-48、 Skatron micro-96、 PerkinElmer) 过滤到玻璃纤维滤器 (Whatman 1821-915 GF/B、 Whatman)， 用 50mM Tris-HCl 缓冲溶液 洗涤 3-6 次后， 用液体闪烁计数器 (Wallac Counter、 PerkinElmer) 测定玻璃纤维滤器的 3 [ H]CGP-39653 的放射活性。非特异性结合由 1000μM 的非标记 L- 谷氨酸存在下的 [3H] CGP-39653 的放射活性来测得。总结合由待测药物非存在下的 [3H]CGP-39653 的放射活性 来测得。另外， 待测药物的结合活性由前述算式的结合抑制率评价。
另外， 本实验的各种条件如下。
细胞膜部分的来源 ： Wistar 系大鼠的大脑皮质
反应缓冲液 ： 50mM Tris-HCl(pH7.4)
对照 ： 0.5％ DMSO
反应时间及温度 ： 20 分钟、 4℃ 3
配体 ： 2nM 的 [ H]CGP-39653(PerkinElmer)
非特异性配体 ： 1000μM 的 L- 谷氨酸 (Sigma)
Kd ： 0.019μM
Bmax ： 2.3pmol/mg 蛋白质
特异性结合 ： 70％
(5) 待测药物对 NMDA 受体的甘氨酸 (Glycine) 结合部位的结合试验 ：
向从 Wistar 系大鼠采集的大脑皮质的组织中， 添加 20mL/g 的 50mM HEPE S 缓冲 溶液， 匀浆后， 离心分离 (1,000×g、 10 分钟、 4℃ )。收集其上清液， 离心分离 (20,000×g、 20 分钟、 4℃ )， 从而得到颗粒。将该颗粒用缓冲溶液再悬浮， 离心分离 (8,000×g、 20 分钟、 4℃ )。收集上清液， 离心分离 (48,000×g、 20 分钟、 4℃ )， 从而得到颗粒。将该颗粒用缓冲 溶液再悬浮， 进行 3 次 (20 分钟、 10 分钟、 10 分钟 ) 离心分离 (48,000×g、 4℃ )， 从而得到膜 3 部分。向 1mL 的管中加入 500μL 的膜部分溶液 (5-20mg/mL)、 20μL 的 [ H]MDL-105519( 最 终浓度 ： 0.33nM) 和各种浓度的待测药物溶液 5.25μL， 在 4℃下孵育 30 分钟。 作为对照组， 加入 DMSO 溶液 ( 最终浓度 0.5％ )， 同样地进行孵育。
孵育完成后， 用细胞收集器 (Brandel MLR-48、 Skatron micro-96、 PerkinElmer) 过滤到玻璃纤维滤器 (Whatman 1821-915 GF/B、 whatman)， 用 50mM HEPES 缓冲液洗涤 3-6 次后， 用液体闪烁计数器 (Wallac Counter、 PerkinElmer) 测定玻璃纤维滤器的 [3H] MDL-105519 的 放 射 活 性。 非 特 异 性 结 合 由 10μM 的 非 标 记 MDL-105519 存 在 下 的 [3H] MDL-105519 的放射活性来测得。总结合由待测药物非存在下的 [3H]MDL-105519 的放射活 性来测得。另外， 待测药物的结合活性由前述算式的结合抑制率评价。
另外， 本实验的各种条件如下。
细胞膜部分的来源 ： Wistar 系大鼠的大脑皮质
反应缓冲液 ： 50mM HEPES(pH7.7)对照 ： 0.5％ DMSO
反应时间及温度 ： 30 分钟、 4℃ 3
配体 ： 0.33nM 的 [ H]MDL-105519(PerkinElmer)
非特异性配体 ： 10μM MDL-105519(Sigma)
Kd ： 6nM
Bmax ： 3.7pmol/mg 蛋白质
特异性结合 ： 85％
(6) 待测药物对代谢型谷氨酸受体 mGluR5 的结合试验 ：
向 1mL 的管中加入 30μg 蛋白质 /100μL 的 CHO-K1 细胞膜溶液、 20μL 的 [3H] 使君子酸 (Quisqulic acid)( 最终浓度 ： 0.03μM) 和各种浓度的待测药物溶液 1.1μL， 在 25℃下孵育 2 个小时。作为对照组， 加入 DMSO 溶液 ( 最终浓度 0.5％ )， 同样地进行孵育。
孵育完成后， 用细胞收集器 (Micro 96 FilterMate， PerkinElmer) 过滤到玻璃纤 维滤器 (Whatman 1821-915 GF/B、 Whatman)， 用 20mM HEPES 缓冲溶液洗涤 6 次后， 用液体 3 闪烁计数器 (Wallac Counter) 测定玻璃纤维滤器的 [ H] 使君子酸的放射活性。非特异性 结合由 1000μM 的非标记 L- 谷氨酸存在下的 [3H] 使君子酸的放射活性来测得。总结合由 待测药物非存在下的 [3H] 使君子酸的放射活性来测得。另外， 待测药物的结合活性由前述 算式的结合抑制率评价。
另外， 本实验的各种条件如下。
细胞膜的来源 ： CHO-K1 细胞 ( 表达人重组 mGluR5)(PerkinElmer)
反应缓冲液 ： 含有 MgCl2 2mM、 CaCl2 2mM 的 20mM HEPES(pH7.4)
对照 ： 0.5％ DMSO
反应时间及温度 ： 2 小时、 25℃
配体 ： 0.03μM 的使君子酸 (PerkinElmer)
非特异性配体 ： 1000μM 的 L- 谷氨酸 (Sigma)
Kd ： 0.026μM
Bmax ： 0.68pmol/mg 蛋白质
特异性结合 ： 85％
( 结果 )
如图 1 所示， 关于 25 到 800μg/mL 浓度的抑肝散 (TJ-54 ； 株式会社津村制 ) 对 谷氨酸受体的结合活性 (％ )， NMDA 显示出最高的结合活性， 接着依次是红藻氨酸、 AMPA、 mGluR5。另外， NMDA 受体中， 可见与谷氨酸结合部位和甘氨酸结合部位的结合活性。进而， 可认为各谷氨酸受体中的结合活性存在用量依赖性。
实施例 2
以实施例 1 的方法求出抑肝散 (TJ-54 ； 株式会社津村制 ) 的各构成生药的 7 种提 取物 (50μg/mL) 的结合活性 (％ )。该结果示于图 2。另外， 图中也一并记载了 200μg/mL 抑肝散的结合活性 (％ )。
由图 2 的结果可认为， 对于 AMPA 受体， 柴胡、 川芎、 和当归有较高活性， 对于红藻氨 酸受体， 柴胡、 川芎、 当归、 和甘草有较高活性。另外认为， 对于 NMDA 受体的谷氨酸结合部 位， 柴胡、 川芎、 当归和甘草有较高活性， 对于 NMDA 受体的甘氨酸结合部位， 柴胡、 川芎和甘草有较高活性。此外认为， 对于 mGluR5， 柴胡和川芎有较高活性。
由上述实施例 1 和实施例 2 的结果可知， 抑肝散的用量与结合活性之间存在较高 的相关关系， 另外， 抑肝散的构成生药中， 柴胡、 川芎、 当归或甘草与对各谷氨酸受体的结合 活性之间存在较高的相关关系。由该结果可以了解到， 以实施例 1 的方法能够测定抑肝散 的药理活性值， 以及各种谷氨酸受体的结合活性是由抑肝散中的柴胡、 川芎、 当归或甘草产 生的。
产业上的可利用性
根据本发明， 通过试管内试验， 能够不受试验设施、 试验动物、 处理能力等的限制， 简便且稳定地求出抑肝散的药理活性值。
因此， 与以往的对所含的一定成分进行分析的方法相比， 能够以更高程度保证抑 肝散的品质。