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促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶的组合物和使用方法
    发明领域 本发明涉及植物基因操作领域， 尤其涉及植物中基因活性和发育的调节。
     发明背景
     在复杂的信号转导机制中， 促分裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinases， MAPKs) 整合各种第二信使所传导的多种细胞内信号。MAPKs 能使多种酶和转录因 子磷酸化并调节其活性。MAPKs 活性由一连串级联反应触发， 所述级联反应通过 MAPK 激酶 (MAPKK) 导致 MAPK 的苏氨酸和酪氨酸的磷酸化。MAPKK 由 MAPKKK 激活， 所述 MAPKKK 通过 其丝氨酸 / 苏氨酸磷酸化而变得有活性。
     MAPK 磷酸化级联在真核生物中高度保守。确实， 已在酵母、 果蝇、 哺乳动物细胞和 植物中鉴定了同源物。到 2002 年为止， 仅在拟南芥 (Arabidopsis) 中就鉴定出超过 60 种 MAPKKK 基因 (Ichimura， et al.， (2002)Trends plant Sci 7 ： 301-308)。由于上述级联中 涉及大量蛋白， 因此， 不明确哪种蛋白是必不可少的、 如果缺失会造成致命性或在功能上是 多余的。
     MAPKKKs 和其靶标参与真核生物的生长和发育。例如， 在植物中， MAPKKK 级联与胚 芽发育、 细胞分裂、 疾病防御应答和非生物胁迫应答有关 (Tena， et al.， (2001)Curr Opin Plant Biol 4 ： 392-400.)。
     最近发现， MAPKKK 基因中称为 YODA(YDA) 的功能突变缺失产生缺失胚柄的拟南芥 (Arabidopsis) 植物胚胎， 胚柄即为， 功能是从胚乳向生长的胚胎提供营养的组织。并不是 所有的 yda 植物都能发育成成熟植物， 并且那些发育成成熟植物的 yda 植物表现出根发育 延迟并且比野生型植物要小。已知的植物激素不能营救 yda 表型， 这提示新的发育信号通 路 (Lukowitz， et al.， (2004)Sci.STKE 2004 tw21)。
     在拟南芥 ANP 家族中， 已经鉴定出数种 MAPKKKs， 并且其与调节细胞分裂有关联。 (Krysan， et al.， (2002)plant cell 14 ： 1109-1120)。在本氏烟 (N.benthamiana) 叶子中 也鉴定出 MAPKKK， 并且发现其在抵御丁香假单胞杆菌 (Pseudomonas syringae) 的过敏反 应和抗性中发挥作用 (Pozo， et al.， (2004)The EMBO Journal 23 ： 3072-3082)。发现同样 的 MAPKKK 在经历丁香假单胞杆菌感染的易感叶子中调节细胞死亡 (Pozo， et al.， (2004) The EMBO Journal 23 ： 3072-3082)。
     发现表达不同水平的 Tobacco NPK1 的组成型活性拟南芥直系同源物的转基因 烟草植株， 在盐水平升高、 低温和热休克存在的情况下， 比野生型植物生长得更旺盛， 但 是在正常的生长条件下， 所述转基因烟草在表型上与野生型植物并无不同 ( 美国专利第 6,613,959 号 )。操纵这个氧化胁迫信号调节剂能保护植物免受各种环境胁迫， 例如热和高 盐。参见美国专利第 6,613,959 号 (Kovtun， et al.， (2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97 ： 2940-2945)。
     因此， MAPKKKs 参与植物生长和发育的很多方面。鉴于 MAPKKK 信号转导级联成 员， 尤其是 MAPKKK 信号转导分子， 在调节范围从细胞增殖和分化到细胞凋亡的植物细胞进 程中的重要作用， 需要鉴定出植物 MAPKKK 多核苷酸和多肽以及用来调节各种应答和发育
     的这些分子的调节剂。由于这些和其他的原因， 需要本发明。
     发明概述
     通常， 本发明的目的是， 提供与 MAPKKK 有关的多核苷酸和多肽。本发明的目的是， 提供包含本发明的多核苷酸和多肽的转基因植物。 此外， 本发明的目的是， 提供在植物细胞 或转基因植物中， 调节本发明的多核苷酸和多肽表达的方法。 本发明的另一个目的是， 提供 增强植物非生物胁迫抗性和耐受性的方法。
     因此， 一方面， 本发明涉及分离的 MAPKKK 多核苷酸， 其编码 SEQ ID NO ： 2、 5、 8 或 10 的多肽 ； 具有 SEQ ID NO ： 1、 4、 7 或 9 的序列的多核苷酸序列 ； 长度为至少有 30 个核苷酸的 多核苷酸， 其在严紧条件下可与任一前述多核苷酸杂交。另一方面， 本发明包括与 SEQ ID NO 为 ： 1、 4、 7 或 9 具有至少 60％的序列同一性的多核苷酸。还包括用基于本发明序列的引 物从核酸文库扩增的分离的多核苷酸， 所述引物为， 例如， 如 SEQ ID NOS 12 和 13 分别所示 的 ZmNPK1b- 正向引物和 ZmNPK1b- 反向引物。一方面， 核酸文库是玉米 (Zea mays( 玉米 )) 文库。另一方面， 核酸文库是 cDNA 文库。在本文中， 本发明另一方面提供了分离的多核苷 酸， 所述多核苷酸由于遗传密码对于任何本发明的 MAPKKK 是简并的。另一方面， 分离的核 苷酸和本发明的任一 MAPKKKs 的多核苷酸是互补的。另一方面， 本发明涉及编码 MAPKKK 多 肽的分离的多核苷酸， 所述 MAPKKK 多肽赋予对脱水、 盐度、 温度胁迫、 环境胁迫或病原体的 抗性和耐受性。
     另一方面， 本发明涉及转基因植物， 包括重组表达盒在内， 其包含可操作地连接于 本发明任何分离的多核苷酸的植物启动子。本发明还提供了转基因植物的转基因种子。另 一方面， 本发明涉及用重组表达盒转染的宿主细胞， 所述重组表达盒包括可操作地连接于 本发明任何分离的多核苷酸的植物启动子。一方面， 宿主细胞是大豆、 水稻或玉米细胞。
     另一方面， 本发明涉及分离的多肽， 所述分离的多肽具有与 SEQ ID NO 2、 5、 8 或 10 所示的氨基酸序列有至少 70％的序列同一性的氨基酸序列， 并具有 MAPKKK 活性。另一方 面， 本发明涉及包含重组表达盒的转基因植物， 所述重组表达盒包含可操作地连接于分离 的多核苷酸的植物启动子， 所述分离的多核苷酸编码多肽， 所述多肽具有与 SEQ ID NO 2、 5、 8 或 10 所示的氨基酸序列有至少 70％的序列同一性的氨基酸序列， 并具有 MAPKKK 活性。 本发明还提供了转基因植物的转基因种子。另一方面， 本发明涉及用重组表达盒转染的宿 主细胞， 所述重组表达盒包含可操作地连接于任何编码本发明多肽的分离的多核苷酸的植 物启动子。
     另一方面， 本发明涉及调节植物细胞中 MAPKKK 蛋白水平的方法。一方面， 所述方 法包括用可操作地连接于启动子的 MAPKKK 多核苷酸转化植物细胞。所述多核苷酸可以位 于有义或反义方向上。所述方法还包括表达所述多核苷酸达足够调节植物细胞内 MAPKKK 蛋白的时间量。
     另一方面， 本发明提供了调节植物中 MAPKKK 蛋白水平的方法。所述方法包括用 MAPKKK 多核苷酸稳定地转化植物细胞， 所述 MAPKKK 多核苷酸， 在有义或反义方向上， 可操 作地连接于在植物细胞中有功能的启动子。 所述方法包括将转化的植物细胞再生为转化的 植物， 所述转化的植物表达的 MAPKKK 多核苷酸的量足以调节植物中的 MAPKKK 蛋白水平。
     另一方面， 本发明涉及增强植物非生物胁迫抗性或耐受性的方法。 一方面， 所述方 法包括将包含编码本发明 MAPKKK 的多核苷酸的构建体引入植物细胞。所述多核苷酸可以可操作地连接于在植物细胞有功能的启动子， 以便产生转化的植物细胞。将所述转化的植 物细胞再生成转化的植物。以足以诱导非生物胁迫抗性和耐受性的水平， 在转基因植物的 至少一些细胞中表达 MAPKKK。 一方面， 非生物胁迫是干旱、 低温、 盐、 渗透胁迫、 霜冻或冰冻、 高温、 氧化胁迫或化学胁迫。所述方法可以提供对其他环境胁迫， 例如， UV-B、 臭氧、 光致氧 化、 除草剂、 病原体， 或也涉及氧化胁迫损伤的其他胁迫等的耐受性。
     根据下面的描述， 本发明的其他目的、 特征、 优势和方面对本领域技术人员而言会 变得明显。 然而， 应当理解， 下面的描述和具体实施例， 尽管表明本发明的优选实施方案， 但 是， 仅以举例而给出。 由阅读下面的描述和本发明公开内容的其他方面， 本公开的发明实质 和范围内的各种改变和修改会毫无困难地变得对于本领域技术人员是显然的。
     附图简要说明
     从下述详细描述和附图更全面的了解本发明并且序列表形成本申请的一部分。
     图 1. 寒冷胁迫下， B73 和 CML349 间胁迫诱导的 ZmNPK1b 基因表达的差异。
     图 2.MAPKKK 的 CLUSTAL X(1.83) 多重序列比对。针对水稻序列， OsNPK1 样蛋白 即 NP_917084(SEQ ID NO ： 14)、 NP_917080(SEQ ID NO ： 15) 和 BAF24980(SEQ ID NO ： 16)， 以及拟南芥 ANP1 序列 O22040(SEQ ID NO ： 17)， 比对 ZmNPK1a(SEQ ID NO ： 2)， ZmNPK1b(SEQ ID NO ： 5) 和 ZmNPK1d(SEQ ID NO ： 10)。 将部分蛋白即 ZmNPK1c(SEQ ID NO ： 8)， 排除在比对 外。优选用星号标记保守残基， 其主要位于该蛋白的 N 端半部分。 图 3. 基于其氨基酸序列， 从玉米、 水稻和拟南芥 NPK1 样序列构建的系统树。用多 重比对工具 CLUSTAL， 构建系统树图。
     序列的简单描述
     如下文表 1 所示， 本申请提供了 MAPKKK 序列的详情。
     表1
     发明的详细描述
     在后文中， 将参照附加的实施例对本发明进行更全面的描述， 在所述实施例中， 展 示了本发明的一些而不是所有实施方案。 实际上， 本发明可以以许多不同的形式体现， 并且 不应解释为局限于本文阐述的实施方案， 更确切地是， 提供这些实施方案， 以便本公开满足 合适的法律要求。相似标记指示相似的元件。
     在获得本文所提出的说明书和附图的教导后， 本领域技术人员会想到本文展示的 本发明的许多改变和其他实施方案。 因此， 应当理解， 本发明并不限于所公开的具体实施方 案， 并且意图将改变和其他实施方案包括在附加的权利要求的范围内。尽管本文用到具体 的术语， 但是其仅以一般和说明性的含义而使用， 并不是为了限制的目的。
     本文所使用的冠词 “a( 一个 )” 和 “an( 一个 )” 是指该冠词的一个或多于一个 ( 即 至少一个 ) 语法对象。作为实例， “元件 (an element)” 表示一个或多于一个元件。
     综述
     本发明提供了调节， 例如， 增加或减少植物细胞或植物中 MAPKKK 蛋白水平的新组 合物和方法。尤其是， 本发明的多核苷酸和多肽能够用来产生表达本发明 MAPKKK 的转基因 植物。
     本发明人发现了四种新的 MAPKKKs， 发现其中之一 (ZmNPK1b)， 相对于在 B73 中的 表达水平， 在 CML349 中高水平表达， CML349 是已知耐寒的热带高原系， B73 是相对较不耐寒 的玉米带臼齿近交种 (corn-belt dent inbred)。 本发明 MAPKKK 的调节可能会提供操纵植 物对非生物胁迫应答的机制， 所述非生物胁迫包括但不限于， 干旱、 低温、 盐、 渗透胁迫、 霜 冻或冰冻、 高温、 氧化胁迫和化学胁迫， 以及由诸如 UV-B、 臭氧、 光致氧化、 除草剂、 病原体的 其他环境因素引起的胁迫或也引起氧化胁迫损伤的其他胁迫。因此， 本发明提供了用本发 明的 MAPKKK 多核苷酸和多肽调节， 例如增强或减弱植物对胁迫尤其是非生物胁迫的抗性 或耐受性的方法。
     组合物
     组合物包括促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶 (MAPKKK) 水平和 / 或活性发生改变 的植物。如本文所使用的， 术语促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶 (MAPKKK) 包括但不限于本 文公开的序列， 例如 MAPKKK， 其保守修饰的变体， 不管其来源， 和保留了 MAPKKK 的生物特性 例如本文公开的 MAPKKK 活性的任何其他变体。 在具体组合物中， 植物的具有 SEQ ID NO ： 2、 5、 8 或 10 所示氨基酸序列的 MAPKKK 多肽或其活性变体或片段的水平和 / 或活性发生改变。还提供了 MAPKKK 多肽或其活性变 体或片段的水平和 / 或活性发生改变的植物， 所述 MAPKKK 多肽由 SEQ ID NO ： 1、 4、 7或9所 示的多核苷酸编码。本发明的植物显示出调节胁迫耐受性、 结籽率 (seed set)、 植物产量、 植物活力 (plant vigor)、 枝条生长、 叶衰老、 枝条再生或根生长。
     在具体的实施方案中， 本发明的植物具有稳定并入其基因组的 MAPKKK 序列。在另 外的实施方案中， MAPKKK 序列可操作地连接于在植物中有活性的组织优选启动子。
     其他的实施方案提供了在编码 MAPKKK 多肽的天然基因组基因座处已被遗传修饰 的植物。 “天然基因组基因座” 意图表示天然存在的基因组序列。在一些实施方案中， 天然 基因座如分别为 ZmNPK1a、 ZmNPK1b 和 ZmNPK1d 的 SEQ ID NOS ： 3、 6 和 11 中所示。用先锋专 有的基因模拟算法， 提供了 ZmNPK1a 和 ZmNPK1d 的基因组序列。所述基因模拟算法统一了 玉米序列的公开和专有信息， 产生基因结构， 并且随着新的玉米序列信息可以利用， 可以修 订该基因结构。用已测序的 BAC 克隆 p1.bacb.pk191.e03 的信息， 提供了 ZmNPK1b 基因组 序列信息。
     遗传修饰包括引入 MAPKKK 序列或修饰编码 MAPKKK 的天然基因组基因组座或两者 都有， 并且其可能导致表型改变。 “表型改变” 意指一个或多个细胞功能中可检测的改变。 例如， 在编码 MAPKKK 多肽的基因组基因座上有遗传修饰的植物可以表现出， MAPKKK 多肽 的表达或活性降低或消除。可以在组织或全植物水平观察某些表型改变， 例如根发育修饰 或幼苗生长增强。本文的其他地方较详细地描述了遗传修饰的各种方法， 正如影响本发明 MAPKKK 序列的水平和 / 或活性的修饰所导致的表型的实例。
     表型改变可以包括但并不限于调节根发育、 胁迫耐受性、 枝条发育、 叶发育、 叶衰 老、 光合作用、 愈伤组织再生、 结籽率、 植物产量或植物活力。
     修饰的植物是感兴趣的， 修饰的植物是修饰的植物细胞、 植物原生质体、 能再生植
     物的植物细胞组织培养物、 植物愈伤组织、 在植物或植物部分中完整的植物块茎和植物细 胞， 所述植物部分例如胚、 花粉、 胚珠、 种子、 叶、 花、 枝 (branch)、 果实 (fruit)、 核 (kemel)、 穗 (ear)、 玉米穗轴 (cob)、 外壳 (husk)、 茎 (stalk)、 根、 根尖、 花药、 谷粒 (grain) 等。如本 文所使用的，″谷粒″表示商业种植物产生的成熟种子， 用于除了发展或繁育物种以外的 目的， 例如， 最终用途为用作饲料、 食品或纤维。再生植物的后代 (progeny)、 变体和突变体 也包括在本发明的范围内， 只要这些植物或植物部分包含遗传修饰。
     本发明使用的 MAPKKK 多肽和 MAPKKK 蛋白家族成员共有序列同一性。MAPKKK 活 性的改变改变了涉及促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶 (MAPKKK) 级联的细胞内信号过程。 这些包括 MAPK 激酶激酶 (MAP3K， 也称为 MAPKKK 或 MEKK)、 MAPK 激酶 (MAP2K， 也称为 MKK 或 MEK) 和 MAPK 或细胞外信号调节激酶 (ERK) 的级联。MAPKKK/MEKK 使其下游的蛋白激酶 MAPKK/MEK 磷酸化并将其激活， 所述 MAPKK/MEK 顺序激活 MAPK。
     如本文所描述的， 本发明人已经在玉米中鉴定出四种新的 MAPKKK cDNAs， 其 是 水 稻 NPK1 的 同 源 物。 本 发 明 的 玉 米 MAPKKKs 多 核 苷 酸 是 长 度 为 1396(ZmNPK1a)、 1864(ZmNPK1b)、 1662(ZmNPK1c) 和 1375(ZmNPK1d) 的 核 苷 酸， 编码计算的分子量为 46KDa(ZmNPK1a)、 54KDa(ZmNPK1b)、 41KDa( 部分 ZmNPK1c) 和 40KDa(ZmNPK1d) 的多肽。利 用 GAP(BLOSUM 62)， 多肽 ZmNPK1a、 ZmNPK1b 和 ZmNPK1d 在 ZmNPK1a 和 ZmNPK1b 之间共享 约 53 ％的氨基酸共有序列， 在 ZmNPK1a 和 ZmNPK1d 之间约 65 ％， 在 ZmNPK1b 和 ZmNPK1d 之 间 约 61 ％。 玉 米 ZmNPK1a、 ZmNPK1b 和 ZmNPK1d 的 cDNA 编 码 与 水 稻 NPK1- 样 基 因 (dbj|BAB64165.1|(AP003254)NPK1- 相关蛋白激酶 - 样蛋白 [ 水稻 (Oryza sativa)] 分 别具有约 58％、 73％、 63％总氨基酸同一性的多肽。用 BLAST 搜索公开的和专有的 BAC 序 列检查玉米 MAPKKK 可能的染色体定位。玉米 MAPKKKS 中的三种， 即 ZmNPK1a， ZmNPK1b 和 ZmNPK1d， 定位在染色体 3 上， 而第四个， 即 ZmNPK1c(PCO622918) 定位在染色体 2 上。用先 锋专有的关联工具 (association tool)， 检查与干旱胁迫的任何已知 QTL 的潜在关联。因 此， 观察到， ZmNPK1a 和 ZmNPK1d 与和 Staygreen 表型相关的 QTL 有潜在关联 (Thomas and Howarth， (2000)J Exp Bot 51Spec No ： 329-337)， 并且观察到 ZmNPK1c 与产量 QTLs 并且还 与雌雄穗花开间隔、 Staygreen 和 Barrencount 的干旱 QTLs 有潜在关联。用这个专有的关 联工具预测的这些与 QTLs 的潜在关联并未证明， 这些具体基因控制所述性状， 而其仅仅暗 示在哪一性状处存在关联。为了进一步表征 MAPKKKs， 在 Lynx 大规模并行信号测序 (Lynx Massively Parallel Signature Sequencing(MPSS)) 文库中分析所有四个 MAPKKK 序列的 表达 ( 表 4)。(Brenner， et al.， (2000)Nat Biotechnol.18 ： 630-634)。ZmNPK1a 的高表 达见于茎、 根和 B73 茎的叶枕组织。ZmNPK1b 的高表达见于核和根组织， 授粉后第 0 天的玉 米核， 和玉米的初生根。在特定组织中没有检测到 ZmNPK1c 的表达， 很可能是在 Lynx 文库 有非常少的代表。最后， ZmNPK1d 表达在所有组织中均匀分配， 在授粉后第 0 天的玉米核中 水平最高。如本文实施例 10 所示， 还发现 ZmNPK1b 和 ZmNPK1d 被干旱胁迫和用本文所述的 应激激素即 ABA 和乙烯处理特异性诱导。
     不希望受到该理论的束缚， 本发明人认为， 本发明的 MAPKKK 对增强许多非生物胁 迫的胁迫抗性或耐受性有用。如本文所使用的， 术语 “非生物胁迫” 包括但不限于干旱、 低 温、 盐、 渗透胁迫、 霜冻或冰冻、 高热温、 氧化胁迫和化学胁迫以及诸如 UV-B、 臭氧、 光致氧 化、 除草剂、 病原体的其他环境胁迫引起的胁迫， 或也涉及氧化胁迫损伤的其他胁迫 (Greenand Fluhr， (1995)Plant Cell 7 ： 203-212 ； Prasad， (1996)Plant J.10 ： 1017-1026 ； Willekens， et al.， (1997)EMBO J.16 ： 4806-4816 ； Chamnongpol， et al.， (1998)Proc. Natl.Acad.Sci USA 95 ： 5818-5823 ； Schraudner， et al.， (1998)Plant J.16 ： 235-245 ； Karpinski， et al.， (1999)Science 284 ： 654-657)。
     对一种或多种非生物胁迫的抗性或耐受性可以直接通过激活 MAPKKK 的靶标或间 接通过 MAPKKK 信号转导级联来实现， 其包括本发明 MAPKKK 的下游靶标。因此， 在植物细胞 中， 调节本发明 MAPKKK 的 MAPKKK 活性， 为交叉保护植物免受一种或多种非生物胁迫提供了 新的策略。
     还考虑的是， 在调节级联中， 激活或表达位于 ZmNPK MAPKKK 上游的基因， 以便实 现 MAPKKK 靶标的激活。MAPKKK 的靶标或底物包括但不限于转录因子、 其他蛋白激酶和细 胞骨架相关蛋白。靶标或底物可以用本领域技术人员共知的技术鉴定， 包括在凝胶激酶检 测 (gel kinase assay)、 酵母双杂交检测 (yeast two-hybrid assay)、 使用连接于报告基 因上的胁迫应答启动子的原生质体瞬时表达检测， 例如， 在氧化胁迫、 热、 寒冷或干旱等过 程中被激活的启动子 (Kovtun， et al.， (2000).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97 ： 2940-2945 ； Machida， et al.， (1997)Critic.Rev.Plant Sci.16 ： 481-496 ； Mazoguchi， et al.， (1997) Trends Biotechnol.15 ： 15-19 ； Zhang and Klessig， (1997)Plant Cell 9 ： 809-824 ； Jonak， et al.， (1999)Cell.Mol.Life.Sci.55 ： 204-231)。
     调节本发明 MAPKKK 活性的化合物可以通过评估转录因子和 MAPKKK 启动子中的调 控元件的相互作用来确定， 例如， 激素应答或胁迫应答调控元件。例如， 在 ZmNPK1b 的启动 子序列中， 至少有一个脱落酸 - 应答元件 (ABRE)， 特别是 ABREAT 共有序列 YACGTGGC， 还有 C- 重复 / 脱水应答元件 (CRT/DRE) 共有序列 CCGAC。检测 DNA 结合蛋白和靶 DNA 序列的相 互作用的试验 ( 例如电泳迁移率变动分析、 DNA 酶 I 足迹分析等 ) 在本领域内是已知的。在 受试化合物例如生长素或过氧化氢存在和缺失下， 通过实施这样的试验， 这些试验能用来 鉴定调节 ( 例如， 抑制或增强 )DNA 结合蛋白和其靶 DNA 序列相互作用的化合物。
     如本文所用的， “其中植物胁迫抗性或耐受性相对于对照植物的胁迫抗性或耐受 性增强了， 所述对照植物对本发明的 MAPKKK 而言是非转基因的” ， 是指相对于对照植物， 所 述植物生长和 / 或产量的增加和 / 或对胁迫的抗性改善。例如， 植物对特定非生物胁迫例 如盐度的胁迫抗性或耐受性， 可以通过比较植物生长的物理特性和特征来估计， 例如， 转基 因植物和非转基因对照植物的植物高度和重量、 叶面积、 植物水分关系、 开花能力、 结种子 的能力、 产量 / 生产率和含糖量 (Shou， et al.， (2004)J Exp Bot.55(399) ： 1013-9)。另一 方面， 非生物胁迫下所观察的转基因 MAPKKK 植物的植物生长的物理特性和特征也可以与 未暴露在非生物胁迫下的转基因 MAPKKK 植物和对本发明的 MAPKKK 而言是非转基因的对照 植物的物理特性和特征比较， 从而可以进一步评价 “正常” 的植物生长和特征。
     “增强胁迫抗性或耐受性” 表示介导转基因植物对胁迫 ( 例如， 诸如污染的人为胁 迫， 或诸如干旱、 盐度和氧化胁迫和温度胁迫的环境胁迫， ) 的忍耐力、 适应性或持久性的水 平， 所述水平比对照植物表现的更好 ( 例如， 非转基因植物 )。优选地， 本发明转基因植物 ( 或转化的植物细胞、 植物组分、 植物组织或植物器官 ) 的胁迫抗性或耐受性水平比非转基 因对照植物 ( 或对照植物细胞、 植物组分、 植物组织或植物器官 ) 所表现出的胁迫耐受性要 高至少 5％、 10％或 20％ ( 并且优选 30％或 40％ )。在其他优选的实施方案中， 胁迫抗性或胁迫耐受性水平比对照植物高 50％、 60％和更优选甚至高 75％或 90％， 最优选， 与对照植 物相比， 高于耐受性水平高达 100％。通过用来测定植物生长和胁迫应答的常规方法， 检测 胁迫抗性或耐受性水平。例如， 对盐度的胁迫耐受性可以通过比较转基因植物和非转基因 对照植物的物理特性和特征 ( 例如， 植物高度和重量、 叶面积、 植物水分关系、 开花能力、 结 种子的能力、 产量 / 生产率 ) 来确定。
     MAPKKK 多核苷酸和由此编码的蛋白的片段和变体可用于本发明。 “片段” 意指多 核苷酸的一部分或氨基酸序列的一部分和因此由其编码的蛋白的一部分。 多核苷酸片段可 以编码蛋白片段， 所述蛋白片段保留了天然蛋白的生物活性并因此保留了 MAPKKK 活性， 例 如， 由其推断的调节结构域的缺失所产生的组成型活性的 MAPKKK。
     如本文所交替使用的， “MAPKKK 活性” ， “MAPKKK 的生物活性” 或 “MAPKKK 的功能活 性” ， 是指按照标准技术， 在体内或体外测定的 MAPKKK 蛋白、 多肽或其部分发挥的活性。 在一 个实施方案中， MAPKKK 活性是直接的活性， 例如与 MAPKKK- 靶分子结合。如本文所使用的， “靶分子” 是 MAPKKK 蛋白本质上与之结合或相互作用的分子， 从而实现 MAPKKK- 介导的功 能。MAPKKK 靶分子可以是非 MAPKK 分子或 MAPKKK 蛋白或本发明的多肽或 MAPKK 蛋白或多 肽。 在示例性实施方案中， MAPKKK 靶分子是 MAPKKK 底物 ( 包括例如但不限于 ZmMPK4(MAP 激 酶 4， Genbank 登录号为 BAA74733) 或 ZmMPK5(MAP 激酶 5， Genbank 登录号为 BAA74734.1)。 在优选实施方案中， MAPKKK 活性为至少一种或多种下述活性 ： (i)MAPKKK 蛋白与可溶的 MAPKKK 配基的相互作用 ( 例如， 但不限于 ZmMPK4 或 ZmMPK5 等 ) ； (ii) 调节 MAPKKK 底物的 活性 ； (iii) 激活 MAPKKK 底物 ； (iv) 间接调节下游信号分子 ( 例如， MAPKK)。在另一个优 选实施方案中， MAPKKK 活性为至少一种或多种下述活性 ： (1) 在体外或体内， 调节细胞信号 转导 ； (2) 调节表达 MAPKKK 蛋白的细胞内的基因转录 ； (3) 调节表达 MAPKKK 蛋白的细胞内 的基因转录， 其中所述细胞参与非生物胁迫抗性或耐受性 ； (4) 调节细胞增殖 ； (5) 调节细 胞分化 ； (6) 调节发育以及 (7) 调节细胞死亡。
     可选择地， 用作杂交探针或 PCR 引物的多核苷酸的片段通常不编码保留生物活性 的蛋白片段。因此， 核苷酸序列片段的变化范围可以为从至少约 20 个核苷酸， 约 50 个核苷 酸， 约 100 个核苷酸， 到高达编码本发明所用蛋白的全长多核苷酸。
     编码本发明所用的 MAPKKK 蛋白的生物活性部分的 MAPKKK 多核苷酸的片段将编码 至少 15、 25、 30、 50、 75、 100、 125、 150、 175、 200、 220 或 225 个连续氨基酸， 或高达存在于本发 明的全长或部分 MAPKKK 蛋白的氨基酸总数 ( 例如， 分别为 SEQ ID NOS ： 2、 5、 8 和 10 的 441、 514、 366 或 392 个氨基酸 )。
     通过分离本发明所用的一个 MAPKKK 多核苷酸的一部分， 表达 MAPKKK 蛋白的编码 部分 ( 例如， 通过体外重组表达 )， 并且评价 MAPKKK 蛋白的编码部分的活性， 来制备 MAPKKK 蛋白的生物活性部分。为 MAPKKK 核苷酸序列片段的多核苷酸包含至少 16、 20、 50、 75、 100、 150、 200、 250、 300、 350、 500、 550、 500、 550、 600、 650、 700、 800、 900、 1,000、 1,100 个 核 苷 酸， 或高达存在于本文所公开的全长 MAPKKK 多核苷酸中的核苷酸数 ( 例如， 分别为 SEQ ID NOS ： 1、 4、 7 和 9 的 1396、 1864、 1662 和 1375 个核苷酸 )。
     “变体” 意图表示实质上相似的序列。对于多核苷酸而言， 变体包含在天然多核 苷酸内一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的缺失和 / 或添加， 和 / 或在天然多核苷酸 的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的取代。如本文所使用的， “天然” 多核苷酸或多肽分别包括天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。对于多核苷酸而言， 保守变体包括这 样的序列， 其由于遗传密码的简并性， 编码本发明 MAPKKK 多肽之一的氨基酸序列。诸如这 些的天然存在的变体， 能用公知的分子生物学技术鉴定， 例如， 用下述概述的聚合酶链式反 应 (PCR) 和杂交技术。变异的多核苷酸还包括合成来源的多核苷酸， 例如， 由例如用定点 诱变产生但仍编码本发明所用的 MAPKKK 蛋白那些多核苷酸。通常， 如本文其他地方描述 的序列比对程序和参数所测定的， 本发明具体多核苷酸的变体与该具体多核苷酸具有至少 约 50％、 55％、 50％、 55％、 60％、 65％、 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 91％、 92％、 93％、 95％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％或更高的序列同一性。
     本发明所用的具体多核苷酸变体 ( 即， 参照多核苷酸 ) 也可以通过比较变异的多 核苷酸所编码的多肽和参照多核苷酸所编码的多肽间的序列同一性来估算。 因此， 例如， 包 括编码与 SEQ ID NO ： 2、 5、 8 或 10 的多肽中任一个具有给定百分比序列同一性的多肽的分 离的多核苷酸。 任何两条多肽间的序列同一性百分比可以用本文其他地方所述的序列比对 程序和参数来计算。 如果本发明的任何给定的多核苷酸对通过比较其编码的两条多肽所共 有的序列同一性百分比来估算， 则两条编码的多肽间的序列同一性百分比为至少约 50％、 55 ％、 50 ％、 55 ％、 60 ％、 65 ％、 70 ％、 75 ％、 80 ％、 85 ％、 90 ％、 91 ％、 92 ％、 93 ％， 、 95 ％、 95 ％、 96％、 97％、 98％、 99％或更高的序列同一性。 “变异” 的蛋白意图表示， 通过在天然蛋白内一个或多个位点处的一个或多个氨基 酸的缺失或添加和 / 或在天然蛋白内一个或多个位点处的一个或多个氨基酸的取代， 而来 源于该天然蛋白的蛋白。 包括在本发明中的变异的蛋白是生物活性的， 换而言之， 其继续具 有期望的天然蛋白生物活性， 即本文所述的 MAPKKK 活性。这样的变体可以由例如， 遗传多 态性或人为操纵产生。如本文其他地方描述的序列比对程序和参数所测定的， 本发明天然 MAPKKK 蛋白的生物活性变体与天然蛋白的氨基酸序列具有至少约 50％、 55％、 60％、 65％、 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 91％、 92％、 93％、 95％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％或更高的 序列同一性。本发明蛋白的生物活性变体与该蛋白的不同可以为少至 1-15 个氨基酸残基， 少至 1-10 个， 例如 6-10， 少至 5 个， 少至 5、 3、 2 或甚至 1 个氨基酸残基。
     本发明方法所用的蛋白可以通过各种方法改变， 包括氨基酸取代、 缺失、 切断和插 入。用于这类操作的方法在本领域内通常是已知的。例如， MAPKKK 蛋白的氨基酸序列变体 和片段能通过 DNA 的突变来制备。诱变和多核苷酸改变的方法在本领域内是公知的。参 见， 例如， Kunkel， (1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82 ： 588-592 ； Kunkel， et al.， (1987) metheds in Enzymol( 酶学方法 ).155 ： 367-382 ； 美国专利第 5,873,192 号， Walker and Gaastra， eds.(1983)Techniques in Molecular Biology( 分子生物学技术 )(MacMillan Publishing Company， New York) 和其中引用的参考文献。有关不影响感兴趣的蛋白的生 物活性的适当的氨基酸取代的指导， 可见于 Dayhoff et al.， (1978)Atlas of Protein Sequence and Structure( 蛋白序列和结构图册， Natl.Biomed.Res.Found.， Washington， D.C.) 的模型， 通过引用将其并入本文。 组成型取代可能是最佳的， 例如， 用另一个有相似性 质的氨基酸交换一个氨基酸。 MAPKKK 多肽的变体还可包括从植物细胞中分离实际存在的天 然变体或产生重组 MAPKKK。
     因此， 本发明所用的基因和多核苷酸包括天然存在的序列以及突变体形式。 同样， 本发明所用的蛋白包括天然存在的蛋白以及其变体和修饰的形式。 这样的变体会继续具有
     所需的 MAPKKK 活性。显然， 将在编码变体的 DNA 内所做的突变一定不能将该序列置于阅读 框外， 并且最好是， 不要产生可能产生 mRNA 二级结构的互补区。
     不希望本文包括的蛋白序列的缺失、 插入和取代对蛋白特征产生根本改变。 然而， 当在进行取代、 缺失或插入之前， 很难预先预测到这样做的精确效应时， 本领域技术人员应 当理解， 会通过常规筛选检测来评估所述效应。即， 活性和 / 或表达能通过凝胶激酶检测、 实时 RT-PCR 分析、 Northern、 Westerns、 电泳迁移率变动分析、 DNA 酶 I 足迹分析等来评 估 (Shou， et al.， (2004)J Exp Bot.55(399) ： 1013-9)。检测这种活性或表达试验是本领 域技术人员已知的。可选择地， 它们在本文其他地方有详细描述。例如， 长度为至少 15、 30、 50、 100、 200、 300、 400、 500、 600、 700、 800、 900 或 1000 个核苷酸并且在严紧条件下足以 与 MAPKKKmRNA 特异杂交的寡核苷酸， 可用于 Northern 印迹分析。MAPKKK 蛋白可以用能结 合本发明 MAPKKKs 蛋白的标记抗体检测。抗体可以是多克隆的或更优选单克隆的。分离 的 MAPKKK 蛋白或其片段能用作， 利用多克隆和单克隆抗体制备的标准技术产生与本发明 的 MAPKKK 特异性结合的抗体的免疫原。检测 MAPKKK 蛋白的技术包括酶联免疫吸附测定 (ELISAs)、 Western 印迹、 免疫沉淀和免疫荧光。
     变异的多核苷酸和蛋白还包括源于诸如 DNA 改组的致突变和致重组方法的序列 和蛋白。用这种方法， 能操作一个或多个不同的 MAPKKK 编码序列， 产生具有所需的特性的 新 MAPKKK。用这种方式， 从许多有关多核苷酸序列产生重组多核苷酸文库， 所述有关多核 苷酸序列包含具有实质性序列同一性并且能在体外或体内同源重组的序列区。例如， 用该 方法， 编码感兴趣的结构域的序列基元可以在本发明的 MAPKKK 基因和其他已知的 MAPKKK 基因间改组， 获得编码感兴趣特性改善的蛋白的新基因， 例如， 就酶而言， Km 增加。用于这 类 DNA 改组的策略在本领域内是已知的。参见， 例如， Stemmer， (1995)Proc.Natl.Acad. Sci.USA91 ： 10757-10751 ； Stemmer， (1995)Nature 370 ： 389-391 ； Crameri， et al.， (1997) Nature Biotech.15 ： 536-538 ； Moore， et al.， (1997)J.Mol.Biol.272 ： 336-357 ； Zhang， et al.， (1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95 ： 5505-5509 ； Crameri， et al.， (1998)Nature 391 ： 288-291 和美国专利第 5,605,793 和 5,837,558 号。
     本发明所用的多核苷酸能用来从其他有机体， 尤其是其他植物， 更尤其是其他单 子叶植物中分离相应的序列。以此方式， 诸如 PCR、 杂交等的方法能用来基于上述序列和本 文所示序列的同源性， 鉴定这些序列。本发明包括基于与 SEQ ID NO ： 1、 4、 7 或 9 所示的完 全 MAPKKK 序列或与其变体或片段的序列同一性而分离的序列。这些序列包括是所公开的 序列的直系同源物的序列。 “直系同源物” 意图表示源于共同祖先基因并且作为物种形成 的结果见于不同物种中的基因。当其核苷酸序列和 / 或其编码的蛋白序列共有至少 60％、 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 91％、 92％、 93％、 95％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％或更高的 序列同一性时， 认为见于不同物种中的基因是直系同源物。直系同源物功能在物种间通常 是高度保守的。因此， 编码 MAPKKK 蛋白且在严紧条件下与 SEQ ID NO ： 1、 4、 7 或 9 的序列或 与其互补物、 变体或其片段杂交的分离的多核苷酸， 包括在本发明中。
     在 PCR 方法中， 可设计用于 PCR 反应中的寡核苷酸引物， 以便由从感兴趣的任何植 物中提取的 cDNA 或基因组 DNA 扩增相应的 DNA 序列。 设计 PCR 引物和 PCR 克隆的方法通常 是本领域已知的， 并且公开于 Sambrook， et al.， (1989)Molecular Cloning ： A Laboratory Manual( 分子克隆 ： 实验室操作手册 )(2d ed.， Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview， New York)。还可参见 Innis， et al.， eds.(1990)PCR Protocols ： A Guide to metheds and Applications(PCR 方法 ： 方法和应用指导 )(Academic Press， New York) ； Innis and Gelfand， eds.(1995)PCR Strategies(PCR 策略 )(Academic Press， New York) 和 Innis and Gelfand， eds.(1999)PCR methods Manual(PCR 方法手册 )(Academic Press， New York)。已知的 PCR 方法包括但不限于， 用配对引物、 巢式引物、 单特异性引物、 简并引 物、 基因特异引物、 载体特异引物、 部分错配的引物等的方法。
     在杂交技术中， 所有或部分已知多核苷酸用作与存在于来自所选的有机体的很多 克隆基因组 DNA 片段或 cDNA 片段 ( 即， 基因组或 cDNA 文库 ) 中的其他相应的多核苷酸 选择性杂交的探针。所述杂交探针可以是基因组 DNA 片段、 cDNA 片段、 RNA 片段或其他寡 核苷酸， 并且可用诸如 32p 的可检测基团或另一可检测标记进行标记。因此， 例如， 杂交探 针能通过标记根据本发明 MAPKKK 多核苷酸合成的寡核苷酸来制备。制备杂交探针和构 建 cDNA 和基因组文库的方法通常是本领域已知的， 并且公开于 Sambrook， et al.， (1989) Molecular Cloning ： A Laboratory Manual( 分子克隆 ： 实验室操作手册 )(2d ed.， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Plainview， New York)。
     例如， 本文公开的完全的 MAPKKK 多核苷酸， 或其一个部分或多个部分， 可以用作 能和相应的 MAPKKK 多核苷酸和信使 RNA 特异杂交的探针。为了在各种条件下实现特异 杂交， 这种探针包括下述序列， 其在 MAPKKK 多核苷酸序列中是唯一的并且长度最好是至少 约 10 个核苷酸， 并且长度再最好是至少约 20 个核苷酸。这种探针可以用来通过 PCR 从所 选的植物中扩增相应的 MAPKKK 多核苷酸。该技术可以用来从所需的植物中分离其他编码 序列或用作确定植物中编码序列存在的诊断检测。杂交技术包括平板 DNA 文库 (plated DNA library) 的杂交筛选 ( 噬斑或集落 ； 参见， 例如， Sambrook， et al.， (1989)Molecular Cloning ： A Laboratory Manual( 分 子 克 隆 ： 实 验 室 操 作 手 册 )(2d ed.， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Plainview， New York)。
     这些序列的杂交可以在严紧条件下进行。 “严紧条件” 或 “严紧杂交条件” 意即， 在 该条件下， 探针与其靶标序列杂交的程度， 可检测地大于与其他序列杂交的的程度 ( 例如， 至少高于背景两倍 )。严紧条件是序列依赖性的， 并且在不同的环境中是不同的。通过控 制杂交和 / 或洗脱条件的严紧性， 能鉴定与探针 100％互补的靶标序列 ( 同源探针 )。可选 择地， 能调整严紧性条件， 以允许序列中的一些错配， 以便检测较低程度的相似性 ( 异源探 针 )。通常， 探针的长度少于约 1000 个核苷酸， 长度最好少于 500 个核苷酸。
     通常， 严紧条件为这样的条件， 在该条件中， 盐浓度约少于 1.5M Na 离子， 通常约 0.01 到 1.0M Na 离子浓度 ( 或其他的盐 )， pH 为 7.0 到 8.3 并且对于短探针 ( 例如， 10 到 50 个核苷酸 )， 温度至少约为 30℃， 且对于长探针 ( 例如， 长于 50 个核苷酸 )， 至少约为 60℃。 严紧条件也可以通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。示例性的低严紧性条件包括在 37℃用 30％ -35％的甲酰胺、 1M NaCl、 1％ SDS( 十二烷基硫酸钠 ) 的缓冲液杂交， 并且于 50-55℃下在 1X 到 2X SSC(20X SSC ＝ 3.0M NaCl/0.3M 柠檬酸三钠 ) 中洗涤。示例性的中 度严紧性条件包括于 37℃在 50-55％的甲酰胺、 1.0M NaCl、 1％ SDS 中杂交， 并且于 55-60℃ 在 0.5X 到 1X SSC 中洗涤。 示例性的高严紧性条件包括于 37℃在 50％甲酰胺、 1M NaCl、 1％ SDS 中杂交， 并且于 60-65℃在 0.1X SSC 中洗涤。任选地， 洗涤缓冲液可以包含约 0.1％到 约 1％的 SDS。杂交的持续时间通常少于约 25 小时， 通常约 5 到约 12 小时。洗涤的持续时间为至少足以达到平衡的时间长度。特异性通常是杂交后洗涤的功能， 决定性因素是离子 强度和最后洗涤溶液的温度。对于 DNA-DNA 杂合物， Tm 能根据 Meinkoth and Wahl(1985) Anal.Biochem.138 ： 267-285 的 方 程 式 近 似 计 算 ： Tm ＝ 81.5 ℃ +16.6(logM)+0.51( ％ GC)-0.61(％ form)-500/L ； 其中， M 是单价阳离子的摩尔浓度，％ GC 是 DNA 中鸟苷和胞嘧 啶核苷酸的百分比，％ form 是杂交溶液中甲酰胺的百分比， 且 L 是碱基对中杂合物地方 长度。Tm 是 50％的互补靶序列与完美匹配的探针杂交的温度 ( 在确定的离子强度和 pH 值 下 )。每错配 1％， Tm 约降低 1℃ ； 因此， 能调整 Tm、 杂交和 / 或洗涤条件以与期望的同一性 的序列杂交。例如， 如果寻找有≥ 90％同一性的序列， 能将 Tm 减小 10℃。通常， 选用的严 紧条件比特异序列和其互补物在确定的离子强度和 pH 下的热解链点 (thermal melting point， Tm) 低约 5℃。然而， 严格的严紧条件能在比热解链点 (Tm) 低 1、 2、 3 或 5℃时使用 杂交和 / 或洗涤 ； 适度的严紧条件能在比热解链点 (Tm) 低 6、 7、 8、 9 或 10℃时使用杂交和 / 或洗涤 ； 低的严紧性条件能在比热解链点 (Tm) 低 11、 12、 13、 15、 15 或 20℃时使用杂交和 / 或洗涤。利用上述方程、 杂交和洗涤组合物以及期望的 Tm， 本领域技术人员应当理解， 所 述严紧性杂交和 / 或洗脱液的变化是固有的。如果期望的错配程度导致 Tm 少于 55℃ ( 水 溶液 ) 或 32 ℃ ( 甲酰胺溶液 )， 最好增加 SSC 浓度以便能使用更高的温度。有关多核苷 酸杂交的广泛指导参见 Tijssen， (1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes( 生化和分子生物学实 验技术 - 核酸探针杂交 )， Part I， Chapter 2(Elsevier， New York) 和 Ausubel， et al.， eds.(1995)Current Protocols in Molecular Biology( 当代分子生物学操作 )Chapter 2(Greene Publishing and Wiley-Interscience， New York)。参见 Sambrook， et al.， (1989)Molecular Cloning ： A Laboratory Manual( 分子克隆 ： 实验手册 )(2d ed.， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Plainview， New York)。
     下述术语用来描述两条或多条多核苷酸或多肽之间的序列关系 ： (a) “参考序列” ， (b)“比较窗” (c)“序列同一性” 和 (d)“序列同一性百分比” 。
     (a) 如本文所用的， “参考序列” 是用作序列比较基础的确定序列。参考序列可以 是指定序列的子集或全部 ； 例如， 作为全长 cDNA 或基因序列的片段， 或完全的 cDNA 或基因 序列。
     (b) 如本文所用的， “比较窗” 涉及多核苷酸序列的连续且指定的片段， 其中， 所述 比较窗中的多核苷酸序列与所述参照序列 ( 其不包含添加或缺失 ) 相比可以包含添加或缺 失 ( 即， 空位 )， 用于对这两条多核苷酸进行最佳比对。通常， 所述比较窗的长度至少为 20 个连续核苷酸， 并且任择地可以是 30 个、 50 个、 100 个或更长。本领域技术人员应当理解， 为了避免由于所述多核苷酸序列含有空位而导致的与参照序列的高相似性， 通常引入空位 罚分， 并将其从匹配数中扣除。
     用于比较的序列比对方法在本领域内是已知的。因此， 用数学算法能完成任何两 条序列间序列同一性百分比的确定。这种数学算法的非限制性实例为 Myers and Miller， (1988)CABIOS 5 ： 11-17 的算法 ； Smith， et al.， (1981)Adv.Appl.Math.2 ： 582 的局部比对 算法 ； Needleman and Wunsch， (1970)J.Mol.Biol.58 ： 553-553 的全局比对算法 ； Pearson and Lipman， (1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85 ： 2555-2558 的搜索局部比对算法 ； 在 Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 ： 5873-5877 中做了改进的 Karlin andAltschul， (1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872265 的算法。
     可以使用计算机执行这些数学算法来比较序列以确定序列同一性。 这些执行程序 包括但不限于 ： PC/Gene 程序中的 CLUSTAL( 可从 Intelligenetics 获得， Mountain View， California) ； ALIGN 程序 ( 版本 2.0) 和 GAP、 BESTFIT、 BLAST、 FASTA 和 TFASTA Accelrys GCG (Accelrys Inc.， 9685 Scranton Road， San Diego， California， USA)。 用 默 认 的参数， 能实施使用这些程序的比对。CLUSTAL 程序在 Higgins， et al.， (1988)Gene73 ： 237-255(1988)、 Higgins， et al.， (1989)CABIOS 5 ： 151-153、 Corpet， et al.， (1988) Nucleic Acids Res.16 ： 10881-90、 Huang， et al.， (1992)CABIOS8 ： 155-65 以及 Pearson， et al.， (1995)Meth.Mol.Biol.25 ： 307-331 中有很好的描述。ALIGN 程序以 Myers and Miller， (1988， 同上 ) 的算法为基础。当比较氨基酸序列时， PAM120 权重残基表、 空位长度 罚分 12 和空位罚分 5 能与 ALIGN 程序一起使用。 Altschul， et al.， (1990)J.Mol.Biol.215 ： 503 的 BLAST 程序以 Karlin and Altschul(1990， 同上 ) 的算法为基础。可用 BLASTN 程序 实施 BLAST 核苷酸搜索， 评分＝ 100， 字长＝ 12， 来获得与编码本发明蛋白的核苷酸序列同 源的核苷酸序列。可用 BLASTX 程序实施 BLAST 蛋白搜索， 评分＝ 50， 字长＝ 3， 来获得与本 发明蛋白或多肽同源的氨基酸序列。 为了获得比较目的的空位比对， 能使用如 Altschul et al.， (1997)Nucleic Acids Res.25 ： 3389 所述的 Gapped BLAST( 在 BLAST 2.0 中 )。可选 择地， PSI-BLAST( 在 BLAST 2.0 中 ) 能用来实施检测分子间远源关系的迭代搜索。参见， Altschul et al.， (1997， 同上 )。当使用 BLAST、 Gapped BLAST、 PSI-BLAST 时， 可用各程 序 ( 例如， 核苷酸序列的 BLASTN， 蛋白的 BLASTX) 的默认参数。美国生物技术信息国家中 心 (The United States’ National Center for Biotechnology Information) 和欧洲分子 生物学实验室的欧洲生物信息研究所 (the European Bioinformatics Institute of the European Molecular Biology Laboratory) 提供这些工具， 如同本领域技术人员已知的各 种商业实体所做的。还可以通过检查手工实施比对。
     除非另有说明， 本文提供的序列同一性 / 相似性值是指用 GAP Version10 利用 下述参数获得的 ： 核苷酸序列的同一性％和相似性％使用 GAP Weight( 空位权重 ) 为 50、 Length Weight( 长度权重 ) 为 3， 及 nwsgapdna.cmp 评分矩阵 ； 氨基酸序列的同一性％和相 似性％使用 GAP Weight 为 8、 Length Weight 为 2， 及 BLOSUM62 评分矩阵。
     GAP 用 Needleman and Wunsch， (1970)J.Mol.Biol.58 ： 553-553 的算法， 来寻找两 条全序列的比对， 该比对使配对数最大化并使空位数最小化。 GAP 考虑所有可能的比对和空 位位置并且用最大数量配对碱基和最少的空位产生比对。 其允许在配对碱基单元中提供空 位产生罚分和空位延伸罚分。GAP 必需利用其插入的每一个空位。如果选择的空位延伸罚 分大于 0， 那么对于插入的每个空位， GAP 必需另外地利用空位长度乘以空位延伸罚分。对 于蛋白序列而言， 第 10 版的 GCG WisconsinGenetics Software Package 默认的空位 产生罚分值和空位延伸罚分值， 分别为 8 和 2。对于核苷酸序列而言， 默认的空位产生罚分 是 50， 而默认的空位延伸罚分值是 3。空位产生罚分和空位延伸罚分可以表示为选自整数 0-200 的整数。因此， 例如， 空位产生罚分和空位延伸罚分可以是 0、 1、 2、 3、 5、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 50、 55、 50、 55、 60、 65 或更大。
     (c) 如本文所使用的， 两条多核苷酸或多肽序列情形下的 “序列同一性” 或 “同一 性” 涉及所述两条序列中的残基， 当处于最大一致性而比对时， 所述残基在指定的比较窗内是相同的。当使用的序列同一性百分比涉及蛋白时， 应当认为， 不相同的残基位置经常由 于保守氨基酸取代而不同， 其中， 用氨基酸残基取代具有相似化学特性 ( 例如， 电荷或疏水 性 ) 的其他氨基酸残基， 并且因此没有改变所述分子的功能特性。当序列中的保守取代不 同时， 可向上调整序列同一性百分比来纠正取代的保守性质。认为由于这种保守取代而不 同的序列具有 “序列相似性” 或相似性 “。 进行这种调整的方法是本领域技术人员公知的。 通 常这涉及将保守取代评分为部分错配而不是全部错配， 由此增加序列同一性百分比。 因此， 例如， 如果给予相同氨基酸的评分为 1， 给予非保守取代的评分为 0， 则给予保守取代的评 分在 0 和 1 之间。 例如， 按照 PC/ 基因程序 (Intelligenetics， Mountain View， California) 中所执行， 计算保守取代评分。
     (d) 如本文所用的， “序列同一性百分比” 表示通过在比较窗内比较两个最佳比对 序列所确定的值， 其中， 比较窗中的部分多核苷酸序列与参照序列 ( 不包含添加或缺失 ) 相 比可以包含添加或缺失 ( 即， 空位 )， 用于对这个两条序列进行最佳比对。通过确定两条序 列中存在相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数量来产生配对位置数， 以比较窗中的位置总 数除配对位置数， 并且将结果乘以 100 以产生序列同一性的百分比， 来计算百分比。
     “分离的” 或 “纯化的” 多核苷酸或蛋白或其生物活性部分， 实质上或基本上不含在 其天然存在的环境中所发现的组分， 该组分通常伴随该多核苷酸或蛋白或与之相互作用。 因此， 当用重组技术产生时， 分离的或纯化的多核苷酸或蛋白实质上不含其他细胞材料或 培养基， 或者当化学合成时， 实质上不含化学前体或其他化学品。最佳地， “分离的” 多核苷 酸不含在该多核苷酸来源的生物的基因组 DNA 中天然地位于多核苷酸侧翼的序列 ( 即， 位 于多核苷酸 5′和 3′端的序列 )( 最佳的是蛋白编码序列 )。 例如， 在各种实施方案中， 分离 的多核苷酸含有少于约 5kb、 5kb、 3kb、 2kb、 1kb、 0.5kb 或 0.1kb 的核苷酸序列， 所述核苷酸 序列在该多核苷酸来源的细胞中的基因组 DNA 中天然位于该多核苷酸的侧翼。实质上不含 细胞材料的蛋白包括具有少于约 30％、 20％、 10％、 5％或 1％ ( 干重 ) 的污染蛋白的蛋白制 剂。当本发明的蛋白或其生物活性部分是重组产生的时， 最佳地， 培养基代表少于约 30％、 20％、 10％、 5％或 1％ ( 干重 ) 的化学前体或非感兴趣蛋白的化学品。
     方法
     I. 提供序列
     本发明序列能在宿主细胞中引入 / 表达， 所述宿主细胞， 例如细菌、 酵母、 昆虫、 哺 乳动物或最佳为植物细胞。可以预期， 本领域技术人员了解很多用来将本发明多肽或核苷 酸序列引入宿主细胞的系统。 没有试图详细描述已知用来将蛋白提供于原核生物或真核生 物中的各种方法。
     “宿主细胞” 表示包含本发明异源多核苷酸序列的细胞。宿主细胞可以是原核细 胞， 例如， 大肠杆菌 (E.coli) 或真核细胞， 例如， 酵母、 昆虫、 两栖动物或哺乳动物细胞。宿 主细胞还可以是单子叶或双子叶植物细胞。在一个实施方案中， 所述单子叶宿主细胞是玉 米宿主细胞。
     使用术语 “多核苷酸” 并非意图将本发明限制为包括 DNA 的多核苷酸。本领域技术 人员应当认识到， 多核苷酸可以包括核糖核苷酸和核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的组合。 这类脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括自然存在的分子和合成的类似物。 本发明的多核苷 酸还包括所有的序列形式， 包括但不限于， 单链形式、 双链形式、 发夹、 茎环结构等。本发明所用的 MAPKKK 多核苷酸能提供于表达盒中， 用于在感兴趣的植物中表达。 所述表达盒包括可操作地连接于 MAPKKK 多核苷酸的 5′和 3′调节序列。 “可操作地连接” 意图表示两个或多个元件间的功能连接。例如， 感兴趣的多核苷酸和启动子之间的可操作 连接是允许所述感兴趣的多核苷酸表达的功能连接。 可操作地连接的元件可以是连续的或 非连续的。 当用来表示两个蛋白编码区的连接时， 可操作地连接表示， 编码区位于同一个阅 读框中。 所述表达盒可以另外含有至少一个可以共转化进有机体中的其他基因。 可选择地， 所述其他基因能提供于多种表达盒中。提供的这种表达盒带有用于将 MAPKKK 多核苷酸插 入以便受调节区的转录调控的多个限制位点和 / 或重组位点。所述表达盒还可以另外含有 选择标记基因。
     表达盒在 5′ -3′转录方向上包括， 在植物中有功能的转录和翻译起始区 ( 即， 启 动子 )、 本发明的 MAPKKK 多核苷酸和转录和翻译终止区 ( 即终止区 )。调节区 ( 包括启动 子、 转录调节区和翻译终止区 ) 和 / 或本发明的 MAPKKK 多核苷酸对宿主细胞和 / 或对彼此 可以是天然的 / 同源的。可选择地， 调节区和 / 或本发明的 MAPKKK 多核苷酸对宿主细胞和 / 或对彼此可以是外来的 / 异源的。如本文所使用的， 对于序列而言 “异源的” 是指来源于 其他物种的序列， 或如果来源于同一物种， 通过有意的人介入， 实质上由其天然形式在组成 和 / 或基因组基因座中进行了修饰。例如， 可操作地连接于异源多核苷酸的启动子， 来源于 与所述多核苷酸来源的物种不同的物种， 或， 如果来源于相同 / 类似的物种， 则一个或两个 都实质上由其原始形式和 / 或基因组基因座进行了修饰， 或所述启动子不是可操作地连接 的多核苷酸的天然启动子。如本文所使用的， 嵌合基因包含可操作连接于启动子的编码序 列， 所述启动子与所述编码序列是异源的。
     虽然用异源启动子表达序列是最佳的， 但是也可以用天然的启动子序列。这种构 建体能改变植物或植物细胞中 MAPKKK 的表达水平。因此， 能改变植物或植物细胞的表型。
     终止区可以与转录起始区是天然的， 可以与可操作地连接的感兴趣的 MAPKKK 多 核苷酸是天然的， 可以与植物宿主是天然的， 或相对启动子、 感兴趣的 MAPKKK 多核苷酸、 植 物宿主， 或其任意组合， 可以源于另一来源 ( 即， 外来的或异源的 )。 便利的终止区可从根瘤 农杆菌 (A.tumefaciens) 的 Ti 质粒获得， 例如羧乙基精氨酸合酶和胭脂氨酸合酶终止区。 还参见， Guerineau， et al.， (1991)Mol.Gen.Genet.262 ： 151-155 ； Proudfoot， (1991)Cell 65 ： 671-675 ； Sanfacon， et al.， (1991)Genes Dev.5 ： 151-159 ； Mogen， et al.， (1990)Plant Cell 2 ： 1261-1272 ； Munroe， et al.， (1990)Gene 91 ： 151-158 ； Ballas， et al.， (1989) Nucleic Acids Res.17 ： 7891-7903 和 Joshi， et al.， (1987)Nucleic Acids Res.15 ： 9627-9639。
     如果合适， 可以优化多核苷酸， 用于通过使用植物偏爱密码子增加在转化植物中 的表达。有关宿主偏爱密码子用法的讨论， 参见， 例如， Campbell and Gowri， (1990)Plant Physiol.92 ： 1-11。 合成植物偏爱基因的方法在本领域技术中是可以获得的。 参见， 例如， 美 国专利第 5,380,831 和 5,536,391 号， 以及 Murray， et al.， (1989)Nucleic Acids Res.17 ： 577-598， 上述文献通过引用并入本文。
     已知其他序列修饰增强细胞宿主中的基因表达， 这些包括除去编码假聚腺苷酸化 信号、 外显子 - 内含子剪接位点信号的序列、 转座子样重复和不利于基因表达的其他此类 充分表征的序列。序列的 G-C 含量可以调整至给定细胞宿主中的平均水平， 这可通过参考在所述宿主细胞中表达的已知基因来计算。可能的话， 修饰序列以避免可提前预知的发夹 二级 mRNA 结构。
     表达盒可以另外含有 5 ′前导序列。这种前导序列能起到增强翻译的作用。翻 译前导区在本领域内是已知的， 并且包括 ： 细小核糖核酸病毒前导区， 例如， EMCV 前导区 ( 脑心肌炎 5 ′非编码区 )(Elroy-Stein， et al.， (1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86 ： 6126-6130) ； 马铃薯 Y 病毒属前导区， 例如， TEV 前导区 ( 烟草蚀刻病毒 )(Gallie， et al.， (1995)Gene165(2) ： 233-238)， MDMV 前导区 ( 玉米矮花叶病毒 )(Virology 155 ： 9-20) 和人 免疫球蛋白重链结合蛋白 (BiP)(Macejak， et al.， (1991)Nature353 ： 90-95) ； 来自苜蓿花 叶病毒 (alfalfa mosaic virus) 的外壳蛋白 mRNA 的非翻译前导区 (AMV RNA 5)(Jobling， et al.， (1987)Nature 325 ： 622-625) ； 烟草花叶病毒前导区 (TMV)(Gallie， et al.， (1989) in Molecular Biology of RNA， ed.Cech(Liss， New York)， pp.237-256) 和玉米枯黄斑点病 毒前导区 (MCMV)(Lommel， et al.， (1991)Virology 81 ： 382-385)。还参见， Della-Cioppa， et al.， (1987)Plant Physiol.85 ： 965-968。还可以使用已知增强翻译的其他方法， 例如， 内含子等。
     在制备表达盒时， 可以操作各种 DNA 片段， 以便将 DNA 序列提供于正确的方向上， 并且如果合适， 提供在正确的阅读框中。最后， 可以使用连接物或连接体连接 DNA 片段或可 以涉及其他的操作来提供便利的限制位点， 去除过多的 DNA， 去除限制位点等。 为此， 可以涉 及体外诱变、 引物修复、 限制、 退火、 再取代， 例如， 转换和颠换。
     表达盒还能包含选择转化的细胞的选择标记基因。选择标记基因用来选择转 化的细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因， 例如， 编码新霉素磷酸转移酶 II(NEO) 和潮霉素磷酸转移酶 (HPT) 的那些基因， 以及赋予对除草化合物抗性的基因， 例 如， 草铵磷 (glufosinate ammonium)、 溴苯腈， 咪唑啉酮类和 2， 5- 二氯苯氧乙酸盐 (2， 5-dichlorophenoxyacetate， 2， 5-D)。其他的选择标记包括表型标记， 例如， β- 半乳糖 苷酶和荧光蛋白， 例如， 绿色荧光蛋白 (GFP)(Su， et al.， (2005)Biotechnol Bioeng 85 ： 610-9 和 Fetter， et al.， (2005)Plant Cell 16 ： 215-28)， 青色荧光蛋白 (CYP)(Bolte， et al.， (2005)J.Cell Science 117 ： 953-55 和 Kato， et al.， (2002)Plant Physiol TM 129 ： 913-52) 和黄色荧光蛋白 (Evrogen 的 PhiYFP ， 参见 Bolte， et al.， (2005)J.Plant Science 117 ： 953-55)。对于其他的选择标记， 通常参见， Yarranton， (1992)Curr.Opin. Biotech.3 ： 506-511 ； Christopherson， et al.， (1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89 ： 6315-6318 ； Yao， et al.， (1992)Cell 71 ： 63-72 ； Reznikoff， (1992)Mol.Microbiol.6 ： 2519-2522 ； Barkley， et al.， (1980)in The Operon， pp.177-220 ； Hu， et al.， (1987) Cell58 ： 555-566 ； Brown ， et al. ， (1987)Cell 59 ： 603-612 ； Figge ， et al. ， (1988) Cell52 ： 713-722 ； Deuschle， et al.， (1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86 ： 5500-5505 ； Fuerst， et al.， (1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86 ： 2559-2553 ； Deuschle， et al.， (1990)Science 258 ： 580-583 ； Gossen， (1993)Ph.D.Thesis， University of Heidelberg ； Reines， et al.， (1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 ： 1917-1921 ； Labow， et al.， (1990) Mol.Cell.Biol.10 ： 3353-3356 ； Zambretti， et al.， (1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89 ： 3952-3956 ； Baim， et al.， (1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88 ： 5072-5076 ； Wyborski， et al.， (1991)Nucleic Acids Res.19 ： 5657-5653 ； Hillenand-Wissman， (1989)Topics Mol.Struc.Biol.10 ： 153-162 ； Degenkolb， et al.， (1991)Antimicrob.Agents Chemother.35 ： 1591-1595 ； Kleinschnidt， et al.， (1988)Biochemistry 27 ： 1095-1105 ； Bonin， (1993) Ph.D.Thesis， University of Heidelberg ； Gossen， et al.， (1992)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 89 ： 5557-5551 ； Oliva， et al.， (1992)Antimicrob.Agents Chemother.36 ： 913-919 ； Hlavka ，et al. ，(1985)Handbook of Experimental Pharmacology ， Vol.78(Springer-Verlag， Berlin) ； Gill， et al.， (1988)Nature335 ： 721-725。这些公开 通过引用并入本文。上述选择标记基因列表并非意图限制。本发明能使用任何选择标记基 因。
     很多启动子能用来实施本发明， 包括感兴趣的多核苷酸序列的天然启动子。所述 启动子能基于所需的结果来选择。 核酸能与组成型启动子、 组织优选启动子、 诱导型启动子 或其他启动子组合， 用于在植物中表达。
     这 类 组 成 型 启 动 子 包 括， 例 如， Rsyn7 启 动 子 的 核 心 启 动 子 和 WO99/53838 和 美国专利号第 6,072,050 号公开的其他组成型启动子 ； 核心 CaMV 35S 启动子 (Odell， et al.， (1985)Nature 313 ： 810-812) ； 水 稻 肌 动 蛋 白 (McElroy， et al.， (1990)Plant Cell 2 ： 163-171) ； 泛 素 (Christensen， et al.， (1989)Plant Mol.Biol.12 ： 619-632 和 Christensen， et al.， (1992)Plant Mol.Biol.18 ： 675-689) ； pEMU(Last， et al.， (1991) Theor.Appl.genet.81 ： 581-588) ； MAS(Velten， et al.， (1985)EMBO J.3 ： 2723-2730) ； ALS 启动子 ( 美国专利第 5,659,026 号 ) 等。其他组成型启动子包括， 例如， 美国专利 号 第 5,608,159、 5,608,155、 5,605,121、 5,569,597、 5,566,785、 5,399,680、 5,268,563、 5,608,152 和 6,177,611 号公开的那些启动子。
     组织优选启动子能用来在特定植物组织中靶向增强型 A RR 表达。 “组织优选” 意图表示表达在特定组织中占优势， 尽管并不必然排除其他组织。组织优选启动子包 括 Yamamoto， et al.， (1997)Plant J.12(2) ： 255-265 ； Kawamata， et al.， (1997)Plant Cell Physiol.38(7) ： 792-803 ； Hansen， et al.， (1997)Mol.Gengenet.255(3) ： 337-353 ； Russell， et al.， (1997)Transgenic Res.6(2) ： 157-168 ； Rinehart， et al.， (1996)Plant Physiol.112(3) ： 1331-1351 ； Van Camp， et al.， (1996)Plant Physiol.112(2) ： 525-535 ； Canevascini et al.(1996)Plant Physiol.112(2) ： 513-525 ； Yamamoto， et al.， (1995) Plant Cell Physiol.35(5) ： 773-778 ； Lam， (1995)Results Probl.Cell Differ.20 ： 181-196 ； Orozco， et al.， (1993)Plant Mol Biol.23(6) ： 1129-1138 ； Matsuoka， et al.， (1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90(20) ： 9586-9590 和 Guevara-Garcia， et al.， (1993) Plant J.5(3) ： 595-505。如果有必要， 这些启动子能被改造为弱表达。还参见美国专利申 请公开号 2003/0074698， 通过引用并入本文。
     叶优选启动子在本领域内是已知的。参见， 例如， Yamamoto， et al.， (1997)Plant J.12(2) ： 255-265 ； Kwon， et al.， (1995)Plant Physiol.105 ： 357-67 ； Yamamoto， et al.， (1995)Plant Cell Physiol.35(5) ： 773-778 ； Gotor， et al.， (1993)Plant J.3 ： 509-18 ； Orozco， et al.， (1993)Plant Mol.Biol.23(6) ： 1129-1138 ； Baszczynski， et al.， (1988) Nucl.Acid Res.16 ： 5732 ； Mitra， et al.， (1995)Plant Molecular Biology 26 ： 35-93 ； Kayaya， et al.， (1995)Molecular and general genetics 258 ： 668-675 和 Matsuoka， et al.， (1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20) ： 9586-9590。也可以用衰老调节启动子， 例如， SAM22(Crowell， et al.， (1992)Plant Mol.Biol.18 ： 559-566)。还参见美国专利第 5,589,052 号， 将其通过引用并入本文。
     枝条优选启动子包括， 枝条分生组织优选启动子， 例如， Weigal， et al.， (1992) Cell 69 ： 853-859 公开的启动子 ； 登录号 AJ131822 ； 登录号 Z71981 ； 登录号 AF059870， ZAP 启动子 ( 美国专利申请系列第 10/387,937 号 )， 玉米 tb1 启动子 (Wang， et al.， (1999) Nature 398 ： 236-239 和 McAvoy， et al(2003)Acta Hort.(ISHS)625 ： 379-385 所公开的枝 条优选启动子。
     根优选启动子是已知的并且能选自很多可得到的文献或由多种相容物种重新分 离。参见， 例如， Hire， et al.， (1992)Plant Mol.Biol.20(2) ： 207-218( 大豆根特异的谷 氨酰胺合成酶基因 ) ； Keller and Baumgartner， (1991)Plant Cell 3(10) ： 1051-1061( 四 季豆 (French bean) 的 GRP 1.8 基因中的根特异性控制元件 ) ； Sanger， et al.， (1990) Plant Mol.Biol.15(3) ： 533-553( 根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) 的甘露碱合 酶 (MAS) 基因的根特异性启动子 ) 和 Miao， et al.， (1991)Plant Cell 3(1) ： 11-22( 编码胞 液谷氨酰胺合成酶 (GS) 的全长 cDNA 克隆， 其在大豆根和根瘤中表达 )。还参见 Bogusz， et al.， (1990)Plant Cell 2(7) ： 633-651， 其中描述了从来自固氮的非豆科植物 Parasponia andersonii 和相关的非固氮非豆科植物山黄麻 (Trema tomentosa) 的血红蛋白基因中分 离的两个根特异性启动子。这些基因的启动子连接于 β- 葡萄糖苷酸酶报告基因上， 并且 引入非豆科植物烟草 (Nicotiana tabacum) 和豆科植物百脉根 (Lotus corniculatus) 中， 并且这两种情况下， 根特异性启动子活性都得以保留。Leach and Aoyagi(1991) 描述了其 对毛根农杆菌 (Agrobacterium rhizogenes) 的高表达的 rolC 和 rolD 根诱导基因的启动子 的分析。( 参见， Plant Science(Limerick)79(1) ： 69-76)。他们推断， 增强子和组织优选 的 DNA 决定子在那些启动子中是解离的。Teeri， et al.， (1989) 使用与 lacZ 的基因融合 物表明， 编码章鱼碱合酶的农杆菌 T-DNA 基因在根尖的表皮中尤其具有活性， 并且 TR2′基 因在完整的植物中是根特异性的， 并受叶组织的创伤刺激， 它们是特别期望的特征组合， 用 于与杀虫或杀幼虫基因一起使用 ( 参见 EMBO J.8(2) ： 343-350)。与 nptII( 新霉素磷酸转 移酶 II) 融合的 TR1′基因显示了类似的性质。其他根优选启动子包括 VfENOD-GRP3 基因 启动子 (Kuster， et al.， (1995)Plant Mol.Biol.29(4) ： 759-772) ； rolB 启动子 (Capana， et al.， (1994)Plant Mol.Biol.25(4) ： 681-691 ； 以及带有 ADH 第一内含子的 CRWAQ81 根 优选启动子 ( 美国临时专利申请系列号 60/509,878， 提交于 2003 年 10 月 9 日， 通过引用 并入本文 )。还参见美国专利第 5,837,876、 5,750,386、 5,633,363、 5,559,252、 5,501,836、 5,110,732 和 5,023,179 号。
     “种子优选” 启动子包括 “种子特异性” 启动子 ( 仅在种子组织中有活性的那些启 动子， 例如， 种子储藏蛋白的启动子 )。种子优选启动子包括那些在授粉前或后有活性的那 些启动子， 或不依赖于授粉而有活性的那些启动子。这种种子优选启动子包括， 但不限于， Cim1( 细胞分裂素诱导的信使 ) ； cZ19B1( 玉米的 19kDa 玉米醇溶蛋白 ) ； milps( 肌醇 -1- 磷 酸合酶 )( 参见 WO 00/11177 和美国专利第 6,225,529 号 ； 通过引用并入本文 ) ； PCNA2( 美 国专利申请系列号 10/388,359， 提交于 2003 年 3 月 13 日 ) 和 CKX1-2( 美国专利申请公开 号 2002/0152500)。γ- 玉米醇溶蛋白是胚乳特异性启动子。球蛋白 -1(Glob-1) 是有代 表性的胚特异性启动子。对于双子叶植物而言， 种子特异性启动子包括但不限于， 豆 β- 菜豆蛋白、 油菜籽蛋白 (napin)、 β- 伴大豆球蛋白、 大豆凝集素、 十字花科蛋白 (cruciferin) 等。对于单子叶植物而言， 种子特异性启动子包括但不限于， 玉米 15kDa 玉米醇溶蛋白、 22kDa 玉米醇溶蛋白、 27kDa 玉米醇溶蛋白、 γ- 玉米醇溶蛋白、 waxy、 shrunken 1、 shrunken 2、 球蛋白 1 等。还参见， WO 00/12733， 其中公开了源于 end1 和 end2 基因的种子优选启动 子， 和 WO 01/21783 和美国专利第 6,403,862 号， 其中公开了 Zm40 启动子 ； 两个都通过引 用并入本文。胚特异性启动子包括 ESR( 美国专利申请公开号 2004/0210960) 和 lec1( 美 国专利申请系列号 09/718,754， 提交于 2000 年 11 月 22 日 )。其他胚特异性启动子公开于 Sato et al.， (1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93 ： 8117-8122 ； Nakase， et al.， (1997)Plant J 12 ： 235-56 和 Postma-Haarsma， et al.， (1999)Plant Mol.Biol.39 ： 257-71 中。胚乳优 选启动子包括美国专利申请公开号 2004/0237147 中公开的 eep1 和 eep2。其他胚乳特异 性启动子公开于 Albani et al.， (1985)EMBO 3 ： 1505-15 ； Albani， et al.， (1999)Theor. Appl.Gen.98 ： 1253-62 ； Albani， et al.， (1993)Plant J.5 ： 353-55 ； Mena， et al.， (1998) The Plant Journal 116 ： 53-62 和 Wu， et al.， (1998)Plant CellPhysiology 39 ： 885-889 中。感兴趣的还有玉米 eep5 启动子 ( 如， 参见 SEQ ID NO ： 20)。在玉米中， 还可以使用未 成熟的穗组织优选启动子 ； 例如， ADF4 启动子 ( 美国专利申请公开号 2009/0094713)。 分裂细胞或分生组织组织优选启动子已经公开于 Ito et al.， (1995)Plant Mol. Biol.25 ： 863-878 ； Reyad， et al.， (1995)Mol.Gen.genet.258 ： 703-711 ； Shaul， et al.， (1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93 ： 5868-5872 ； Ito， et al.， (1997)Plant J.11 ： 983-992 ； Trehin， et al.， (1997)Plant Molecular Biology35 ： 667-672 ； 玉 米 的 Zag1(Schmidt， et al.， (1993)The Plant Cell 5 ： 729-37) 和 Zag2(Theissen， et al.， (1995)gene 156 ： 155-166)GenBank 登 录 号 X80206 和 Hubbard， et al.， (2002)genetics 162 ： 1927-1935 中， 所有的这些文献都通过引用并入本文。某些启动子在萌芽时间内是有活性的 ； 参见， Thompson， et al.， (1989)BioEssays 10 ： 108。
     花序优选启动子包括查耳酮合酶的启动子 (Van der Meer， et al.， (1990)Plant Mol.Biol.15 ： 95-109)、 LAT52(Twell， et al.， (1989)Mol.Gen.genet.217 ： 250-255)、 花粉 特异性基因 (Albani， et al.， (1990)plant Mol Biol.15 ： 605， Zm13(Buerrero， et al.， (1993)Mol.Gen.genet.225 ： 161-168)、 玉米花粉特异性基因 (Hamilton， et al.， (1992) Plant Mol.Biol.18 ： 211-218)、 向日葵花粉表达的基因 (Baltz， et al.， (1992)The Plant Journal 2 ： 713-721)、 欧洲油菜 (B.Napus) 花粉特异性基因 (Arnoldo， et al.， (1992) J.Cell.Biochem， Abstract Number( 摘要号 )Y101205)。也可以使用未成熟的穗组织优选 启动子。
     胁迫诱导启动子包括盐 / 水胁迫诱导启动子， 例如 P5CS(Zang， et al.， (1997) Plant Sciences 129 ： 81-89) ； 寒冷诱导启动子， 例如， cor15a(Hajela， et al.， (1990) Plant Physiol.93 ： 1256-1252)， cor15b(Wilhelm， et al.， (1993)Plant Mol Biol 23 ： 1073-1077)， wsc120(Ouellet， et al.， (1998)FEBS Lett.523 ： 325-328)， ci7(Kirch， et al.， (1997)Plant Mol Biol.33 ： 897-909)， ci21A(Schneider， et al.， (1997)Plant Physiol.113 ： 335-55) ； 和 MLIP15( 美 国 专 利 第 6,479,734 号 ) 干 旱 诱 导 启 动 子， 例 如， Trg-31(Chaudhary， et al.， (1996)Plant Mol.Biol.30 ： 1257-57)， rd29(Kasuga， et al.， (1999)Nature Biotechnology 18 ： 287-291) ； 渗透诱导启动子， 例如， Rab17(Vilardell， et
     al.， (1991)Plant Mol.Biol.17 ： 985-93 ； 还参见 SEQ ID NO ： 18)， 还有脱落酸和渗压素诱导 的 (Raghothama， et al.， (1993)Plant Mol Biol 23 ： 1117-28) 和热诱导的启动子， 例如， 热休克蛋白 (Barros， et al.， (1992)Plant Mol.19 ： 665-75 ； Marrs， et al.， (1993)Dev. genet.15 ： 27-51)， 衰老诱导启动子， 例如， SEE1(GB_AJ494982) 和 smHSP(Waters， et al.， (1996)J.Experimental Botany57 ： 325-338)。其他胁迫诱导启动子包括 rip2( 美国专利 第 5,332,808 和 7,074,985 号 ) 和 RD29A(Yamaguchi-Shinozaki， et al.， (1993)Mol.Gen. genetics 236 ： 331-340 ； 还参见 SEQ ID NO ： 19)。
     氮应答启动子也可以用于本发明的方法。这类启动子包括， 但不限于， 22kDa 玉米 醇溶蛋白启动子 (Spena， et al.， (1982)EMBO J 1 ： 1589-1594 和 Muller， et al.， (1995) J.Plant Physiol 145 ： 606-613) ； 19kDa 玉米醇溶蛋白启动子 (Pedersen， et al.， (1982) Cell 29 ： 1019-1025) ； 14kDa 玉 米 醇 溶 蛋 白 启 动 子 (Pedersen， et al.， (1986)J.Biol. Chem.261 ： 6279-6284)， b-32 启动子 (Lohmer， et al.， (1991)EMBO J 10 ： 617-624) 和亚 硝酸盐还原酶 (NiR) 启动子 (Rastogi， et al.， (1997)Plant Mol Biol.34(3) ： 465-76 和 Sander， et al.， (1995)Plant Mol Biol.27(1) ： 165-77)。有关在氮诱导的启动子中发现 的共有序列的综述， 参见例如， Muller， et al.， (1997)The Plant Journal 12 ： 281-291。
     其他有用的启动子包括 F3.7( 美国专利第 5,850,018 号 ) 和玉米硫氧还蛋白 H 启 动子 (Nu， et al.， MGCNL 2004 ； 美国临时专利申请系列号 60/514,123)。启动子可以没有 落入上述组， 落入上述组中的一个或多个， 并且就其组织特异性或时机或其他特征而言， 或 就这些特征的结合而言， 可以用在本发明中。
     此外， 构建体可以包含调节以及引起表达的控制区。 通常， 依照很多通常实施的程 序， 这些区域通过控制转录施加影响， 如转录因子， 阻遏物结合位点和终止信号等。为了将 翻译的蛋白分泌进内质网腔， 分泌进壁膜间隙或分泌进细胞外环境， 可以将合适的分泌信 号并入表达的多肽中。这些信号对多肽而言可以是内源的 ； 或它们可以是异源信号。
     高等真核生物对编码本发明多肽的 DNA 的转录， 可以通过将增强子序列插入载体 来增强。增强子是 DNA 的顺式元件， 通常约 10-300bp， 其作用是， 在给定宿主细胞类型中， 增强启动子的转录活性。增强子的实例包括 SV40 增强子， 其位于复制起点近侧 100-270bp 处， 巨细胞病毒早期启动子增强子， 复制原点近侧的多瘤病毒增强子和腺病毒增强子。 可用 于本发明中增加引入的 DNA 片段转录的其他增强子， 包括， 特别是像那些 35S 启动子内增强 子的病毒增强子， 其由 Odell， et al.， (1988)Plant Mol.Biol.10 ： 263-72 展示， 和 Fromm， et al.， (1989)Plant Cell 1 ： 977 描述的来自冠缨碱基因的增强子。增强子可以影响载体 中所包括的序列表达的组织特异性和 / 或时间特异性。
     终止区通过在合适位点终止转录也促进有效表达。 实施本发明有用终止子包括但 不限于， pinII( 参见， An， et al.， (1989)Plant Cell1(1) ： 115-122)、 glb1( 参见 Genbank 登录号 L22345)、 gz( 参见， gzw64a 终止子， Genbank 登录号 S78780) 和农杆菌的 nos 终止 子。
     本发明方法包括将多肽或多核苷酸引入植物。 “引入” 意图表示将多核苷酸或多肽 以序列获得进入植物细胞内的方式呈递给植物。 本发明方法不取决于将序列引入植物的特 定方法， 只要多核苷酸或多肽获得进入至少一个植物细胞的内部。将多核苷酸或多肽引入 植物的方法在本领域内是已知的， 包括但不限于， 稳定转化方法、 瞬时转化方法和病毒介导的方法。
     “稳定转化” 意图表示引入植物中的核苷酸构建体整合进植物基因组中， 并且能通 过其后代遗传。 “瞬时转化” 意图表示多核苷酸被引入植物但并没有整合进植物基因组中， 或将多肽引入植物中。
     转化方案以及将多肽或多核苷酸序列引入植物中的方案可以随着靶向转化的植 物或植物细胞类型即单子叶植物或双子叶植物而改变。将多肽和多核苷酸引入植物细胞 中的合适的方法包括， 显微注射 (Crossway， et al.， (1986)Biotechniches 5 ： 320-335)、 电穿孔 (Riggs， et al.， (1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83 ： 5602-5606、 农杆菌介导的 转化 (Townsend， et al.， 美国专利第 5,563,055 ； Zhao， et al.， 美国专利第 5,981,850 号 )、 直接基因转移 (Paszkowski， et al.， (1985)EMBO J.3 ： 2717-2722) 和弹道粒子加 速 ( 参见， 例如， Sanford， et al.， 美国专利第 5,955,050 号， Tomes， et al.， 美国专利 第 5,879,918 号 ； Tomes， et al.， 美 国 专 利 第 5,886,255 号 ； Bidney， et al.， 美国专利 第 5,932,782 号 ； Tomes， et al.， (1995)“Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bormbardment( 通过微粒轰击将 DNA 直接转移进完整的植 物细胞中 )” ， in Plant Cell， and Organ Culture ： Fundamental Methods， ed.Gamborg and Phillips， (Springer-Verlag， Berlin) ； McCabe， et al.， (1988)Biotechnology 6 ： 923-926) 和 Lec1 转 化 (WO00/28058)。 还 参 见 Weissinger， et al.， (1988)Ann.Rev. genet.22 ： 521-577 ； Sanford， et al.， (1987)Particulate Science and Technology 5 ： 27-37( 洋 葱 ) ； Christou， et al.， (1988)Plant Physiol.87 ： 671-675( 大 豆 ) ； McCabe， et al.， (1988)Bio/Technology 6 ： 923-926( 大 豆 ) ； Finer and McMullen， (1991) In Vitro Cell Dev.Biol.27P ： 175-182( 大 豆 ) ； Singh， et al.， (1998)Theor.Appl. genet.96 ： 319-325( 大 豆 ) ； Datta， et al.， (1990)Biotechnology8 ： 736-750( 水 稻 ) ； Klein， et al.， (1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85 ： 5305-5309( 玉米 ) ； Klein， et al.， (1988)Biotechnology 6 ： 559-563( 玉 米 ) ； Tomes， 美 国 专 利 第 5,250,855 号 ； Buising， et al.， 美 国 专 利 第 5,322,783 和 5,325,656 号 ； Tomes， et al.， (1995)“Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment( 通过微粒轰击 将 DNA 直接转移进完整的植物细胞中 )， ” ， ” in Plant Cell， Tissue， and Organ Culture ： Fundamental Methods， ed.Gamborg， (Springer-Verlag， Berlin)( 玉 米 ) ； Klein， et al.， (1988)Plant Physiol.91 ： 550-555( 玉 米 ) ； Fromm， et al.， (1990)Biotechnology 8： 833-839( 玉 米 ) ； Hooykaas-Van Slogteren， et al.， (1985)Nature(London)311 ： 763-765 ； Bowen， et al.， 美国专利第 5,736,369 号 ( 谷粒 ) ； Bytebier， et al.， (1987) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85 ： 5355-5359( 百 合 科 ) ； De Wet， et al.， (1985)in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues( 胚珠组织内的实验操作 )， ed.， Chapman， et al.(Longman， New York)， pp.197-209( 花粉 ) ； Kaeppler， et al.， (1990)Plant Cell Reports 9 ： 515-518 和 Kaeppler， et al.， (1992)Theor.Appl.genet.85 ： 560-566( 触 须 介 导 的 转 化 (whisker-mediated transformation) ； D ′ Halluin， et al.， (1992)Plant Cell5 ： 1595-1505( 电穿孔 ) ； Li， et al.， (1993)Plant Cell Reports 12 ： 250-255 and Christou and Ford， (1995)Annals of Botany 75 ： 507-513( 水 稻 ) ； Osjoda， et al.， (1996)Nature Biotechnology 15 ： 755-750( 通过根瘤农杆菌的玉米 ) ； Leelavathi， etal.， (2004)Plant Cell Reports 22 ： 465-470( 通过根瘤农杆菌的棉花 ) ； Kumar， et al.， (2004)Plant Molecular Biology56 ： 203-216( 通过轰击的棉花质粒 )， 所有的这些文献都 通过引用并入本文。
     在具体的实施方案中， 用各种瞬时转化方法， 将本发明所用的 MAPKKK 序列提供 给植物。这些瞬时转化方法包括但不限于， 将 MAPKKK 蛋白或变体和其片段直接引入植物 或将 MAPKKK 转录物引入植物。这些方法包括， 例如， 显微注射或微粒轰击。参见， 例如， Crossway， et al.， (1986)Mol Gen.genet.202 ： 179-185 ； Nomura， et al.， (1986)Plant Sci.55 ： 53-58 ； Hepler， et al.， (1995)Proc.Natl.Acad.Sci.91 ： 2176-2180 和 Hush， et al.， (1995)The Journal of Cell Science 107 ： 775-785， 所有上述文献通过引用并入本 文。可选择地， MAPKKK 多核苷酸能用本领域已知的技术瞬时转化进植物。这些技术包括病 毒载体系统和多核苷酸沉淀， 所述多核苷酸以阻止随后的 DNA 释放的方式沉淀。因此， 能发 生微粒结合的 DNA 的转录， 但是其释放整合进基因组的频率大大降低。这些方法包括使用 包被有聚乙二胺亚胺的微粒 (PEI ； Sigma#P3153)。
     在其他的实施方案中， 本发明的多核苷酸可以通过将植物与病毒或病毒核酸接触 引入植物。通常， 这些方法涉及将本发明的核苷酸构建体并入病毒 DNA 或 RNA 分子中。应 当认识到， 最初， 可将本发明的 MAPKKK 合成为病毒多蛋白的一部分， 其随后可通过体内或 体外水解加工产生所需的重组蛋白。此外， 应当认识到， 本发明的启动子还包括病毒 RNA 聚 合酶转录所用的启动子。将多核苷酸， 包括病毒 DNA 或 RNA 分子， 引入植物和表达其中所 编码的蛋白的方法， 在本领域内是已知的。参见， 例如， 美国专利第 5,889,191、 5,889,190、 5,866,785、 5,589,367、 5,316,931 号以及 Porta， et al.， (1996)Molecular Biotechnology 5： 209-221， 上述文献通过引用并入本文。
     将多核苷酸定向插入植物基因组特定位置的方法， 在本领域内是已知的。在一个 实施方案中， 使用位点特异性重组系统， 可实现多核苷酸在所需的基因组位置的插入。参 见， 例如， WO 99/25821、 WO 99/25855、 WO 99/25850、 WO 99/25855 和 WO 99/25853， 通过引 用将上述所有文献并入本文。简单而言， 本发明的多核苷酸可以包含在侧翼为非相同重组 位点的转移盒中。 将所述转移盒引入植物中， 该植物具有稳定地并入其基因组的靶位点， 所 述靶位点的侧翼为对应于转移盒位点的两个非相同的重组位点。提供合适的重组酶， 并且 所述转移盒整合于靶位点。目的多核苷酸从而被整合于植物基因组的特定染色体位置。
     按照常规方式， 可以使已经转化的细胞生长为植物。参见， 例如， McCormick， et al.， (1986)Plant Cell Reports 5 ： 81-85。 这些植物随后可以用相同的转化品系或不同的 品系授粉， 并且能鉴定因而产生的、 表达想要的目的表型特征的后代。 可以种植两代或更多 代， 确保稳定维持并遗传想要的表型特征的表达， 并且然后收获种子， 确保已实现了想要的 表型特征的表达。用这种方式， 本发明提供了具有稳定地并入其基因组的本发明多核苷酸 的转化的种子 ( 也称为 “转基因种子” )， 例如， 本发明的表达盒。
     谱系育种 (pedigree breeding) 从两种基因型的杂交开始， 例如， 感兴趣的优良品 系 (elite line) 和具有一个或多个所需的特征的另一品系 ( 例如， 具有稳定地并入的本发 明的多核苷酸， 可调节本发明多肽的活性和 / 或水平 ) 所述的另一品系补充感兴趣的优良 品系。如果两个原始亲本没有提供所有想要的特征， 那么育种群体能包括其他来源。在该 谱系方法中， 使优良植物自交， 并且在连续的子代中选择。在随后的子代中， 由于自花授粉和选择， 杂合状况为纯合品系所代替。在育种的谱系方法中， 通常实施 5 代或更多代连续子 代的自交和选择 ： F1 → F2 ； F2 → F3 ； F3 → F5 ； F5 → F5 等。在足量的近交后， 连续的子代将 发挥增加发育的近交种 (inbred) 的种子的作用。优选地， 所述近交系 (inbred line) 包括 在其约 95％或更多的基因座处的纯合等位基因。
     除了用来产生回交转换 (backcross conversion)， 回交还能与纯种繁育组合使 用， 以修饰感兴趣的优良品系和利用修饰的的优良品系产生的杂种。如之前所讨论的， 回 交能用来将一个或多个特别所需的特征从一个品系、 供体亲本转移至称为回交亲本的近交 种， 其有全面的良好的农艺学特征， 但仍然缺少所需的一种或多种性状。然而， 能用相同 的方法将后代向回交亲本的基因型移动， 但是同时， 通过在早期中断回交和继续自交和选 择， 保留非回交亲本的很多组分。例如， 产生了 F1， 其为商业杂种。该商业杂种可以和其亲 本品系之一回交， 产生 BC1 或 BC2。自交和选择后代， 以便新开发的近交种具有很多回交 亲本的特性并且仍有若干所需的非回交亲本的特性。该方法平衡回交亲本的价值和抗力 (strength)， 用于新的杂种和育种中。
     因此， 本发明的实施方案是， 使感兴趣的玉米近交系进行回交转换的方法， 所述方 法包括使感兴趣的玉米近交系植物和供体植物杂交的步骤， 所述供体植物包含赋予所需的 性状的突变基因或转基因 ( 即， 增强根生长、 增加产量、 增强耐旱性、 在非生物条件下增加 或维持结籽率， 增强枝条生长、 延迟衰老或增强光合作用 )， 选择包含赋予所需的性状的突 变基因或转基因的 F1 后代植物并且将所选的 F1 后代植物与感兴趣的玉米近交系植物回 交。该方法还可以包括获得感兴趣的玉米近交系的分子标记谱 (marker profile) 和用该 分子标记谱来选择有所需特性和感兴趣的玉米近交系分子标记谱的后代植物的步骤。同 样， 该方法可以用于通过增加最后一步产生 F1 杂交种子， 所述最后一步是用不同的玉米植 物来杂交所需性状变换的感兴趣的玉米近交系， 以产生包含赋予所需性状的突变基因或转 基因的 F1 杂交玉米种子。
     回交选择是用于植物育种程序中以改善植物群体的方法。 该方法需要个体植物相 互杂交授粉形成后代。使该后代生长并且通过任何数量的选择方法选择优良后代， 所述后 代包括个体植物、 半同胞后代、 全同胞后代、 自交后代和顶交。 使所选的后代彼此杂交授粉， 形成另一群体的后代。种植该群体并且再次选择优良植物彼此杂交授粉。回交选择是循环 的过程并且因此能按想要的次数重复。回交选择的目的是改善群体的性状。该改善的群 体随后能用作育种材料的来源， 以获得用于杂种的近交品系， 或用作综合品种 (synthetic cultivar) 的亲本。综合品种是通过数个选择的近交种的互交形成的作为结果的后代。
     当与增强分子标记的选择结合使用时， 混合选择是有用的技术。 在混合选择中， 基 于表型和 / 或基因型， 选择来自个体的种子。 随后将这些所选的种子混合在一起 (bulked)， 并且用来培育下一代。 集团选择需要在主体地块 (bulk plot) 中种植植物群体， 从而允许植 物自花授粉， 大量收获种子并随后用大量收获的种子样本种植下一代。 定向授粉 (directed pollination) 而不是自花授粉， 能用作育种程序的一部分。
     突变育种是能用来将新性状引入优良品系的很多方法之一。自发发生的或人工 诱导的突变， 对于植物育种者而言是有用的变异性的来源。人工诱变的目的是增加所需特 征的突变率。突变率能通过许多不同的方法增加， 包括温度、 长期的种子储存、 组织培养条 件、 辐射 ； 例如 X 射线、 γ 射线 ( 例如， 钴 60 或铯 137)、 中子 ( 铀 235 在原子反应堆中核裂变的产物 )， β 射线 ( 由放射性同位素例如磷 32 或碳 15 发射 ) 或紫外线辐射 ( 优选 2500-2900nm) 或化学诱变剂 ( 例如， 碱基类似物 (5- 溴尿嘧啶 )， 相关化合物 (8- 乙氧基咖 啡碱 )， 抗生素 ( 链黑菌素 )， 烷化剂 ( 硫芥、 氮芥、 环氧化物、 乙撑胺 (ethylenamine)、 硫酸 盐、 磺酸盐、 砜、 内酯 )， 叠氮化物， 羟胺， 亚硝酸或吖啶。 一旦通过诱变观察到所需的性状， 则 随后可以通过传统的繁殖技术， 例如回交， 将所述性状并入现有种质中。 突变育种的详情可 见于 “Principles of Cultivar Development( 栽培品系发育原理 )” Fehr， 1993， Macmillan Publishing Company， 通过引用将其公开的内容并入本文。 此外， 在其他品系中所产生的突 变也可以用来产生包含这种突变的优良品系的回交转换。
     本发明可以用于转化任何植物种类， 包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。感 兴趣的植物种类的实例包括但不限于， 玉米 ( 玉米 (Zea may)， 也称为玉米 (maize))、 芸 苔属种类 (Brassica sp.， 例如， 欧洲油菜 (B.napus)、 芫青 (B.rapa)、 芥菜 (B.juncea))， 尤 其 是 用 作 种 子 油 来 源 的 芸 苔 属 种 类， 苜 蓿 ( 紫 花 苜 蓿 (Medicago sativa))、 水稻 (Oryza sativa)、 黑麦 (Secale cereale)、 高粱 ( 高粱 (Sorghum bicolor)、 高粱 (Sorghum vulgare))、 小 米 ( 例 如， 珍 珠 稷 (Pennisetum glaucum)、 黄 米 (proso millet)( 黍 稷 (Panicum miliaceum))、 谷 子 (foxtail millet， Setaria italica)、 龙 爪 稷 (Eleusine coracana))、向 日 葵 (Helianthus annuus)、红 花 (Carthamus tinctorius)、小 麦 (Triticum aestivum)、 大豆 (Glycine max)、 烟草 (Nicotiana tabacum)、 马铃薯 (Solanum tuberosum)、 花生 (Arachis hypogaea)、 棉花 ( 海岛棉 (Gossypium barbadense)、 陆地棉 (Gossypium hirsutum))、 甘薯 (Ipomoea batatus)、 木薯 (Manihot esculenta)、 咖啡 ( 咖 啡属种类 (Coffea spp.))、 椰子 (Cocos nucifera)、 菠萝 (Ananas comosus)、 柑橘树 ( 柑橘 属种类 (Citrus spp.))、 可可 (Theobroma cacao)、 茶 (Camellia sinensis)、 香蕉 ( 芭蕉属 种类 (Musa spp.))、 鳄梨 (Persea americana)、 无花果 (Ficus casica)、 番石榴 (Psidium guajava)、 芒果 (Mangifera indica)、 木犀榄 (Olea europaea)、 番木瓜 (Carica papaya)、 腰果 (Anacardium occidentale)， 澳大利亚坚果 (Macadamia integrifolia)、 杏 (Prunus amygdalus)、 甜菜 (Beta vulgaris)、 甘蔗 ( 甘蔗属种类 (Saccharum spp.))、 燕麦、 大麦、 蔬 菜、 观赏植物和针叶树。
     蔬 菜 包 括 番 茄 (Lycopersicon esculentum)、莴 苣 ( 例 如，莴 苣 (Lactuca sativa))、 菜豆 (Phaseolus vulgaris)、 利马豆 (Phaseolus limensis)、 豌豆 (Lathyrus spp.) 和 黄 瓜 属 (Cucumis) 的 成 员， 例 如 黄 瓜 (C.sativus)、 哈 密 瓜 (C.cantalupensis) 和甜瓜 (C.melo)。观赏植物包括， 杜鹃花 ( 杜鹃属种类 (Rhododendron spp.))、 八仙花 (Macrophylla hydrangea)、 芙 蓉 (Hibiscus rosasanensis)、 玫 瑰 ( 蔷 薇 属 种 类 (Rosa spp.))、 郁金香 ( 郁金香属种类 (Tulipa spp.))、 水仙花 ( 水仙属种类 (Narcissus spp.))、 碧 冬 茄 (Petunia hybrida)、康 乃 馨 (Dianthus caryophyllus)、一 品 红 (Euphorbia pulcherrima) 和菊花。
     可用于实施本发明针叶树包括， 例如， 松树， 例如火炬松 (Pinus taeda)、 沼泽松 (Pinus elliotii)、 西黄松 (Pinus ponderosa)、 黑松 (Pinus contorta) 和辐射松 (Pinus radiata) ； 花旗松 (Pseudotsuga menziesii) ； 加拿大铁杉 (Tsuga canadensis) ； 苍白云 杉 (Picea glauca) ； 北美红杉 (Sequoia sempervirens) ； 冷杉， 例如温哥华冷杉 (Abies amabilis) 和香脂冷杉 (Abies balsamea) 和雪松例如北美乔柏 (Thuja plicata) 和黄扁柏(Chamaecyparis nootkatensis)。在具体的实施方案中， 本发明的植物是农作物 ( 例如， 玉 米、 苜蓿、 向日葵、 芸苔、 大豆、 棉花、 红花、 花生、 高粱、 小麦、 小米、 烟草等 )。 在其他实施方案 中， 玉米和大豆植物是最佳的并且在其他的实施方案中， 玉米植物是最佳的。
     其他感兴趣的植物包括提供感兴趣的种子的谷物植物， 油料种子植物和豆科植 物。感兴趣的种子包括谷物种子， 例如玉米、 小麦、 大麦、 水稻、 高粱、 黑麦等。油料种子植物 包括棉花、 大豆、 红花、 向日葵、 芸苔、 玉米、 苜蓿、 棕榈、 椰子等。豆科植物包括豆 (beans) 和 豌豆， 豆包括瓜尔豆、 槐豆 (locust bean)、 葫芦巴、 大豆、 四季豆 (garden beans)、 豇豆、 绿 豆、 利马豆、 蚕豆、 小扁豆、 鹰嘴豆等。
     通常， 在实施本发明时会使用中间宿主细胞， 来增加克隆载体的拷贝数。 通过拷贝 数增加， 能够大量分离含有目的核酸的载体， 用于引入所需的植物细胞中。 在一个实施方案 中， 使用在细菌中不引起多肽表达的植物启动子。
     原核生物最频繁地以各种大肠杆菌 (E.coli) 菌株为代表。然而， 也可以使用其他 微生物菌株。 常用的原核控制序列， 本文将其定义为包括用于转录起始的启动子， 任选地带 有操纵基因， 以及核糖体结合序列， 包括如下述一样常用的启动子 ： β- 内酰胺酶 ( 青霉素 酶 ) 和乳糖 (lac) 启动子系统 (Chang， e al.， (1977)Nature 198 ： 1056)、 色氨酸 (trp) 启 动子系统 (Goeddel， et al.， (1980)Nucleic Acids Res.8 ： 5057) 和源于 PL 的 λ 启动子 和 N- 基因核糖体结合位点 (Shimatake， et al.， (1981)Nature 292 ： 128)。将选择标记包 括于在大肠杆菌中转染的 DNA 载体中， 也是有用的。这种标记的实例包括确定抗氨苄青霉 素、 四环素或氯霉素抗性的基因。
     选择允许引入合适的宿主细胞的载体。细菌载体通常是质粒或噬菌体来源 的。合适的细菌细胞用噬菌体载体颗粒感染或用裸噬菌体载体 DNA 转染。如果使用质 粒载体， 则用质粒载体 DNA 转染细菌细胞。用芽孢杆菌种类 (Bacillus sp.) 和沙门氏 菌 (Salmonella)， 可得到表达本发明蛋白的表达系统 (Palva， et al.， (1983)gene 22 ： 229-235) ； Mosbach， et al.， (1983)Nature 302 ： 553-555)。
     多种真核表达系统， 例如酵母、 昆虫细胞系、 植物和哺乳动物细胞， 对本领域技术 人员而言是已知的。如下文简要解释的， 本发明的多核苷酸能在这些真核系统中表达。在 一些实施方案中， 如下文所讨论的， 用转化的 / 转染的植物细胞作为产生本发明蛋白的表 达系统。
     在酵母中合成异源多核苷酸是已知的 (Sherman， et al.， (1982)Metherds in Yeast genetics， Cold Spring Harbor Laboratory)。两种广泛应用的产生真核蛋白的 酵母是酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 和毕赤酵母 (Pichia pastoris)。在酿酒 酵母和毕赤酵母中表达的载体、 菌株和方案是本领域已知的， 并且可从商业供应商 ( 例如， Invitrogen) 获得。 适当的载体通常有表达控制序列， 例如启动子， 包括 3- 磷酸甘油酸盐激 酶或醇氧化酶在内的， 和复制起点、 终止序列和及所需要的序列等。
     本发明的蛋白一但表达， 就能通过裂解细胞和应用列表中的标准蛋白分离技术从 酵母中分离。可以用 Western 印迹技术或其他标准免疫测定技术的放射性免疫测定来完成 纯化过程的监测。
     本发明的序列也能连接到各种表达载体中， 用于转染例如哺乳动物、 昆虫或植物 来源的细胞培养物。用来产生肽的示例性细胞培养物是哺乳动物细胞。现有技术已开发了多种能表达完整蛋白的合适宿主细胞系， 并且所述细胞系包括 HEK293、 BHK21 和 CHO 细 胞系。用于这些细胞的表达载体包括表达控制序列， 例如复制起点、 启动子 ( 如， CMV 启动 子、 HSV tk 启动子或 pgk( 磷酸甘油酸盐激酶 ) 启动子 )、 增强子 (Queen， et al.， (1986) Immunol.Rev.89 ： 59)， 和必需的加工信息位点， 例如， 核糖体结合位点、 RNA 剪接位点、 聚 腺苷酸化位点 ( 例如， SV50 巨大 T Ag PolyA 添加位点 ) 和转录终止序列。用来产生本 发明蛋白的其他动物细胞可以从例如美国典型培养物保藏中心 (American Type Culture Collection) 获得。
     用于在昆虫细胞中表达本发明蛋白的合适的载体通常源于 SF9 杆状病毒。合适 的昆虫细胞系包括蚊幼虫、 蚕、 粘虫、 蛾和果蝇 (Drosophila) 细胞系例如， 施耐德细胞系 (Schneider cell line， 参见， Schneider， (1987)J.Embryol.Exp.Morphol.27 ： 353-365)。
     同用酵母一样， 当使用高等动物或植物宿主细胞时， 通常将聚腺苷酸化或转录终 止序列并入载体中。终止序列的实例是源于牛生长激素基因的聚腺苷酸化序列。还可以包 括精确剪接转录物的序列。 剪接序列的实例是来源于 SV50 的 VP1 内含子 (Sprague， et al.， (1983)J.Virol.55 ： 773-781)。此外， 可以将在宿主细胞中控制复制的基因序列并入载体 中， 例如， 那些见于牛乳头状瘤病毒的载体类型 (Saveria-Campo， (1985)DNA Cloning Vol. II a Practical Approach， Glover， Ed.， IRL Press， Arlington， Virginia， pp.213-238)。
     动物和低等真核 ( 例如， 酵母 ) 宿主细胞对感染是感受态的或能通过各种方式是 感受态的。有数种公知的将 DNA 引入动物细胞的方法。这些方法包括 ： 磷酸钙沉淀、 受体细 胞和含有 DNA 的细菌原生质体的融合、 用含有 DNA 的脂质体处理受体细胞、 DEAE 葡聚糖、 电 穿孔、 DNA 通过微弹轰击法 (biolistics) 和直接微注射进入细胞。转染的细胞用本领域公 知的方法培养。 (Kuchler， (1997)Biochemical Methods in Cell Culture and Virology， Dowden， Hutchinson and Ross， Inc.)。
     在某些实施方案中， 本发明的核酸序列能和感兴趣的多核苷酸序列的任何组 合叠加， 以产生具有所需表型的植物。产生的组合可以包括多拷贝的任一目的多核苷 酸。例如， 本发明的多核苷酸可以和本发明的任何其他多核苷酸叠加。本发明的多核苷 酸也能和参与非生物胁迫耐受性的其他基因或基因组合叠加， 包括， 例如， 参与渗透保护 (osmoprotection)、 抗氧化剂应答和 / 或膜稳定性的多核苷酸。一种这样的多核苷酸包 括但不限于 C 重复结合因子 (C-repeat Binding Factor， CBF)， 其为已知结合 C 重复元 件 (CRT) 的转录因子， 也被称为脱水应答元件 (Dehydration Response Element， DRE) 元 件。( 参见， 美国专利申请公开号第 2006/0026716 号和美国专利第 6,706,866、 6,417,428、 5,965,705、 5,929,305、 5,892,009 和 5,891,859 号， 通过引用将上述公开内容并入本 文 )。DRE 存在于数个基因的启动子中， 所述基因受干旱或寒冷形式的非生物胁迫诱导。已 知 CRT/DRE 元件存在于数个脱水素或 LEA( 晚期胚丰富 ) 基因的启动子中。Rodriguez， et al.， (2005)Theor.Appl genet.110(5) ： 852-858 ； Kobayashi， (2004)， Regulation of cold-responsive Cor/Lea genes and their transcription factors by the major freezing tolerance locus Fr-1 in wheat( 通过主要的冰冻耐受性基因座 Fr-1， 在小 麦中调节寒冷应答 Cor/Lea 基因和其转录因子 )， In Recent research developments in plant science Vol.2， pages 249-266。 已知超表达 CBF 的转基因植物比非转基因植物积累 更高水平的被认为是渗透调节剂的糖和脯氨酸。 参见， 例如， Yamada， et al.， (2005)J.Exp.Botany 56(417) ： 1975-1981。因此， 在本发明一方面， 本发明的 MAPKKK 和 CBF 叠加。一方 面， MAPKKK 多核苷酸是 ZmNPK1a。一方面， CBF 是 CBF1。( 参见， 美国专利第 6,706,866、 6,417,428、 5965,705、 5,929,305、 5,892,009 和 5,891,859 号， 通过引用将上述公开的内容 并入本文 )。一方面， CBF1 来自玉米。( 参见， 美国专利第 6,417,428 号的 SEQ ID NO ： 94)。 一方面， CBF 由和 MAPKKK 多核苷酸相同的启动子驱动。 一方面， CBF 由不同于 MAPKKK 多核苷 酸的启动子驱动。 一方面， 启动子胁迫诱导启动子。 另一方面， 启动子是 RAB17。 (Vilardell， et al.， (1990)Plant Mol Biol 14 ： 423 432)。
     本发明的多核苷酸也能与任何其他基因或基因组合叠加， 以产生有很多所需性状 组合的植物， 所述的性状组合包括但不限于动物饲料所需的性状， 例如高油基因 ( 例如， 美 国专利第 6,232,529 号 ) ； 平衡的氨基酸 ( 例如， hordothionins( 美国专利第 5,990,389、 5,885,801、 5,885,802 和 5,703,409 号 ) ； 大 麦 高 赖 氨 酸 (Williamson， et al.， (1987) Eur.J.Biochem.165 ： 99-106 和 WO 98/20122) 和高蛋氨酸蛋白 (Pedersen， et al.， (1986) J.Biol.Chem.261 ： 6279 ； Kirihara， et al.， (1988)Gene 71 ： 359 和 Musumura， et al.， (1989)Plant Mol.Biol.12 ： 123)) ； 增强的消化性 ( 例如， 修饰的储存蛋白 ( 美国专利申 请系列第 10/053,410 号， 于 2001 年 11 月 7 日提交 ) 和硫氧还蛋白 ( 美国专利申请系列 第 10/005,429 号， 于 2001 年 12 月 3 日提交 ))， 通过引用将上述公开的内容并入本文。 本发明的多核苷酸还能与昆虫、 疾病或除草剂抗性所需的性状叠加 ( 例如， 苏云金杆菌 (Bacillus thuringiensis) 毒 性 蛋 白 ( 美 国 专 利 第 5,366,892、 5,747,450、 5,737,514、 5723,756、 5,593,881 号 ； Geiser， et al.， (1986)Gene 48 ： 109) ； 凝集素 (Van Damme， et al.， (1994)Plant Mol.Biol.24 ： 825) ； 烟曲霉毒素解毒基因 ( 美国专利第 5,792,931 号 ) ； 无毒性和疾病抗性基因 (Jones， et al.， (1994)Science 266 ： 789 ； Martin， et al.， (1993) Science 262 ： 1432 ； Mindrinos， et al.， (1994)Cell78 ： 1089) ； 引起除草剂抗性的乙酰乳 酸合酶 (ALS) 突变体， 例如 S4 和 / 或 Hra 突变 ； 谷氨酰胺合成酶抑制剂例如， 膦丝菌素或 basta( 例如， bar 基因 ) 和草甘膦抗性 (EPSPS 基因 )) 和加工或工艺产品所需的性状， 例如 高油 ( 例如， 美国专利第 6,232,529 号 ) ； 修饰的油 ( 例如， 脂肪酸去饱和基因 ( 美国专利 第 5,952,544 号、 WO 94/11516)) ； 修饰的淀粉 ( 例如， ADPG 焦磷酸化酶 (AGPase)、 淀粉合 酶 (SS)、 淀粉分支酶 (SBE) 和淀粉去分支酶 (SDBE)) 和聚合物或生物塑料 ( 例如， 美国专利 第 5.602,321 号 ； β- 酮硫解酶、 聚羟基丁酸酯合成酶和乙酰乙酸 -CoA 还原酶 (Schubert， et al.， (1988)J.Bacteriol.170 ： 5837-5847) 促进聚羟基脂肪酸酯 (PHAs) 的表达 )， 通过 引用将上述公开的内容并入本文。 还能将本发明的多核苷酸与影响农艺学性状的多核苷酸 组合， 所述农艺学性状例如， 雄性不育、 茎强度、 花期或转化技术性状， 例如， 细胞周期调节 或基因定向 ( 例如， WO 99/61619、 WO 00/17364、 WO99/25821)。
     这些叠加的组合能用任何方法产生， 所述方法包括但不限于， 通过任何常规的或 顶交方法或遗传转化植物杂交育种。如果通过遗传转化植物叠加性状， 那么感兴趣的多核 苷酸序列能在任何时间和以任何次序组合。例如， 包含一个或多个所需性状的转基因植物 能用作通过随后转化引入其他性状的靶标。 所述性状在共转化方案中能与转化盒的任何组 合所提供的感兴趣的多核苷酸同时引入。 例如， 如果要引入两条序列， 则所述两条序列可以 包含在各自的转化盒 ( 反式 ) 或包含在同一转化盒 ( 顺式 ) 中。序列表达能由同一启动子 或不同的启动子驱动。 在某些情况下， 可能需要引入抑制感兴趣的多核苷酸表达的转化盒。这可以与其他抑制盒或超表达盒的任何组合联合， 以在植物中产生所需的性状组合。
     II. 调节 MAPKKK 多肽的浓度和 / 或活性
     提供了在植物中调节本发明多肽浓度和 / 或活性的方法。通常， 相对于天然对照 植物、 植物部分或细胞， 浓度和 / 或活性增加或降低至少 1％、 5％、 10％、 20％、 30％、 50％、 50％、 60％、 70％、 80％或 90％。本发明的调节可以发生在所需的任何发育阶段。在具体的 实施方案中， 在单子叶植物， 特别是玉米中， 调节本发明的多肽。
     “个体植物或植物细胞” ， 是感兴趣的基因的遗传改变例如转化， 已经生效的植物 或植物细胞， 或是从发生如此改变的植物或细胞传下来的并且包含所述改变的植物或植物 细胞。 “对照” 或 “对照植物” 或 “对照植物细胞” 为检测个体植物或植物细胞中的表型改变 提供参考点。
     对照植物或植物细胞可以包含， 例如 ： (a) 野生型植物或细胞， 即， 与导致个体植 物或细胞的遗传改变的起始材料有相同的基因型 ； (b) 与起始材料有相同基因型， 但是已 经用无效构建体 ( 即， 用对感兴趣的性状没有已知效应的构建体， 例如， 包含标记基因的构 建体 ) 转化的植物或植物细胞 ； (c) 个体植物或植物细胞后代中， 为非转化分离子的植物或 植物细胞 ； (d) 与个体植物或植物细胞基因相同的植物或植物细胞， 但是， 所述植物或植物 细胞没有暴露在诱导目的基因表达的条件和刺激剂下， 或 (e) 处于没有表达目的基因的条 件下的个体植物或植物细胞本身。
     MAPKKK 多肽的表达水平可以直接检测， 例如， 通过测定植物中 MAPKKK 多肽的水 平， 或间接检测， 例如， 通过检测植物中 MAPKKK 多肽的 MAPKKK 活性。测定 MAPKKK 活性的方 法在本文其他地方有描述， 并且包括评价表型改变， 例如增强的非生物胁迫抗性或耐受性。
     在具体的实施方案中， 将本发明的 MAPKKK 多肽或多核苷酸引入植物细胞。随后 用本领域技术人员已知的方法筛选具有引入的序列的植物细胞， 所述方法例如， 但不限于， Southern 印迹分析、 DNA 测序、 PCR 分析或表型分析。使上述实施方案所改变的植物或植物 部分在植物形成条件生长到足以允许调节植物中本发明多肽的浓度和 / 或活性的时间。植 物形成条件是本领域公知的， 并在本文其他地方作了简单论述。
     还应当认识到， 可以通过使用多核苷酸来调节多肽的水平和 / 或活性， 所述多核 苷酸不能在转化的植物中指导蛋白或 RNA 的表达。例如， 本发明的多核苷酸可以用来设计 多核苷酸构建体， 该多核苷酸构建体能用于使有机体中的基因组核苷酸序列改变或突变的 方法中。这种多核苷酸构建体包括但不限于， RNA:DNA 载体、 RNA:DNA 突变载体、 RNA:DNA 修复载体、 混合的双链寡核苷酸 (mixed-duplex oligonucleotide)、 自身互补的 RNA:DNA 寡核苷酸和诱重组寡核碱基 (recombinogenic oligonucleobase)。这种核苷酸构建体 和使用方法在本领域内是已知的。参见， 美国专利第 5,565,350、 5,731,181、 5,756,325、 5,760,012、 5,795,972 和 5,871,985 号 ； 通过引用将上述全部内容并入本文。还参见， WO98/59350、 WO 99/07865、 WO 99/25821 和 Beetham， et al.， (1999)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 96 ： 8775-8778 ； 通过引用并入本文。
     因此， 应当认识到， 本发明方法不依赖于并入基因组的全部多核苷酸， 只要植物或 其细胞由于多核苷酸向细胞内的引入而被改变。在本发明的一个实施方案中， 基因组可以 在将多核苷酸引入细胞内后被改变。 例如， 多核苷酸， 或其任意部分， 可以并入植物基因组。 本发明基因组改变包括但不限于， 基因组核苷酸的添加、 缺失或取代。 虽然本发明的方法不依赖于插入、 缺失或取代任何具体数量的核苷酸， 但是， 应当认识到， 这种插入、 缺失或取代 至少包括一个核苷酸。
     A. 增加 MAPKKK 多肽的活性和 / 或水平
     提供了增加 MAPKKK 多肽活性和 / 或水平的方法。通过向植物提供 MAPKKK 多肽， 可以实现本发明 MAPKKK 多肽活性和 / 或水平的增加。通过下述方法提供 MAPKKK 多肽 ： 将 编码 MAPKKK 多肽的氨基酸序列引入植物， 将编码 MAPKKK 多肽的核苷酸序列引入植物， 或可 选择地， 修饰编码 MAPKKK 多肽的基因组基因座。一方面， 编码本发明 MAPKKK 多肽的多核苷 酸在植物细胞或植物中超表达。如本文所使用的， 术语 “超表达 (over-express)” “超表达 、 (over-expressed)” 、 “超表达 (over-expressing)” 或 “超表达 (over-expression)” 是指 植物细胞中 MAPKKK 多核苷酸和 / 或多肽的产生在量上超过该植物细胞中通常所产生的量。 本发明的 MAPKKK 多核苷酸和 / 或多肽可以在植物细胞中， 在特定的时间点或特定的植物发 育阶段超表达。
     如本文其他地方所讨论的， 本领域知晓很多向植物提供多肽的方法包括， 但不限 于， 直接将多肽引入植物， 将编码具有 MAPKKK 活性的多肽的多核苷酸构建体引入 ( 瞬时 地或稳定地 ) 植物。还应当认识到， 本发明方法可以使用不能在转化的植物中指导蛋白 或 RNA 表达的多核苷酸。因此， MAPKKK 多肽的水平和 / 或活性可以通过改变编码 MAPKKK 多肽的基因或其启动子而增加。参见， 例如， Kmiec 的美国专利第 5,565,350 号 (Kmiec， US Patent Number 5,565,350) ； Zarling 等 的 PCT/US93/03868(Zarling， et al.， PCT/ US93/03868)。因此， 提供了携带 MAPKKK 基因中的突变的诱变植物， 其中所述突变增加了 MAPKKK 基因的表达或增加了编码的 MAPKKK 多肽的 MAPKKK 活性。如本文所用的， 术语 “超 表达 (over-express)” 、 “超表达 (over-expressed)” 或 “超表达 (over-expressing)” 是指 植物细胞中 MAPKKK 多核苷酸和 / 或多肽的产生在量上超过该植物细胞中通常所产生的量。
     B. 降低 MAPKKK 多肽的活性和 / 或水平
     提供了通过用表达盒转化植物细胞降低或消除 MAPKKK 多肽的活性和 / 或水平的 方法， 该表达盒表达抑制 MAPKKK 多肽表达的多核苷酸。 所述多核苷酸可以通过阻止 MAPKKK 信使 RNA 的翻译直接抑制一种或多种 MAPKKK 多肽的表达， 通过编码抑制植物基因的转录 或翻译的多肽， 所述植物基因编码 MAPKKK 多肽， 间接地抑制一种或多种 MAPKKK 多肽的表 达。抑制或消除植物中基因表达的方法是本领域公知的， 并且任何这种方法可以用于本发 明中， 以抑制一种或多种 MAPKKK 多肽的表达。
     按照本发明， 如果 MAPKKK 多肽的蛋白水平在统计学上显著低于未受到遗传修饰 或诱变以抑制该蛋白的表达的植物中相同 MAPKKK 多肽的蛋白水平， 那么 MAPKKK 多肽的表 达受到抑制。在本发明的具体实施方案中， 按照本发明， 在修饰的植物中， MAPKKK 多肽的蛋 白水平比不是突变体或未受到遗传修饰以抑制所述 MAPKKK 多肽表达的植物中相同 MAPKKK 多肽的蛋白水平少于 96 ％、 少于 90 ％、 少于 80 ％、 少于 75 ％、 少于 60 ％、 少于 50 ％、 少于 50％、 少于 30％、 少于 20％、 少于 10％或少于 5％。MAPKKK 多肽的表达水平可以直接检测， 例如， 通过测定植物细胞或植物中所表达的 MAPKKK 多肽水平， 或间接检测， 例如， 通过检测 植物细胞或植物中 MAPKKK 多肽的活性。测定 MAPKKK 多肽的 MAPKKK 活性的方法在本文其 他地方作了描述。
     在本发明的其他实施方案中， 通过表达盒转化植物细胞降低或消除一种或多种MAPKKK 的活性， 所述表达盒包含编码抑制一种或多种 MAPKKK 活性的多肽的多核苷酸。 按照 本发明， 如果 MAPKKK 的 MAPKKK 活性在统计学上显著低于未受到遗传修饰以抑制其 MAPKKK 活性的植物中的相同 MAPKKK 的活性， 那么 MAPKKK 的 MAPKKK 活性受到了抑制。在本发明的 具体实施方案中， 按照本发明， 修饰的植物中的 MAPKKK 的 MAPKKK 活性比未受到遗传修饰以 抑制所述 MAPKKK 表达的植物中相同 MAPKKK 的 MAPKKK 活性少于 95％、 少于 90％、 少于 80％、 少于 70％、 少于 60％、 少于 50％、 少于 50％、 少于 30％、 少于 20％、 少于 10％或少于 5％。 按 照本发明， 当通过本文其他地方描述的检测方法检测不到 MAPKKK 活性时， MAPKKK 的 MAPKKK 活性被 “消除” 。测定 MAPKKK 的 MAPKKK 活性的方法在本文其他地方作了描述。
     在其他的实施方案中， 通过破坏编码 MAPKKK 的基因可以降低或消除 MAPKKK 的活 性。本发明包括携带 MAPKKK 基因中的突变的诱变植物， 其中， 所述突变降低 MAPKKK 基因的 表达或抑制编码的 MAPKKK 的 MAPKKK 活性。
     因此， 可以使用很多方法来降低或消除 MAPKKK 活性。可以使用多于一种方法以降 低单个 MAPKKK 的活性。 此外， 可以使用方法的组合来降低或消除两种或更多种不同 MAPKKK 多肽的活性。
     下文给出了降低或消除 MAPKKK 表达的方法的非限制性实例。 1. 基于多核苷酸的方法
     在本发明的一些实施方案中， 植物细胞用能表达抑制 MAPKKK 多肽表达的多核苷 酸的表达盒转化。如本文所用的， 术语 “表达” 是指基因产物的生物合成， 包括所述基因产 物的转录和 / 或翻译。例如， 对于本发明的目的而言， 能表达抑制至少一种 MAPKKK 多肽表 达的多核苷酸的表达盒是能产生抑制至少一种 MAPKKK 多肽转录和 / 或翻译的 RNA 分子的 表达盒。从 DNA 分子 “表达” 或 “产生” 蛋白或多肽是指转录和翻译编码序列， 以产生蛋白 或多肽， 而从 RNA 分子 “表达” 或 “产生” 蛋白或多肽是指翻译 RNA 编码序列， 以产生蛋白或 多肽。
     下文给出抑制 MAPKKK 多肽表达的多核苷酸的实例
     i. 有义抑制 / 共抑制
     在本发明的一些实施方案中， 通过有义抑制或共抑制可以获得抑制 MAPKKK 多肽 的表达。对于共抑制而言， 设计表达 RNA 分子的表达盒， 所述 RNA 分子在 “有义” 方向上对应 于编码 MAPKKK 多肽的全部或部分信使 RNA。RNA 分子的超表达导致天然基因的表达降低。 因此， 筛选用共抑制表达盒转化的多个植物系， 以鉴定对 MAPKKK 多肽表达表现出最大抑制 的那些植物系。
     用于共抑制的多核苷酸对应于编码 MAPKKK 多肽的全部或部分序列、 MAPKKK 转录 物的全部或部分 5′和 / 或 3′非翻译区或编码 MAPKKK 多肽的转录物的全部或部分编码序 列和非翻译区。在一些实施方案中， 其中， 多核苷酸包含 MAPKKK 多肽的全部或部分编码区， 设计表达盒以去除该多核苷酸的起始密码子， 以便不转录蛋白产物。
     共抑制可以用来抑制植物基因的表达， 以产生对于这些基因编码的蛋白而言具 有无法检测到的蛋白水平的植物。参见， 例如， Broin， et al.， (2002)Plant Cell 15 ： 1517-1532。 共抑制还可以用来在同一植物中抑制多种蛋白的表达。 参见， 例如， 美国专利第 5,952,657 号。 用共抑制来抑制植物中内源基因表达的方法描述于 Flavell， et al.， (1995) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91 ： 3590-3596 ； Jorgensen， et al.， (1996)Plant Mol.Biol.31 ：
     957-973 ； Johansen and Carrington， (2001)Plant Physiol.126 ： 930-938 ； Broin， et al.， (2002)Plant Cell 15 ： 1517-1532 ； Stoutjesdijk， et al.， (2002)Plant Physiol.129 ： 1723-1731 ； Yu， et al.， (2003)Phytochemistry 63 ： 753-763 和 美 国 专 利 第 5,035,323、 5,283,185 和 5,952,657 号中 ； 通过引用将上述每一篇并入本文。通过在有义序列的 3′端 和聚腺苷酸化信号的 5′端， 将 poly-dT( 聚 -dT) 区包括于表达盒中， 可以增强共抑制的效 率。参见， 美国专利申请公开号第 2002/0058815 号， 通过引用并入本文。通常， 这种核苷酸 序列与内源基因的转录物序列有实质性序列同一性， 优选地， 多于约 65％的序列同一性， 更 优选地， 多于约 85％的序列同一性， 最优选地， 多于约 95％的序列同一性。参见， 美国专利 第 5,283,185 号和第 5,035,323 号 ； 通过引用并入本文。
     转录基因沉默 (transcriptional gene silencing， TGS) 可以通过使用 hpRNA 构 建体实现， 其中发夹的反向重复与待沉默的基因的启动子区域共有序列同一性。hpRNA 加 工成能与同源启动子区相互作用的短 RNA， 可引发降解或甲基化， 导致沉默。(Aufsatz， et al.， (2002)PNAS99(4) ： 16499-16506 ； Mette， et al.， (2000)EMBO J 19(19) ： 5194-5201)。 还参见， 美国专利申请公开号第 2005/0246796 号。
     ii. 反义抑制
     在本发明的一些实施方案中， 通过反义抑制实现 MAPKKK 多肽表达的抑制。对于反 义抑制而言， 设计表达盒表达 RNA 分子， 所述 RNA 分子与编码 MAPKKK 多肽的全部或部分信 使 RNA 互补。反义 RNA 分子的超表达能导致天然基因的表达降低。因此， 筛选用反义抑制 表达盒转化的多个植物系， 以鉴定对 MAPKKK 多肽表达表现出最大抑制的那些植物系。
     反义抑制中所用的多核苷酸对应于编码 MAPKKK 多肽的序列的全部或部分互补 物、 MAPKKK 多肽转录物的 5′和 / 或 3′非翻译区的全部或部分互补物或编码 MAPKKK 多肽 的转录物的编码序列和非翻译区域的全部或部分互补物。此外， 反义多核苷酸可以与靶序 列完全互补 ( 即， 与靶序列的互补物 100％相同 ) 或部分互补 ( 即， 与靶序列的互补物小于 100％相同 )。 反义抑制可以用来在同一植物中抑制多种蛋白的表达。 参见， 例如， 美国专利 第 5,952,657 号。此外， 反义核苷酸的一部分可以用来破坏靶基因的表达。通常， 可以使用 至少有 50 个核苷酸、 100 个核苷酸、 200 个核苷酸、 300 个、 500 个、 550 个、 500 个、 550 个或 更长的序列。用反义抑制来抑制植物中内源基表达的方法描述于例如 Liu， et al.， (2002) Plant Physiol.129 ： 1732-1753 和美国专利第 5,759,829 号和第 5,952,657 号中。通过在 反义序列的 3′端和聚腺苷酸化信号的 5′端， 将 poly-dT 区域包括于表达盒中， 可以增强 反义抑制的效率。参见， 美国专利申请公开号第 2002/0058815 号。
     iii. 双链 RNA 干扰
     在本发明的一些实施方案中， 通过双链 RNA(dsRNA) 干扰可以实现 MAPKKK 多肽表 达的抑制。对于 dsRNA 干扰而言， 在同一细胞中表达有义 RNA 分子和反义 RNA 分子， 所述有 义 RNA 分子如上文共抑制所述的有义 RNA 分子一样， 所述反义 RNA 分子与所述有义 RNA 分 子完全或部分互补， 从而导致相应内源信使 RNA 表达的抑制。
     有义和反义分子的表达能通过设计包含有义序列和反义序列的表达盒来实现。 可 选择地， 单独的表达盒可以用于有义和反义序列。随后筛选用 dsRNA 干扰表达盒或表达盒 转化的多个植物系， 以鉴定对 MAPKKK 多肽表达表现出最大抑制的植物系。用 dsRNA 干扰来 抑制内源性植物基因表达的方法描述于 Waterhouse， et al.， (1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95 ： 13959-13965， Liu， et al.， (2002)Plant Physiol.129 ： 1732-1753 和 WO99/59029、 WO 99/53050、 WO 99/61631 和 WO 00/59035 中。
     iv. 发夹 RNA 干扰和含有内含子的发夹 RNA 干扰
     在本发明的一些实施方案中， 可以通过发夹 RNA(hpRNA) 干扰或含有内含子的发 夹 RNA(ihpRNA) 干扰实现一种或多种 A 型 RR 多肽表达的抑制。这些方法高效抑制内源基 因的表达。参见， Waterhouse and Helliwell， (2003)Nat.Rev.genet.5 ： 29-38 和其中引用 的参考文献。
     对于 hpRNA 干扰而言， 设计表达 RNA 分子的表达盒， 所述 RNA 分子自身杂交形 成包含单链环状区和碱基配对茎的发夹结构。所述碱基配对茎区包含有义序列和反义 序列， 所述有义序列对应于编码表达待受到抑制的基因的全部或部分内源信使 RNA， 所 述反义序列与该有义序列完全或部分互补。因此， 分子的碱基配对茎区通常决定 RNA 干 扰的特异性。hpRNA 分子高效抑制内源基因的表达， 并且其诱导的 RNA 干扰遗传给植物 的 下 一 代。 参 见， 例 如， Chuang and Meyerowitz， (2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97 ： 5985-5990 ； Stoutjesdijk， et al.， (2002)Plant Physiol.129 ： 1723-1731 和 Waterhouse and Helliwell， (2003)Nat.Rev.Genet.5 ： 29-38。 用 hpRNA 干 扰 抑 制 或 沉 默 基 因 表 达 的 方 法 描 述 于， 例 如， Chuang and Meyerowitz， (2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97 ： 5985-5990 ； Stoutjesdijk， et al.， (2002)Plant Physiol.129 ： 1723-1731 ； Waterhouse and Helliwell， (2003)Nat.Rev.Genet.5 ： 29-38 ； Pandolfini， et al.， BMCBiotechnology 3： 7 和美国专利申请公开号第 2003/0175965 号中 ； 通过引用将上述每一篇并入本文。 hpRNA 构建体体内沉默基因表达效率的瞬时检测描述于， Panstruga， et al.， (2003)Mol.Biol. Rep.30 ： 135-150 中。
     对于 ihpRNA 而言， 干扰分子与 hpRNA 有相同的基因结构， 但是该 RNA 分子另外 还含有内含子， 所述内含子在表达 ihpRNA 的细胞内能被剪接。剪接随后， 使用内含子可 以使发夹 RNA 分子中环的大小最小化， 并且这提高干扰效率。参见， 例如， Smith， et al.， (2000)Nature507 ： 319-320。事实上， Smith 等用 ihpRNA 介导的干扰证实了 100 ％抑制 内源基因表达。用 ihpRNA 干扰抑制内源性植物基因表达的方法描述于， 例如， Smith， et al.， (2000)Nature 507 ： 319-320 ； Wesley， et al.， (2001)Plant J.27 ： 581-590 ； Wang and Waterhouse， (2001)Curr.Opin.Plant Biol.5 ： 156-150 ； Waterhouse and Helliwell， (2003)Nat.Rev.Genet.5 ： 29-38 ； Helliwell and Waterhouse， (2003)Metheds 30 ： 289-295 和美国专利申请公开号第 2003/0180955 号中。
     还可以这样设计用于 hpRNA 干扰的表达盒， 有义序列和反义序列不对应于内源 RNA。在该实施方案中， 有义和反义序列为环状序列侧翼， 所述环状序列包含对应于靶基因 的全部或部分内源信使 RNA 的核苷酸序列。因此， 是环状区决定了 RNA 干扰的特异性。参 见， 例如， WO 02/00905。
     v. 扩增子介导的干扰
     扩增子表达盒包含植物病毒来源的序列， 所述序列含有全部或部分靶基因， 但通 常不含有天然病毒的全部基因。存在于表达盒的转录产物中的病毒序列， 允许转录产物指 导其自身复制。扩增子所产生的转录物相对于靶序列 ( 即， MAPKKK 多肽的信使 RNA) 可以 是有义的或反义的。用扩增子抑制内源性植物基因表达的方法描述于， 例如， Angell andBaulcombe， (1997)EMBO J.16 ： 3675-3685， Angell and Baulcombe， (1999)Plant J.20 ： 357-362 和美国专利第 6,656,805 号。
     vi. 核酶
     在一些实施方案中， 本发明的表达盒所表达的多核苷酸是催化性 RNA 或对 MAPKKK 多肽的信使 RNA 有特异性的核酶活性。因此， 所述多核苷酸使内源信使 RNA 降解， 从而导致 MAPKKK 多肽的表达降低。该方法描述于， 例如美国专利第 5,987,071 号中。
     vii. 小干扰 RNA 或微 RNA
     在本发明的一些实施方案中， 通过表达编码微 RNA(miRNA) 的基因， 经 RNA 干扰， 可以实现一种或多种 MAPKKK 多肽表达的抑制。miRNAs 是由约 22 个核糖核苷酸组成的调 节剂。miRNA 高效抑制内源基因的表达。参见， 例如 Javier， et al.， (2003)Nature 525 ： 257-263， 通过引用并入本文。
     对于 miRNA 干扰而言， 设计表达 RNA 分子的表达盒， 所述 RNA 分子以内源 miRNA 基 因为模型。miRNA 基因编码形成发夹结构的 RNA， 所述发夹结构含有与另一内源基因 ( 靶序 列 ) 互补的 22 个核苷酸的序列。对于 MAPKKK 多肽表达的抑制， 所述 22 个核苷酸的序列选 自 MAPKKK 转录物序列， 并且含有所述 MAPKKK 多肽序列有义方向上的 22 个核苷酸和 21 个 相应反义序列的核苷酸， 所述相应反义序列与所述有义序列互补。 miRNA 分子高效抑制内源 基因的表达， 并且其诱导的 RNA 干扰遗传给植物的下一代。
     2. 基于多肽的基因表达抑制
     在一个实施方案中， 多核苷酸编码锌指蛋白， 所述锌指蛋白与编码 MAPKKK 多肽的 基因结合， 从而导致该基因的表达降低。在具体实施方案中， 锌指蛋白与 MAPKKK 多肽基因 的调节区结合。在其他的实施方案中， 锌指蛋白与编码 MAPKKK 多肽的信使 RNA 结合， 并且 阻止其翻译。通过锌指蛋白选择靶向位点的方法描述于， 例如美国专利第 6,553,252 号中， 使用锌指蛋白抑制植物中基因表达的方法描述于， 例如美国专利申请公开第 2003/0037355 号中。
     3. 基于多肽的蛋白活性抑制
     在本发明的一些实施方案中， 多核苷酸编码与至少一种 MAPKKK 多肽结合并且降 低所述 MAPKKK 多肽的 MAPKKK 活性的抗体。 在另一个实施方案中， 抗体的结合通过细胞质量 控制机制， 导致抗体 -MAPKKK 多肽复合物的周转增加。在植物细胞中表达抗体和通过植物 细胞中抗体与蛋白的结合和表达抑制分子通路， 是本领域公知的。参见， 例如， Conrad and Sonnewald， (2003)Nature Biotech.21 ： 35-36， 通过引用并入本文。
     4. 基因破坏 (gene disruption)
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 案 中， 通 过 破 坏 编 码 MAPKKK 多 肽 的 基 因 降 低 或 消 除 MAPKKK 多肽的活性。可以用本领域已知的任何方法破坏编码 MAPKKK 多肽的基因。例如， 在 一个实施方案中， 用转座子标签破坏该基因。 在另一个实施方案中， 用随机或定向诱变使植 物诱变， 并选择 MAPKKK 活性降低的植物， 来破坏基因。
     i. 转座子标记 (transposon tagging)
     在本发明的一个实施方案中， 使用转座子标记降低或消除一种或多种 MAPKKK 多 肽的 MAPKKK 活性。转座子标记包括将转座子插入在内源 MAPKKK 多肽基因中， 以降低或消 除该 MAPKKK 多肽的表达。按照本发明， “MAPKKK 基因” 意图表示编码 MAPKKK 多肽的基因。在该实施方案中， 通过在编码 MAPKKK 多肽的基因的调节区和编码区插入转座子， 降低或消除一种或多种 MAPKKK 多肽的表达。位于 MAPKKK 基因的外显子、 内含子、 5 ′或 3 ′非翻译序列、 启动子或任何其他调节序列中的转座子， 都可以用来降低或消除编码的 MAPKKK 多肽的表达和 / 或活性。
     转座子标记植物中具体基因的方法在本领域内是公知的。参见， 例如， Maes， et al.， (1999)Trends Plant Sci.5 ： 90-96 ； Dharmapuri and Sonti， (1999)FEMS Microbiol. Lett.179 ： 53-59 ； Meissner， et al.， (2000)Plant J.22 ： 265-275 ； Phogat， et al.， (2000)J.Biosci.25 ： 57-63 ； Walbot， (2000)Curr.Opin.Plant Biol.2 ： 103-107 ； Gai， et al.， (2000)Nucleic Acids Res.28 ： 95-96 ； Fitzmaurice， et al.， (1999)Genetics 153 ： 1919-1928)。此外， 在所选的基因中选择 Mu 插入片段的 TUSC 方法描述于 Bensen， et al.， (1995)Plant Cell7 ： 75-85 ； Mena， et al.， (1996)Science 275 ： 1537-1550 和美国专利第 5,962,765 号中。
     ii. 有降低活性的突变体植物
     降低或消除植物中内源基因表达的其他方法在本领域内也是已知的并且同样能 用于本发明。这些方法包括其他形式的诱变， 例如甲磺酸乙酯诱导的诱变、 缺失诱变以及 快中子缺失诱变， 所述快中子缺失诱变用在反向遗传学 ( 用 PCR) 中以鉴定其内源基因已 缺失的植物系。这些方法的实例， 参见， Ohshima， et al.， (1998)Virology 253 ： 572-581 ； Okubara， et al.， (1995)Genetics 137 ： 867-875 和 Quesada， et al.， (2000)Genetics155 ： 521-536。此外， 用所选 PCR 产物的变性 HPLC 或选择性核酸内切酶消化， 快速和自动化地筛 选化学诱导的突变的方法， 即 TILLING(Targeting Induced Local Lesions In Genomes， 定向诱导基因组局部突变技术 )， 也适用于本发明。参见， McCallum， et al.， (2000)Nat. Biotechnol.18 ： 555-557。
     影响基因表达的突变或干扰编码的蛋白功能 (MAPKKK 活性 ) 的突变是本领域公知 的。基因外显子内的插入突变常常导致无效突变体。保守残基内的突变在抑制编码的蛋白 的 MAPKKK 活性中非常有效。 这些突变体能根据公知的方法分离， 并且不同的 A 型 RR 基因座 突变能通过遗传杂交叠加。参见， 例如， Gruis， et al.， (2002)Plant Cell 15 ： 2863-2882。
     在本发明的另一个实施方案中， 占优势的突变体能用来引发由于基因倒位和复制 的基因基因座重组而导致的 RNA 沉默。参见， 例如， Kusaba， et al.， (2003)Plant Cell 15 ： 1555-1567。
     本发明包括降低或消除一种或多种 MAPKKK 多肽活性的其他方法。使植物中基因 组核苷酸序列发生改变或突变的其他方法的实例在本领域内是已知的， 并包括但不限于， 使用 RNA:DNA 载体、 RNA:DNA 突变载体、 RNA:DNA 修复载体、 混合的双链寡核苷酸、 自身互补 的 RNA:DNA 寡核苷酸和诱重组寡核碱基。这些载体和使用方法在本领域内是已知的。参 见， 例如， 美国专利第 5,565,350、 5,731,181、 5,756,325、 5,760,012、 5,795,972 号以及第 5,871,985 号。还参见， WO 98/59350、 WO 99/07865、 WO 99/25821 以及 Beetham， et al.， (1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA96 ： 8775-8778。
     iii. 调节植物的胁迫耐受性
     提供了使用本发明的 MAPKKK 序列调节植物的非生物胁迫耐受性的方法。在具 体的实施方案中， 提供了在非生物胁迫事件中， 增强或维持植物生长和发育的方法。在胁迫 ( 即， 干旱、 盐、 重金属、 极端温度等 ) 阶段， 植物发育通常被推迟或降低。本发明 MAPKKK 序列的水平和 / 或活性的调节能维持或改善植物生长， 甚至在胁迫期间。特别敏感的发育 时期包括早期幼苗发育和开花。在一种方法中， 将 MAPKKK 核苷酸序列引入植物， 并且调节 MAPKKK 多肽的水平和 / 或活性， 据此改善植物对胁迫条件的耐受性并维持生长， 例如， 上述 情况可以反映在枝条生长率、 根发育程度、 成功开花和结籽率或所产生的种子的数量和大 小上。通常引入的 MAPKKK 核苷酸构建体稳定地并入植物基因组并传递给后代。
     检测非生物胁迫中结籽率调节的方法在本领域内是已知的。例如， 在各种胁迫条 件下， 可以监测 MAPKKK 活性受到调节的植物， 并与对照植物比较。 例如， MAPKKK 活性和 / 或 水平受到调节的植物能在开花和结籽期遭受各种程度的胁迫。在相同的条件下， MAPKKK 多 肽的活性和 / 或水平受到调节的遗传修饰的植物比野生型 ( 非转化的 ) 植物， 具有更高数 量和 / 或更大量的发育中的种子。
     因此， 本发明进一步提供了在非生物胁迫 ( 即干旱、 盐、 重金属、 极端温度等 ) 时 期， 产量增加或产量保持的植物。 在一些实施方案中， 在非生物胁迫中产量增加或保持的植 物， 其本发明的 MAPKKK 多肽的水平 / 活性受到调节。在其他实施方案中， 植物包含可操作 地连接于启动子的本发明的 MAPKKK 核苷酸序列， 所述启动子驱动植物细胞中的表达。在某 些实施方案中， 这些植物具有稳定地并入其基因组的核酸分子， 所述核酸分子包含可操作 地连接于启动子的本发明的 MAPKKK 核苷酸序列， 该启动子驱动植物细胞中的表达。 iv. 调节枝条和叶发育
     还提供了调节植物枝条和叶发育的方法。 “调节枝条发育” 和/或 “调节叶发育” 意指植物枝条和 / 或叶发育中的任何改变。在枝条和 / 或叶发育中的这种改变包括但不限 于， 枝条分生组织发育中的改变、 叶数量的改变、 叶大小的改变、 叶和茎维管组织的改变、 节 间长度的改变和叶衰老的改变。如本文所用的， “叶发育” 和 “枝条发育” 包括在单子叶植物 和双子叶植物中在叶和枝条的不同发育阶段， 分别组成叶系统和枝条系统的不同部分的所 有生长方面。检测枝条和叶系统中这种发育改变的方法在本领域内是已知的。参见， 例如， Werner， et al.， (2001)PNAS98 ： 10587-10592 和美国专利申请公开第 2003/0075698 号， 通 过引用将上述每一篇并入本文。
     调节植物枝条和 / 或叶发育的方法包括， 调节本发明 MAPKKK 多肽的活性和 / 或水 平。在一个实施方案中， 提供了本发明的 MAPKKK 序列。在其他实施方案中， 通过向植物中 引入包含本发明 MAPKKK 核苷酸序列的多核苷酸， 表达该 MAPKKK 序列并且据此修饰枝条和 / 或叶发育， 来提供 MAPKKK 核苷酸序列。在其他实施方案中， 引入植物中的 MAPKKK 核苷酸 构建体稳定地并入该植物的基因组。
     在具体的实施方案中， 通过调节植物中 MAPKKK 的水平和 / 或活性， 调节枝条和 / 或叶发育。MAPKKK 活性的调节能导致枝条和 / 或叶发育中的至少一种或多种下述改变， 包 括但不限于， 枝条生长改变 ( 增强或降低 )、 光合作用改变、 叶数量调节、 叶面积改变、 节间 长度改变和叶衰老调节。调节植物中 MAPKKK 多肽的水平因而能增加植物产量。
     如上文讨论， 本领域技术人员可以认出用于调节植物枝条和叶发育的合适启动 子。 该实施方案中示例性的启动子包括组成型启动子或光和作用组织中优选有活性的启动 子， 所述作用组织中有活性的优选启动子包括， 例如， 枝条优选启动子、 枝条分生组织优选 启动子和叶优选启动子。本文其他地方公开了示例性的启动子。
     因此， 本发明还提供了与对照植物相比枝条和 / 或叶发育受到调节的植物。在一 些实施方案中， 本发明的植物具有水平 / 活性增加的或水平 / 活性降低的本发明的 MAPKKK 多肽。
     从外植体建立愈伤组织的方法是已知的。 例如， 根、 茎、 芽、 未成熟胚和无菌下发芽 的幼苗仅是能用来诱导愈伤组织形成的少数组织来源。通常， 使用年轻和活跃生长的组织 ( 即， 年轻叶、 根、 分生组织 )， 但并不是必须的。 通过培养基中存在的生长调节物质 ( 生长素 和细胞分裂素 )， 控制愈伤组织形成。 诱导愈伤组织形成所需的植物调节剂的具体浓度在物 种和物种之间不同， 并且其甚至取决于外植体来源。 在一些实例中， 建议在试验中使用不同 的生长物质 ( 即， 2， 5-D 或 NAA) 或它们的组合， 因为一些物种可能不对特定的生长调节剂作 出反应。此外， 培养条件 ( 即， 光、 温度等 ) 也能影响愈伤组织的建立。一旦建立了， 愈伤组 织培养物能用来起始枝条再生。参见， 例如， Gurel， et al.， (2001)Turk J.Bot.25 ： 25-33 ； Dodds， et al.， (1995).Experiments in Plant Tissue Culture( 植物组织培养实验 )， Cambridge University Press ； Gamborg(1995)Plant Cell， Tissue and Organ Culture， eds.Phillips 和美国专利申请公开第 2003/0180952 号， 通过引用将上述所有文献并入本 文。
     还应当认识到， 增加种子大小和 / 或重量能伴随幼苗生长速率的增加或早期活力 的增加。此外， 如上述讨论的， 调节植物对胁迫的耐受性， 和调节根、 枝条和叶发育， 能增加 植物产量和活力。如本文所用的， 术语 “活力” 是指植物和 / 或特定植物部分的相对健康、 生产率和生长速率， 并且其可以反应在一种或多种不同的发育特性上， 例如叶绿素浓度、 光 和速率、 总生物量和根生物量。 特别相关的是植物早期发育中快速生长的能力， 且该能力与 萌发后发育良好的根系统和发育良好的光合作用器官的成功建立有关。 如本文其他地方所 定义的， 参照对照检测活力改善。
     v. 调节根发育
     提供了调节植物根发育的方法。 “调节根发育” 意指， 与对照植物比较时， 植物根部 发育中的任何改变。 根部发育的这些改变包括但不限于， 初生根生长速率的改变、 新鲜根重 量的改变、 侧根和不定根形成程度的改变、 脉管系统的改变、 分生组织发育改变或或径向膨 胀的改变。
     调节根发育的方法包括调节 ( 降低或增加 ) 植物中 MAPKKK 多肽的水平和 / 或活 性。在一个方法中， 将 MAPKKK 核苷酸序列引入植物并且调节 MAPKKK 多肽的水平和 / 或活 性。在其他的方法中， 引入植物中的 MAPKKK 核苷酸构建体稳定地并入植物基因组中。
     同对照植物相比， 调节 MAPKKK 活性能导致根发育至少有下述一种或多种根发育 的改变， 包括但不限于， 根分生组织更大、 根生长增强、 径向膨胀增强、 脉管系统增强、 根分 支增加、 不定根更多和 / 或新鲜根重量增加。
     如本文所用的， “根生长” 包括， 在单子叶植物和双子叶植物中， 在根发育的不同阶 段， 组成根系统的不同部分的所有生长方面。应当理解， 根生长的增强产生于一种或多种 其部分生长的增强， 所述部分包括初生根、 侧根、 不定根等。检测根系统中这种发育改变的 方法在本领域内是已知的。参见， 例如美国专利申请公开第 2003/0075698 号和 Wemer， et al.， (2001)PNAS 18 ： 10587-10592， 通过引用将上述文献并入本文。
     如上述讨论， 本领域技术人员应当了解用于调节植物根发育的合适启动子。该实施方案的示例性启动子包括本文其他地方公开的根优选启动子。
     还发现， 通过调节多肽的活性和 / 或水平来刺激根生长和增加根群 (root mass) 可用于改善植物的直立性 (standability)。术语 “抗倒伏性 (resistance to lodging)” 或 “直立性” 是指植物将自己固定于土壤的能力。 对于具有直立或半直立生长习性的植物而 言， 该术语还指在不利的 ( 环境 ) 条件下， 维持垂直位置的能力。该性状与根系统的大小、 深度和形态有关。此外， 还发现， 通过调节 MAPKKK 多肽的活性和 / 或水平来刺激根生长和 增加根群可用于在体外促进外植体增殖。
     因此， 本发明还提供了， 与对照植物的根发育相比， 根发育受到调节的植物。在一 些实施方案中， 本发明的植物具有水平 / 活性受到调节的本发明 MAPKKK 多肽并且其根生长 和 / 或根生物量增强。在其他实施方案中， 这些植物有稳定地并入其基因组的核酸分子， 所 述核酸分子包含本发明的 MAPKKK 核苷酸序列， 该核苷酸序列可操作地连接于驱动植物细 胞中表达的根优选启动子， 其中所述序列的表达调节 MAPKKK 多肽的水平和 / 或活性。
     以举例而非限制的方式， 提供下列实施例。
     实施例
     实施例 1 ： 用本发明序列转化玉米
     如在本文的方法中所述的， 用含有 MAPKKK 表达盒的质粒轰击来自温室供体植 物 的 未 成 熟 玉 米 胚。 该 MAPKKK 多 核 苷 酸 可 操 作 地 连 接 于 MAPKKK 启 动 子 和 选 择 标 记 基 因 PAT(Wohlleben， et al.， (1988)Gene70 ： 25-37)， 该 PAT 赋 予 对 除 草 剂 双 丙 氨 膦 (Bialaphos) 的抗性。可选择地， 将该选择标记基因提供在单独的质粒上。按下述实施转 化。培养基配方如下。
     将穗去壳并将表面于 30％的 Clorox 漂白剂外加 0.5％的 Micro 洗涤剂 (Micro detergent) 中灭菌 20 分钟， 并用无菌水漂洗两次。切下未成熟的胚， 并将胚轴朝下 ( 盾片 朝上 )， 每个平板有 25 个胚， 置于 560Y 培养基中 5 小时， 然后排列于 2.5cm 靶区域内准备轰 击。
     制备包含玉米 RR5 序列的质粒载体， 所述 RR5 序列可操作地连接于玉米 RAB17 启 动子。该质粒 DNA 和含有 PAT 选择标记的质粒 DNA 沉淀于 1.1μm( 平均直径 ) 的钨球上， 用如下 CaCl2 沉淀法 ： 100μl 制备的钨颗粒水悬液 ； 10μl(1μg)DNA 的 Tris EDTA 缓冲液 (1μg 总 DNA) ； 100μl2.5M 的 CaCl2 和 10μl 0.1M 的亚精胺。
     向钨颗粒悬液依次加入每种试剂， 同时保持于多管振荡器上。将最终的混合液短 暂超声处理并于持续涡旋中孵育 10 分钟。沉淀以后， 将管短暂离心， 去除液体， 用 500ml 100 ％的乙醇洗涤并离心 30 秒。再去除液体并向最终的钨颗粒球中添加 105μl 100 ％ 的乙醇。为了粒子枪轰击， 将钨 /DNA 颗粒短暂超声处理， 并取 10μl 点于每个大载体 (macrocarrier) 的中心， 并允许在轰击前干燥约 2 分钟。
     用 #HE35-1 或 #HE35-2 粒子枪以 5 级水平轰击样品平板。所有的样品以 650PSI 接受一次射击， 总共 10 等份等分试样取自每管制备的颗粒 /DNA。
     轰击后， 将胚于 560Y 培养基中保存 2 天， 然后转移至含有 3mg/L 双丙烯膦的 560R 选择培养基中， 并每两周传代培养。在选择约 10 周后， 将选择抗性愈伤组织克隆转移至 288J 培养基中， 起始植物再生。体细胞胚成熟 (2-5 周 ) 后， 将发育良好的体细胞胚转移至 发芽培养基中， 并转移至光照培养室中。约 7-10 天后， 将发育中的小植物 (plantlet) 转移至管中不含激素的 272V 培养基中 7-10 天， 直至小植物充分建立 (well-established)。随 后将植物转移到含有盆栽土的浅箱的衬垫 (inserts inflats)( 相当于 2.5″的盆 ) 中， 并 于生长室中生长 1 周， 随后于温室中再生长 1-2 周， 随后转移至标准的盆 600 中 (1.6 加仑 ) 并生长至成熟。在各种胁迫条件下， 监测植物并对其评分， 并与对照植物比较。将监测表型 改变， 例如胁迫耐受性的改善。
     轰 击 培 养 基 (560Y) 含 有 5.0g/l 的 N6 基 础 盐 (SIGMA C-1516)、 1.0ml/l 的 Eriksson 维生素混合物 (1000X SIGMA-1511)、 0.5mg/l 盐酸硫胺素、 120.0g/l 蔗糖、 1.0mg/ l 2， 5-D 和 2.88g/l L- 脯氨酸 ( 用 KOH 将 pH 调节至 5.8， 随后用 D-I 水定容 ) ； 2.0g/l Gelrite ( 在用 D-I 水定容后添加 ) ； 和 8.5mg/l 硝酸银 ( 将培养基灭菌并冷却至室温后 添加 )。选择培养基 (560R) 包含 5.0g/l N6 基础盐 (SIGMA C-1516)、 1.0ml/l Eriksson 维 生素混合物 (1000X SIGMA-1511)、 0.5mg/l 盐酸硫胺素、 30.0g/l 蔗糖和 2.0mg/l 2， 5-D( 用 KOH 将 pH 调节至 5.8 后， 用 D-I 水定容 ) ； 3.0g/l Gelrite ( 在用 D-I 水定容后添加 ) 和 0.85mg/l 硝酸银和 3.0mg/l 双丙烯膦 ( 两者都在培养基灭菌并冷却至室温后添加 )。
     植物再生培养基 (288J) 包含 5.3g/l MS 盐 (GIBCO 11117-075)、 5.0ml/lMS 维生 素储备液 (0.100g 烟酸、 0.02g/l 盐酸硫胺素、 0.10g/l 烟酸吡哆醇和 0.50g/l 甘氨酸， 用精 制的的 D-I 水定容 )(Murashige and Skoog， (1962)Physiol.Plant.15 ： 573)、 100mg/l 肌 醇、 0.5mg/l 玉米素、 60g/l 蔗糖和 1.0ml/l 的 0.1mM 脱落酸 ( 在将 pH 值调至 5.6 后， 用精 制的的 D-I 水定容 ) ； 3.0g/l Gelrite ( 在用 D-I 水定容后添加 ) 和 1.0mg/l 吲哚乙酸 和 3.0mg/l 双丙烯膦 ( 将培养基灭菌并冷却至 60℃后添加 )。无激素培养基 (272V) 包含 5.3g/l MS 盐 (GIBCO 11117-075)、 5.0ml/l MS 维生素储备液 (0.100g/l 烟酸、 0.02g/l 盐 酸硫胺素、 0.10g/l 烟酸吡哆醇和 0.50g/l 甘氨酸， 用精制的 D-I 水定容 )、 0.1g/l 肌醇和 50.0g/l 蔗糖 ( 在将 pH 值调到 5.6 以后， 用精制的 D-I 水定容 ) 和 6g/l BactoTM- 琼脂固 化剂 ( 在用精制的 D-I 水定容后添加 )， 灭菌并冷却至 60℃。
     实施例 2 ： 调节植物产量
     对 于 用 MAPKKK 核 苷 酸 序 列 (SEQ ID NO ： 1、 4、 7 或 9) 进 行 的 农 杆 菌 (Agrobacterium) 介导的玉米转化， 所述 MAPKKK 核苷酸序列 (SEQ ID NO ： 1、 4、 7 或 9) 可操 作地连接于玉米泛素启动子或胁迫诱导启动子， 使用 Zhao 的方法 ( 美国专利第 5,981,850 号和 PCT 专利公开号第 WO98/32326 号 ； 通过引用将其内容并入本文 )。简单而言， 从玉米 分离未成熟的胚并将该胚与农杆菌悬液接触， 其中该细菌能将 MAPKKK 核苷酸序列转移至 至少一个未成熟胚的至少一个细胞中 (1 步 ： 感染步骤 )。在该步中， 将未成熟胚浸入农杆 菌悬液中， 起始接种。将该胚与该农杆菌共培养一段时间 (2 步 ： 共培养步骤 )。感染步骤 以后， 将该未成熟胚培养于固体培养基。该共培养时期后， 考虑一可选的 “休眠 (resting) 步骤。在该休眠步骤中， 在至少一种抗生素存在的情况下， 孵育该胚， 已知所述抗生素在没 有添加植物转化体的选择剂时抑制农杆菌的生长 (3 步 ： 休眠步骤 )。为了去除农杆菌和为 了感染细胞的休眠期， 该未成熟的胚培养于有抗生素但没有选择剂的固体培养基上。 然后， 将接种过的胚培养于含有选择剂的培养基中， 并且恢复生长中的转化的愈伤组织 (5 步 ： 选 择步骤 )。 将未成熟胚培养于含有选择剂的固体培养基上， 该选择剂导致转化的细胞的选择 生长。随后将愈伤组织再生为植物 (5 步 ： 再生步骤 )， 并将生长于选择培养基上的愈伤组 织培养在固体培养基上， 以再生为植物。监测与合适的对照植物比较时， 该植物枝条生长、 叶衰老和 / 或光合作用的调节。 还监测植物产量的调节。
     实施例 3 ： 大豆转化
     如下述， 用含有 MAPKKK 序列的质粒轰击大豆胚， 所述 MAPKKK 序列可操作地连接于 玉米泛素启动子。为了诱导体细胞胚， 将从表面消过毒的大豆品种 A2872 的未成熟种子切 下长度为 3-5mm 的子叶， 在光下或黑暗中于 26℃下于琼脂培养基中培养 6-10 周。 随后切下 产生次级胚的体细胞胚， 并置于合适的液体培养基中。在反复选择繁殖为早期球形期胚的 体细胞胚簇后， 按下文所述， 维持悬液。
     将大豆胚胎发生悬浮培养物维持于 26℃下， 维持在 150rpm 旋转振荡器上的 35ml 液体培养基中， 同时按日 / 夜为 16 ∶ 8 小时安排荧光照射。每两周， 通过将约 35mg 的组织 接种至 35ml 液体培养基中， 对培养物进行传代培养。
     大豆胚胎发生悬浮培养物然后用粒子枪轰击方法转化 (Klein， et al.， (1987) Nature(London)327 ： 70-73， 美国专利第 5,955,050 号 )。DuPontBiolistic PDS1000/HE 仪 器 ( 改装氦 ) 可用于这些转化。
     用来促进大豆转化的选择标记基因是转基因， 该转基因由来自花椰菜花叶病毒 35S 启动子 (Odell， et al.， (1985)Nature 313 ： 810-812)、 来自质粒 pJR225 的潮霉素磷酸 转移酶基因 ( 来自 E.coli ； Gritz， et al.， (1983)Gene25 ： 179-188) 和来自根瘤农杆菌的 Ti 质粒的 T-DNA 中的胭脂氨酸合酶基因的 3′端组成。包含 MAPKKK 的表达盒可分离为限 制性片段， 所述 MAPKKK 可操作地连接于玉米泛素启动子。能随后将该片段插入携带标记基 因的载体的唯一限制位点。
     向 50μl 60mg/ml 的 1μm 金粒悬液中加入 ( 依次 ) ： 5μl DNA(1μg/μl)、 20μl 亚精胺 (0.1M) 和 50μl CaCl2(2.5M)。该颗粒制剂随后搅动 3 分钟， 微量离心机中离心 10 秒， 并去除上清。该 DNA 包被的微粒随后在 500μl 70％乙醇中洗涤一次， 并重悬于 50μl 无水乙醇中。将该 DNA/ 微粒悬液超声处理 3 次， 每次 1 秒。随后， 将 5μl DNA 包被的金粒 加载于每个大载体盘 (macro carrier disk) 上。
     将约 300-500mg 两周龄的悬浮培养物放置于空的 60×15mm 的皮氏培养皿中， 并用 吸管从组织中去除残余的液体。对于每次转化实验， 通常轰击约 5-10 个平板组织。膜破裂 压设置在 1100psi， 并将枪膛抽真空至 28 英寸汞。距保留屏 (retaining screen) 约 3.5 英 寸， 放置组织， 并轰击 3 次。轰击后， 将组织分成两半， 并放回至液体中， 并按上述描述培养。
     轰击后 5-7 天， 用新鲜的培养基更换液体培养基， 并且轰击后 11-12 天， 用含 50mg/ ml 潮霉素的新鲜培养基更换。可每周更换该选择培养基。轰击后 7-8 周， 可以观察到绿色 的转化组织从未转化的坏死胚胎簇中长出。去除分离的绿色组织并接种至个体烧瓶中， 以 产生新的无性繁殖的、 转化的胚胎发生悬浮培养物。可以将每个新品系作为独立的转化事 件处理。 这些悬液可随后进行传代培养， 并作为未成熟胚簇维持， 或通过个体体细胞胚的成 熟和发芽再生为完整植物。
     实施例 4 ： 向日葵分生组织转化
     如下述， 用含有 MAPKKK(SEQ ID NO ： 1、 4、 7 或 9) 的表达盒转化向日葵分生组织， 所 述 MAPKKK 可操作地连接于玉米泛素启动子或胁迫诱导启动子 ( 还参见， 欧洲专利申请号第 EP 0 586233 号， 通过引用并入本文， 和 Malone-Schoneberg， et al.， (1995)Plant Science103 ： 199-207)。用单小麦穗脱粒机 (single-wheat head thresher) 将成熟的向日葵种子 (Helianthus annuus L.) 去壳。将种子在 20％ Clorox 漂白剂溶液进行表面灭菌 30 分 钟， 每 50ml 溶液加两滴 Tween20 。将种子用无菌蒸馏水漂洗两次。
     劈开胚轴的外植体通过改良的 Schrammeijer 等 (Schrammeijer， et al.， (1990) Plant Cell Rep.9 ： 55-60) 所述的方法制备。表面灭菌过程后， 将种子在馏水中浸没 60 分 钟。随后折断每粒种子的子叶， 从而在胚轴平面处产生干净的断面。切除根尖以后， 在初 叶间纵向对切外植体。将两等份切面朝上放置于由 Murashige 和 Skoog 矿物元素组成的 GBA 培养基中 (Murashige， et al.， (1962)Physiol.Plant.， 15 ： 573-597)， Shepard 维生 素添加物 (Shepard， (1980)in Emergent Techniques for the Genetic Improvement of Crops(University of Minnesota Press， St.Paul， Minnesota)， 50mg/l 硫酸腺嘌呤、 30g/ l 蔗糖、 0.5mg/l 6- 苄基氨基喋呤 (BAP)、 0.25mg/l 吲哚 -3- 醋酸 (IAA)、 0.1mg/l 赤霉酸 (GA3)pH 5.6 以及 8g/l 植物琼脂。
     在农杆菌处理之前， 外植体进行微粒轰击 (Bidney， et al.， (1992)Plant Mol. Biol.18 ： 301-313)。 将 30-40 株外植体放置于 60×20mm 平板中心围成圆圈进行该处理。 将 约 5.7mg 1.8mm 的钨微粒悬浮于 25ml 无菌 TE 缓冲液 (10mM Tris HCl， 1mM EDTA， pH 8.0) 中， 并且每次轰击用 1.5ml 等分试样。在 PDS 1000 粒子加速装置中， 通过置于样品上方 2cm 处的 150mm nytex 屏幕， 将每一平板轰击两次。
     在所有的转化实验中， 使用无害的根瘤农杆菌菌株 EHA105。包含表达盒的二元质 粒载体， 如 Holsters， et al.， (1978)Mol.Gen.Genet.163 ： 181-187 所述， 通过冻融引入农 杆菌菌株 EHA105， 所述表达盒含有可操作地连接于玉米泛素启动子的 RR6 基因。该质粒还 包含卡那霉素选择标记基因 ( 即 nptII)。将用于植物转化实验的细菌在液体 YEP 培养基 (10gm/l 酵母提取物， 10gm/l Bacto 蛋白胨和 5gm/l NaCl， pH 7.0) 中生长过夜 ( 于 28℃ 和 100RPM 连续搅拌 )， 所述液体 YEP 培养基中有细菌菌株和二元质粒维持所需的合适的抗 生素。当细菌的 OD600 达到约 0.5-0.8 时， 可以使用该悬液。沉淀农杆菌细胞， 并以 0.5 的 最终 OD600 重悬浮于由 12.5mM MES pH 5.7、 1gm/l NH5Cl 和 0.3gm/l MgSO5 组成的接种培养 基中。
     将新近轰击的外植体置于农杆菌悬液中， 混合， 并静置 30 分钟。随后将该外植体 转移至 GBA 培养基中， 于 26℃和日 18 小时下共培养， 切割面向下。共培养 3 天后， 将该外植 体转移至补充有 250mg/l 头孢噻肟和 50mg/l 硫酸卡那霉素的 375B( 不含生长调节剂和蔗 糖水平减少至 1％的 GBA 培养基 ) 中。根据选择， 将该外植体培养 2-5 周， 随后转移至不含 卡那霉素的新 375B 培养基中继续发育 1-2 周。将该外植体转移至含有 250mg/l 头孢噻肟 的 GBA 培养基中， 进行第二次 3 天的植物激素处理， 该外植体具有未形成适于切割枝条的分 化的抗生素抗性生长区域。通过 ELISA 检测来自绿色卡那霉素抗性枝条的叶样品中 NPTII 的存在， 并通过测定 MAPKKK 活性， 检测转基因表达的存在。
     将 NPTII 阳性枝条移植至体外生长的 PIONEER 杂种 6550 向日葵幼苗根茎。表 面灭菌的种子在 58-0 培养基中萌发 ( 半强度 Murashige 和 Skoog 盐、 0.5 ％蔗糖、 0.3 ％ Gelrite pH 5.6)， 并生长于外植体培养所述的条件下。除去幼苗的上部分， 于下胚轴中 制成 1cm 的垂直切片， 并将转化的枝条插入该切口。用 PARA film 包裹整个区域以固定枝 条。在体外培养一周后， 将移植的植物转移至土壤中。土壤中的移植体维持在高湿度条件下， 缓慢适应温室环境。通过叶提取物的 NPTII ELISA 鉴定和 / 或通过 MAPKKK 活性分析， 鉴定温室中成熟的 T0 植物 ( 亲本 ) 的转化部分， 而通过干种子子叶小部分的 MAPKKK 活性 分析来鉴定从 NPTII 阳性 T0 植物收获的转基因种子。
     实施例 5 ： 水稻转化
     本领域技术人员可利用的将 DNA 转化进高等植物细胞中的方法是高速弹道 轰击法， 其使用包被有感兴趣的核酸构建体的金属颗粒 ( 参见， Klein， et al.， (1987) Nature(London)327 ： 70-73， 并 参 见 美 国 专 利 第 4,945,050 号 )。 这 些 补 充 性 实 验 使 用 PDS-1000/He(BioRAD Laboratories， Hercules， CA)。
     赋予抗生素抗性的来自吸水链霉菌 (Streptomyces hygroscopicus) 的细菌潮霉 素 B 磷酸转移酶 (Hpt II) 基因， 可以用作水稻转化的选择标记。在该载体中， Hpt II 基因 可以用来自花椰菜花叶病毒的 35S 启动子和来自根瘤农杆菌的羧乙基精氨酸合酶基因的 终止和聚腺苷酸化信号进行改造。例如， 参见 WO 97/47731 中 pML18 载体的描述， 其公开于 1997 年 12 月 18 日， 通过引用将其公开的内容并入本文。
     来自发芽的水稻种子盾片的胚胎发生愈伤组织培养物作为转化实验的材料来源。 该材料通过在黑暗中于 27-28℃下的愈伤组织起始培养基 (MS 盐、 Nitsch 和 Nitsch 维生 素、 1.0mg/l 2， 4-D 和 10μM AgNO3) 中使无菌水稻种子发芽而产生。将从胚的盾片中增殖 的胚胎发生愈伤组织转移至 CM 培养基 (N6 盐、 Nitsch 和 Nitsch 维生素、 1mg/l 2， 4-D， Chu， et al.， (1985)Sci.Sinica 18 ： 659-668) 中。通过常规传代培养以 2 周间隔将愈伤组织培 养物维持在 CM 上， 用于在起始 10 周内转化。
     通过传代培养 0.5-1.0mm 碎片制备愈伤组织用于转化， 该碎片相隔约 1mm， 排列在 放置于 CM 培养基上的 Whatman #541 纸上环中心约 4cm 直径的圆形区域内。将具有愈伤 组织的平板在 27-28℃于黑暗中培养 3-5 天。轰击前， 将具有愈伤组织的滤纸转移到补充 有 0.25M 甘露醇和 0.25M 山梨醇的 CM 中， 在黑暗中放置 3 小时。在无菌罩内， 使皮氏培养 皿的盖子半开约 20-45 分钟， 驱散组织上的水分。
     将每个基因组 DNA 片段用 pML18( 含有用于水稻转化的选择标记 ) 共沉淀至金颗 粒表面。为完成该步骤， 将总计 10μg 的性状 ： 选择标记 DNA 比例为 2 ∶ 1 的 DNA 添加至已 -1 经以 60mg ml 浓度重悬浮的 50μl 金颗粒的等分试样中。随后将氯化钙 (50μl 2.5M 的 溶液 ) 和亚精胺 (20μl 0.1M 的溶液 ) 添加至涡旋中的金 -DNA 悬液中， 同时试管涡旋 3 分 钟。将该金颗粒于微量离心机中离心 1 秒， 并去除上清。用 1ml 无水乙醇将该金颗粒洗涤 两次， 随后重悬浮于用 50μl 无水乙醇中， 并超声处理 ( 水浴超声器 )1 秒以分散该金颗粒。 将该金颗粒于 -70℃孵育 5 分钟， 如果需要分散该颗粒， 进行超声处理 ( 水浴超声器 )。然 后将 6μl DNA 包被的金颗粒加载至 Mylar 大载体盘上并允许乙醇挥发。
     在干燥阶段结束时， 将含有该组织的皮氏培养皿置于 PDS-1000/He 的腔室中。然 后将该腔室内的空气抽真空至 28-29 英寸汞。使用当冲击管 (shock tube) 中 He 压达到 1080-1100psi 时破裂的安全膜 (rupture membrane， 用氦冲击波使该大载体加速。该组织 置于停止屏约 8cm 处， 并轰击该愈伤组织两次。用 DNA 包被的金颗粒以该方法轰击 2-4 个 平板组织。轰击后， 将该愈伤组织组织转移至没有补充山梨醇或甘露醇的 CM 培养基中。
     轰击后 3-5 天内， 将该愈伤组织转移至 SM 培养基中 ( 含有 50mg/l 潮霉素的 CM 培养基 )。为完成该步骤， 将该愈伤组织从平板转移至无菌的 50ml 圆锥管中并称重。以每100mg 愈伤组织， 2.5ml 顶层琼脂， 添加 40℃溶化的顶层琼脂。通过 10ml 移液管反复吸打， 将愈伤组织团块打碎成直径小于 2mm 的碎块。将每份 3ml 愈伤组织悬液的等分试样平铺至 新鲜的 SM 培养基上， 并将该平板于黑暗中 27-28℃下孵育 4 周。4 周以后， 鉴定转基因愈伤 组织事件， 转移至新鲜的 SM 平板， 并在黑暗中于 27-28℃下再生长 2 周。
     将生长中的愈伤组织转移至 RM1 培养基 (MS 盐、 Nitsch 和 Nitsch 维生素、 2％蔗 糖、 3％山梨醇、 0.4％ Gelrite +50ppm 潮霉素 B) 中， 于黑暗中 25℃下 2 周。两周后， 将该 愈伤组织转移至 RM2 培养基 (MS 盐、 Nitsch 和 Nitsch 维生素、 3 ％蔗糖、 0.4 ％ Gelrite -2 -1 +50ppm 潮霉素 B) 中， 并在冷白光 ( ～ 40μEm s ) 光周期 12 小时的情形下， 置于 25℃和 30-40％湿度下。在光下 2-4 周后， 愈伤组织开始组织起来并形成枝条。将枝条从周围的愈 伤组织 / 培养基中去除并轻轻的转移至 RM3 培养基 (1/2×MS 盐、 Nitsch 和 Nitsch 维生素、 TM 1％蔗糖 +50ppm 潮霉素 B) 中， 该培养基在 PHYTATRAY 一次性植物细胞培养容器中 (Sigma Chemical Co.， St.Louis， MO)， 并用上述步骤描述的相同条件继续孵育。
     当出现足够的根和枝条时， 2-3 周后， 将该植物从 RM3 转移至含有 Metro 混合物 350 的 4” 盆中。
     实施例 6 ： MAPKKK 变体
     A. 不改变编码的氨基酸序列的 MAPKKK 的变异的核苷酸序列 (SEQ ID NOS ： 1、 4、 7、 9)
     SEQ ID NOS ： 1、 4、 7、 9 所示的 MAPKKK 核苷酸序列可以用来产生变异的核苷酸序 列， 该变异的核苷酸序列当与 SEQ ID NOS ： 1、 4、 7、 9 的初始未改变的 ORF 核苷酸序列比较 时， 具有 0％、 75 ％、 80％、 81％、 82 ％、 83 ％、 84 ％、 85％、 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89％、 90 ％、 91 ％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％的核苷酸序列同一性。 用标准密码子表产生 这些功能变体。尽管变体的核苷酸序列发生了改变， 但可读框编码的氨基酸序列并未发生 改变。
     B.MAPKKK 的变异的氨基酸序列
     可以产生 MAPKKK 的变异的氨基酸序列。在本实施例中， 可以改变一个氨基酸。特 别是， 可以检查 SEQ ID NO ： 2、 5、 8 或 10 所示的序列， 以确定适当的氨基酸改变。通过参考 蛋白比对， 可以选择待改变的氨基酸。参见图 2。可以选择认为并未处于高选择压 ( 不是高 度保守的 ) 下并且其相当容易地被有相似化学特征 ( 即， 相似的功能侧链 ) 的氨基酸取代 的氨基酸。用图 2 所示的蛋白比对， 能改变合适的氨基酸。玉米 MAPKKK 蛋白中表现出低百 分比序列同一性的氨基酸残基未突出显示。在图 2 中可发现其他的保守残基。一旦鉴定出 定向氨基酸， 则进行实施例 5A 概括的程序。用该方法可以产生与 SEQ ID NOS ： 2、 5、 8 或 10 具有约 70 ％、 75 ％、 80％、 81％、 82 ％、 83 ％、 84％、 85 ％、 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89 ％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％的氨基酸序列同一性的变体。
     C.MAPKKK 的其他变异的氨基酸序列
     在本实施例中， 产生相对于参照蛋白序列具有 70％、 75％、 80％、 81％、 82％、 83％、 84 ％、 85 ％、 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89 ％、 90 ％、 91 ％、 92 ％、 93 ％、 94 ％、 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98 ％或 99％的同一性的人工蛋白序列。该较后的努力需要根据图 2 所示的比对鉴定保守区和可变 区， 然后正确运用氨基酸取代表。这些部分将在下文进行更详细的论述。
     在很大程度上， 确定可以改变哪个氨基酸序列基于 MAPKKK 蛋白中的保守区。参见图 2。基于序列比对， 能确定可能改变的 MAPKKK 的各个区。应当认识到， 在不改变功能的情 况下， 能在保守区域内进行保守取代。此外， 本领域技术人员应当理解， 本发明 MAPKKK 序列 的功能变体还可以在保守结构域内有较小的氨基酸改变。
     随 后 产 生 人 工 蛋 白 序 列， 其 在 80-85 ％、 85-90 ％、 90-95 ％ 和 95-100 ％ 同 一 性 的间隔内， 不同于原始序列。这些间隔的中点， 例如以减或加 1 ％的自由范围 (literal latitude) 定向。氨基酸取代通过常规 Perl script 实现。下文的表 2 提供了该取代表。
     表 2. 取代表
     氨基酸 I L V A G D E W Y S 高度相似的和最佳的取代 L， V I， V I， L G A E D Y W T 改变的顺序等级 1 2 3 5 5 6 7 8 9 10 备注 50 ∶ 50 取代 50 ∶ 50 取代 50 ∶ 50 取代T K R N Q F MS R K Q N Y L11 12 13 15 15 16 17 第一个蛋氨酸不能改变46102112614 A CN 102112618 H C P
     说明Na Na Na书没有好的取代 没有好的取代 没有好的取代44/51 页首先， 鉴定蛋白中不应当被改变的任何保守氨基酸， 并且 “划分出” 用于与取代隔 离。当然， 起始蛋氨酸将自动地添加至该表。下一步， 进行所述改变。
     H、 C 和 P 在任何条件下不改变。首先， 改变将从异亮氨酸开始， 从 N 末端扫到 C 末 端； 随后是亮氨酸， 并沿列表向下至达到所需的靶标。可以进行中间数量的取代， 以不引起 改变的逆转。列表按 1-17 排列， 以便在亮氨酸前根据需要进行许多异亮氨酸改变， 并如此 继续向下至蛋氨酸。很显然， 按这种方式， 很多氨基酸不需要改变。L、 I 和 V 将包括两种交 替的最佳取代的 50 ∶ 50 的取代。
     变异的氨基酸序列作为输出结果记下。Perl script 用来计算同一性百分比。使 用该程序， 产生的 MAPKKK 变体与 SEQ ID NO ： 3 或 6 的起始未改变的 ORF 序列具有约 70％、 75 ％、 80 ％、 81 ％、 82 ％、 83 ％、 84 ％、 85 ％、 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89 ％、 90 ％、 91 ％、 92 ％、 93 ％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％的氨基酸同一性。 实施例 7 ： 鉴定玉米 NPK1 相关序列
     玉 米 MAPKKK 与 水 稻 NPK1 样 基 因 (dbj|BAB64165.1|(AP003254)NPKl 相 关 蛋 白 激酶样蛋白 [ 水稻 ]E ＝ 0.094[5 ′ (1)， 3 ′ (0)PCL253028(1)cds3f.pk005.d19) 是直系 同源的， 其从两个表达谱分析实验 (expression profiling Agilent experiment) 中首次 得以鉴定， 即 ‘Cold-induced gene expression in B73 seedling shoots with time of 在 B73 幼苗枝条中寒 exposure to low-temperature stress( 随着暴露于低温胁迫的时间， 冷诱导的基因表达 )’ ， 和 ‘Stress-induced gene expression in CML349seedling shoots with time of exposure to stress( 随着暴露于胁迫的时间， 在 CML349 幼苗枝条中胁迫诱 导的基因表达 )’ 。
     这些实验的目的是开发在暴露于脱水胁迫的时间增加的条件下改变基因表达模 式的蓝图， 应用于低温胁迫形式。第一个实验涉及使 B73 幼苗生长 14 天， 从种植开始， 接下 来强迫其接受 10℃的寒冷胁迫， 随后在暴露于低温下 0 小时、 0.5 小时、 1 小时、 4 小时、 8小 时和 24 小时时， 和最后低温胁迫处理即寒冷胁迫 24 小时后， 在 25℃恢复 48 小时时， 收集超 出胚芽鞘的全部枝条组织。进行两两比较， 以便确定相对于 0 时间对照， 在暴露于寒冷后的 每个时间点的基因表达改变的本质。该实验给出， 了解 B73 中各种基因和通路的时控诱导， 所述基因和通路从暴露于寒冷胁迫的早期至晚期被打开。 其还通过以下方式帮助鉴定干旱 和寒冷的候选基因和启动子 ： (1) 确定寒冷胁迫下有关键诱导行为的基因是否在文献中报 道为与干旱胁迫具有相关性， 和 (2) 寒冷胁迫下有关键诱导行为的基因的表达是否在 Lynx MPSS 实验中表现出干旱或激素 (ABA， 乙烯 ) 胁迫的相关诱导。
     用 CML349 代替 B73 重复了上述实验。CML349 是来自 CIMMYT 的热带高原玉米系， 已知所述 CIMMYT 对低温的耐受性获得改善。第二个实验后， 比较 CML349 和 B73 中的基因 时控诱导， CML349 为有耐寒性的墨西哥高原系， B73 为比 CML349 具有较少耐寒性的玉米带 臼齿系。
     在这些基因表达谱分析实验中， 与水稻 NPK1 样激酶同源的玉米 EST 显出有趣的行 为。我们发现， 在 CML349 中， 玉米 EST， cds3f.pk005.d19， 在寒冷暴露后 1 小时的早期时间 点表现出最高的表达水平。而在 B73 中没有诱导出相同的程度 ( 表 3， 附图 1)。Agilent 表 达的强度显示， B73 在正常温度下有高的该基因表达水平， 在暴露于低温胁迫下 4 小时后， 表达水平进一步增加两倍。另一方面， 在正常温度下， CML349 有低水平的该基因表达， 但是 在暴露于寒冷胁迫后很早的 1 小时， 该基因几乎被诱导 36 倍。在胁迫暴露后 1 小时的早期 时间点， 诱导水平比相同时间点的 B73 中的水平要高， 并且也高于暴露于胁迫 4 小时后 B73 中的诱导水平。我们以前的蛋白谱分析实验 ( 与 Oxford GlycoSciences 合作 ) 已经表明， 参与抗氧化胁迫的数种基因的蛋白水平， 在 CML349 中为正常高的水平， 或经诱导， 高于 B73 中的水平。这与报道的 NPK1 的拟南芥直系同源物即 ANP1 的作用一致， ANP1 自身受模拟氧 化胁迫的过氧化氢的诱导， 并当其为组成型活性， 增加了包括 GST6 在内的特异性胁迫应答 基因的启动子活性 (Kovtun， et al.， (2000)Proc Natl Acad Sci 97 ： 2940-2945)。
     表 3.B73 和 CML349 中 ZmNPK1b 的胁迫诱导表达水平。 在暴露于胁迫后不同的时间 段， B73 和 CML349 中的 ZmNPK1b 表达水平， 通过微列阵分析 (Agilent Technologies， Santa Clara， CA) 中颜色强度来检测。强度 2 表示暴露于胁迫后任何给定时间点的基因表达。
     实施例 8 ： 分离玉米 NPK1 相关序列
     在 EST cds3f.pk005.d19 全插入测序 (full-insert sequencing) 后， 显示其含有 部分克隆。以两种方式使用 cds3f.pk005.d19 的序列， 以获得 NPK1 的全序列。
     首先， 对于 cds3f.pk005.d19 部分序列的同源物， 针对 PHI 重叠群， 进行 blast 搜 索。依赖该结果， 将 PCO527001(UC5.1) 或 PCO644860(UC6.0) 鉴定为接近的同源物和代表 性 EST， 将 ctst1s.pk017.e17 全插入测序， 并随后发现是全长的。
     cds3f.pk005.d19 序列也用于 BAC- 文库筛查。鉴定 BAC 克隆 (bacb.pk191.e03) 并测序。使用从 BAC 序列的基因组信息拼接在一起的编码序列信息 PCR 出完全的编码序列 (CDS)。该完全的 CDS 序列表示在 PCO644861 中 (Top Blast UPI00000AA4AE NPK1 相关蛋 白激酶样蛋白 [ 水稻 ( 日本培养组 )]E ＝ 0.0( 参考蛋白 MAR-31-2006)[Members( 成员 )
     ＝ 20， ORFCode ＝ 5NOCXX]UC6.0)。因此， 要求和完成了数个组成性 EST 的全插入测序。使 用 SEQ ID NO ： 12 和 13 所示的引物从 BAC 克隆 p1.bacb.pk191.e03 扩增 Zm NPK1b 互补的 DNA 序列。
     鉴定为与 ctst1s.pk017.e17(PCO644860) 直系同源的水稻 NPK1 相关蛋白激酶是 NP_917080， 并且与 cds3f.pk005.d19(PCO644861) 同系的， 是 NP_917084/BAB64165.1。 来自 前者的玉米 NPK1 序列称为 ZmNPK1a， 且来自后者的玉米 NPK1 序列称为 ZmNPK1b。
     用烟草 NPK1 蛋白进行随后的搜索以在公共结构域中鉴定有最接近的同源性的水 稻序列， 并且这产生了水稻蛋白 BAF24980。该水稻蛋白与烟草蛋白具有 57.5％的共有序 列和 48.2％的同一性。使用该水稻蛋白搜索 Unicorn 6.0， 并且鉴定出的最接近的玉米直 系同源物是 PCO622918。该序列是部分的， 有不完全的 5’ 端， 并称为 ZmNPK1c。此外， 当检 查可能的图谱位置时， 鉴定出， ZmNPK1a 与以 PCO638212 为代表的 NPK1 相关激酶共定位， 该 PCO638212 称为 ZmNPK1d。ZmNPK1a， ZmNPK1b， ZmNPK1c 和 ZmNPK1d 的序列信息分别提供为 SEQ ID NOS ： 1-3、 4-6、 7-8 和 9-11。
     实施例 9 ： 染色体定位， 表达信息和鉴定序列的细胞特异性
     针对公开的和专有的 BAC 序列， 用 BLAST 搜索， 检查与 ZmNPK1a、 ZmNPK1b、 ZmNPK1c 和 ZmNPK1d( 分别为 PCO644860、 PCO644861、 PCO622918 和 PCO638212) 相关的重叠群的可 能的染色体位置。ZmNPK1a(PCO644860)、 ZmNPK1b(PCO644861) 和 ZmNPK1d(PCO638212) 定 位在 3 号染色体上， 而 ZmNPK1c 定位在 2 号染色体上。用专有的关联工具发现 ZmNPK1a 和 ZmNPK1d 与 Staygreen 表型的 QTL 潜在关联。用该同一工具观察到， ZmNPK1c(PCO622918) 表现出与产量 QTL， 还和抽丝开花间隔、 Staygreen 和 Barrencount 的干旱 QTL 显示潜在关 联。应当指出， 该专有关联工具使用专有 QTL 数据， 所述专有 QTL 数据涉及与染色体区的低 分辨率的表型关联， 对一些性状而言， 所述染色体区可以大至 75cM。因此， 这里提出的关联 不能证明， 具体基因控制这些性状， 而是这些关联表明， 存在哪些可供考虑的性状关联。
     在 Lynx MPSS 文库中分析了所有四条序列的天然表达。发现 ZmNPK1a 在茎和根组 织中高表达， 在 B73 茎的叶枕组织中观察到 204ppm 的最高表达。发现 ZmNPK1b 在核和根组 织中高表达， 在授粉后 0 天时的玉米核中表达最高， 为 984ppm， 紧接其后的是玉米初生根中 的 928ppm。 ZmNPK1c 在 Lynx 文库中几乎没有表现度， 并因此具有非常低的该基因表达水平。 最后， ZmNPK1d 的表达在所有组织中均匀分配， 在授粉后 0 天时的玉米核中， 最高为 263ppm。
     用商业上或公众可获得的 TargetP、 ChloroP、 SIGNALP 和 PSORT 搜索工具， 扫描蛋 白序列的典型靶肽， 检查所有四条序列的细胞定位。(Emanuelsson et al.(2007)Nature Protocols 2 ： 953-971 ； Nakai and Horton(1999)Trends Biochem.Sci.24(1) ： 34-36)。该 结果显示， ZmNPK1a、 ZmNPK1b 和 ZmNPK1d 定位于植物细胞的线粒体。任何程度的自信都不 能预测 ZmNPK1c 的定位， 可能是由于其不完全的 N 端区。
     实施例 10 ： 通过胁迫或激素处理诱导天然 MAPKKK
     用 Lynx(MPSSTM) 中的大规模并行信号测序进行玉米基因的胁迫诱导表达谱分析 ( 参见， Brenner， et al.， (2000)Nature Biotechnology18 ： 630-634， Brenner， et al.， (2000)Proc Natl Acad Sci USA 97 ： 1665-1670)。
     玉米杂种 3245 遭受剧烈的水胁迫， 目的是相对于良好水条件下的相同杂种产量 降低约 55-70％。在开花期前， 在约 650-700GDU 时 ( 生长程度单位 )， 强加该胁迫 5 周， 并且开花期后继续 2 周或超过 300GDU。每个小块地有 4 排植物。在该胁迫期， 授粉后 7 天时， 在良好水和干旱胁迫处理下， 从穗叶、 第一次抽丝时未成熟的穗和穗基部和穗顶部核收集 样品。在液氮中研磨样品， 提取 RNA 并进行表达谱分析。
     对于寒冷胁迫诱导研究， 将近交种 B73 或 CML349 的玉米幼苗发芽并在温室中生长 在最适宜的温度条件下。 10 天龄幼苗的叶构成样品材料。 该实验包括三种处理， 即， 对照或 最佳温度、 冷处理和从冰冻中恢复。 将未接受任何寒冷胁迫的对照幼苗迁移至生长室， 该生 长室与温室保持相同的温度条件， 而将进行冷处理的幼苗迁移至维持在 10℃的生长室。用 于从冰冻恢复的幼苗经历 -2℃达 2 小时， 并随后于最佳温度下允许恢复 6 小时。继续冷和 从冰冻中恢复达 6 小时的时间段。在需要的时间段末收获所有的三种处理物， 放入液氮并 进行 RNA 提取， 随后进行表达谱分析。
     对于激素诱导研究， 将近交种 B73 的玉米幼苗生长于温室中， 高达 V5 阶段。这时， 用 0.1mM ABA( 脱落酸 ) 或 1mM 乙烯利植物生长调节剂处理该植物。在 ABA 或乙烯利处理 0 小时、 24 小时和 48 小时， 收获因此而受到处理的六株植物的叶， 在液氮中研磨， 并进行 RNA 提取， 随后进行表达谱分析。在激素处理 0 小时时收获的植物构成对照。
     如表 4 所示， 发现 ZmNPK1b 和 ZmNPK1d 为干旱胁迫和应激激素 ABA 和乙烯处理特 异诱导。ZmNPK1b 为寒冷诱导。
     表 4. 在 Lynx MPSS 文库中， ZmNPK1b 和 ZmNPK1d 的胁迫相关表达
     在 Lynx MPSS 文库中 ZmNPK1b 的胁迫相关表达 ( 标签 ： GATCAGCGGATGCTTCG)
     在 Lynx MPSS 文库中 ZmNPK1d 的胁迫相关表达 ( 标签 ： GATCCCGGGTGTTGTGT)50102112614 A CN 102112618 名称 Cla24lm-sig Cla48lm-sig Cle24lm-sig Cle48lm-sig Cl0lm-sig Cktsslm-sig Ckbsslm-sig Cktwwlm-sig Ckbwwlm-sig Csdl1lm-chil 16 Csdl1lm-fro
     39 幼苗 幼苗 B73 B73 PPM 99 205 75 19 52 114 29 74 155 组织 叶 叶 叶 叶 叶 种子 种子 种子 种子说基因型 B73 B73 B73 B73 B73 3245 3245 3245 3245明处理书48/51 页玉米， B73， ABA 处理 V5 叶， 24 小时 玉米， B73， ABA 处理 V5 叶， 48 小时 玉米， B73， 乙烯利处理 V5 叶， 24 小时 玉米， B73， 乙烯利处理 V5 叶， 48 小时 玉米， B73， V5 叶片 种子， 3245， 干旱胁迫 7-DAP 顶端核 种子， 3245， 干旱胁迫 7-DAP 基部核 种子， 3245， 水分充足的 7-DAP 顶端核 种子， 3245， 水分充足的 7-DAP 基部核于 10℃遭受冷处理的幼苗 幼苗从 -2℃的冰冻处理中恢复实施例 11 ： 转基因 MAPKKK 的胁迫诱导表达
     将 ZmNPK1a 序 列 并 入 玉 米 转 化 载 体 PHP29013 中 (RAB17::ZmNPK1a+RAB17::ZmCBF1)， 以检验非生物胁迫下的效率。 制作的其他构建体如下 ： RAB17::ZmNPK1b(PHP32420)、 RD29A::ZmNPK1a(PHP32647)、 RD29A::ZmNPK1b(PHP32984) 和 ZmEEP5::ZmNPK1a(PHP36818)。
     如 上 述 指 出， RAB17 和 RD29A 启 动 子 是 胁 迫 诱 导 的。 如 实 施 例 12 所 描 述， 为 了 检 验 MAPKKK 转 基 因 的 胁 迫 诱 导 表 达， 将 含 有 RAB17::ZmNPK1b、 RD29A::ZmNPK1a 或 RD29A::ZmNPK1b 构建体的 T1 植物种植在温室中的干旱胁迫下。从个体植物中取下叶穿孔 物 (leaf punch) 并储存于 -80℃， 用 QIAGEN， Inc.(Valencia， California) 的 RNeasy96 试 剂盒提取 RNA。按照生产者所指导的， 用 QIAGEN 的 QuantiTect 反转录试剂盒从总 RNA 制备 cDNA， 并通过 Q-PCR 分析目的转基因的表达。所有三个构建体的事件都已表现出胁迫诱导 表达。进一步使用干旱条件下的田间检验来评价每一株转基因的效果。田间评价包括评价 胎生现象 (vivipary)， 其与 rab17 的使用有关， 并且其通常是不想要的性状。
     实施例 12 ： 在胁迫条件下检验转基因植物
     表达本发明重组 MAPKKK 的转基因植物， 例如， 用实施例 1 或 2 的方法产生的那 些植物， 可以遭受模拟非生物胁迫的人工环境， 所述非生物胁迫例如， 寒冷、 干旱或有限的 水条件、 干旱和热的组合或盐度胁迫。在应用这些胁迫前， 在对照生长条件下建立植物， 如 下：营养液 ： 以 20 ∶ 10 ∶ 20 的 NPK 化肥混合物配备营养液， 浓度为每 5 加仑水 3.7 盎司。该储备液用水进一步稀释至 1/16 的浓度并应用于植物。
     在移植时或露出 (emergence) 后， 向盆中加半茶匙 Osmocote (NPK15 ∶ 9 ∶ 12) (The Scotts Miracle-Gro Company， OH， USA) 是有用的。
     边界植物 ： 在邻近温室的玻璃墙的坡顶线 (bench-edge) 或邻近小环境易变性的 其他潜在因素例如冷风机处， 放置一排边界植物。
     自动操作 ： 用带有钻孔的 PVC 管浇水， 以便用虹吸设备对系统放置的盆供水。 可用 定时器安排灌溉。
     复制 ： 每次时间， 每次处理， 使用 8-10 株个体植物。
     处理和收集数据后， 将针对不同的胁迫处理情况下转基因事件记录的的植物大 小、 颜色和叶绿素荧光的平均值输出至 Spotfire(Spotfire， Inc.， MA， USA)。用方差分析评 估处理方式。
     A. 低温耐受性
     为了证明凉爽条件下本发明的 MAPKKK 的表达是否赋予增强的发芽能力， 可以使 表达本发明 MAPKKK 多肽的转基因种子在与种子产业所用的标准寒冷发芽检验相似的条件 下发芽。可选择地， 可以将表达这类 MAPKKK 的转基因种子种植于通过人工环境变凉爽的 苗床条件下或田间的天然凉爽苗床下。此外， 可以在种子发育阶段通过凉爽的夜晚时间 温度激发表达 MAPKKK 的植物， 以证明， 在该作物发育的时间内， 由于冷胁迫， 导致叶或冠 (canopy) 活性的抑制降低。
     可 以 使 转 基 因 幼 苗 在 光 期 生 长 于 低 温 下， 例 如 约 13 ℃， 并在黑暗期间生长 于 13 ℃。植物播种于含有温室土壤培养基的 96 槽的浅箱 (96-pod flat) 中。开始用 Seplex(Blackmore Company， Belleville， MI) 供水， 在温室中种植和萌发幼苗后的第一天 浇水。最初供水后， 用 85ppm 的 20 ∶ 10 ∶ 20 肥料水继续给幼苗供水。一旦植物达到 V3 阶 段 ( 约 10-14 天 )， 将其移至生长室并进行 16/8 小时的光 / 暗循环的冷却方案 (chilling regimen)， 其中， 在恒定湿度下， 日 / 夜温度维持在光 15℃ / 黑 13℃， 并且该盆应当放在浅 箱中， 所述浅箱， 在浅箱中没有隙状开口。 用 85ppm 的 20 ∶ 10 ∶ 20 化肥水， 给幼苗底供水， 从而保持幼苗水分充足。 使幼苗再遭受 16 天的冷却条件。 在进入胁迫期 4、 8、 12 和 16 天时， 对可见的泛黄评分， 并还用 Hansatech FMS2 叶绿素荧光计 (Hansatech Instruments Ltd) 记录叶绿素荧光。叶盘能用来确定由于低温结合强光下光氧化损伤导致的 ROS(reactive oxygen species， 活性氧 ) 累积。在胁迫期末， 在土壤水平收获植物并记录鲜重或生物量累 积。包括对低温生长耐受敏感的对照品种， 对跨越实验使观察结果标准化非常重要。转基 因植物对胁迫的耐受性可以基于下述来评估 ： 相对于对照非转基因植物， 转基因植物中增 强的植物生长、 幼苗的鲜重或干重和 / 或增强的光合活性或叶绿素荧光。转基因的和对照 植物生长的物理特征如本文所述进行评估。
     还可以在幼苗阶段以及晚季阶段检测表达本发明 MAPKKK 的转基因植物的增强的 冰冻耐受性。优选在模拟霜冻或冰冻事件的人工环境中进行这些检测。此外， 在自然环境 施加胁迫期间， 例如， 在霜冻出现时， 转基因种子可以种植在户外。
     B. 耐旱性
     还可以在基于盆的研究中在人工干旱胁迫环境下， 或在田间在可控制的干旱胁迫条件下， 检测表达本发明 MAPKKK 的转基因植物， 以便证明该转基因赋予抗旱性或耐旱性。 以下述方式， 通过基于盆的筛查， 筛查含有候选基因的转基因玉米幼苗对干旱胁迫的耐受 性。使转基因玉米植物遭受水分充足的条件 ( 对照 ) 和干旱胁迫的条件。在 T1 代或更晚 筛查转基因玉米植物。在播种 (DAS) 后 10-14 天或移植后 7 天开始， 施加胁迫， 并持续至抽 穗丝。 通过配备有定时器的自动系统对盆供水， 以在整个干旱胁迫处理期以 25 或 50％田间 持水量 (field capacity) 供水。该胁迫的强度和持续时间将允许鉴定对营养生长以及开 花抽穗丝间隔 (anthesis-silking interval， ASI) 的影响。
     盆栽混合土 ： 能使用 1/3 蒙脱石 (Profile Products LLC， IL， USA)、 1/3 沙子和 1/3SB300(Sun Gro Horticulture， WA， USA) 的混合物。能用 Fafard Fine-Germ(Conrad Fafard， Inc.， MA， USA) 替换 SB300， 并且混合物中的沙子比例可以降低。因此， 最终的盆栽 混合土可以是 3/8(37.5％ ) 的蒙脱石、 3/8(37.5％ ) 的 Fafard 和 1/4(25％ ) 的沙子。
     确定田间持水量 ： 检测待用于一个 S200 花盆的土壤混合物的重量 (w1)( 减去花盆 重量 )。如果所有的土壤混合物组分都不是干的， 那么在测定 w1 前， 将土壤于 100℃干燥至 恒重。对花盆中的土壤供水至完全饱和， 并且流出所有的重力水。在漏出所有的重力水后， 测定土壤的重量 (w2)( 减去花盆重量 )。田间持水量是按 w2-w1 而获得的保留于土壤中的 水的重量。其能表示为烘干的土壤重量的百分比。
     胁迫处理 ： 允许植物在水分充足的条件下在最初的 12-14 天的时期内生长， 之后， 将土壤水分含量降低至约 30％的田间持水量， 以给予慢性干旱胁迫。在该早期生长期 ( 水 分充足的观察结果 ) 和对慢性干旱胁迫阶段再浇水而从干旱胁迫恢复期间 ( 干旱胁迫的观 察结果 )， 记录叶绿素荧光的测量结果。在该慢性干旱胁迫处理后， 完全停止给水， 以允许 植物非常接近于永久萎蔫点 ( 约 8％的田间持水量 )， 在该点时， 给它们供水至饱和。植物 从该严重干旱的恢复， 记录为达到 50％恢复的时间， 或干旱胁迫 48 小时后恢复的植物的数 量。在该实验末， 收集枝条测量鲜重和干重。
     作出观察结果 ： 在水分充足生长过程， 以及在从再供水后从干旱胁迫恢复过程中， 以 PhiPSII( 其表示光系统 II 光化学的运行量子效率 (operating quantum efficiency)) 和 Fv’ /Fm’ ( 其为光系统 II 的最大效率 )， 记录叶绿素荧光的观察结果。 用 Hansatech FMS2 仪器 (Hansatech Instruments Ltd.Norfolk， England) 记录这些测量结果。记录最小的完 全展开的叶子的测量结果。还记录极端干旱胁迫后对植物恢复的观察结果， 以及还记录实 验期末枝条鲜重和干重的观察结果。
     测验 rd29a:ZmNPK1b 构建体的六项事件对耐旱性的改善。在水分充足条件下， 对 于该六项事件中的两项， Fv’ /Fm’ 显著高于对照的 Fv’ /Fm’ 。尤其是， 在上文所述的干旱条 件下， 六项事件中的五项显示出显著高于对照的 Fy’ /Fm’ 。干旱条件下， 对于 PSII 荧光， 五 项中四项的评分也显著优于对照。
     恢复评分显示， 植物在干旱胁迫后恢复的能力如上述描述被缓解。在耐旱性改善 的植物中寻找早期恢复或降低的恢复所需的时间。荧光评分改善的事件中的两项还表现 出， 与对照植物相比， 恢复时间显著降低。
     为了研究这些积极数据是否反应了对较小植物的偏爱， 检测了幼苗枝条的湿质量 和干质量。只有一项事件 (3.1 事件 ) 的平均枝条湿质量小于对照。其他所有的相当或更 大 (3.39 事件 )。相对于对照， 该六项事件中的五项的枝条的干质量没变 ； 一项质量降低。表 7.PHP32984 转基因玉米的幼苗干旱筛查
     WW 荧光 WW 荧光 DRT 荧光 DRT 荧光 恢复 湿枝条 干枝条
     事件 Fv′ /Fm′ ？ PSII Fv′ /Fm′ ？ PSII 小时 克 克
     3.39 0.530a 0.420a 0.687a 0.511a 12.3b 2.90a 0.3999a
     3.32 0.488b 0.380a 0.668ab 0.505a 18.7a 2.34b 0.3683a
     3.19 0.464b 0.366a 0.640ab 0.484a 12.8b 2.43b 0.3441b
     2.9 0.489b 0.392a 0.603c 0.452b 21.3a 2.28b 0.3657a
     1.3 0.476b 0.415a 0.615b 0.459b 18.4a 2.32b 0.4004a
     3.1 0.497a 0.420a 0.661ab 0.485a 20.2a 1.99c 0.3946a
     对照 0.475b 0.400a 0.605c 0.460b 19.9a 2.09b 0.3697a
     总之， 相对于对照， 检测的 83％的 rd29a::ZmNPK1b 事件在干旱条件下表现出显著 改善的 Fv’ /Fm’ 。
     氧化胁迫是暴露于胁迫环境条件下的植物损伤的主要原因。 氧化胁迫由在细胞中 产生的活性氧所引起细胞损伤造成。这些活性氧分子能损害细胞膜、 蛋白和核酸。可以分 析表达本发明 MAPKKK 的转基因植物对氧化胁迫抗性的改善。
     可以在人工环境或田间检测表达本发明 MAPKKK 的转基因植物， 以证明转基因赋 予对化学品 ( 例如， 除草剂、 臭氧或污染物 ) 或金属 ( 例如， 铜或锌 ) 的抗性或耐受性。相 对于非转基因植物， 在更高浓度有毒化合物存在下， 生长能力增强的转基因植物在本发明 中是有用的。
     另一方面， 本文所述的本发明 MAPKKK 可以改善作物产量或生产率。用本领域技 术人员熟悉的技术， 表达本发明 MAPKKK 的转基因植物的种子可以种植在试验小区 (test plot) 中， 并且将其农艺学性能与标准植物进行比较。任择地， 将相似遗传背景但无转基因 的的植物包括于该比较中。可以观察产量效益， 并且促进显示产量增加的植物的商品化。
     此外， 在包括但不限于有限的或不充分的可用性水以模仿干旱的条件下， 可以在 田间检测表达本发明 MAPKKK 的转基因植物的农艺学性能。当与非转基因植物相比时， 在非 最佳生长条件下， 表达本发明 MAPKKK 的转基因植物比其非转基因对应物表现出更高的产 量。
     本说明书提到的所有出版物和专利申请表示本发明所属技术领域技术人员的水 平。通过引用将所有出版物和专利申请并入本文， 其引用程度如同特别和单独指出通过引 用并入每一个单个出版物或专利申请。
     发明背景
     在复杂的信号转导机制中， 促分裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinases， MAPKs) 整合各种第二信使所传导的多种细胞内信号。MAPKs 能使多种酶和转录因 子磷酸化并调节其活性。MAPKs 活性由一连串级联反应触发， 所述级联反应通过 MAPK 激酶 (MAPKK) 导致 MAPK 的苏氨酸和酪氨酸的磷酸化。MAPKK 由 MAPKKK 激活， 所述 MAPKKK 通过 其丝氨酸 / 苏氨酸磷酸化而变得有活性。
     MAPK 磷酸化级联在真核生物中高度保守。确实， 已在酵母、 果蝇、 哺乳动物细胞和 植物中鉴定了同源物。到 2002 年为止， 仅在拟南芥 (Arabidopsis) 中就鉴定出超过 60 种 MAPKKK 基因 (Ichimura， et al.， (2002)Trends plant Sci 7 ： 301-308)。由于上述级联中 涉及大量蛋白， 因此， 不明确哪种蛋白是必不可少的、 如果缺失会造成致命性或在功能上是 多余的。
    MAPKKKs 和其靶标参与真核生物的生长和发育。例如， 在植物中， MAPKKK 级联与胚 芽发育、 细胞分裂、 疾病防御应答和非生物胁迫应答有关 (Tena， et al.， (2001)Curr Opin Plant Biol 4 ： 392-400.)。
     最近发现， MAPKKK 基因中称为 YODA(YDA) 的功能突变缺失产生缺失胚柄的拟南芥 (Arabidopsis) 植物胚胎， 胚柄即为， 功能是从胚乳向生长的胚胎提供营养的组织。并不是 所有的 yda 植物都能发育成成熟植物， 并且那些发育成成熟植物的 yda 植物表现出根发育 延迟并且比野生型植物要小。已知的植物激素不能营救 yda 表型， 这提示新的发育信号通 路 (Lukowitz， et al.， (2004)Sci.STKE 2004 tw21)。
     在拟南芥 ANP 家族中， 已经鉴定出数种 MAPKKKs， 并且其与调节细胞分裂有关联。 (Krysan， et al.， (2002)plant cell 14 ： 1109-1120)。在本氏烟 (N.benthamiana) 叶子中 也鉴定出 MAPKKK， 并且发现其在抵御丁香假单胞杆菌 (Pseudomonas syringae) 的过敏反 应和抗性中发挥作用 (Pozo， et al.， (2004)The EMBO Journal 23 ： 3072-3082)。发现同样 的 MAPKKK 在经历丁香假单胞杆菌感染的易感叶子中调节细胞死亡 (Pozo， et al.， (2004) The EMBO Journal 23 ： 3072-3082)。
     发现表达不同水平的 Tobacco NPK1 的组成型活性拟南芥直系同源物的转基因 烟草植株， 在盐水平升高、 低温和热休克存在的情况下， 比野生型植物生长得更旺盛， 但 是在正常的生长条件下， 所述转基因烟草在表型上与野生型植物并无不同 ( 美国专利第 6,613,959 号 )。操纵这个氧化胁迫信号调节剂能保护植物免受各种环境胁迫， 例如热和高 盐。参见美国专利第 6,613,959 号 (Kovtun， et al.， (2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97 ： 2940-2945)。
     因此， MAPKKKs 参与植物生长和发育的很多方面。鉴于 MAPKKK 信号转导级联成 员， 尤其是 MAPKKK 信号转导分子， 在调节范围从细胞增殖和分化到细胞凋亡的植物细胞进 程中的重要作用， 需要鉴定出植物 MAPKKK 多核苷酸和多肽以及用来调节各种应答和发育
     最近发现， MAPKKK 基因中称为 YODA(YDA) 的功能突变缺失产生缺失胚柄的拟南芥 (Arabidopsis) 植物胚胎， 胚柄即为， 功能是从胚乳向生长的胚胎提供营养的组织。并不是 所有的 yda 植物都能发育成成熟植物， 并且那些发育成成熟植物的 yda 植物表现出根发育 延迟并且比野生型植物要小。已知的植物激素不能营救 yda 表型， 这提示新的发育信号通 路 (Lukowitz， et al.， (2004)Sci.STKE 2004 tw21)。
     在拟南芥 ANP 家族中， 已经鉴定出数种 MAPKKKs， 并且其与调节细胞分裂有关联。 (Krysan， et al.， (2002)plant cell 14 ： 1109-1120)。在本氏烟 (N.benthamiana) 叶子中 也鉴定出 MAPKKK， 并且发现其在抵御丁香假单胞杆菌 (Pseudomonas syringae) 的过敏反 应和抗性中发挥作用 (Pozo， et al.， (2004)The EMBO Journal 23 ： 3072-3082)。发现同样 的 MAPKKK 在经历丁香假单胞杆菌感染的易感叶子中调节细胞死亡 (Pozo， et al.， (2004) The EMBO Journal 23 ： 3072-3082)。
     发现表达不同水平的 Tobacco NPK1 的组成型活性拟南芥直系同源物的转基因 烟草植株， 在盐水平升高、 低温和热休克存在的情况下， 比野生型植物生长得更旺盛， 但 是在正常的生长条件下， 所述转基因烟草在表型上与野生型植物并无不同 ( 美国专利第 6,613,959 号 )。操纵这个氧化胁迫信号调节剂能保护植物免受各种环境胁迫， 例如热和高 盐。参见美国专利第 6,613,959 号 (Kovtun， et al.， (2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97 ： 2940-2945)。
     因此， MAPKKKs 参与植物生长和发育的很多方面。鉴于 MAPKKK 信号转导级联成 员， 尤其是 MAPKKK 信号转导分子， 在调节范围从细胞增殖和分化到细胞凋亡的植物细胞进 程中的重要作用， 需要鉴定出植物 MAPKKK 多核苷酸和多肽以及用来调节各种应答和发育
     的这些分子的调节剂。由于这些和其他的原因， 需要本发明。
     发明概述
     通常， 本发明的目的是， 提供与 MAPKKK 有关的多核苷酸和多肽。本发明的目的是， 提供包含本发明的多核苷酸和多肽的转基因植物。 此外， 本发明的目的是， 提供在植物细胞 或转基因植物中， 调节本发明的多核苷酸和多肽表达的方法。 本发明的另一个目的是， 提供 增强植物非生物胁迫抗性和耐受性的方法。
     因此， 一方面， 本发明涉及分离的 MAPKKK 多核苷酸， 其编码 SEQ ID NO ： 2、 5、 8 或 10 的多肽 ； 具有 SEQ ID NO ： 1、 4、 7 或 9 的序列的多核苷酸序列 ； 长度为至少有 30 个核苷酸的 多核苷酸， 其在严紧条件下可与任一前述多核苷酸杂交。另一方面， 本发明包括与 SEQ ID NO 为 ： 1、 4、 7 或 9 具有至少 60％的序列同一性的多核苷酸。还包括用基于本发明序列的引 物从核酸文库扩增的分离的多核苷酸， 所述引物为， 例如， 如 SEQ ID NOS 12 和 13 分别所示 的 ZmNPK1b- 正向引物和 ZmNPK1b- 反向引物。一方面， 核酸文库是玉米 (Zea mays( 玉米 )) 文库。另一方面， 核酸文库是 cDNA 文库。在本文中， 本发明另一方面提供了分离的多核苷 酸， 所述多核苷酸由于遗传密码对于任何本发明的 MAPKKK 是简并的。另一方面， 分离的核 苷酸和本发明的任一 MAPKKKs 的多核苷酸是互补的。另一方面， 本发明涉及编码 MAPKKK 多 肽的分离的多核苷酸， 所述 MAPKKK 多肽赋予对脱水、 盐度、 温度胁迫、 环境胁迫或病原体的 抗性和耐受性。
     另一方面， 本发明涉及转基因植物， 包括重组表达盒在内， 其包含可操作地连接于 本发明任何分离的多核苷酸的植物启动子。本发明还提供了转基因植物的转基因种子。另 一方面， 本发明涉及用重组表达盒转染的宿主细胞， 所述重组表达盒包括可操作地连接于 本发明任何分离的多核苷酸的植物启动子。一方面， 宿主细胞是大豆、 水稻或玉米细胞。
     另一方面， 本发明涉及分离的多肽， 所述分离的多肽具有与 SEQ ID NO 2、 5、 8 或 10 所示的氨基酸序列有至少 70％的序列同一性的氨基酸序列， 并具有 MAPKKK 活性。另一方 面， 本发明涉及包含重组表达盒的转基因植物， 所述重组表达盒包含可操作地连接于分离 的多核苷酸的植物启动子， 所述分离的多核苷酸编码多肽， 所述多肽具有与 SEQ ID NO 2、 5、 8 或 10 所示的氨基酸序列有至少 70％的序列同一性的氨基酸序列， 并具有 MAPKKK 活性。 本发明还提供了转基因植物的转基因种子。另一方面， 本发明涉及用重组表达盒转染的宿 主细胞， 所述重组表达盒包含可操作地连接于任何编码本发明多肽的分离的多核苷酸的植 物启动子。
     另一方面， 本发明涉及调节植物细胞中 MAPKKK 蛋白水平的方法。一方面， 所述方 法包括用可操作地连接于启动子的 MAPKKK 多核苷酸转化植物细胞。所述多核苷酸可以位 于有义或反义方向上。所述方法还包括表达所述多核苷酸达足够调节植物细胞内 MAPKKK 蛋白的时间量。
     另一方面， 本发明提供了调节植物中 MAPKKK 蛋白水平的方法。所述方法包括用 MAPKKK 多核苷酸稳定地转化植物细胞， 所述 MAPKKK 多核苷酸， 在有义或反义方向上， 可操 作地连接于在植物细胞中有功能的启动子。 所述方法包括将转化的植物细胞再生为转化的 植物， 所述转化的植物表达的 MAPKKK 多核苷酸的量足以调节植物中的 MAPKKK 蛋白水平。
     另一方面， 本发明涉及增强植物非生物胁迫抗性或耐受性的方法。 一方面， 所述方 法包括将包含编码本发明 MAPKKK 的多核苷酸的构建体引入植物细胞。所述多核苷酸可以可操作地连接于在植物细胞有功能的启动子， 以便产生转化的植物细胞。将所述转化的植 物细胞再生成转化的植物。以足以诱导非生物胁迫抗性和耐受性的水平， 在转基因植物的 至少一些细胞中表达 MAPKKK。 一方面， 非生物胁迫是干旱、 低温、 盐、 渗透胁迫、 霜冻或冰冻、 高温、 氧化胁迫或化学胁迫。所述方法可以提供对其他环境胁迫， 例如， UV-B、 臭氧、 光致氧 化、 除草剂、 病原体， 或也涉及氧化胁迫损伤的其他胁迫等的耐受性。
     根据下面的描述， 本发明的其他目的、 特征、 优势和方面对本领域技术人员而言会 变得明显。 然而， 应当理解， 下面的描述和具体实施例， 尽管表明本发明的优选实施方案， 但 是， 仅以举例而给出。 由阅读下面的描述和本发明公开内容的其他方面， 本公开的发明实质 和范围内的各种改变和修改会毫无困难地变得对于本领域技术人员是显然的。
     附图简要说明
     从下述详细描述和附图更全面的了解本发明并且序列表形成本申请的一部分。
     图 1. 寒冷胁迫下， B73 和 CML349 间胁迫诱导的 ZmNPK1b 基因表达的差异。
     图 2.MAPKKK 的 CLUSTAL X(1.83) 多重序列比对。针对水稻序列， OsNPK1 样蛋白 即 NP_917084(SEQ ID NO ： 14)、 NP_917080(SEQ ID NO ： 15) 和 BAF24980(SEQ ID NO ： 16)， 以及拟南芥 ANP1 序列 O22040(SEQ ID NO ： 17)， 比对 ZmNPK1a(SEQ ID NO ： 2)， ZmNPK1b(SEQ ID NO ： 5) 和 ZmNPK1d(SEQ ID NO ： 10)。 将部分蛋白即 ZmNPK1c(SEQ ID NO ： 8)， 排除在比对 外。优选用星号标记保守残基， 其主要位于该蛋白的 N 端半部分。 图 3. 基于其氨基酸序列， 从玉米、 水稻和拟南芥 NPK1 样序列构建的系统树。用多 重比对工具 CLUSTAL， 构建系统树图。
     序列的简单描述
     如下文表 1 所示， 本申请提供了 MAPKKK 序列的详情。
     表1
    
    发明的详细描述
     在后文中， 将参照附加的实施例对本发明进行更全面的描述， 在所述实施例中， 展 示了本发明的一些而不是所有实施方案。 实际上， 本发明可以以许多不同的形式体现， 并且 不应解释为局限于本文阐述的实施方案， 更确切地是， 提供这些实施方案， 以便本公开满足 合适的法律要求。相似标记指示相似的元件。
     在获得本文所提出的说明书和附图的教导后， 本领域技术人员会想到本文展示的 本发明的许多改变和其他实施方案。 因此， 应当理解， 本发明并不限于所公开的具体实施方 案， 并且意图将改变和其他实施方案包括在附加的权利要求的范围内。尽管本文用到具体 的术语， 但是其仅以一般和说明性的含义而使用， 并不是为了限制的目的。
     本文所使用的冠词 “a( 一个 )” 和 “an( 一个 )” 是指该冠词的一个或多于一个 ( 即 至少一个 ) 语法对象。作为实例， “元件 (an element)” 表示一个或多于一个元件。
     综述
     本发明提供了调节， 例如， 增加或减少植物细胞或植物中 MAPKKK 蛋白水平的新组 合物和方法。尤其是， 本发明的多核苷酸和多肽能够用来产生表达本发明 MAPKKK 的转基因 植物。
     本发明人发现了四种新的 MAPKKKs， 发现其中之一 (ZmNPK1b)， 相对于在 B73 中的 表达水平， 在 CML349 中高水平表达， CML349 是已知耐寒的热带高原系， B73 是相对较不耐寒 的玉米带臼齿近交种 (corn-belt dent inbred)。 本发明 MAPKKK 的调节可能会提供操纵植 物对非生物胁迫应答的机制， 所述非生物胁迫包括但不限于， 干旱、 低温、 盐、 渗透胁迫、 霜 冻或冰冻、 高温、 氧化胁迫和化学胁迫， 以及由诸如 UV-B、 臭氧、 光致氧化、 除草剂、 病原体的 其他环境因素引起的胁迫或也引起氧化胁迫损伤的其他胁迫。因此， 本发明提供了用本发 明的 MAPKKK 多核苷酸和多肽调节， 例如增强或减弱植物对胁迫尤其是非生物胁迫的抗性 或耐受性的方法。
     组合物
     组合物包括促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶 (MAPKKK) 水平和 / 或活性发生改变 的植物。如本文所使用的， 术语促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶 (MAPKKK) 包括但不限于本 文公开的序列， 例如 MAPKKK， 其保守修饰的变体， 不管其来源， 和保留了 MAPKKK 的生物特性 例如本文公开的 MAPKKK 活性的任何其他变体。 在具体组合物中， 植物的具有 SEQ ID NO ： 2、 5、 8 或 10 所示氨基酸序列的 MAPKKK 多肽或其活性变体或片段的水平和 / 或活性发生改变。还提供了 MAPKKK 多肽或其活性变 体或片段的水平和 / 或活性发生改变的植物， 所述 MAPKKK 多肽由 SEQ ID NO ： 1、 4、 7或9所 示的多核苷酸编码。本发明的植物显示出调节胁迫耐受性、 结籽率 (seed set)、 植物产量、 植物活力 (plant vigor)、 枝条生长、 叶衰老、 枝条再生或根生长。
     在具体的实施方案中， 本发明的植物具有稳定并入其基因组的 MAPKKK 序列。在另 外的实施方案中， MAPKKK 序列可操作地连接于在植物中有活性的组织优选启动子。
     其他的实施方案提供了在编码 MAPKKK 多肽的天然基因组基因座处已被遗传修饰 的植物。 “天然基因组基因座” 意图表示天然存在的基因组序列。在一些实施方案中， 天然 基因座如分别为 ZmNPK1a、 ZmNPK1b 和 ZmNPK1d 的 SEQ ID NOS ： 3、 6 和 11 中所示。用先锋专 有的基因模拟算法， 提供了 ZmNPK1a 和 ZmNPK1d 的基因组序列。所述基因模拟算法统一了 玉米序列的公开和专有信息， 产生基因结构， 并且随着新的玉米序列信息可以利用， 可以修 订该基因结构。用已测序的 BAC 克隆 p1.bacb.pk191.e03 的信息， 提供了 ZmNPK1b 基因组 序列信息。
     遗传修饰包括引入 MAPKKK 序列或修饰编码 MAPKKK 的天然基因组基因组座或两者 都有， 并且其可能导致表型改变。 “表型改变” 意指一个或多个细胞功能中可检测的改变。 例如， 在编码 MAPKKK 多肽的基因组基因座上有遗传修饰的植物可以表现出， MAPKKK 多肽 的表达或活性降低或消除。可以在组织或全植物水平观察某些表型改变， 例如根发育修饰 或幼苗生长增强。本文的其他地方较详细地描述了遗传修饰的各种方法， 正如影响本发明 MAPKKK 序列的水平和 / 或活性的修饰所导致的表型的实例。
     表型改变可以包括但并不限于调节根发育、 胁迫耐受性、 枝条发育、 叶发育、 叶衰 老、 光合作用、 愈伤组织再生、 结籽率、 植物产量或植物活力。
     修饰的植物是感兴趣的， 修饰的植物是修饰的植物细胞、 植物原生质体、 能再生植
     物的植物细胞组织培养物、 植物愈伤组织、 在植物或植物部分中完整的植物块茎和植物细 胞， 所述植物部分例如胚、 花粉、 胚珠、 种子、 叶、 花、 枝 (branch)、 果实 (fruit)、 核 (kemel)、 穗 (ear)、 玉米穗轴 (cob)、 外壳 (husk)、 茎 (stalk)、 根、 根尖、 花药、 谷粒 (grain) 等。如本 文所使用的，″谷粒″表示商业种植物产生的成熟种子， 用于除了发展或繁育物种以外的 目的， 例如， 最终用途为用作饲料、 食品或纤维。再生植物的后代 (progeny)、 变体和突变体 也包括在本发明的范围内， 只要这些植物或植物部分包含遗传修饰。
     本发明使用的 MAPKKK 多肽和 MAPKKK 蛋白家族成员共有序列同一性。MAPKKK 活 性的改变改变了涉及促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶 (MAPKKK) 级联的细胞内信号过程。 这些包括 MAPK 激酶激酶 (MAP3K， 也称为 MAPKKK 或 MEKK)、 MAPK 激酶 (MAP2K， 也称为 MKK 或 MEK) 和 MAPK 或细胞外信号调节激酶 (ERK) 的级联。MAPKKK/MEKK 使其下游的蛋白激酶 MAPKK/MEK 磷酸化并将其激活， 所述 MAPKK/MEK 顺序激活 MAPK。
     如本文所描述的， 本发明人已经在玉米中鉴定出四种新的 MAPKKK cDNAs， 其 是 水 稻 NPK1 的 同 源 物。 本 发 明 的 玉 米 MAPKKKs 多 核 苷 酸 是 长 度 为 1396(ZmNPK1a)、 1864(ZmNPK1b)、 1662(ZmNPK1c) 和 1375(ZmNPK1d) 的 核 苷 酸， 编码计算的分子量为 46KDa(ZmNPK1a)、 54KDa(ZmNPK1b)、 41KDa( 部分 ZmNPK1c) 和 40KDa(ZmNPK1d) 的多肽。利 用 GAP(BLOSUM 62)， 多肽 ZmNPK1a、 ZmNPK1b 和 ZmNPK1d 在 ZmNPK1a 和 ZmNPK1b 之间共享 约 53 ％的氨基酸共有序列， 在 ZmNPK1a 和 ZmNPK1d 之间约 65 ％， 在 ZmNPK1b 和 ZmNPK1d 之 间 约 61 ％。 玉 米 ZmNPK1a、 ZmNPK1b 和 ZmNPK1d 的 cDNA 编 码 与 水 稻 NPK1- 样 基 因 (dbj|BAB64165.1|(AP003254)NPK1- 相关蛋白激酶 - 样蛋白 [ 水稻 (Oryza sativa)] 分 别具有约 58％、 73％、 63％总氨基酸同一性的多肽。用 BLAST 搜索公开的和专有的 BAC 序 列检查玉米 MAPKKK 可能的染色体定位。玉米 MAPKKKS 中的三种， 即 ZmNPK1a， ZmNPK1b 和 ZmNPK1d， 定位在染色体 3 上， 而第四个， 即 ZmNPK1c(PCO622918) 定位在染色体 2 上。用先 锋专有的关联工具 (association tool)， 检查与干旱胁迫的任何已知 QTL 的潜在关联。因 此， 观察到， ZmNPK1a 和 ZmNPK1d 与和 Staygreen 表型相关的 QTL 有潜在关联 (Thomas and Howarth， (2000)J Exp Bot 51Spec No ： 329-337)， 并且观察到 ZmNPK1c 与产量 QTLs 并且还 与雌雄穗花开间隔、 Staygreen 和 Barrencount 的干旱 QTLs 有潜在关联。用这个专有的关 联工具预测的这些与 QTLs 的潜在关联并未证明， 这些具体基因控制所述性状， 而其仅仅暗 示在哪一性状处存在关联。为了进一步表征 MAPKKKs， 在 Lynx 大规模并行信号测序 (Lynx Massively Parallel Signature Sequencing(MPSS)) 文库中分析所有四个 MAPKKK 序列的 表达 ( 表 4)。(Brenner， et al.， (2000)Nat Biotechnol.18 ： 630-634)。ZmNPK1a 的高表 达见于茎、 根和 B73 茎的叶枕组织。ZmNPK1b 的高表达见于核和根组织， 授粉后第 0 天的玉 米核， 和玉米的初生根。在特定组织中没有检测到 ZmNPK1c 的表达， 很可能是在 Lynx 文库 有非常少的代表。最后， ZmNPK1d 表达在所有组织中均匀分配， 在授粉后第 0 天的玉米核中 水平最高。如本文实施例 10 所示， 还发现 ZmNPK1b 和 ZmNPK1d 被干旱胁迫和用本文所述的 应激激素即 ABA 和乙烯处理特异性诱导。
     不希望受到该理论的束缚， 本发明人认为， 本发明的 MAPKKK 对增强许多非生物胁 迫的胁迫抗性或耐受性有用。如本文所使用的， 术语 “非生物胁迫” 包括但不限于干旱、 低 温、 盐、 渗透胁迫、 霜冻或冰冻、 高热温、 氧化胁迫和化学胁迫以及诸如 UV-B、 臭氧、 光致氧 化、 除草剂、 病原体的其他环境胁迫引起的胁迫， 或也涉及氧化胁迫损伤的其他胁迫 (Greenand Fluhr， (1995)Plant Cell 7 ： 203-212 ； Prasad， (1996)Plant J.10 ： 1017-1026 ； Willekens， et al.， (1997)EMBO J.16 ： 4806-4816 ； Chamnongpol， et al.， (1998)Proc. Natl.Acad.Sci USA 95 ： 5818-5823 ； Schraudner， et al.， (1998)Plant J.16 ： 235-245 ； Karpinski， et al.， (1999)Science 284 ： 654-657)。
     对一种或多种非生物胁迫的抗性或耐受性可以直接通过激活 MAPKKK 的靶标或间 接通过 MAPKKK 信号转导级联来实现， 其包括本发明 MAPKKK 的下游靶标。因此， 在植物细胞 中， 调节本发明 MAPKKK 的 MAPKKK 活性， 为交叉保护植物免受一种或多种非生物胁迫提供了 新的策略。
     还考虑的是， 在调节级联中， 激活或表达位于 ZmNPK MAPKKK 上游的基因， 以便实 现 MAPKKK 靶标的激活。MAPKKK 的靶标或底物包括但不限于转录因子、 其他蛋白激酶和细 胞骨架相关蛋白。靶标或底物可以用本领域技术人员共知的技术鉴定， 包括在凝胶激酶检 测 (gel kinase assay)、 酵母双杂交检测 (yeast two-hybrid assay)、 使用连接于报告基 因上的胁迫应答启动子的原生质体瞬时表达检测， 例如， 在氧化胁迫、 热、 寒冷或干旱等过 程中被激活的启动子 (Kovtun， et al.， (2000).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97 ： 2940-2945 ； Machida， et al.， (1997)Critic.Rev.Plant Sci.16 ： 481-496 ； Mazoguchi， et al.， (1997) Trends Biotechnol.15 ： 15-19 ； Zhang and Klessig， (1997)Plant Cell 9 ： 809-824 ； Jonak， et al.， (1999)Cell.Mol.Life.Sci.55 ： 204-231)。
     调节本发明 MAPKKK 活性的化合物可以通过评估转录因子和 MAPKKK 启动子中的调 控元件的相互作用来确定， 例如， 激素应答或胁迫应答调控元件。例如， 在 ZmNPK1b 的启动 子序列中， 至少有一个脱落酸 - 应答元件 (ABRE)， 特别是 ABREAT 共有序列 YACGTGGC， 还有 C- 重复 / 脱水应答元件 (CRT/DRE) 共有序列 CCGAC。检测 DNA 结合蛋白和靶 DNA 序列的相 互作用的试验 ( 例如电泳迁移率变动分析、 DNA 酶 I 足迹分析等 ) 在本领域内是已知的。在 受试化合物例如生长素或过氧化氢存在和缺失下， 通过实施这样的试验， 这些试验能用来 鉴定调节 ( 例如， 抑制或增强 )DNA 结合蛋白和其靶 DNA 序列相互作用的化合物。
     如本文所用的， “其中植物胁迫抗性或耐受性相对于对照植物的胁迫抗性或耐受 性增强了， 所述对照植物对本发明的 MAPKKK 而言是非转基因的” ， 是指相对于对照植物， 所 述植物生长和 / 或产量的增加和 / 或对胁迫的抗性改善。例如， 植物对特定非生物胁迫例 如盐度的胁迫抗性或耐受性， 可以通过比较植物生长的物理特性和特征来估计， 例如， 转基 因植物和非转基因对照植物的植物高度和重量、 叶面积、 植物水分关系、 开花能力、 结种子 的能力、 产量 / 生产率和含糖量 (Shou， et al.， (2004)J Exp Bot.55(399) ： 1013-9)。另一 方面， 非生物胁迫下所观察的转基因 MAPKKK 植物的植物生长的物理特性和特征也可以与 未暴露在非生物胁迫下的转基因 MAPKKK 植物和对本发明的 MAPKKK 而言是非转基因的对照 植物的物理特性和特征比较， 从而可以进一步评价 “正常” 的植物生长和特征。
     “增强胁迫抗性或耐受性” 表示介导转基因植物对胁迫 ( 例如， 诸如污染的人为胁 迫， 或诸如干旱、 盐度和氧化胁迫和温度胁迫的环境胁迫， ) 的忍耐力、 适应性或持久性的水 平， 所述水平比对照植物表现的更好 ( 例如， 非转基因植物 )。优选地， 本发明转基因植物 ( 或转化的植物细胞、 植物组分、 植物组织或植物器官 ) 的胁迫抗性或耐受性水平比非转基 因对照植物 ( 或对照植物细胞、 植物组分、 植物组织或植物器官 ) 所表现出的胁迫耐受性要 高至少 5％、 10％或 20％ ( 并且优选 30％或 40％ )。在其他优选的实施方案中， 胁迫抗性或胁迫耐受性水平比对照植物高 50％、 60％和更优选甚至高 75％或 90％， 最优选， 与对照植 物相比， 高于耐受性水平高达 100％。通过用来测定植物生长和胁迫应答的常规方法， 检测 胁迫抗性或耐受性水平。例如， 对盐度的胁迫耐受性可以通过比较转基因植物和非转基因 对照植物的物理特性和特征 ( 例如， 植物高度和重量、 叶面积、 植物水分关系、 开花能力、 结 种子的能力、 产量 / 生产率 ) 来确定。
     MAPKKK 多核苷酸和由此编码的蛋白的片段和变体可用于本发明。 “片段” 意指多 核苷酸的一部分或氨基酸序列的一部分和因此由其编码的蛋白的一部分。 多核苷酸片段可 以编码蛋白片段， 所述蛋白片段保留了天然蛋白的生物活性并因此保留了 MAPKKK 活性， 例 如， 由其推断的调节结构域的缺失所产生的组成型活性的 MAPKKK。
     如本文所交替使用的， “MAPKKK 活性” ， “MAPKKK 的生物活性” 或 “MAPKKK 的功能活 性” ， 是指按照标准技术， 在体内或体外测定的 MAPKKK 蛋白、 多肽或其部分发挥的活性。 在一 个实施方案中， MAPKKK 活性是直接的活性， 例如与 MAPKKK- 靶分子结合。如本文所使用的， “靶分子” 是 MAPKKK 蛋白本质上与之结合或相互作用的分子， 从而实现 MAPKKK- 介导的功 能。MAPKKK 靶分子可以是非 MAPKK 分子或 MAPKKK 蛋白或本发明的多肽或 MAPKK 蛋白或多 肽。 在示例性实施方案中， MAPKKK 靶分子是 MAPKKK 底物 ( 包括例如但不限于 ZmMPK4(MAP 激 酶 4， Genbank 登录号为 BAA74733) 或 ZmMPK5(MAP 激酶 5， Genbank 登录号为 BAA74734.1)。 在优选实施方案中， MAPKKK 活性为至少一种或多种下述活性 ： (i)MAPKKK 蛋白与可溶的 MAPKKK 配基的相互作用 ( 例如， 但不限于 ZmMPK4 或 ZmMPK5 等 ) ； (ii) 调节 MAPKKK 底物的 活性 ； (iii) 激活 MAPKKK 底物 ； (iv) 间接调节下游信号分子 ( 例如， MAPKK)。在另一个优 选实施方案中， MAPKKK 活性为至少一种或多种下述活性 ： (1) 在体外或体内， 调节细胞信号 转导 ； (2) 调节表达 MAPKKK 蛋白的细胞内的基因转录 ； (3) 调节表达 MAPKKK 蛋白的细胞内 的基因转录， 其中所述细胞参与非生物胁迫抗性或耐受性 ； (4) 调节细胞增殖 ； (5) 调节细 胞分化 ； (6) 调节发育以及 (7) 调节细胞死亡。
     可选择地， 用作杂交探针或 PCR 引物的多核苷酸的片段通常不编码保留生物活性 的蛋白片段。因此， 核苷酸序列片段的变化范围可以为从至少约 20 个核苷酸， 约 50 个核苷 酸， 约 100 个核苷酸， 到高达编码本发明所用蛋白的全长多核苷酸。
     编码本发明所用的 MAPKKK 蛋白的生物活性部分的 MAPKKK 多核苷酸的片段将编码 至少 15、 25、 30、 50、 75、 100、 125、 150、 175、 200、 220 或 225 个连续氨基酸， 或高达存在于本发 明的全长或部分 MAPKKK 蛋白的氨基酸总数 ( 例如， 分别为 SEQ ID NOS ： 2、 5、 8 和 10 的 441、 514、 366 或 392 个氨基酸 )。
     通过分离本发明所用的一个 MAPKKK 多核苷酸的一部分， 表达 MAPKKK 蛋白的编码 部分 ( 例如， 通过体外重组表达 )， 并且评价 MAPKKK 蛋白的编码部分的活性， 来制备 MAPKKK 蛋白的生物活性部分。为 MAPKKK 核苷酸序列片段的多核苷酸包含至少 16、 20、 50、 75、 100、 150、 200、 250、 300、 350、 500、 550、 500、 550、 600、 650、 700、 800、 900、 1,000、 1,100 个 核 苷 酸， 或高达存在于本文所公开的全长 MAPKKK 多核苷酸中的核苷酸数 ( 例如， 分别为 SEQ ID NOS ： 1、 4、 7 和 9 的 1396、 1864、 1662 和 1375 个核苷酸 )。
     “变体” 意图表示实质上相似的序列。对于多核苷酸而言， 变体包含在天然多核 苷酸内一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的缺失和 / 或添加， 和 / 或在天然多核苷酸 的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的取代。如本文所使用的， “天然” 多核苷酸或多肽分别包括天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。对于多核苷酸而言， 保守变体包括这 样的序列， 其由于遗传密码的简并性， 编码本发明 MAPKKK 多肽之一的氨基酸序列。诸如这 些的天然存在的变体， 能用公知的分子生物学技术鉴定， 例如， 用下述概述的聚合酶链式反 应 (PCR) 和杂交技术。变异的多核苷酸还包括合成来源的多核苷酸， 例如， 由例如用定点 诱变产生但仍编码本发明所用的 MAPKKK 蛋白那些多核苷酸。通常， 如本文其他地方描述 的序列比对程序和参数所测定的， 本发明具体多核苷酸的变体与该具体多核苷酸具有至少 约 50％、 55％、 50％、 55％、 60％、 65％、 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 91％、 92％、 93％、 95％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％或更高的序列同一性。
     本发明所用的具体多核苷酸变体 ( 即， 参照多核苷酸 ) 也可以通过比较变异的多 核苷酸所编码的多肽和参照多核苷酸所编码的多肽间的序列同一性来估算。 因此， 例如， 包 括编码与 SEQ ID NO ： 2、 5、 8 或 10 的多肽中任一个具有给定百分比序列同一性的多肽的分 离的多核苷酸。 任何两条多肽间的序列同一性百分比可以用本文其他地方所述的序列比对 程序和参数来计算。 如果本发明的任何给定的多核苷酸对通过比较其编码的两条多肽所共 有的序列同一性百分比来估算， 则两条编码的多肽间的序列同一性百分比为至少约 50％、 55 ％、 50 ％、 55 ％、 60 ％、 65 ％、 70 ％、 75 ％、 80 ％、 85 ％、 90 ％、 91 ％、 92 ％、 93 ％， 、 95 ％、 95 ％、 96％、 97％、 98％、 99％或更高的序列同一性。 “变异” 的蛋白意图表示， 通过在天然蛋白内一个或多个位点处的一个或多个氨基 酸的缺失或添加和 / 或在天然蛋白内一个或多个位点处的一个或多个氨基酸的取代， 而来 源于该天然蛋白的蛋白。 包括在本发明中的变异的蛋白是生物活性的， 换而言之， 其继续具 有期望的天然蛋白生物活性， 即本文所述的 MAPKKK 活性。这样的变体可以由例如， 遗传多 态性或人为操纵产生。如本文其他地方描述的序列比对程序和参数所测定的， 本发明天然 MAPKKK 蛋白的生物活性变体与天然蛋白的氨基酸序列具有至少约 50％、 55％、 60％、 65％、 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 91％、 92％、 93％、 95％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％或更高的 序列同一性。本发明蛋白的生物活性变体与该蛋白的不同可以为少至 1-15 个氨基酸残基， 少至 1-10 个， 例如 6-10， 少至 5 个， 少至 5、 3、 2 或甚至 1 个氨基酸残基。
     本发明方法所用的蛋白可以通过各种方法改变， 包括氨基酸取代、 缺失、 切断和插 入。用于这类操作的方法在本领域内通常是已知的。例如， MAPKKK 蛋白的氨基酸序列变体 和片段能通过 DNA 的突变来制备。诱变和多核苷酸改变的方法在本领域内是公知的。参 见， 例如， Kunkel， (1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82 ： 588-592 ； Kunkel， et al.， (1987) metheds in Enzymol( 酶学方法 ).155 ： 367-382 ； 美国专利第 5,873,192 号， Walker and Gaastra， eds.(1983)Techniques in Molecular Biology( 分子生物学技术 )(MacMillan Publishing Company， New York) 和其中引用的参考文献。有关不影响感兴趣的蛋白的生 物活性的适当的氨基酸取代的指导， 可见于 Dayhoff et al.， (1978)Atlas of Protein Sequence and Structure( 蛋白序列和结构图册， Natl.Biomed.Res.Found.， Washington， D.C.) 的模型， 通过引用将其并入本文。 组成型取代可能是最佳的， 例如， 用另一个有相似性 质的氨基酸交换一个氨基酸。 MAPKKK 多肽的变体还可包括从植物细胞中分离实际存在的天 然变体或产生重组 MAPKKK。
     因此， 本发明所用的基因和多核苷酸包括天然存在的序列以及突变体形式。 同样， 本发明所用的蛋白包括天然存在的蛋白以及其变体和修饰的形式。 这样的变体会继续具有
     所需的 MAPKKK 活性。显然， 将在编码变体的 DNA 内所做的突变一定不能将该序列置于阅读 框外， 并且最好是， 不要产生可能产生 mRNA 二级结构的互补区。
     不希望本文包括的蛋白序列的缺失、 插入和取代对蛋白特征产生根本改变。 然而， 当在进行取代、 缺失或插入之前， 很难预先预测到这样做的精确效应时， 本领域技术人员应 当理解， 会通过常规筛选检测来评估所述效应。即， 活性和 / 或表达能通过凝胶激酶检测、 实时 RT-PCR 分析、 Northern、 Westerns、 电泳迁移率变动分析、 DNA 酶 I 足迹分析等来评 估 (Shou， et al.， (2004)J Exp Bot.55(399) ： 1013-9)。检测这种活性或表达试验是本领 域技术人员已知的。可选择地， 它们在本文其他地方有详细描述。例如， 长度为至少 15、 30、 50、 100、 200、 300、 400、 500、 600、 700、 800、 900 或 1000 个核苷酸并且在严紧条件下足以 与 MAPKKKmRNA 特异杂交的寡核苷酸， 可用于 Northern 印迹分析。MAPKKK 蛋白可以用能结 合本发明 MAPKKKs 蛋白的标记抗体检测。抗体可以是多克隆的或更优选单克隆的。分离 的 MAPKKK 蛋白或其片段能用作， 利用多克隆和单克隆抗体制备的标准技术产生与本发明 的 MAPKKK 特异性结合的抗体的免疫原。检测 MAPKKK 蛋白的技术包括酶联免疫吸附测定 (ELISAs)、 Western 印迹、 免疫沉淀和免疫荧光。
     变异的多核苷酸和蛋白还包括源于诸如 DNA 改组的致突变和致重组方法的序列 和蛋白。用这种方法， 能操作一个或多个不同的 MAPKKK 编码序列， 产生具有所需的特性的 新 MAPKKK。用这种方式， 从许多有关多核苷酸序列产生重组多核苷酸文库， 所述有关多核 苷酸序列包含具有实质性序列同一性并且能在体外或体内同源重组的序列区。例如， 用该 方法， 编码感兴趣的结构域的序列基元可以在本发明的 MAPKKK 基因和其他已知的 MAPKKK 基因间改组， 获得编码感兴趣特性改善的蛋白的新基因， 例如， 就酶而言， Km 增加。用于这 类 DNA 改组的策略在本领域内是已知的。参见， 例如， Stemmer， (1995)Proc.Natl.Acad. Sci.USA91 ： 10757-10751 ； Stemmer， (1995)Nature 370 ： 389-391 ； Crameri， et al.， (1997) Nature Biotech.15 ： 536-538 ； Moore， et al.， (1997)J.Mol.Biol.272 ： 336-357 ； Zhang， et al.， (1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95 ： 5505-5509 ； Crameri， et al.， (1998)Nature 391 ： 288-291 和美国专利第 5,605,793 和 5,837,558 号。
     本发明所用的多核苷酸能用来从其他有机体， 尤其是其他植物， 更尤其是其他单 子叶植物中分离相应的序列。以此方式， 诸如 PCR、 杂交等的方法能用来基于上述序列和本 文所示序列的同源性， 鉴定这些序列。本发明包括基于与 SEQ ID NO ： 1、 4、 7 或 9 所示的完 全 MAPKKK 序列或与其变体或片段的序列同一性而分离的序列。这些序列包括是所公开的 序列的直系同源物的序列。 “直系同源物” 意图表示源于共同祖先基因并且作为物种形成 的结果见于不同物种中的基因。当其核苷酸序列和 / 或其编码的蛋白序列共有至少 60％、 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 91％、 92％、 93％、 95％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％或更高的 序列同一性时， 认为见于不同物种中的基因是直系同源物。直系同源物功能在物种间通常 是高度保守的。因此， 编码 MAPKKK 蛋白且在严紧条件下与 SEQ ID NO ： 1、 4、 7 或 9 的序列或 与其互补物、 变体或其片段杂交的分离的多核苷酸， 包括在本发明中。
     在 PCR 方法中， 可设计用于 PCR 反应中的寡核苷酸引物， 以便由从感兴趣的任何植 物中提取的 cDNA 或基因组 DNA 扩增相应的 DNA 序列。 设计 PCR 引物和 PCR 克隆的方法通常 是本领域已知的， 并且公开于 Sambrook， et al.， (1989)Molecular Cloning ： A Laboratory Manual( 分子克隆 ： 实验室操作手册 )(2d ed.， Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview， New York)。还可参见 Innis， et al.， eds.(1990)PCR Protocols ： A Guide to metheds and Applications(PCR 方法 ： 方法和应用指导 )(Academic Press， New York) ； Innis and Gelfand， eds.(1995)PCR Strategies(PCR 策略 )(Academic Press， New York) 和 Innis and Gelfand， eds.(1999)PCR methods Manual(PCR 方法手册 )(Academic Press， New York)。已知的 PCR 方法包括但不限于， 用配对引物、 巢式引物、 单特异性引物、 简并引 物、 基因特异引物、 载体特异引物、 部分错配的引物等的方法。
     在杂交技术中， 所有或部分已知多核苷酸用作与存在于来自所选的有机体的很多 克隆基因组 DNA 片段或 cDNA 片段 ( 即， 基因组或 cDNA 文库 ) 中的其他相应的多核苷酸 选择性杂交的探针。所述杂交探针可以是基因组 DNA 片段、 cDNA 片段、 RNA 片段或其他寡 核苷酸， 并且可用诸如 32p 的可检测基团或另一可检测标记进行标记。因此， 例如， 杂交探 针能通过标记根据本发明 MAPKKK 多核苷酸合成的寡核苷酸来制备。制备杂交探针和构 建 cDNA 和基因组文库的方法通常是本领域已知的， 并且公开于 Sambrook， et al.， (1989) Molecular Cloning ： A Laboratory Manual( 分子克隆 ： 实验室操作手册 )(2d ed.， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Plainview， New York)。
     例如， 本文公开的完全的 MAPKKK 多核苷酸， 或其一个部分或多个部分， 可以用作 能和相应的 MAPKKK 多核苷酸和信使 RNA 特异杂交的探针。为了在各种条件下实现特异 杂交， 这种探针包括下述序列， 其在 MAPKKK 多核苷酸序列中是唯一的并且长度最好是至少 约 10 个核苷酸， 并且长度再最好是至少约 20 个核苷酸。这种探针可以用来通过 PCR 从所 选的植物中扩增相应的 MAPKKK 多核苷酸。该技术可以用来从所需的植物中分离其他编码 序列或用作确定植物中编码序列存在的诊断检测。杂交技术包括平板 DNA 文库 (plated DNA library) 的杂交筛选 ( 噬斑或集落 ； 参见， 例如， Sambrook， et al.， (1989)Molecular Cloning ： A Laboratory Manual( 分 子 克 隆 ： 实 验 室 操 作 手 册 )(2d ed.， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Plainview， New York)。
     这些序列的杂交可以在严紧条件下进行。 “严紧条件” 或 “严紧杂交条件” 意即， 在 该条件下， 探针与其靶标序列杂交的程度， 可检测地大于与其他序列杂交的的程度 ( 例如， 至少高于背景两倍 )。严紧条件是序列依赖性的， 并且在不同的环境中是不同的。通过控 制杂交和 / 或洗脱条件的严紧性， 能鉴定与探针 100％互补的靶标序列 ( 同源探针 )。可选 择地， 能调整严紧性条件， 以允许序列中的一些错配， 以便检测较低程度的相似性 ( 异源探 针 )。通常， 探针的长度少于约 1000 个核苷酸， 长度最好少于 500 个核苷酸。
     通常， 严紧条件为这样的条件， 在该条件中， 盐浓度约少于 1.5M Na 离子， 通常约 0.01 到 1.0M Na 离子浓度 ( 或其他的盐 )， pH 为 7.0 到 8.3 并且对于短探针 ( 例如， 10 到 50 个核苷酸 )， 温度至少约为 30℃， 且对于长探针 ( 例如， 长于 50 个核苷酸 )， 至少约为 60℃。 严紧条件也可以通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。示例性的低严紧性条件包括在 37℃用 30％ -35％的甲酰胺、 1M NaCl、 1％ SDS( 十二烷基硫酸钠 ) 的缓冲液杂交， 并且于 50-55℃下在 1X 到 2X SSC(20X SSC ＝ 3.0M NaCl/0.3M 柠檬酸三钠 ) 中洗涤。示例性的中 度严紧性条件包括于 37℃在 50-55％的甲酰胺、 1.0M NaCl、 1％ SDS 中杂交， 并且于 55-60℃ 在 0.5X 到 1X SSC 中洗涤。 示例性的高严紧性条件包括于 37℃在 50％甲酰胺、 1M NaCl、 1％ SDS 中杂交， 并且于 60-65℃在 0.1X SSC 中洗涤。任选地， 洗涤缓冲液可以包含约 0.1％到 约 1％的 SDS。杂交的持续时间通常少于约 25 小时， 通常约 5 到约 12 小时。洗涤的持续时间为至少足以达到平衡的时间长度。特异性通常是杂交后洗涤的功能， 决定性因素是离子 强度和最后洗涤溶液的温度。对于 DNA-DNA 杂合物， Tm 能根据 Meinkoth and Wahl(1985) Anal.Biochem.138 ： 267-285 的 方 程 式 近 似 计 算 ： Tm ＝ 81.5 ℃ +16.6(logM)+0.51( ％ GC)-0.61(％ form)-500/L ； 其中， M 是单价阳离子的摩尔浓度，％ GC 是 DNA 中鸟苷和胞嘧 啶核苷酸的百分比，％ form 是杂交溶液中甲酰胺的百分比， 且 L 是碱基对中杂合物地方 长度。Tm 是 50％的互补靶序列与完美匹配的探针杂交的温度 ( 在确定的离子强度和 pH 值 下 )。每错配 1％， Tm 约降低 1℃ ； 因此， 能调整 Tm、 杂交和 / 或洗涤条件以与期望的同一性 的序列杂交。例如， 如果寻找有≥ 90％同一性的序列， 能将 Tm 减小 10℃。通常， 选用的严 紧条件比特异序列和其互补物在确定的离子强度和 pH 下的热解链点 (thermal melting point， Tm) 低约 5℃。然而， 严格的严紧条件能在比热解链点 (Tm) 低 1、 2、 3 或 5℃时使用 杂交和 / 或洗涤 ； 适度的严紧条件能在比热解链点 (Tm) 低 6、 7、 8、 9 或 10℃时使用杂交和 / 或洗涤 ； 低的严紧性条件能在比热解链点 (Tm) 低 11、 12、 13、 15、 15 或 20℃时使用杂交和 / 或洗涤。利用上述方程、 杂交和洗涤组合物以及期望的 Tm， 本领域技术人员应当理解， 所 述严紧性杂交和 / 或洗脱液的变化是固有的。如果期望的错配程度导致 Tm 少于 55℃ ( 水 溶液 ) 或 32 ℃ ( 甲酰胺溶液 )， 最好增加 SSC 浓度以便能使用更高的温度。有关多核苷 酸杂交的广泛指导参见 Tijssen， (1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes( 生化和分子生物学实 验技术 - 核酸探针杂交 )， Part I， Chapter 2(Elsevier， New York) 和 Ausubel， et al.， eds.(1995)Current Protocols in Molecular Biology( 当代分子生物学操作 )Chapter 2(Greene Publishing and Wiley-Interscience， New York)。参见 Sambrook， et al.， (1989)Molecular Cloning ： A Laboratory Manual( 分子克隆 ： 实验手册 )(2d ed.， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Plainview， New York)。
     下述术语用来描述两条或多条多核苷酸或多肽之间的序列关系 ： (a) “参考序列” ， (b)“比较窗” (c)“序列同一性” 和 (d)“序列同一性百分比” 。
     (a) 如本文所用的， “参考序列” 是用作序列比较基础的确定序列。参考序列可以 是指定序列的子集或全部 ； 例如， 作为全长 cDNA 或基因序列的片段， 或完全的 cDNA 或基因 序列。
     (b) 如本文所用的， “比较窗” 涉及多核苷酸序列的连续且指定的片段， 其中， 所述 比较窗中的多核苷酸序列与所述参照序列 ( 其不包含添加或缺失 ) 相比可以包含添加或缺 失 ( 即， 空位 )， 用于对这两条多核苷酸进行最佳比对。通常， 所述比较窗的长度至少为 20 个连续核苷酸， 并且任择地可以是 30 个、 50 个、 100 个或更长。本领域技术人员应当理解， 为了避免由于所述多核苷酸序列含有空位而导致的与参照序列的高相似性， 通常引入空位 罚分， 并将其从匹配数中扣除。
     用于比较的序列比对方法在本领域内是已知的。因此， 用数学算法能完成任何两 条序列间序列同一性百分比的确定。这种数学算法的非限制性实例为 Myers and Miller， (1988)CABIOS 5 ： 11-17 的算法 ； Smith， et al.， (1981)Adv.Appl.Math.2 ： 582 的局部比对 算法 ； Needleman and Wunsch， (1970)J.Mol.Biol.58 ： 553-553 的全局比对算法 ； Pearson and Lipman， (1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85 ： 2555-2558 的搜索局部比对算法 ； 在 Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 ： 5873-5877 中做了改进的 Karlin andAltschul， (1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872265 的算法。
     可以使用计算机执行这些数学算法来比较序列以确定序列同一性。 这些执行程序 包括但不限于 ： PC/Gene 程序中的 CLUSTAL( 可从 Intelligenetics 获得， Mountain View， California) ； ALIGN 程序 ( 版本 2.0) 和 GAP、 BESTFIT、 BLAST、 FASTA 和 TFASTA Accelrys GCG (Accelrys Inc.， 9685 Scranton Road， San Diego， California， USA)。 用 默 认 的参数， 能实施使用这些程序的比对。CLUSTAL 程序在 Higgins， et al.， (1988)Gene73 ： 237-255(1988)、 Higgins， et al.， (1989)CABIOS 5 ： 151-153、 Corpet， et al.， (1988) Nucleic Acids Res.16 ： 10881-90、 Huang， et al.， (1992)CABIOS8 ： 155-65 以及 Pearson， et al.， (1995)Meth.Mol.Biol.25 ： 307-331 中有很好的描述。ALIGN 程序以 Myers and Miller， (1988， 同上 ) 的算法为基础。当比较氨基酸序列时， PAM120 权重残基表、 空位长度 罚分 12 和空位罚分 5 能与 ALIGN 程序一起使用。 Altschul， et al.， (1990)J.Mol.Biol.215 ： 503 的 BLAST 程序以 Karlin and Altschul(1990， 同上 ) 的算法为基础。可用 BLASTN 程序 实施 BLAST 核苷酸搜索， 评分＝ 100， 字长＝ 12， 来获得与编码本发明蛋白的核苷酸序列同 源的核苷酸序列。可用 BLASTX 程序实施 BLAST 蛋白搜索， 评分＝ 50， 字长＝ 3， 来获得与本 发明蛋白或多肽同源的氨基酸序列。 为了获得比较目的的空位比对， 能使用如 Altschul et al.， (1997)Nucleic Acids Res.25 ： 3389 所述的 Gapped BLAST( 在 BLAST 2.0 中 )。可选 择地， PSI-BLAST( 在 BLAST 2.0 中 ) 能用来实施检测分子间远源关系的迭代搜索。参见， Altschul et al.， (1997， 同上 )。当使用 BLAST、 Gapped BLAST、 PSI-BLAST 时， 可用各程 序 ( 例如， 核苷酸序列的 BLASTN， 蛋白的 BLASTX) 的默认参数。美国生物技术信息国家中 心 (The United States’ National Center for Biotechnology Information) 和欧洲分子 生物学实验室的欧洲生物信息研究所 (the European Bioinformatics Institute of the European Molecular Biology Laboratory) 提供这些工具， 如同本领域技术人员已知的各 种商业实体所做的。还可以通过检查手工实施比对。
     除非另有说明， 本文提供的序列同一性 / 相似性值是指用 GAP Version10 利用 下述参数获得的 ： 核苷酸序列的同一性％和相似性％使用 GAP Weight( 空位权重 ) 为 50、 Length Weight( 长度权重 ) 为 3， 及 nwsgapdna.cmp 评分矩阵 ； 氨基酸序列的同一性％和相 似性％使用 GAP Weight 为 8、 Length Weight 为 2， 及 BLOSUM62 评分矩阵。
     GAP 用 Needleman and Wunsch， (1970)J.Mol.Biol.58 ： 553-553 的算法， 来寻找两 条全序列的比对， 该比对使配对数最大化并使空位数最小化。 GAP 考虑所有可能的比对和空 位位置并且用最大数量配对碱基和最少的空位产生比对。 其允许在配对碱基单元中提供空 位产生罚分和空位延伸罚分。GAP 必需利用其插入的每一个空位。如果选择的空位延伸罚 分大于 0， 那么对于插入的每个空位， GAP 必需另外地利用空位长度乘以空位延伸罚分。对 于蛋白序列而言， 第 10 版的 GCG WisconsinGenetics Software Package 默认的空位 产生罚分值和空位延伸罚分值， 分别为 8 和 2。对于核苷酸序列而言， 默认的空位产生罚分 是 50， 而默认的空位延伸罚分值是 3。空位产生罚分和空位延伸罚分可以表示为选自整数 0-200 的整数。因此， 例如， 空位产生罚分和空位延伸罚分可以是 0、 1、 2、 3、 5、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 50、 55、 50、 55、 60、 65 或更大。
     (c) 如本文所使用的， 两条多核苷酸或多肽序列情形下的 “序列同一性” 或 “同一 性” 涉及所述两条序列中的残基， 当处于最大一致性而比对时， 所述残基在指定的比较窗内是相同的。当使用的序列同一性百分比涉及蛋白时， 应当认为， 不相同的残基位置经常由 于保守氨基酸取代而不同， 其中， 用氨基酸残基取代具有相似化学特性 ( 例如， 电荷或疏水 性 ) 的其他氨基酸残基， 并且因此没有改变所述分子的功能特性。当序列中的保守取代不 同时， 可向上调整序列同一性百分比来纠正取代的保守性质。认为由于这种保守取代而不 同的序列具有 “序列相似性” 或相似性 “。 进行这种调整的方法是本领域技术人员公知的。 通 常这涉及将保守取代评分为部分错配而不是全部错配， 由此增加序列同一性百分比。 因此， 例如， 如果给予相同氨基酸的评分为 1， 给予非保守取代的评分为 0， 则给予保守取代的评 分在 0 和 1 之间。 例如， 按照 PC/ 基因程序 (Intelligenetics， Mountain View， California) 中所执行， 计算保守取代评分。
     (d) 如本文所用的， “序列同一性百分比” 表示通过在比较窗内比较两个最佳比对 序列所确定的值， 其中， 比较窗中的部分多核苷酸序列与参照序列 ( 不包含添加或缺失 ) 相 比可以包含添加或缺失 ( 即， 空位 )， 用于对这个两条序列进行最佳比对。通过确定两条序 列中存在相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数量来产生配对位置数， 以比较窗中的位置总 数除配对位置数， 并且将结果乘以 100 以产生序列同一性的百分比， 来计算百分比。
     “分离的” 或 “纯化的” 多核苷酸或蛋白或其生物活性部分， 实质上或基本上不含在 其天然存在的环境中所发现的组分， 该组分通常伴随该多核苷酸或蛋白或与之相互作用。 因此， 当用重组技术产生时， 分离的或纯化的多核苷酸或蛋白实质上不含其他细胞材料或 培养基， 或者当化学合成时， 实质上不含化学前体或其他化学品。最佳地， “分离的” 多核苷 酸不含在该多核苷酸来源的生物的基因组 DNA 中天然地位于多核苷酸侧翼的序列 ( 即， 位 于多核苷酸 5′和 3′端的序列 )( 最佳的是蛋白编码序列 )。 例如， 在各种实施方案中， 分离 的多核苷酸含有少于约 5kb、 5kb、 3kb、 2kb、 1kb、 0.5kb 或 0.1kb 的核苷酸序列， 所述核苷酸 序列在该多核苷酸来源的细胞中的基因组 DNA 中天然位于该多核苷酸的侧翼。实质上不含 细胞材料的蛋白包括具有少于约 30％、 20％、 10％、 5％或 1％ ( 干重 ) 的污染蛋白的蛋白制 剂。当本发明的蛋白或其生物活性部分是重组产生的时， 最佳地， 培养基代表少于约 30％、 20％、 10％、 5％或 1％ ( 干重 ) 的化学前体或非感兴趣蛋白的化学品。
     方法
     I. 提供序列
     本发明序列能在宿主细胞中引入 / 表达， 所述宿主细胞， 例如细菌、 酵母、 昆虫、 哺 乳动物或最佳为植物细胞。可以预期， 本领域技术人员了解很多用来将本发明多肽或核苷 酸序列引入宿主细胞的系统。 没有试图详细描述已知用来将蛋白提供于原核生物或真核生 物中的各种方法。
     “宿主细胞” 表示包含本发明异源多核苷酸序列的细胞。宿主细胞可以是原核细 胞， 例如， 大肠杆菌 (E.coli) 或真核细胞， 例如， 酵母、 昆虫、 两栖动物或哺乳动物细胞。宿 主细胞还可以是单子叶或双子叶植物细胞。在一个实施方案中， 所述单子叶宿主细胞是玉 米宿主细胞。
     使用术语 “多核苷酸” 并非意图将本发明限制为包括 DNA 的多核苷酸。本领域技术 人员应当认识到， 多核苷酸可以包括核糖核苷酸和核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的组合。 这类脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括自然存在的分子和合成的类似物。 本发明的多核苷 酸还包括所有的序列形式， 包括但不限于， 单链形式、 双链形式、 发夹、 茎环结构等。本发明所用的 MAPKKK 多核苷酸能提供于表达盒中， 用于在感兴趣的植物中表达。 所述表达盒包括可操作地连接于 MAPKKK 多核苷酸的 5′和 3′调节序列。 “可操作地连接” 意图表示两个或多个元件间的功能连接。例如， 感兴趣的多核苷酸和启动子之间的可操作 连接是允许所述感兴趣的多核苷酸表达的功能连接。 可操作地连接的元件可以是连续的或 非连续的。 当用来表示两个蛋白编码区的连接时， 可操作地连接表示， 编码区位于同一个阅 读框中。 所述表达盒可以另外含有至少一个可以共转化进有机体中的其他基因。 可选择地， 所述其他基因能提供于多种表达盒中。提供的这种表达盒带有用于将 MAPKKK 多核苷酸插 入以便受调节区的转录调控的多个限制位点和 / 或重组位点。所述表达盒还可以另外含有 选择标记基因。
     表达盒在 5′ -3′转录方向上包括， 在植物中有功能的转录和翻译起始区 ( 即， 启 动子 )、 本发明的 MAPKKK 多核苷酸和转录和翻译终止区 ( 即终止区 )。调节区 ( 包括启动 子、 转录调节区和翻译终止区 ) 和 / 或本发明的 MAPKKK 多核苷酸对宿主细胞和 / 或对彼此 可以是天然的 / 同源的。可选择地， 调节区和 / 或本发明的 MAPKKK 多核苷酸对宿主细胞和 / 或对彼此可以是外来的 / 异源的。如本文所使用的， 对于序列而言 “异源的” 是指来源于 其他物种的序列， 或如果来源于同一物种， 通过有意的人介入， 实质上由其天然形式在组成 和 / 或基因组基因座中进行了修饰。例如， 可操作地连接于异源多核苷酸的启动子， 来源于 与所述多核苷酸来源的物种不同的物种， 或， 如果来源于相同 / 类似的物种， 则一个或两个 都实质上由其原始形式和 / 或基因组基因座进行了修饰， 或所述启动子不是可操作地连接 的多核苷酸的天然启动子。如本文所使用的， 嵌合基因包含可操作连接于启动子的编码序 列， 所述启动子与所述编码序列是异源的。
     虽然用异源启动子表达序列是最佳的， 但是也可以用天然的启动子序列。这种构 建体能改变植物或植物细胞中 MAPKKK 的表达水平。因此， 能改变植物或植物细胞的表型。
     终止区可以与转录起始区是天然的， 可以与可操作地连接的感兴趣的 MAPKKK 多 核苷酸是天然的， 可以与植物宿主是天然的， 或相对启动子、 感兴趣的 MAPKKK 多核苷酸、 植 物宿主， 或其任意组合， 可以源于另一来源 ( 即， 外来的或异源的 )。 便利的终止区可从根瘤 农杆菌 (A.tumefaciens) 的 Ti 质粒获得， 例如羧乙基精氨酸合酶和胭脂氨酸合酶终止区。 还参见， Guerineau， et al.， (1991)Mol.Gen.Genet.262 ： 151-155 ； Proudfoot， (1991)Cell 65 ： 671-675 ； Sanfacon， et al.， (1991)Genes Dev.5 ： 151-159 ； Mogen， et al.， (1990)Plant Cell 2 ： 1261-1272 ； Munroe， et al.， (1990)Gene 91 ： 151-158 ； Ballas， et al.， (1989) Nucleic Acids Res.17 ： 7891-7903 和 Joshi， et al.， (1987)Nucleic Acids Res.15 ： 9627-9639。
     如果合适， 可以优化多核苷酸， 用于通过使用植物偏爱密码子增加在转化植物中 的表达。有关宿主偏爱密码子用法的讨论， 参见， 例如， Campbell and Gowri， (1990)Plant Physiol.92 ： 1-11。 合成植物偏爱基因的方法在本领域技术中是可以获得的。 参见， 例如， 美 国专利第 5,380,831 和 5,536,391 号， 以及 Murray， et al.， (1989)Nucleic Acids Res.17 ： 577-598， 上述文献通过引用并入本文。
     已知其他序列修饰增强细胞宿主中的基因表达， 这些包括除去编码假聚腺苷酸化 信号、 外显子 - 内含子剪接位点信号的序列、 转座子样重复和不利于基因表达的其他此类 充分表征的序列。序列的 G-C 含量可以调整至给定细胞宿主中的平均水平， 这可通过参考在所述宿主细胞中表达的已知基因来计算。可能的话， 修饰序列以避免可提前预知的发夹 二级 mRNA 结构。
     表达盒可以另外含有 5 ′前导序列。这种前导序列能起到增强翻译的作用。翻 译前导区在本领域内是已知的， 并且包括 ： 细小核糖核酸病毒前导区， 例如， EMCV 前导区 ( 脑心肌炎 5 ′非编码区 )(Elroy-Stein， et al.， (1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86 ： 6126-6130) ； 马铃薯 Y 病毒属前导区， 例如， TEV 前导区 ( 烟草蚀刻病毒 )(Gallie， et al.， (1995)Gene165(2) ： 233-238)， MDMV 前导区 ( 玉米矮花叶病毒 )(Virology 155 ： 9-20) 和人 免疫球蛋白重链结合蛋白 (BiP)(Macejak， et al.， (1991)Nature353 ： 90-95) ； 来自苜蓿花 叶病毒 (alfalfa mosaic virus) 的外壳蛋白 mRNA 的非翻译前导区 (AMV RNA 5)(Jobling， et al.， (1987)Nature 325 ： 622-625) ； 烟草花叶病毒前导区 (TMV)(Gallie， et al.， (1989) in Molecular Biology of RNA， ed.Cech(Liss， New York)， pp.237-256) 和玉米枯黄斑点病 毒前导区 (MCMV)(Lommel， et al.， (1991)Virology 81 ： 382-385)。还参见， Della-Cioppa， et al.， (1987)Plant Physiol.85 ： 965-968。还可以使用已知增强翻译的其他方法， 例如， 内含子等。
     在制备表达盒时， 可以操作各种 DNA 片段， 以便将 DNA 序列提供于正确的方向上， 并且如果合适， 提供在正确的阅读框中。最后， 可以使用连接物或连接体连接 DNA 片段或可 以涉及其他的操作来提供便利的限制位点， 去除过多的 DNA， 去除限制位点等。 为此， 可以涉 及体外诱变、 引物修复、 限制、 退火、 再取代， 例如， 转换和颠换。
     表达盒还能包含选择转化的细胞的选择标记基因。选择标记基因用来选择转 化的细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因， 例如， 编码新霉素磷酸转移酶 II(NEO) 和潮霉素磷酸转移酶 (HPT) 的那些基因， 以及赋予对除草化合物抗性的基因， 例 如， 草铵磷 (glufosinate ammonium)、 溴苯腈， 咪唑啉酮类和 2， 5- 二氯苯氧乙酸盐 (2， 5-dichlorophenoxyacetate， 2， 5-D)。其他的选择标记包括表型标记， 例如， β- 半乳糖 苷酶和荧光蛋白， 例如， 绿色荧光蛋白 (GFP)(Su， et al.， (2005)Biotechnol Bioeng 85 ： 610-9 和 Fetter， et al.， (2005)Plant Cell 16 ： 215-28)， 青色荧光蛋白 (CYP)(Bolte， et al.， (2005)J.Cell Science 117 ： 953-55 和 Kato， et al.， (2002)Plant Physiol TM 129 ： 913-52) 和黄色荧光蛋白 (Evrogen 的 PhiYFP ， 参见 Bolte， et al.， (2005)J.Plant Science 117 ： 953-55)。对于其他的选择标记， 通常参见， Yarranton， (1992)Curr.Opin. Biotech.3 ： 506-511 ； Christopherson， et al.， (1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89 ： 6315-6318 ； Yao， et al.， (1992)Cell 71 ： 63-72 ； Reznikoff， (1992)Mol.Microbiol.6 ： 2519-2522 ； Barkley， et al.， (1980)in The Operon， pp.177-220 ； Hu， et al.， (1987) Cell58 ： 555-566 ； Brown ， et al. ， (1987)Cell 59 ： 603-612 ； Figge ， et al. ， (1988) Cell52 ： 713-722 ； Deuschle， et al.， (1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86 ： 5500-5505 ； Fuerst， et al.， (1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86 ： 2559-2553 ； Deuschle， et al.， (1990)Science 258 ： 580-583 ； Gossen， (1993)Ph.D.Thesis， University of Heidelberg ； Reines， et al.， (1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 ： 1917-1921 ； Labow， et al.， (1990) Mol.Cell.Biol.10 ： 3353-3356 ； Zambretti， et al.， (1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89 ： 3952-3956 ； Baim， et al.， (1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88 ： 5072-5076 ； Wyborski， et al.， (1991)Nucleic Acids Res.19 ： 5657-5653 ； Hillenand-Wissman， (1989)Topics Mol.Struc.Biol.10 ： 153-162 ； Degenkolb， et al.， (1991)Antimicrob.Agents Chemother.35 ： 1591-1595 ； Kleinschnidt， et al.， (1988)Biochemistry 27 ： 1095-1105 ； Bonin， (1993) Ph.D.Thesis， University of Heidelberg ； Gossen， et al.， (1992)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 89 ： 5557-5551 ； Oliva， et al.， (1992)Antimicrob.Agents Chemother.36 ： 913-919 ； Hlavka ，et al. ，(1985)Handbook of Experimental Pharmacology ， Vol.78(Springer-Verlag， Berlin) ； Gill， et al.， (1988)Nature335 ： 721-725。这些公开 通过引用并入本文。上述选择标记基因列表并非意图限制。本发明能使用任何选择标记基 因。
     很多启动子能用来实施本发明， 包括感兴趣的多核苷酸序列的天然启动子。所述 启动子能基于所需的结果来选择。 核酸能与组成型启动子、 组织优选启动子、 诱导型启动子 或其他启动子组合， 用于在植物中表达。
     这 类 组 成 型 启 动 子 包 括， 例 如， Rsyn7 启 动 子 的 核 心 启 动 子 和 WO99/53838 和 美国专利号第 6,072,050 号公开的其他组成型启动子 ； 核心 CaMV 35S 启动子 (Odell， et al.， (1985)Nature 313 ： 810-812) ； 水 稻 肌 动 蛋 白 (McElroy， et al.， (1990)Plant Cell 2 ： 163-171) ； 泛 素 (Christensen， et al.， (1989)Plant Mol.Biol.12 ： 619-632 和 Christensen， et al.， (1992)Plant Mol.Biol.18 ： 675-689) ； pEMU(Last， et al.， (1991) Theor.Appl.genet.81 ： 581-588) ； MAS(Velten， et al.， (1985)EMBO J.3 ： 2723-2730) ； ALS 启动子 ( 美国专利第 5,659,026 号 ) 等。其他组成型启动子包括， 例如， 美国专利 号 第 5,608,159、 5,608,155、 5,605,121、 5,569,597、 5,566,785、 5,399,680、 5,268,563、 5,608,152 和 6,177,611 号公开的那些启动子。
     组织优选启动子能用来在特定植物组织中靶向增强型 A RR 表达。 “组织优选” 意图表示表达在特定组织中占优势， 尽管并不必然排除其他组织。组织优选启动子包 括 Yamamoto， et al.， (1997)Plant J.12(2) ： 255-265 ； Kawamata， et al.， (1997)Plant Cell Physiol.38(7) ： 792-803 ； Hansen， et al.， (1997)Mol.Gengenet.255(3) ： 337-353 ； Russell， et al.， (1997)Transgenic Res.6(2) ： 157-168 ； Rinehart， et al.， (1996)Plant Physiol.112(3) ： 1331-1351 ； Van Camp， et al.， (1996)Plant Physiol.112(2) ： 525-535 ； Canevascini et al.(1996)Plant Physiol.112(2) ： 513-525 ； Yamamoto， et al.， (1995) Plant Cell Physiol.35(5) ： 773-778 ； Lam， (1995)Results Probl.Cell Differ.20 ： 181-196 ； Orozco， et al.， (1993)Plant Mol Biol.23(6) ： 1129-1138 ； Matsuoka， et al.， (1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90(20) ： 9586-9590 和 Guevara-Garcia， et al.， (1993) Plant J.5(3) ： 595-505。如果有必要， 这些启动子能被改造为弱表达。还参见美国专利申 请公开号 2003/0074698， 通过引用并入本文。
     叶优选启动子在本领域内是已知的。参见， 例如， Yamamoto， et al.， (1997)Plant J.12(2) ： 255-265 ； Kwon， et al.， (1995)Plant Physiol.105 ： 357-67 ； Yamamoto， et al.， (1995)Plant Cell Physiol.35(5) ： 773-778 ； Gotor， et al.， (1993)Plant J.3 ： 509-18 ； Orozco， et al.， (1993)Plant Mol.Biol.23(6) ： 1129-1138 ； Baszczynski， et al.， (1988) Nucl.Acid Res.16 ： 5732 ； Mitra， et al.， (1995)Plant Molecular Biology 26 ： 35-93 ； Kayaya， et al.， (1995)Molecular and general genetics 258 ： 668-675 和 Matsuoka， et al.， (1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20) ： 9586-9590。也可以用衰老调节启动子， 例如， SAM22(Crowell， et al.， (1992)Plant Mol.Biol.18 ： 559-566)。还参见美国专利第 5,589,052 号， 将其通过引用并入本文。
     枝条优选启动子包括， 枝条分生组织优选启动子， 例如， Weigal， et al.， (1992) Cell 69 ： 853-859 公开的启动子 ； 登录号 AJ131822 ； 登录号 Z71981 ； 登录号 AF059870， ZAP 启动子 ( 美国专利申请系列第 10/387,937 号 )， 玉米 tb1 启动子 (Wang， et al.， (1999) Nature 398 ： 236-239 和 McAvoy， et al(2003)Acta Hort.(ISHS)625 ： 379-385 所公开的枝 条优选启动子。
     根优选启动子是已知的并且能选自很多可得到的文献或由多种相容物种重新分 离。参见， 例如， Hire， et al.， (1992)Plant Mol.Biol.20(2) ： 207-218( 大豆根特异的谷 氨酰胺合成酶基因 ) ； Keller and Baumgartner， (1991)Plant Cell 3(10) ： 1051-1061( 四 季豆 (French bean) 的 GRP 1.8 基因中的根特异性控制元件 ) ； Sanger， et al.， (1990) Plant Mol.Biol.15(3) ： 533-553( 根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) 的甘露碱合 酶 (MAS) 基因的根特异性启动子 ) 和 Miao， et al.， (1991)Plant Cell 3(1) ： 11-22( 编码胞 液谷氨酰胺合成酶 (GS) 的全长 cDNA 克隆， 其在大豆根和根瘤中表达 )。还参见 Bogusz， et al.， (1990)Plant Cell 2(7) ： 633-651， 其中描述了从来自固氮的非豆科植物 Parasponia andersonii 和相关的非固氮非豆科植物山黄麻 (Trema tomentosa) 的血红蛋白基因中分 离的两个根特异性启动子。这些基因的启动子连接于 β- 葡萄糖苷酸酶报告基因上， 并且 引入非豆科植物烟草 (Nicotiana tabacum) 和豆科植物百脉根 (Lotus corniculatus) 中， 并且这两种情况下， 根特异性启动子活性都得以保留。Leach and Aoyagi(1991) 描述了其 对毛根农杆菌 (Agrobacterium rhizogenes) 的高表达的 rolC 和 rolD 根诱导基因的启动子 的分析。( 参见， Plant Science(Limerick)79(1) ： 69-76)。他们推断， 增强子和组织优选 的 DNA 决定子在那些启动子中是解离的。Teeri， et al.， (1989) 使用与 lacZ 的基因融合 物表明， 编码章鱼碱合酶的农杆菌 T-DNA 基因在根尖的表皮中尤其具有活性， 并且 TR2′基 因在完整的植物中是根特异性的， 并受叶组织的创伤刺激， 它们是特别期望的特征组合， 用 于与杀虫或杀幼虫基因一起使用 ( 参见 EMBO J.8(2) ： 343-350)。与 nptII( 新霉素磷酸转 移酶 II) 融合的 TR1′基因显示了类似的性质。其他根优选启动子包括 VfENOD-GRP3 基因 启动子 (Kuster， et al.， (1995)Plant Mol.Biol.29(4) ： 759-772) ； rolB 启动子 (Capana， et al.， (1994)Plant Mol.Biol.25(4) ： 681-691 ； 以及带有 ADH 第一内含子的 CRWAQ81 根 优选启动子 ( 美国临时专利申请系列号 60/509,878， 提交于 2003 年 10 月 9 日， 通过引用 并入本文 )。还参见美国专利第 5,837,876、 5,750,386、 5,633,363、 5,559,252、 5,501,836、 5,110,732 和 5,023,179 号。
     “种子优选” 启动子包括 “种子特异性” 启动子 ( 仅在种子组织中有活性的那些启 动子， 例如， 种子储藏蛋白的启动子 )。种子优选启动子包括那些在授粉前或后有活性的那 些启动子， 或不依赖于授粉而有活性的那些启动子。这种种子优选启动子包括， 但不限于， Cim1( 细胞分裂素诱导的信使 ) ； cZ19B1( 玉米的 19kDa 玉米醇溶蛋白 ) ； milps( 肌醇 -1- 磷 酸合酶 )( 参见 WO 00/11177 和美国专利第 6,225,529 号 ； 通过引用并入本文 ) ； PCNA2( 美 国专利申请系列号 10/388,359， 提交于 2003 年 3 月 13 日 ) 和 CKX1-2( 美国专利申请公开 号 2002/0152500)。γ- 玉米醇溶蛋白是胚乳特异性启动子。球蛋白 -1(Glob-1) 是有代 表性的胚特异性启动子。对于双子叶植物而言， 种子特异性启动子包括但不限于， 豆 β- 菜豆蛋白、 油菜籽蛋白 (napin)、 β- 伴大豆球蛋白、 大豆凝集素、 十字花科蛋白 (cruciferin) 等。对于单子叶植物而言， 种子特异性启动子包括但不限于， 玉米 15kDa 玉米醇溶蛋白、 22kDa 玉米醇溶蛋白、 27kDa 玉米醇溶蛋白、 γ- 玉米醇溶蛋白、 waxy、 shrunken 1、 shrunken 2、 球蛋白 1 等。还参见， WO 00/12733， 其中公开了源于 end1 和 end2 基因的种子优选启动 子， 和 WO 01/21783 和美国专利第 6,403,862 号， 其中公开了 Zm40 启动子 ； 两个都通过引 用并入本文。胚特异性启动子包括 ESR( 美国专利申请公开号 2004/0210960) 和 lec1( 美 国专利申请系列号 09/718,754， 提交于 2000 年 11 月 22 日 )。其他胚特异性启动子公开于 Sato et al.， (1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93 ： 8117-8122 ； Nakase， et al.， (1997)Plant J 12 ： 235-56 和 Postma-Haarsma， et al.， (1999)Plant Mol.Biol.39 ： 257-71 中。胚乳优 选启动子包括美国专利申请公开号 2004/0237147 中公开的 eep1 和 eep2。其他胚乳特异 性启动子公开于 Albani et al.， (1985)EMBO 3 ： 1505-15 ； Albani， et al.， (1999)Theor. Appl.Gen.98 ： 1253-62 ； Albani， et al.， (1993)Plant J.5 ： 353-55 ； Mena， et al.， (1998) The Plant Journal 116 ： 53-62 和 Wu， et al.， (1998)Plant CellPhysiology 39 ： 885-889 中。感兴趣的还有玉米 eep5 启动子 ( 如， 参见 SEQ ID NO ： 20)。在玉米中， 还可以使用未 成熟的穗组织优选启动子 ； 例如， ADF4 启动子 ( 美国专利申请公开号 2009/0094713)。 分裂细胞或分生组织组织优选启动子已经公开于 Ito et al.， (1995)Plant Mol. Biol.25 ： 863-878 ； Reyad， et al.， (1995)Mol.Gen.genet.258 ： 703-711 ； Shaul， et al.， (1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93 ： 5868-5872 ； Ito， et al.， (1997)Plant J.11 ： 983-992 ； Trehin， et al.， (1997)Plant Molecular Biology35 ： 667-672 ； 玉 米 的 Zag1(Schmidt， et al.， (1993)The Plant Cell 5 ： 729-37) 和 Zag2(Theissen， et al.， (1995)gene 156 ： 155-166)GenBank 登 录 号 X80206 和 Hubbard， et al.， (2002)genetics 162 ： 1927-1935 中， 所有的这些文献都通过引用并入本文。某些启动子在萌芽时间内是有活性的 ； 参见， Thompson， et al.， (1989)BioEssays 10 ： 108。
     花序优选启动子包括查耳酮合酶的启动子 (Van der Meer， et al.， (1990)Plant Mol.Biol.15 ： 95-109)、 LAT52(Twell， et al.， (1989)Mol.Gen.genet.217 ： 250-255)、 花粉 特异性基因 (Albani， et al.， (1990)plant Mol Biol.15 ： 605， Zm13(Buerrero， et al.， (1993)Mol.Gen.genet.225 ： 161-168)、 玉米花粉特异性基因 (Hamilton， et al.， (1992) Plant Mol.Biol.18 ： 211-218)、 向日葵花粉表达的基因 (Baltz， et al.， (1992)The Plant Journal 2 ： 713-721)、 欧洲油菜 (B.Napus) 花粉特异性基因 (Arnoldo， et al.， (1992) J.Cell.Biochem， Abstract Number( 摘要号 )Y101205)。也可以使用未成熟的穗组织优选 启动子。
     胁迫诱导启动子包括盐 / 水胁迫诱导启动子， 例如 P5CS(Zang， et al.， (1997) Plant Sciences 129 ： 81-89) ； 寒冷诱导启动子， 例如， cor15a(Hajela， et al.， (1990) Plant Physiol.93 ： 1256-1252)， cor15b(Wilhelm， et al.， (1993)Plant Mol Biol 23 ： 1073-1077)， wsc120(Ouellet， et al.， (1998)FEBS Lett.523 ： 325-328)， ci7(Kirch， et al.， (1997)Plant Mol Biol.33 ： 897-909)， ci21A(Schneider， et al.， (1997)Plant Physiol.113 ： 335-55) ； 和 MLIP15( 美 国 专 利 第 6,479,734 号 ) 干 旱 诱 导 启 动 子， 例 如， Trg-31(Chaudhary， et al.， (1996)Plant Mol.Biol.30 ： 1257-57)， rd29(Kasuga， et al.， (1999)Nature Biotechnology 18 ： 287-291) ； 渗透诱导启动子， 例如， Rab17(Vilardell， et
     al.， (1991)Plant Mol.Biol.17 ： 985-93 ； 还参见 SEQ ID NO ： 18)， 还有脱落酸和渗压素诱导 的 (Raghothama， et al.， (1993)Plant Mol Biol 23 ： 1117-28) 和热诱导的启动子， 例如， 热休克蛋白 (Barros， et al.， (1992)Plant Mol.19 ： 665-75 ； Marrs， et al.， (1993)Dev. genet.15 ： 27-51)， 衰老诱导启动子， 例如， SEE1(GB_AJ494982) 和 smHSP(Waters， et al.， (1996)J.Experimental Botany57 ： 325-338)。其他胁迫诱导启动子包括 rip2( 美国专利 第 5,332,808 和 7,074,985 号 ) 和 RD29A(Yamaguchi-Shinozaki， et al.， (1993)Mol.Gen. genetics 236 ： 331-340 ； 还参见 SEQ ID NO ： 19)。
     氮应答启动子也可以用于本发明的方法。这类启动子包括， 但不限于， 22kDa 玉米 醇溶蛋白启动子 (Spena， et al.， (1982)EMBO J 1 ： 1589-1594 和 Muller， et al.， (1995) J.Plant Physiol 145 ： 606-613) ； 19kDa 玉米醇溶蛋白启动子 (Pedersen， et al.， (1982) Cell 29 ： 1019-1025) ； 14kDa 玉 米 醇 溶 蛋 白 启 动 子 (Pedersen， et al.， (1986)J.Biol. Chem.261 ： 6279-6284)， b-32 启动子 (Lohmer， et al.， (1991)EMBO J 10 ： 617-624) 和亚 硝酸盐还原酶 (NiR) 启动子 (Rastogi， et al.， (1997)Plant Mol Biol.34(3) ： 465-76 和 Sander， et al.， (1995)Plant Mol Biol.27(1) ： 165-77)。有关在氮诱导的启动子中发现 的共有序列的综述， 参见例如， Muller， et al.， (1997)The Plant Journal 12 ： 281-291。
     其他有用的启动子包括 F3.7( 美国专利第 5,850,018 号 ) 和玉米硫氧还蛋白 H 启 动子 (Nu， et al.， MGCNL 2004 ； 美国临时专利申请系列号 60/514,123)。启动子可以没有 落入上述组， 落入上述组中的一个或多个， 并且就其组织特异性或时机或其他特征而言， 或 就这些特征的结合而言， 可以用在本发明中。
     此外， 构建体可以包含调节以及引起表达的控制区。 通常， 依照很多通常实施的程 序， 这些区域通过控制转录施加影响， 如转录因子， 阻遏物结合位点和终止信号等。为了将 翻译的蛋白分泌进内质网腔， 分泌进壁膜间隙或分泌进细胞外环境， 可以将合适的分泌信 号并入表达的多肽中。这些信号对多肽而言可以是内源的 ； 或它们可以是异源信号。
     高等真核生物对编码本发明多肽的 DNA 的转录， 可以通过将增强子序列插入载体 来增强。增强子是 DNA 的顺式元件， 通常约 10-300bp， 其作用是， 在给定宿主细胞类型中， 增强启动子的转录活性。增强子的实例包括 SV40 增强子， 其位于复制起点近侧 100-270bp 处， 巨细胞病毒早期启动子增强子， 复制原点近侧的多瘤病毒增强子和腺病毒增强子。 可用 于本发明中增加引入的 DNA 片段转录的其他增强子， 包括， 特别是像那些 35S 启动子内增强 子的病毒增强子， 其由 Odell， et al.， (1988)Plant Mol.Biol.10 ： 263-72 展示， 和 Fromm， et al.， (1989)Plant Cell 1 ： 977 描述的来自冠缨碱基因的增强子。增强子可以影响载体 中所包括的序列表达的组织特异性和 / 或时间特异性。
     终止区通过在合适位点终止转录也促进有效表达。 实施本发明有用终止子包括但 不限于， pinII( 参见， An， et al.， (1989)Plant Cell1(1) ： 115-122)、 glb1( 参见 Genbank 登录号 L22345)、 gz( 参见， gzw64a 终止子， Genbank 登录号 S78780) 和农杆菌的 nos 终止 子。
     本发明方法包括将多肽或多核苷酸引入植物。 “引入” 意图表示将多核苷酸或多肽 以序列获得进入植物细胞内的方式呈递给植物。 本发明方法不取决于将序列引入植物的特 定方法， 只要多核苷酸或多肽获得进入至少一个植物细胞的内部。将多核苷酸或多肽引入 植物的方法在本领域内是已知的， 包括但不限于， 稳定转化方法、 瞬时转化方法和病毒介导的方法。
     “稳定转化” 意图表示引入植物中的核苷酸构建体整合进植物基因组中， 并且能通 过其后代遗传。 “瞬时转化” 意图表示多核苷酸被引入植物但并没有整合进植物基因组中， 或将多肽引入植物中。
     转化方案以及将多肽或多核苷酸序列引入植物中的方案可以随着靶向转化的植 物或植物细胞类型即单子叶植物或双子叶植物而改变。将多肽和多核苷酸引入植物细胞 中的合适的方法包括， 显微注射 (Crossway， et al.， (1986)Biotechniches 5 ： 320-335)、 电穿孔 (Riggs， et al.， (1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83 ： 5602-5606、 农杆菌介导的 转化 (Townsend， et al.， 美国专利第 5,563,055 ； Zhao， et al.， 美国专利第 5,981,850 号 )、 直接基因转移 (Paszkowski， et al.， (1985)EMBO J.3 ： 2717-2722) 和弹道粒子加 速 ( 参见， 例如， Sanford， et al.， 美国专利第 5,955,050 号， Tomes， et al.， 美国专利 第 5,879,918 号 ； Tomes， et al.， 美 国 专 利 第 5,886,255 号 ； Bidney， et al.， 美国专利 第 5,932,782 号 ； Tomes， et al.， (1995)“Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bormbardment( 通过微粒轰击将 DNA 直接转移进完整的植 物细胞中 )” ， in Plant Cell， and Organ Culture ： Fundamental Methods， ed.Gamborg and Phillips， (Springer-Verlag， Berlin) ； McCabe， et al.， (1988)Biotechnology 6 ： 923-926) 和 Lec1 转 化 (WO00/28058)。 还 参 见 Weissinger， et al.， (1988)Ann.Rev. genet.22 ： 521-577 ； Sanford， et al.， (1987)Particulate Science and Technology 5 ： 27-37( 洋 葱 ) ； Christou， et al.， (1988)Plant Physiol.87 ： 671-675( 大 豆 ) ； McCabe， et al.， (1988)Bio/Technology 6 ： 923-926( 大 豆 ) ； Finer and McMullen， (1991) In Vitro Cell Dev.Biol.27P ： 175-182( 大 豆 ) ； Singh， et al.， (1998)Theor.Appl. genet.96 ： 319-325( 大 豆 ) ； Datta， et al.， (1990)Biotechnology8 ： 736-750( 水 稻 ) ； Klein， et al.， (1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85 ： 5305-5309( 玉米 ) ； Klein， et al.， (1988)Biotechnology 6 ： 559-563( 玉 米 ) ； Tomes， 美 国 专 利 第 5,250,855 号 ； Buising， et al.， 美 国 专 利 第 5,322,783 和 5,325,656 号 ； Tomes， et al.， (1995)“Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment( 通过微粒轰击 将 DNA 直接转移进完整的植物细胞中 )， ” ， ” in Plant Cell， Tissue， and Organ Culture ： Fundamental Methods， ed.Gamborg， (Springer-Verlag， Berlin)( 玉 米 ) ； Klein， et al.， (1988)Plant Physiol.91 ： 550-555( 玉 米 ) ； Fromm， et al.， (1990)Biotechnology 8： 833-839( 玉 米 ) ； Hooykaas-Van Slogteren， et al.， (1985)Nature(London)311 ： 763-765 ； Bowen， et al.， 美国专利第 5,736,369 号 ( 谷粒 ) ； Bytebier， et al.， (1987) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85 ： 5355-5359( 百 合 科 ) ； De Wet， et al.， (1985)in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues( 胚珠组织内的实验操作 )， ed.， Chapman， et al.(Longman， New York)， pp.197-209( 花粉 ) ； Kaeppler， et al.， (1990)Plant Cell Reports 9 ： 515-518 和 Kaeppler， et al.， (1992)Theor.Appl.genet.85 ： 560-566( 触 须 介 导 的 转 化 (whisker-mediated transformation) ； D ′ Halluin， et al.， (1992)Plant Cell5 ： 1595-1505( 电穿孔 ) ； Li， et al.， (1993)Plant Cell Reports 12 ： 250-255 and Christou and Ford， (1995)Annals of Botany 75 ： 507-513( 水 稻 ) ； Osjoda， et al.， (1996)Nature Biotechnology 15 ： 755-750( 通过根瘤农杆菌的玉米 ) ； Leelavathi， etal.， (2004)Plant Cell Reports 22 ： 465-470( 通过根瘤农杆菌的棉花 ) ； Kumar， et al.， (2004)Plant Molecular Biology56 ： 203-216( 通过轰击的棉花质粒 )， 所有的这些文献都 通过引用并入本文。
     在具体的实施方案中， 用各种瞬时转化方法， 将本发明所用的 MAPKKK 序列提供 给植物。这些瞬时转化方法包括但不限于， 将 MAPKKK 蛋白或变体和其片段直接引入植物 或将 MAPKKK 转录物引入植物。这些方法包括， 例如， 显微注射或微粒轰击。参见， 例如， Crossway， et al.， (1986)Mol Gen.genet.202 ： 179-185 ； Nomura， et al.， (1986)Plant Sci.55 ： 53-58 ； Hepler， et al.， (1995)Proc.Natl.Acad.Sci.91 ： 2176-2180 和 Hush， et al.， (1995)The Journal of Cell Science 107 ： 775-785， 所有上述文献通过引用并入本 文。可选择地， MAPKKK 多核苷酸能用本领域已知的技术瞬时转化进植物。这些技术包括病 毒载体系统和多核苷酸沉淀， 所述多核苷酸以阻止随后的 DNA 释放的方式沉淀。因此， 能发 生微粒结合的 DNA 的转录， 但是其释放整合进基因组的频率大大降低。这些方法包括使用 包被有聚乙二胺亚胺的微粒 (PEI ； Sigma#P3153)。
     在其他的实施方案中， 本发明的多核苷酸可以通过将植物与病毒或病毒核酸接触 引入植物。通常， 这些方法涉及将本发明的核苷酸构建体并入病毒 DNA 或 RNA 分子中。应 当认识到， 最初， 可将本发明的 MAPKKK 合成为病毒多蛋白的一部分， 其随后可通过体内或 体外水解加工产生所需的重组蛋白。此外， 应当认识到， 本发明的启动子还包括病毒 RNA 聚 合酶转录所用的启动子。将多核苷酸， 包括病毒 DNA 或 RNA 分子， 引入植物和表达其中所 编码的蛋白的方法， 在本领域内是已知的。参见， 例如， 美国专利第 5,889,191、 5,889,190、 5,866,785、 5,589,367、 5,316,931 号以及 Porta， et al.， (1996)Molecular Biotechnology 5： 209-221， 上述文献通过引用并入本文。
     将多核苷酸定向插入植物基因组特定位置的方法， 在本领域内是已知的。在一个 实施方案中， 使用位点特异性重组系统， 可实现多核苷酸在所需的基因组位置的插入。参 见， 例如， WO 99/25821、 WO 99/25855、 WO 99/25850、 WO 99/25855 和 WO 99/25853， 通过引 用将上述所有文献并入本文。简单而言， 本发明的多核苷酸可以包含在侧翼为非相同重组 位点的转移盒中。 将所述转移盒引入植物中， 该植物具有稳定地并入其基因组的靶位点， 所 述靶位点的侧翼为对应于转移盒位点的两个非相同的重组位点。提供合适的重组酶， 并且 所述转移盒整合于靶位点。目的多核苷酸从而被整合于植物基因组的特定染色体位置。
     按照常规方式， 可以使已经转化的细胞生长为植物。参见， 例如， McCormick， et al.， (1986)Plant Cell Reports 5 ： 81-85。 这些植物随后可以用相同的转化品系或不同的 品系授粉， 并且能鉴定因而产生的、 表达想要的目的表型特征的后代。 可以种植两代或更多 代， 确保稳定维持并遗传想要的表型特征的表达， 并且然后收获种子， 确保已实现了想要的 表型特征的表达。用这种方式， 本发明提供了具有稳定地并入其基因组的本发明多核苷酸 的转化的种子 ( 也称为 “转基因种子” )， 例如， 本发明的表达盒。
     谱系育种 (pedigree breeding) 从两种基因型的杂交开始， 例如， 感兴趣的优良品 系 (elite line) 和具有一个或多个所需的特征的另一品系 ( 例如， 具有稳定地并入的本发 明的多核苷酸， 可调节本发明多肽的活性和 / 或水平 ) 所述的另一品系补充感兴趣的优良 品系。如果两个原始亲本没有提供所有想要的特征， 那么育种群体能包括其他来源。在该 谱系方法中， 使优良植物自交， 并且在连续的子代中选择。在随后的子代中， 由于自花授粉和选择， 杂合状况为纯合品系所代替。在育种的谱系方法中， 通常实施 5 代或更多代连续子 代的自交和选择 ： F1 → F2 ； F2 → F3 ； F3 → F5 ； F5 → F5 等。在足量的近交后， 连续的子代将 发挥增加发育的近交种 (inbred) 的种子的作用。优选地， 所述近交系 (inbred line) 包括 在其约 95％或更多的基因座处的纯合等位基因。
     除了用来产生回交转换 (backcross conversion)， 回交还能与纯种繁育组合使 用， 以修饰感兴趣的优良品系和利用修饰的的优良品系产生的杂种。如之前所讨论的， 回 交能用来将一个或多个特别所需的特征从一个品系、 供体亲本转移至称为回交亲本的近交 种， 其有全面的良好的农艺学特征， 但仍然缺少所需的一种或多种性状。然而， 能用相同 的方法将后代向回交亲本的基因型移动， 但是同时， 通过在早期中断回交和继续自交和选 择， 保留非回交亲本的很多组分。例如， 产生了 F1， 其为商业杂种。该商业杂种可以和其亲 本品系之一回交， 产生 BC1 或 BC2。自交和选择后代， 以便新开发的近交种具有很多回交 亲本的特性并且仍有若干所需的非回交亲本的特性。该方法平衡回交亲本的价值和抗力 (strength)， 用于新的杂种和育种中。
     因此， 本发明的实施方案是， 使感兴趣的玉米近交系进行回交转换的方法， 所述方 法包括使感兴趣的玉米近交系植物和供体植物杂交的步骤， 所述供体植物包含赋予所需的 性状的突变基因或转基因 ( 即， 增强根生长、 增加产量、 增强耐旱性、 在非生物条件下增加 或维持结籽率， 增强枝条生长、 延迟衰老或增强光合作用 )， 选择包含赋予所需的性状的突 变基因或转基因的 F1 后代植物并且将所选的 F1 后代植物与感兴趣的玉米近交系植物回 交。该方法还可以包括获得感兴趣的玉米近交系的分子标记谱 (marker profile) 和用该 分子标记谱来选择有所需特性和感兴趣的玉米近交系分子标记谱的后代植物的步骤。同 样， 该方法可以用于通过增加最后一步产生 F1 杂交种子， 所述最后一步是用不同的玉米植 物来杂交所需性状变换的感兴趣的玉米近交系， 以产生包含赋予所需性状的突变基因或转 基因的 F1 杂交玉米种子。
     回交选择是用于植物育种程序中以改善植物群体的方法。 该方法需要个体植物相 互杂交授粉形成后代。使该后代生长并且通过任何数量的选择方法选择优良后代， 所述后 代包括个体植物、 半同胞后代、 全同胞后代、 自交后代和顶交。 使所选的后代彼此杂交授粉， 形成另一群体的后代。种植该群体并且再次选择优良植物彼此杂交授粉。回交选择是循环 的过程并且因此能按想要的次数重复。回交选择的目的是改善群体的性状。该改善的群 体随后能用作育种材料的来源， 以获得用于杂种的近交品系， 或用作综合品种 (synthetic cultivar) 的亲本。综合品种是通过数个选择的近交种的互交形成的作为结果的后代。
     当与增强分子标记的选择结合使用时， 混合选择是有用的技术。 在混合选择中， 基 于表型和 / 或基因型， 选择来自个体的种子。 随后将这些所选的种子混合在一起 (bulked)， 并且用来培育下一代。 集团选择需要在主体地块 (bulk plot) 中种植植物群体， 从而允许植 物自花授粉， 大量收获种子并随后用大量收获的种子样本种植下一代。 定向授粉 (directed pollination) 而不是自花授粉， 能用作育种程序的一部分。
     突变育种是能用来将新性状引入优良品系的很多方法之一。自发发生的或人工 诱导的突变， 对于植物育种者而言是有用的变异性的来源。人工诱变的目的是增加所需特 征的突变率。突变率能通过许多不同的方法增加， 包括温度、 长期的种子储存、 组织培养条 件、 辐射 ； 例如 X 射线、 γ 射线 ( 例如， 钴 60 或铯 137)、 中子 ( 铀 235 在原子反应堆中核裂变的产物 )， β 射线 ( 由放射性同位素例如磷 32 或碳 15 发射 ) 或紫外线辐射 ( 优选 2500-2900nm) 或化学诱变剂 ( 例如， 碱基类似物 (5- 溴尿嘧啶 )， 相关化合物 (8- 乙氧基咖 啡碱 )， 抗生素 ( 链黑菌素 )， 烷化剂 ( 硫芥、 氮芥、 环氧化物、 乙撑胺 (ethylenamine)、 硫酸 盐、 磺酸盐、 砜、 内酯 )， 叠氮化物， 羟胺， 亚硝酸或吖啶。 一旦通过诱变观察到所需的性状， 则 随后可以通过传统的繁殖技术， 例如回交， 将所述性状并入现有种质中。 突变育种的详情可 见于 “Principles of Cultivar Development( 栽培品系发育原理 )” Fehr， 1993， Macmillan Publishing Company， 通过引用将其公开的内容并入本文。 此外， 在其他品系中所产生的突 变也可以用来产生包含这种突变的优良品系的回交转换。
     本发明可以用于转化任何植物种类， 包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。感 兴趣的植物种类的实例包括但不限于， 玉米 ( 玉米 (Zea may)， 也称为玉米 (maize))、 芸 苔属种类 (Brassica sp.， 例如， 欧洲油菜 (B.napus)、 芫青 (B.rapa)、 芥菜 (B.juncea))， 尤 其 是 用 作 种 子 油 来 源 的 芸 苔 属 种 类， 苜 蓿 ( 紫 花 苜 蓿 (Medicago sativa))、 水稻 (Oryza sativa)、 黑麦 (Secale cereale)、 高粱 ( 高粱 (Sorghum bicolor)、 高粱 (Sorghum vulgare))、 小 米 ( 例 如， 珍 珠 稷 (Pennisetum glaucum)、 黄 米 (proso millet)( 黍 稷 (Panicum miliaceum))、 谷 子 (foxtail millet， Setaria italica)、 龙 爪 稷 (Eleusine coracana))、向 日 葵 (Helianthus annuus)、红 花 (Carthamus tinctorius)、小 麦 (Triticum aestivum)、 大豆 (Glycine max)、 烟草 (Nicotiana tabacum)、 马铃薯 (Solanum tuberosum)、 花生 (Arachis hypogaea)、 棉花 ( 海岛棉 (Gossypium barbadense)、 陆地棉 (Gossypium hirsutum))、 甘薯 (Ipomoea batatus)、 木薯 (Manihot esculenta)、 咖啡 ( 咖 啡属种类 (Coffea spp.))、 椰子 (Cocos nucifera)、 菠萝 (Ananas comosus)、 柑橘树 ( 柑橘 属种类 (Citrus spp.))、 可可 (Theobroma cacao)、 茶 (Camellia sinensis)、 香蕉 ( 芭蕉属 种类 (Musa spp.))、 鳄梨 (Persea americana)、 无花果 (Ficus casica)、 番石榴 (Psidium guajava)、 芒果 (Mangifera indica)、 木犀榄 (Olea europaea)、 番木瓜 (Carica papaya)、 腰果 (Anacardium occidentale)， 澳大利亚坚果 (Macadamia integrifolia)、 杏 (Prunus amygdalus)、 甜菜 (Beta vulgaris)、 甘蔗 ( 甘蔗属种类 (Saccharum spp.))、 燕麦、 大麦、 蔬 菜、 观赏植物和针叶树。
     蔬 菜 包 括 番 茄 (Lycopersicon esculentum)、莴 苣 ( 例 如，莴 苣 (Lactuca sativa))、 菜豆 (Phaseolus vulgaris)、 利马豆 (Phaseolus limensis)、 豌豆 (Lathyrus spp.) 和 黄 瓜 属 (Cucumis) 的 成 员， 例 如 黄 瓜 (C.sativus)、 哈 密 瓜 (C.cantalupensis) 和甜瓜 (C.melo)。观赏植物包括， 杜鹃花 ( 杜鹃属种类 (Rhododendron spp.))、 八仙花 (Macrophylla hydrangea)、 芙 蓉 (Hibiscus rosasanensis)、 玫 瑰 ( 蔷 薇 属 种 类 (Rosa spp.))、 郁金香 ( 郁金香属种类 (Tulipa spp.))、 水仙花 ( 水仙属种类 (Narcissus spp.))、 碧 冬 茄 (Petunia hybrida)、康 乃 馨 (Dianthus caryophyllus)、一 品 红 (Euphorbia pulcherrima) 和菊花。
     可用于实施本发明针叶树包括， 例如， 松树， 例如火炬松 (Pinus taeda)、 沼泽松 (Pinus elliotii)、 西黄松 (Pinus ponderosa)、 黑松 (Pinus contorta) 和辐射松 (Pinus radiata) ； 花旗松 (Pseudotsuga menziesii) ； 加拿大铁杉 (Tsuga canadensis) ； 苍白云 杉 (Picea glauca) ； 北美红杉 (Sequoia sempervirens) ； 冷杉， 例如温哥华冷杉 (Abies amabilis) 和香脂冷杉 (Abies balsamea) 和雪松例如北美乔柏 (Thuja plicata) 和黄扁柏(Chamaecyparis nootkatensis)。在具体的实施方案中， 本发明的植物是农作物 ( 例如， 玉 米、 苜蓿、 向日葵、 芸苔、 大豆、 棉花、 红花、 花生、 高粱、 小麦、 小米、 烟草等 )。 在其他实施方案 中， 玉米和大豆植物是最佳的并且在其他的实施方案中， 玉米植物是最佳的。
     其他感兴趣的植物包括提供感兴趣的种子的谷物植物， 油料种子植物和豆科植 物。感兴趣的种子包括谷物种子， 例如玉米、 小麦、 大麦、 水稻、 高粱、 黑麦等。油料种子植物 包括棉花、 大豆、 红花、 向日葵、 芸苔、 玉米、 苜蓿、 棕榈、 椰子等。豆科植物包括豆 (beans) 和 豌豆， 豆包括瓜尔豆、 槐豆 (locust bean)、 葫芦巴、 大豆、 四季豆 (garden beans)、 豇豆、 绿 豆、 利马豆、 蚕豆、 小扁豆、 鹰嘴豆等。
     通常， 在实施本发明时会使用中间宿主细胞， 来增加克隆载体的拷贝数。 通过拷贝 数增加， 能够大量分离含有目的核酸的载体， 用于引入所需的植物细胞中。 在一个实施方案 中， 使用在细菌中不引起多肽表达的植物启动子。
     原核生物最频繁地以各种大肠杆菌 (E.coli) 菌株为代表。然而， 也可以使用其他 微生物菌株。 常用的原核控制序列， 本文将其定义为包括用于转录起始的启动子， 任选地带 有操纵基因， 以及核糖体结合序列， 包括如下述一样常用的启动子 ： β- 内酰胺酶 ( 青霉素 酶 ) 和乳糖 (lac) 启动子系统 (Chang， e al.， (1977)Nature 198 ： 1056)、 色氨酸 (trp) 启 动子系统 (Goeddel， et al.， (1980)Nucleic Acids Res.8 ： 5057) 和源于 PL 的 λ 启动子 和 N- 基因核糖体结合位点 (Shimatake， et al.， (1981)Nature 292 ： 128)。将选择标记包 括于在大肠杆菌中转染的 DNA 载体中， 也是有用的。这种标记的实例包括确定抗氨苄青霉 素、 四环素或氯霉素抗性的基因。
     选择允许引入合适的宿主细胞的载体。细菌载体通常是质粒或噬菌体来源 的。合适的细菌细胞用噬菌体载体颗粒感染或用裸噬菌体载体 DNA 转染。如果使用质 粒载体， 则用质粒载体 DNA 转染细菌细胞。用芽孢杆菌种类 (Bacillus sp.) 和沙门氏 菌 (Salmonella)， 可得到表达本发明蛋白的表达系统 (Palva， et al.， (1983)gene 22 ： 229-235) ； Mosbach， et al.， (1983)Nature 302 ： 553-555)。
     多种真核表达系统， 例如酵母、 昆虫细胞系、 植物和哺乳动物细胞， 对本领域技术 人员而言是已知的。如下文简要解释的， 本发明的多核苷酸能在这些真核系统中表达。在 一些实施方案中， 如下文所讨论的， 用转化的 / 转染的植物细胞作为产生本发明蛋白的表 达系统。
     在酵母中合成异源多核苷酸是已知的 (Sherman， et al.， (1982)Metherds in Yeast genetics， Cold Spring Harbor Laboratory)。两种广泛应用的产生真核蛋白的 酵母是酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 和毕赤酵母 (Pichia pastoris)。在酿酒 酵母和毕赤酵母中表达的载体、 菌株和方案是本领域已知的， 并且可从商业供应商 ( 例如， Invitrogen) 获得。 适当的载体通常有表达控制序列， 例如启动子， 包括 3- 磷酸甘油酸盐激 酶或醇氧化酶在内的， 和复制起点、 终止序列和及所需要的序列等。
     本发明的蛋白一但表达， 就能通过裂解细胞和应用列表中的标准蛋白分离技术从 酵母中分离。可以用 Western 印迹技术或其他标准免疫测定技术的放射性免疫测定来完成 纯化过程的监测。
     本发明的序列也能连接到各种表达载体中， 用于转染例如哺乳动物、 昆虫或植物 来源的细胞培养物。用来产生肽的示例性细胞培养物是哺乳动物细胞。现有技术已开发了多种能表达完整蛋白的合适宿主细胞系， 并且所述细胞系包括 HEK293、 BHK21 和 CHO 细 胞系。用于这些细胞的表达载体包括表达控制序列， 例如复制起点、 启动子 ( 如， CMV 启动 子、 HSV tk 启动子或 pgk( 磷酸甘油酸盐激酶 ) 启动子 )、 增强子 (Queen， et al.， (1986) Immunol.Rev.89 ： 59)， 和必需的加工信息位点， 例如， 核糖体结合位点、 RNA 剪接位点、 聚 腺苷酸化位点 ( 例如， SV50 巨大 T Ag PolyA 添加位点 ) 和转录终止序列。用来产生本 发明蛋白的其他动物细胞可以从例如美国典型培养物保藏中心 (American Type Culture Collection) 获得。
     用于在昆虫细胞中表达本发明蛋白的合适的载体通常源于 SF9 杆状病毒。合适 的昆虫细胞系包括蚊幼虫、 蚕、 粘虫、 蛾和果蝇 (Drosophila) 细胞系例如， 施耐德细胞系 (Schneider cell line， 参见， Schneider， (1987)J.Embryol.Exp.Morphol.27 ： 353-365)。
     同用酵母一样， 当使用高等动物或植物宿主细胞时， 通常将聚腺苷酸化或转录终 止序列并入载体中。终止序列的实例是源于牛生长激素基因的聚腺苷酸化序列。还可以包 括精确剪接转录物的序列。 剪接序列的实例是来源于 SV50 的 VP1 内含子 (Sprague， et al.， (1983)J.Virol.55 ： 773-781)。此外， 可以将在宿主细胞中控制复制的基因序列并入载体 中， 例如， 那些见于牛乳头状瘤病毒的载体类型 (Saveria-Campo， (1985)DNA Cloning Vol. II a Practical Approach， Glover， Ed.， IRL Press， Arlington， Virginia， pp.213-238)。
     动物和低等真核 ( 例如， 酵母 ) 宿主细胞对感染是感受态的或能通过各种方式是 感受态的。有数种公知的将 DNA 引入动物细胞的方法。这些方法包括 ： 磷酸钙沉淀、 受体细 胞和含有 DNA 的细菌原生质体的融合、 用含有 DNA 的脂质体处理受体细胞、 DEAE 葡聚糖、 电 穿孔、 DNA 通过微弹轰击法 (biolistics) 和直接微注射进入细胞。转染的细胞用本领域公 知的方法培养。 (Kuchler， (1997)Biochemical Methods in Cell Culture and Virology， Dowden， Hutchinson and Ross， Inc.)。
     在某些实施方案中， 本发明的核酸序列能和感兴趣的多核苷酸序列的任何组 合叠加， 以产生具有所需表型的植物。产生的组合可以包括多拷贝的任一目的多核苷 酸。例如， 本发明的多核苷酸可以和本发明的任何其他多核苷酸叠加。本发明的多核苷 酸也能和参与非生物胁迫耐受性的其他基因或基因组合叠加， 包括， 例如， 参与渗透保护 (osmoprotection)、 抗氧化剂应答和 / 或膜稳定性的多核苷酸。一种这样的多核苷酸包 括但不限于 C 重复结合因子 (C-repeat Binding Factor， CBF)， 其为已知结合 C 重复元 件 (CRT) 的转录因子， 也被称为脱水应答元件 (Dehydration Response Element， DRE) 元 件。( 参见， 美国专利申请公开号第 2006/0026716 号和美国专利第 6,706,866、 6,417,428、 5,965,705、 5,929,305、 5,892,009 和 5,891,859 号， 通过引用将上述公开内容并入本 文 )。DRE 存在于数个基因的启动子中， 所述基因受干旱或寒冷形式的非生物胁迫诱导。已 知 CRT/DRE 元件存在于数个脱水素或 LEA( 晚期胚丰富 ) 基因的启动子中。Rodriguez， et al.， (2005)Theor.Appl genet.110(5) ： 852-858 ； Kobayashi， (2004)， Regulation of cold-responsive Cor/Lea genes and their transcription factors by the major freezing tolerance locus Fr-1 in wheat( 通过主要的冰冻耐受性基因座 Fr-1， 在小 麦中调节寒冷应答 Cor/Lea 基因和其转录因子 )， In Recent research developments in plant science Vol.2， pages 249-266。 已知超表达 CBF 的转基因植物比非转基因植物积累 更高水平的被认为是渗透调节剂的糖和脯氨酸。 参见， 例如， Yamada， et al.， (2005)J.Exp.Botany 56(417) ： 1975-1981。因此， 在本发明一方面， 本发明的 MAPKKK 和 CBF 叠加。一方 面， MAPKKK 多核苷酸是 ZmNPK1a。一方面， CBF 是 CBF1。( 参见， 美国专利第 6,706,866、 6,417,428、 5965,705、 5,929,305、 5,892,009 和 5,891,859 号， 通过引用将上述公开的内容 并入本文 )。一方面， CBF1 来自玉米。( 参见， 美国专利第 6,417,428 号的 SEQ ID NO ： 94)。 一方面， CBF 由和 MAPKKK 多核苷酸相同的启动子驱动。 一方面， CBF 由不同于 MAPKKK 多核苷 酸的启动子驱动。 一方面， 启动子胁迫诱导启动子。 另一方面， 启动子是 RAB17。 (Vilardell， et al.， (1990)Plant Mol Biol 14 ： 423 432)。
     本发明的多核苷酸也能与任何其他基因或基因组合叠加， 以产生有很多所需性状 组合的植物， 所述的性状组合包括但不限于动物饲料所需的性状， 例如高油基因 ( 例如， 美 国专利第 6,232,529 号 ) ； 平衡的氨基酸 ( 例如， hordothionins( 美国专利第 5,990,389、 5,885,801、 5,885,802 和 5,703,409 号 ) ； 大 麦 高 赖 氨 酸 (Williamson， et al.， (1987) Eur.J.Biochem.165 ： 99-106 和 WO 98/20122) 和高蛋氨酸蛋白 (Pedersen， et al.， (1986) J.Biol.Chem.261 ： 6279 ； Kirihara， et al.， (1988)Gene 71 ： 359 和 Musumura， et al.， (1989)Plant Mol.Biol.12 ： 123)) ； 增强的消化性 ( 例如， 修饰的储存蛋白 ( 美国专利申 请系列第 10/053,410 号， 于 2001 年 11 月 7 日提交 ) 和硫氧还蛋白 ( 美国专利申请系列 第 10/005,429 号， 于 2001 年 12 月 3 日提交 ))， 通过引用将上述公开的内容并入本文。 本发明的多核苷酸还能与昆虫、 疾病或除草剂抗性所需的性状叠加 ( 例如， 苏云金杆菌 (Bacillus thuringiensis) 毒 性 蛋 白 ( 美 国 专 利 第 5,366,892、 5,747,450、 5,737,514、 5723,756、 5,593,881 号 ； Geiser， et al.， (1986)Gene 48 ： 109) ； 凝集素 (Van Damme， et al.， (1994)Plant Mol.Biol.24 ： 825) ； 烟曲霉毒素解毒基因 ( 美国专利第 5,792,931 号 ) ； 无毒性和疾病抗性基因 (Jones， et al.， (1994)Science 266 ： 789 ； Martin， et al.， (1993) Science 262 ： 1432 ； Mindrinos， et al.， (1994)Cell78 ： 1089) ； 引起除草剂抗性的乙酰乳 酸合酶 (ALS) 突变体， 例如 S4 和 / 或 Hra 突变 ； 谷氨酰胺合成酶抑制剂例如， 膦丝菌素或 basta( 例如， bar 基因 ) 和草甘膦抗性 (EPSPS 基因 )) 和加工或工艺产品所需的性状， 例如 高油 ( 例如， 美国专利第 6,232,529 号 ) ； 修饰的油 ( 例如， 脂肪酸去饱和基因 ( 美国专利 第 5,952,544 号、 WO 94/11516)) ； 修饰的淀粉 ( 例如， ADPG 焦磷酸化酶 (AGPase)、 淀粉合 酶 (SS)、 淀粉分支酶 (SBE) 和淀粉去分支酶 (SDBE)) 和聚合物或生物塑料 ( 例如， 美国专利 第 5.602,321 号 ； β- 酮硫解酶、 聚羟基丁酸酯合成酶和乙酰乙酸 -CoA 还原酶 (Schubert， et al.， (1988)J.Bacteriol.170 ： 5837-5847) 促进聚羟基脂肪酸酯 (PHAs) 的表达 )， 通过 引用将上述公开的内容并入本文。 还能将本发明的多核苷酸与影响农艺学性状的多核苷酸 组合， 所述农艺学性状例如， 雄性不育、 茎强度、 花期或转化技术性状， 例如， 细胞周期调节 或基因定向 ( 例如， WO 99/61619、 WO 00/17364、 WO99/25821)。
     这些叠加的组合能用任何方法产生， 所述方法包括但不限于， 通过任何常规的或 顶交方法或遗传转化植物杂交育种。如果通过遗传转化植物叠加性状， 那么感兴趣的多核 苷酸序列能在任何时间和以任何次序组合。例如， 包含一个或多个所需性状的转基因植物 能用作通过随后转化引入其他性状的靶标。 所述性状在共转化方案中能与转化盒的任何组 合所提供的感兴趣的多核苷酸同时引入。 例如， 如果要引入两条序列， 则所述两条序列可以 包含在各自的转化盒 ( 反式 ) 或包含在同一转化盒 ( 顺式 ) 中。序列表达能由同一启动子 或不同的启动子驱动。 在某些情况下， 可能需要引入抑制感兴趣的多核苷酸表达的转化盒。这可以与其他抑制盒或超表达盒的任何组合联合， 以在植物中产生所需的性状组合。
     II. 调节 MAPKKK 多肽的浓度和 / 或活性
     提供了在植物中调节本发明多肽浓度和 / 或活性的方法。通常， 相对于天然对照 植物、 植物部分或细胞， 浓度和 / 或活性增加或降低至少 1％、 5％、 10％、 20％、 30％、 50％、 50％、 60％、 70％、 80％或 90％。本发明的调节可以发生在所需的任何发育阶段。在具体的 实施方案中， 在单子叶植物， 特别是玉米中， 调节本发明的多肽。
     “个体植物或植物细胞” ， 是感兴趣的基因的遗传改变例如转化， 已经生效的植物 或植物细胞， 或是从发生如此改变的植物或细胞传下来的并且包含所述改变的植物或植物 细胞。 “对照” 或 “对照植物” 或 “对照植物细胞” 为检测个体植物或植物细胞中的表型改变 提供参考点。
     对照植物或植物细胞可以包含， 例如 ： (a) 野生型植物或细胞， 即， 与导致个体植 物或细胞的遗传改变的起始材料有相同的基因型 ； (b) 与起始材料有相同基因型， 但是已 经用无效构建体 ( 即， 用对感兴趣的性状没有已知效应的构建体， 例如， 包含标记基因的构 建体 ) 转化的植物或植物细胞 ； (c) 个体植物或植物细胞后代中， 为非转化分离子的植物或 植物细胞 ； (d) 与个体植物或植物细胞基因相同的植物或植物细胞， 但是， 所述植物或植物 细胞没有暴露在诱导目的基因表达的条件和刺激剂下， 或 (e) 处于没有表达目的基因的条 件下的个体植物或植物细胞本身。
     MAPKKK 多肽的表达水平可以直接检测， 例如， 通过测定植物中 MAPKKK 多肽的水 平， 或间接检测， 例如， 通过检测植物中 MAPKKK 多肽的 MAPKKK 活性。测定 MAPKKK 活性的方 法在本文其他地方有描述， 并且包括评价表型改变， 例如增强的非生物胁迫抗性或耐受性。
     在具体的实施方案中， 将本发明的 MAPKKK 多肽或多核苷酸引入植物细胞。随后 用本领域技术人员已知的方法筛选具有引入的序列的植物细胞， 所述方法例如， 但不限于， Southern 印迹分析、 DNA 测序、 PCR 分析或表型分析。使上述实施方案所改变的植物或植物 部分在植物形成条件生长到足以允许调节植物中本发明多肽的浓度和 / 或活性的时间。植 物形成条件是本领域公知的， 并在本文其他地方作了简单论述。
     还应当认识到， 可以通过使用多核苷酸来调节多肽的水平和 / 或活性， 所述多核 苷酸不能在转化的植物中指导蛋白或 RNA 的表达。例如， 本发明的多核苷酸可以用来设计 多核苷酸构建体， 该多核苷酸构建体能用于使有机体中的基因组核苷酸序列改变或突变的 方法中。这种多核苷酸构建体包括但不限于， RNA:DNA 载体、 RNA:DNA 突变载体、 RNA:DNA 修复载体、 混合的双链寡核苷酸 (mixed-duplex oligonucleotide)、 自身互补的 RNA:DNA 寡核苷酸和诱重组寡核碱基 (recombinogenic oligonucleobase)。这种核苷酸构建体 和使用方法在本领域内是已知的。参见， 美国专利第 5,565,350、 5,731,181、 5,756,325、 5,760,012、 5,795,972 和 5,871,985 号 ； 通过引用将上述全部内容并入本文。还参见， WO98/59350、 WO 99/07865、 WO 99/25821 和 Beetham， et al.， (1999)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 96 ： 8775-8778 ； 通过引用并入本文。
     因此， 应当认识到， 本发明方法不依赖于并入基因组的全部多核苷酸， 只要植物或 其细胞由于多核苷酸向细胞内的引入而被改变。在本发明的一个实施方案中， 基因组可以 在将多核苷酸引入细胞内后被改变。 例如， 多核苷酸， 或其任意部分， 可以并入植物基因组。 本发明基因组改变包括但不限于， 基因组核苷酸的添加、 缺失或取代。 虽然本发明的方法不依赖于插入、 缺失或取代任何具体数量的核苷酸， 但是， 应当认识到， 这种插入、 缺失或取代 至少包括一个核苷酸。
     A. 增加 MAPKKK 多肽的活性和 / 或水平
     提供了增加 MAPKKK 多肽活性和 / 或水平的方法。通过向植物提供 MAPKKK 多肽， 可以实现本发明 MAPKKK 多肽活性和 / 或水平的增加。通过下述方法提供 MAPKKK 多肽 ： 将 编码 MAPKKK 多肽的氨基酸序列引入植物， 将编码 MAPKKK 多肽的核苷酸序列引入植物， 或可 选择地， 修饰编码 MAPKKK 多肽的基因组基因座。一方面， 编码本发明 MAPKKK 多肽的多核苷 酸在植物细胞或植物中超表达。如本文所使用的， 术语 “超表达 (over-express)” “超表达 、 (over-expressed)” 、 “超表达 (over-expressing)” 或 “超表达 (over-expression)” 是指 植物细胞中 MAPKKK 多核苷酸和 / 或多肽的产生在量上超过该植物细胞中通常所产生的量。 本发明的 MAPKKK 多核苷酸和 / 或多肽可以在植物细胞中， 在特定的时间点或特定的植物发 育阶段超表达。
     如本文其他地方所讨论的， 本领域知晓很多向植物提供多肽的方法包括， 但不限 于， 直接将多肽引入植物， 将编码具有 MAPKKK 活性的多肽的多核苷酸构建体引入 ( 瞬时 地或稳定地 ) 植物。还应当认识到， 本发明方法可以使用不能在转化的植物中指导蛋白 或 RNA 表达的多核苷酸。因此， MAPKKK 多肽的水平和 / 或活性可以通过改变编码 MAPKKK 多肽的基因或其启动子而增加。参见， 例如， Kmiec 的美国专利第 5,565,350 号 (Kmiec， US Patent Number 5,565,350) ； Zarling 等 的 PCT/US93/03868(Zarling， et al.， PCT/ US93/03868)。因此， 提供了携带 MAPKKK 基因中的突变的诱变植物， 其中所述突变增加了 MAPKKK 基因的表达或增加了编码的 MAPKKK 多肽的 MAPKKK 活性。如本文所用的， 术语 “超 表达 (over-express)” 、 “超表达 (over-expressed)” 或 “超表达 (over-expressing)” 是指 植物细胞中 MAPKKK 多核苷酸和 / 或多肽的产生在量上超过该植物细胞中通常所产生的量。
     B. 降低 MAPKKK 多肽的活性和 / 或水平
     提供了通过用表达盒转化植物细胞降低或消除 MAPKKK 多肽的活性和 / 或水平的 方法， 该表达盒表达抑制 MAPKKK 多肽表达的多核苷酸。 所述多核苷酸可以通过阻止 MAPKKK 信使 RNA 的翻译直接抑制一种或多种 MAPKKK 多肽的表达， 通过编码抑制植物基因的转录 或翻译的多肽， 所述植物基因编码 MAPKKK 多肽， 间接地抑制一种或多种 MAPKKK 多肽的表 达。抑制或消除植物中基因表达的方法是本领域公知的， 并且任何这种方法可以用于本发 明中， 以抑制一种或多种 MAPKKK 多肽的表达。
     按照本发明， 如果 MAPKKK 多肽的蛋白水平在统计学上显著低于未受到遗传修饰 或诱变以抑制该蛋白的表达的植物中相同 MAPKKK 多肽的蛋白水平， 那么 MAPKKK 多肽的表 达受到抑制。在本发明的具体实施方案中， 按照本发明， 在修饰的植物中， MAPKKK 多肽的蛋 白水平比不是突变体或未受到遗传修饰以抑制所述 MAPKKK 多肽表达的植物中相同 MAPKKK 多肽的蛋白水平少于 96 ％、 少于 90 ％、 少于 80 ％、 少于 75 ％、 少于 60 ％、 少于 50 ％、 少于 50％、 少于 30％、 少于 20％、 少于 10％或少于 5％。MAPKKK 多肽的表达水平可以直接检测， 例如， 通过测定植物细胞或植物中所表达的 MAPKKK 多肽水平， 或间接检测， 例如， 通过检测 植物细胞或植物中 MAPKKK 多肽的活性。测定 MAPKKK 多肽的 MAPKKK 活性的方法在本文其 他地方作了描述。
     在本发明的其他实施方案中， 通过表达盒转化植物细胞降低或消除一种或多种MAPKKK 的活性， 所述表达盒包含编码抑制一种或多种 MAPKKK 活性的多肽的多核苷酸。 按照 本发明， 如果 MAPKKK 的 MAPKKK 活性在统计学上显著低于未受到遗传修饰以抑制其 MAPKKK 活性的植物中的相同 MAPKKK 的活性， 那么 MAPKKK 的 MAPKKK 活性受到了抑制。在本发明的 具体实施方案中， 按照本发明， 修饰的植物中的 MAPKKK 的 MAPKKK 活性比未受到遗传修饰以 抑制所述 MAPKKK 表达的植物中相同 MAPKKK 的 MAPKKK 活性少于 95％、 少于 90％、 少于 80％、 少于 70％、 少于 60％、 少于 50％、 少于 50％、 少于 30％、 少于 20％、 少于 10％或少于 5％。 按 照本发明， 当通过本文其他地方描述的检测方法检测不到 MAPKKK 活性时， MAPKKK 的 MAPKKK 活性被 “消除” 。测定 MAPKKK 的 MAPKKK 活性的方法在本文其他地方作了描述。
     在其他的实施方案中， 通过破坏编码 MAPKKK 的基因可以降低或消除 MAPKKK 的活 性。本发明包括携带 MAPKKK 基因中的突变的诱变植物， 其中， 所述突变降低 MAPKKK 基因的 表达或抑制编码的 MAPKKK 的 MAPKKK 活性。
     因此， 可以使用很多方法来降低或消除 MAPKKK 活性。可以使用多于一种方法以降 低单个 MAPKKK 的活性。 此外， 可以使用方法的组合来降低或消除两种或更多种不同 MAPKKK 多肽的活性。
     下文给出了降低或消除 MAPKKK 表达的方法的非限制性实例。 1. 基于多核苷酸的方法
     在本发明的一些实施方案中， 植物细胞用能表达抑制 MAPKKK 多肽表达的多核苷 酸的表达盒转化。如本文所用的， 术语 “表达” 是指基因产物的生物合成， 包括所述基因产 物的转录和 / 或翻译。例如， 对于本发明的目的而言， 能表达抑制至少一种 MAPKKK 多肽表 达的多核苷酸的表达盒是能产生抑制至少一种 MAPKKK 多肽转录和 / 或翻译的 RNA 分子的 表达盒。从 DNA 分子 “表达” 或 “产生” 蛋白或多肽是指转录和翻译编码序列， 以产生蛋白 或多肽， 而从 RNA 分子 “表达” 或 “产生” 蛋白或多肽是指翻译 RNA 编码序列， 以产生蛋白或 多肽。
     下文给出抑制 MAPKKK 多肽表达的多核苷酸的实例
     i. 有义抑制 / 共抑制
     在本发明的一些实施方案中， 通过有义抑制或共抑制可以获得抑制 MAPKKK 多肽 的表达。对于共抑制而言， 设计表达 RNA 分子的表达盒， 所述 RNA 分子在 “有义” 方向上对应 于编码 MAPKKK 多肽的全部或部分信使 RNA。RNA 分子的超表达导致天然基因的表达降低。 因此， 筛选用共抑制表达盒转化的多个植物系， 以鉴定对 MAPKKK 多肽表达表现出最大抑制 的那些植物系。
     用于共抑制的多核苷酸对应于编码 MAPKKK 多肽的全部或部分序列、 MAPKKK 转录 物的全部或部分 5′和 / 或 3′非翻译区或编码 MAPKKK 多肽的转录物的全部或部分编码序 列和非翻译区。在一些实施方案中， 其中， 多核苷酸包含 MAPKKK 多肽的全部或部分编码区， 设计表达盒以去除该多核苷酸的起始密码子， 以便不转录蛋白产物。
     共抑制可以用来抑制植物基因的表达， 以产生对于这些基因编码的蛋白而言具 有无法检测到的蛋白水平的植物。参见， 例如， Broin， et al.， (2002)Plant Cell 15 ： 1517-1532。 共抑制还可以用来在同一植物中抑制多种蛋白的表达。 参见， 例如， 美国专利第 5,952,657 号。 用共抑制来抑制植物中内源基因表达的方法描述于 Flavell， et al.， (1995) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91 ： 3590-3596 ； Jorgensen， et al.， (1996)Plant Mol.Biol.31 ：
     957-973 ； Johansen and Carrington， (2001)Plant Physiol.126 ： 930-938 ； Broin， et al.， (2002)Plant Cell 15 ： 1517-1532 ； Stoutjesdijk， et al.， (2002)Plant Physiol.129 ： 1723-1731 ； Yu， et al.， (2003)Phytochemistry 63 ： 753-763 和 美 国 专 利 第 5,035,323、 5,283,185 和 5,952,657 号中 ； 通过引用将上述每一篇并入本文。通过在有义序列的 3′端 和聚腺苷酸化信号的 5′端， 将 poly-dT( 聚 -dT) 区包括于表达盒中， 可以增强共抑制的效 率。参见， 美国专利申请公开号第 2002/0058815 号， 通过引用并入本文。通常， 这种核苷酸 序列与内源基因的转录物序列有实质性序列同一性， 优选地， 多于约 65％的序列同一性， 更 优选地， 多于约 85％的序列同一性， 最优选地， 多于约 95％的序列同一性。参见， 美国专利 第 5,283,185 号和第 5,035,323 号 ； 通过引用并入本文。
     转录基因沉默 (transcriptional gene silencing， TGS) 可以通过使用 hpRNA 构 建体实现， 其中发夹的反向重复与待沉默的基因的启动子区域共有序列同一性。hpRNA 加 工成能与同源启动子区相互作用的短 RNA， 可引发降解或甲基化， 导致沉默。(Aufsatz， et al.， (2002)PNAS99(4) ： 16499-16506 ； Mette， et al.， (2000)EMBO J 19(19) ： 5194-5201)。 还参见， 美国专利申请公开号第 2005/0246796 号。
     ii. 反义抑制
     在本发明的一些实施方案中， 通过反义抑制实现 MAPKKK 多肽表达的抑制。对于反 义抑制而言， 设计表达盒表达 RNA 分子， 所述 RNA 分子与编码 MAPKKK 多肽的全部或部分信 使 RNA 互补。反义 RNA 分子的超表达能导致天然基因的表达降低。因此， 筛选用反义抑制 表达盒转化的多个植物系， 以鉴定对 MAPKKK 多肽表达表现出最大抑制的那些植物系。
     反义抑制中所用的多核苷酸对应于编码 MAPKKK 多肽的序列的全部或部分互补 物、 MAPKKK 多肽转录物的 5′和 / 或 3′非翻译区的全部或部分互补物或编码 MAPKKK 多肽 的转录物的编码序列和非翻译区域的全部或部分互补物。此外， 反义多核苷酸可以与靶序 列完全互补 ( 即， 与靶序列的互补物 100％相同 ) 或部分互补 ( 即， 与靶序列的互补物小于 100％相同 )。 反义抑制可以用来在同一植物中抑制多种蛋白的表达。 参见， 例如， 美国专利 第 5,952,657 号。此外， 反义核苷酸的一部分可以用来破坏靶基因的表达。通常， 可以使用 至少有 50 个核苷酸、 100 个核苷酸、 200 个核苷酸、 300 个、 500 个、 550 个、 500 个、 550 个或 更长的序列。用反义抑制来抑制植物中内源基表达的方法描述于例如 Liu， et al.， (2002) Plant Physiol.129 ： 1732-1753 和美国专利第 5,759,829 号和第 5,952,657 号中。通过在 反义序列的 3′端和聚腺苷酸化信号的 5′端， 将 poly-dT 区域包括于表达盒中， 可以增强 反义抑制的效率。参见， 美国专利申请公开号第 2002/0058815 号。
     iii. 双链 RNA 干扰
     在本发明的一些实施方案中， 通过双链 RNA(dsRNA) 干扰可以实现 MAPKKK 多肽表 达的抑制。对于 dsRNA 干扰而言， 在同一细胞中表达有义 RNA 分子和反义 RNA 分子， 所述有 义 RNA 分子如上文共抑制所述的有义 RNA 分子一样， 所述反义 RNA 分子与所述有义 RNA 分 子完全或部分互补， 从而导致相应内源信使 RNA 表达的抑制。
     有义和反义分子的表达能通过设计包含有义序列和反义序列的表达盒来实现。 可 选择地， 单独的表达盒可以用于有义和反义序列。随后筛选用 dsRNA 干扰表达盒或表达盒 转化的多个植物系， 以鉴定对 MAPKKK 多肽表达表现出最大抑制的植物系。用 dsRNA 干扰来 抑制内源性植物基因表达的方法描述于 Waterhouse， et al.， (1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95 ： 13959-13965， Liu， et al.， (2002)Plant Physiol.129 ： 1732-1753 和 WO99/59029、 WO 99/53050、 WO 99/61631 和 WO 00/59035 中。
     iv. 发夹 RNA 干扰和含有内含子的发夹 RNA 干扰
     在本发明的一些实施方案中， 可以通过发夹 RNA(hpRNA) 干扰或含有内含子的发 夹 RNA(ihpRNA) 干扰实现一种或多种 A 型 RR 多肽表达的抑制。这些方法高效抑制内源基 因的表达。参见， Waterhouse and Helliwell， (2003)Nat.Rev.genet.5 ： 29-38 和其中引用 的参考文献。
     对于 hpRNA 干扰而言， 设计表达 RNA 分子的表达盒， 所述 RNA 分子自身杂交形 成包含单链环状区和碱基配对茎的发夹结构。所述碱基配对茎区包含有义序列和反义 序列， 所述有义序列对应于编码表达待受到抑制的基因的全部或部分内源信使 RNA， 所 述反义序列与该有义序列完全或部分互补。因此， 分子的碱基配对茎区通常决定 RNA 干 扰的特异性。hpRNA 分子高效抑制内源基因的表达， 并且其诱导的 RNA 干扰遗传给植物 的 下 一 代。 参 见， 例 如， Chuang and Meyerowitz， (2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97 ： 5985-5990 ； Stoutjesdijk， et al.， (2002)Plant Physiol.129 ： 1723-1731 和 Waterhouse and Helliwell， (2003)Nat.Rev.Genet.5 ： 29-38。 用 hpRNA 干 扰 抑 制 或 沉 默 基 因 表 达 的 方 法 描 述 于， 例 如， Chuang and Meyerowitz， (2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97 ： 5985-5990 ； Stoutjesdijk， et al.， (2002)Plant Physiol.129 ： 1723-1731 ； Waterhouse and Helliwell， (2003)Nat.Rev.Genet.5 ： 29-38 ； Pandolfini， et al.， BMCBiotechnology 3： 7 和美国专利申请公开号第 2003/0175965 号中 ； 通过引用将上述每一篇并入本文。 hpRNA 构建体体内沉默基因表达效率的瞬时检测描述于， Panstruga， et al.， (2003)Mol.Biol. Rep.30 ： 135-150 中。
     对于 ihpRNA 而言， 干扰分子与 hpRNA 有相同的基因结构， 但是该 RNA 分子另外 还含有内含子， 所述内含子在表达 ihpRNA 的细胞内能被剪接。剪接随后， 使用内含子可 以使发夹 RNA 分子中环的大小最小化， 并且这提高干扰效率。参见， 例如， Smith， et al.， (2000)Nature507 ： 319-320。事实上， Smith 等用 ihpRNA 介导的干扰证实了 100 ％抑制 内源基因表达。用 ihpRNA 干扰抑制内源性植物基因表达的方法描述于， 例如， Smith， et al.， (2000)Nature 507 ： 319-320 ； Wesley， et al.， (2001)Plant J.27 ： 581-590 ； Wang and Waterhouse， (2001)Curr.Opin.Plant Biol.5 ： 156-150 ； Waterhouse and Helliwell， (2003)Nat.Rev.Genet.5 ： 29-38 ； Helliwell and Waterhouse， (2003)Metheds 30 ： 289-295 和美国专利申请公开号第 2003/0180955 号中。
     还可以这样设计用于 hpRNA 干扰的表达盒， 有义序列和反义序列不对应于内源 RNA。在该实施方案中， 有义和反义序列为环状序列侧翼， 所述环状序列包含对应于靶基因 的全部或部分内源信使 RNA 的核苷酸序列。因此， 是环状区决定了 RNA 干扰的特异性。参 见， 例如， WO 02/00905。
     v. 扩增子介导的干扰
     扩增子表达盒包含植物病毒来源的序列， 所述序列含有全部或部分靶基因， 但通 常不含有天然病毒的全部基因。存在于表达盒的转录产物中的病毒序列， 允许转录产物指 导其自身复制。扩增子所产生的转录物相对于靶序列 ( 即， MAPKKK 多肽的信使 RNA) 可以 是有义的或反义的。用扩增子抑制内源性植物基因表达的方法描述于， 例如， Angell andBaulcombe， (1997)EMBO J.16 ： 3675-3685， Angell and Baulcombe， (1999)Plant J.20 ： 357-362 和美国专利第 6,656,805 号。
     vi. 核酶
     在一些实施方案中， 本发明的表达盒所表达的多核苷酸是催化性 RNA 或对 MAPKKK 多肽的信使 RNA 有特异性的核酶活性。因此， 所述多核苷酸使内源信使 RNA 降解， 从而导致 MAPKKK 多肽的表达降低。该方法描述于， 例如美国专利第 5,987,071 号中。
     vii. 小干扰 RNA 或微 RNA
     在本发明的一些实施方案中， 通过表达编码微 RNA(miRNA) 的基因， 经 RNA 干扰， 可以实现一种或多种 MAPKKK 多肽表达的抑制。miRNAs 是由约 22 个核糖核苷酸组成的调 节剂。miRNA 高效抑制内源基因的表达。参见， 例如 Javier， et al.， (2003)Nature 525 ： 257-263， 通过引用并入本文。
     对于 miRNA 干扰而言， 设计表达 RNA 分子的表达盒， 所述 RNA 分子以内源 miRNA 基 因为模型。miRNA 基因编码形成发夹结构的 RNA， 所述发夹结构含有与另一内源基因 ( 靶序 列 ) 互补的 22 个核苷酸的序列。对于 MAPKKK 多肽表达的抑制， 所述 22 个核苷酸的序列选 自 MAPKKK 转录物序列， 并且含有所述 MAPKKK 多肽序列有义方向上的 22 个核苷酸和 21 个 相应反义序列的核苷酸， 所述相应反义序列与所述有义序列互补。 miRNA 分子高效抑制内源 基因的表达， 并且其诱导的 RNA 干扰遗传给植物的下一代。
     2. 基于多肽的基因表达抑制
     在一个实施方案中， 多核苷酸编码锌指蛋白， 所述锌指蛋白与编码 MAPKKK 多肽的 基因结合， 从而导致该基因的表达降低。在具体实施方案中， 锌指蛋白与 MAPKKK 多肽基因 的调节区结合。在其他的实施方案中， 锌指蛋白与编码 MAPKKK 多肽的信使 RNA 结合， 并且 阻止其翻译。通过锌指蛋白选择靶向位点的方法描述于， 例如美国专利第 6,553,252 号中， 使用锌指蛋白抑制植物中基因表达的方法描述于， 例如美国专利申请公开第 2003/0037355 号中。
     3. 基于多肽的蛋白活性抑制
     在本发明的一些实施方案中， 多核苷酸编码与至少一种 MAPKKK 多肽结合并且降 低所述 MAPKKK 多肽的 MAPKKK 活性的抗体。 在另一个实施方案中， 抗体的结合通过细胞质量 控制机制， 导致抗体 -MAPKKK 多肽复合物的周转增加。在植物细胞中表达抗体和通过植物 细胞中抗体与蛋白的结合和表达抑制分子通路， 是本领域公知的。参见， 例如， Conrad and Sonnewald， (2003)Nature Biotech.21 ： 35-36， 通过引用并入本文。
     4. 基因破坏 (gene disruption)
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 案 中， 通 过 破 坏 编 码 MAPKKK 多 肽 的 基 因 降 低 或 消 除 MAPKKK 多肽的活性。可以用本领域已知的任何方法破坏编码 MAPKKK 多肽的基因。例如， 在 一个实施方案中， 用转座子标签破坏该基因。 在另一个实施方案中， 用随机或定向诱变使植 物诱变， 并选择 MAPKKK 活性降低的植物， 来破坏基因。
     i. 转座子标记 (transposon tagging)
     在本发明的一个实施方案中， 使用转座子标记降低或消除一种或多种 MAPKKK 多 肽的 MAPKKK 活性。转座子标记包括将转座子插入在内源 MAPKKK 多肽基因中， 以降低或消 除该 MAPKKK 多肽的表达。按照本发明， “MAPKKK 基因” 意图表示编码 MAPKKK 多肽的基因。在该实施方案中， 通过在编码 MAPKKK 多肽的基因的调节区和编码区插入转座子， 降低或消除一种或多种 MAPKKK 多肽的表达。位于 MAPKKK 基因的外显子、 内含子、 5 ′或 3 ′非翻译序列、 启动子或任何其他调节序列中的转座子， 都可以用来降低或消除编码的 MAPKKK 多肽的表达和 / 或活性。
     转座子标记植物中具体基因的方法在本领域内是公知的。参见， 例如， Maes， et al.， (1999)Trends Plant Sci.5 ： 90-96 ； Dharmapuri and Sonti， (1999)FEMS Microbiol. Lett.179 ： 53-59 ； Meissner， et al.， (2000)Plant J.22 ： 265-275 ； Phogat， et al.， (2000)J.Biosci.25 ： 57-63 ； Walbot， (2000)Curr.Opin.Plant Biol.2 ： 103-107 ； Gai， et al.， (2000)Nucleic Acids Res.28 ： 95-96 ； Fitzmaurice， et al.， (1999)Genetics 153 ： 1919-1928)。此外， 在所选的基因中选择 Mu 插入片段的 TUSC 方法描述于 Bensen， et al.， (1995)Plant Cell7 ： 75-85 ； Mena， et al.， (1996)Science 275 ： 1537-1550 和美国专利第 5,962,765 号中。
     ii. 有降低活性的突变体植物
     降低或消除植物中内源基因表达的其他方法在本领域内也是已知的并且同样能 用于本发明。这些方法包括其他形式的诱变， 例如甲磺酸乙酯诱导的诱变、 缺失诱变以及 快中子缺失诱变， 所述快中子缺失诱变用在反向遗传学 ( 用 PCR) 中以鉴定其内源基因已 缺失的植物系。这些方法的实例， 参见， Ohshima， et al.， (1998)Virology 253 ： 572-581 ； Okubara， et al.， (1995)Genetics 137 ： 867-875 和 Quesada， et al.， (2000)Genetics155 ： 521-536。此外， 用所选 PCR 产物的变性 HPLC 或选择性核酸内切酶消化， 快速和自动化地筛 选化学诱导的突变的方法， 即 TILLING(Targeting Induced Local Lesions In Genomes， 定向诱导基因组局部突变技术 )， 也适用于本发明。参见， McCallum， et al.， (2000)Nat. Biotechnol.18 ： 555-557。
     影响基因表达的突变或干扰编码的蛋白功能 (MAPKKK 活性 ) 的突变是本领域公知 的。基因外显子内的插入突变常常导致无效突变体。保守残基内的突变在抑制编码的蛋白 的 MAPKKK 活性中非常有效。 这些突变体能根据公知的方法分离， 并且不同的 A 型 RR 基因座 突变能通过遗传杂交叠加。参见， 例如， Gruis， et al.， (2002)Plant Cell 15 ： 2863-2882。
     在本发明的另一个实施方案中， 占优势的突变体能用来引发由于基因倒位和复制 的基因基因座重组而导致的 RNA 沉默。参见， 例如， Kusaba， et al.， (2003)Plant Cell 15 ： 1555-1567。
     本发明包括降低或消除一种或多种 MAPKKK 多肽活性的其他方法。使植物中基因 组核苷酸序列发生改变或突变的其他方法的实例在本领域内是已知的， 并包括但不限于， 使用 RNA:DNA 载体、 RNA:DNA 突变载体、 RNA:DNA 修复载体、 混合的双链寡核苷酸、 自身互补 的 RNA:DNA 寡核苷酸和诱重组寡核碱基。这些载体和使用方法在本领域内是已知的。参 见， 例如， 美国专利第 5,565,350、 5,731,181、 5,756,325、 5,760,012、 5,795,972 号以及第 5,871,985 号。还参见， WO 98/59350、 WO 99/07865、 WO 99/25821 以及 Beetham， et al.， (1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA96 ： 8775-8778。
     iii. 调节植物的胁迫耐受性
     提供了使用本发明的 MAPKKK 序列调节植物的非生物胁迫耐受性的方法。在具 体的实施方案中， 提供了在非生物胁迫事件中， 增强或维持植物生长和发育的方法。在胁迫 ( 即， 干旱、 盐、 重金属、 极端温度等 ) 阶段， 植物发育通常被推迟或降低。本发明 MAPKKK 序列的水平和 / 或活性的调节能维持或改善植物生长， 甚至在胁迫期间。特别敏感的发育 时期包括早期幼苗发育和开花。在一种方法中， 将 MAPKKK 核苷酸序列引入植物， 并且调节 MAPKKK 多肽的水平和 / 或活性， 据此改善植物对胁迫条件的耐受性并维持生长， 例如， 上述 情况可以反映在枝条生长率、 根发育程度、 成功开花和结籽率或所产生的种子的数量和大 小上。通常引入的 MAPKKK 核苷酸构建体稳定地并入植物基因组并传递给后代。
     检测非生物胁迫中结籽率调节的方法在本领域内是已知的。例如， 在各种胁迫条 件下， 可以监测 MAPKKK 活性受到调节的植物， 并与对照植物比较。 例如， MAPKKK 活性和 / 或 水平受到调节的植物能在开花和结籽期遭受各种程度的胁迫。在相同的条件下， MAPKKK 多 肽的活性和 / 或水平受到调节的遗传修饰的植物比野生型 ( 非转化的 ) 植物， 具有更高数 量和 / 或更大量的发育中的种子。
     因此， 本发明进一步提供了在非生物胁迫 ( 即干旱、 盐、 重金属、 极端温度等 ) 时 期， 产量增加或产量保持的植物。 在一些实施方案中， 在非生物胁迫中产量增加或保持的植 物， 其本发明的 MAPKKK 多肽的水平 / 活性受到调节。在其他实施方案中， 植物包含可操作 地连接于启动子的本发明的 MAPKKK 核苷酸序列， 所述启动子驱动植物细胞中的表达。在某 些实施方案中， 这些植物具有稳定地并入其基因组的核酸分子， 所述核酸分子包含可操作 地连接于启动子的本发明的 MAPKKK 核苷酸序列， 该启动子驱动植物细胞中的表达。 iv. 调节枝条和叶发育
     还提供了调节植物枝条和叶发育的方法。 “调节枝条发育” 和/或 “调节叶发育” 意指植物枝条和 / 或叶发育中的任何改变。在枝条和 / 或叶发育中的这种改变包括但不限 于， 枝条分生组织发育中的改变、 叶数量的改变、 叶大小的改变、 叶和茎维管组织的改变、 节 间长度的改变和叶衰老的改变。如本文所用的， “叶发育” 和 “枝条发育” 包括在单子叶植物 和双子叶植物中在叶和枝条的不同发育阶段， 分别组成叶系统和枝条系统的不同部分的所 有生长方面。检测枝条和叶系统中这种发育改变的方法在本领域内是已知的。参见， 例如， Werner， et al.， (2001)PNAS98 ： 10587-10592 和美国专利申请公开第 2003/0075698 号， 通 过引用将上述每一篇并入本文。
     调节植物枝条和 / 或叶发育的方法包括， 调节本发明 MAPKKK 多肽的活性和 / 或水 平。在一个实施方案中， 提供了本发明的 MAPKKK 序列。在其他实施方案中， 通过向植物中 引入包含本发明 MAPKKK 核苷酸序列的多核苷酸， 表达该 MAPKKK 序列并且据此修饰枝条和 / 或叶发育， 来提供 MAPKKK 核苷酸序列。在其他实施方案中， 引入植物中的 MAPKKK 核苷酸 构建体稳定地并入该植物的基因组。
     在具体的实施方案中， 通过调节植物中 MAPKKK 的水平和 / 或活性， 调节枝条和 / 或叶发育。MAPKKK 活性的调节能导致枝条和 / 或叶发育中的至少一种或多种下述改变， 包 括但不限于， 枝条生长改变 ( 增强或降低 )、 光合作用改变、 叶数量调节、 叶面积改变、 节间 长度改变和叶衰老调节。调节植物中 MAPKKK 多肽的水平因而能增加植物产量。
     如上文讨论， 本领域技术人员可以认出用于调节植物枝条和叶发育的合适启动 子。 该实施方案中示例性的启动子包括组成型启动子或光和作用组织中优选有活性的启动 子， 所述作用组织中有活性的优选启动子包括， 例如， 枝条优选启动子、 枝条分生组织优选 启动子和叶优选启动子。本文其他地方公开了示例性的启动子。
     因此， 本发明还提供了与对照植物相比枝条和 / 或叶发育受到调节的植物。在一 些实施方案中， 本发明的植物具有水平 / 活性增加的或水平 / 活性降低的本发明的 MAPKKK 多肽。
     从外植体建立愈伤组织的方法是已知的。 例如， 根、 茎、 芽、 未成熟胚和无菌下发芽 的幼苗仅是能用来诱导愈伤组织形成的少数组织来源。通常， 使用年轻和活跃生长的组织 ( 即， 年轻叶、 根、 分生组织 )， 但并不是必须的。 通过培养基中存在的生长调节物质 ( 生长素 和细胞分裂素 )， 控制愈伤组织形成。 诱导愈伤组织形成所需的植物调节剂的具体浓度在物 种和物种之间不同， 并且其甚至取决于外植体来源。 在一些实例中， 建议在试验中使用不同 的生长物质 ( 即， 2， 5-D 或 NAA) 或它们的组合， 因为一些物种可能不对特定的生长调节剂作 出反应。此外， 培养条件 ( 即， 光、 温度等 ) 也能影响愈伤组织的建立。一旦建立了， 愈伤组 织培养物能用来起始枝条再生。参见， 例如， Gurel， et al.， (2001)Turk J.Bot.25 ： 25-33 ； Dodds， et al.， (1995).Experiments in Plant Tissue Culture( 植物组织培养实验 )， Cambridge University Press ； Gamborg(1995)Plant Cell， Tissue and Organ Culture， eds.Phillips 和美国专利申请公开第 2003/0180952 号， 通过引用将上述所有文献并入本 文。
     还应当认识到， 增加种子大小和 / 或重量能伴随幼苗生长速率的增加或早期活力 的增加。此外， 如上述讨论的， 调节植物对胁迫的耐受性， 和调节根、 枝条和叶发育， 能增加 植物产量和活力。如本文所用的， 术语 “活力” 是指植物和 / 或特定植物部分的相对健康、 生产率和生长速率， 并且其可以反应在一种或多种不同的发育特性上， 例如叶绿素浓度、 光 和速率、 总生物量和根生物量。 特别相关的是植物早期发育中快速生长的能力， 且该能力与 萌发后发育良好的根系统和发育良好的光合作用器官的成功建立有关。 如本文其他地方所 定义的， 参照对照检测活力改善。
     v. 调节根发育
     提供了调节植物根发育的方法。 “调节根发育” 意指， 与对照植物比较时， 植物根部 发育中的任何改变。 根部发育的这些改变包括但不限于， 初生根生长速率的改变、 新鲜根重 量的改变、 侧根和不定根形成程度的改变、 脉管系统的改变、 分生组织发育改变或或径向膨 胀的改变。
     调节根发育的方法包括调节 ( 降低或增加 ) 植物中 MAPKKK 多肽的水平和 / 或活 性。在一个方法中， 将 MAPKKK 核苷酸序列引入植物并且调节 MAPKKK 多肽的水平和 / 或活 性。在其他的方法中， 引入植物中的 MAPKKK 核苷酸构建体稳定地并入植物基因组中。
     同对照植物相比， 调节 MAPKKK 活性能导致根发育至少有下述一种或多种根发育 的改变， 包括但不限于， 根分生组织更大、 根生长增强、 径向膨胀增强、 脉管系统增强、 根分 支增加、 不定根更多和 / 或新鲜根重量增加。
     如本文所用的， “根生长” 包括， 在单子叶植物和双子叶植物中， 在根发育的不同阶 段， 组成根系统的不同部分的所有生长方面。应当理解， 根生长的增强产生于一种或多种 其部分生长的增强， 所述部分包括初生根、 侧根、 不定根等。检测根系统中这种发育改变的 方法在本领域内是已知的。参见， 例如美国专利申请公开第 2003/0075698 号和 Wemer， et al.， (2001)PNAS 18 ： 10587-10592， 通过引用将上述文献并入本文。
     如上述讨论， 本领域技术人员应当了解用于调节植物根发育的合适启动子。该实施方案的示例性启动子包括本文其他地方公开的根优选启动子。
     还发现， 通过调节多肽的活性和 / 或水平来刺激根生长和增加根群 (root mass) 可用于改善植物的直立性 (standability)。术语 “抗倒伏性 (resistance to lodging)” 或 “直立性” 是指植物将自己固定于土壤的能力。 对于具有直立或半直立生长习性的植物而 言， 该术语还指在不利的 ( 环境 ) 条件下， 维持垂直位置的能力。该性状与根系统的大小、 深度和形态有关。此外， 还发现， 通过调节 MAPKKK 多肽的活性和 / 或水平来刺激根生长和 增加根群可用于在体外促进外植体增殖。
     因此， 本发明还提供了， 与对照植物的根发育相比， 根发育受到调节的植物。在一 些实施方案中， 本发明的植物具有水平 / 活性受到调节的本发明 MAPKKK 多肽并且其根生长 和 / 或根生物量增强。在其他实施方案中， 这些植物有稳定地并入其基因组的核酸分子， 所 述核酸分子包含本发明的 MAPKKK 核苷酸序列， 该核苷酸序列可操作地连接于驱动植物细 胞中表达的根优选启动子， 其中所述序列的表达调节 MAPKKK 多肽的水平和 / 或活性。
     以举例而非限制的方式， 提供下列实施例。
     实施例
     实施例 1 ： 用本发明序列转化玉米
     如在本文的方法中所述的， 用含有 MAPKKK 表达盒的质粒轰击来自温室供体植 物 的 未 成 熟 玉 米 胚。 该 MAPKKK 多 核 苷 酸 可 操 作 地 连 接 于 MAPKKK 启 动 子 和 选 择 标 记 基 因 PAT(Wohlleben， et al.， (1988)Gene70 ： 25-37)， 该 PAT 赋 予 对 除 草 剂 双 丙 氨 膦 (Bialaphos) 的抗性。可选择地， 将该选择标记基因提供在单独的质粒上。按下述实施转 化。培养基配方如下。
     将穗去壳并将表面于 30％的 Clorox 漂白剂外加 0.5％的 Micro 洗涤剂 (Micro detergent) 中灭菌 20 分钟， 并用无菌水漂洗两次。切下未成熟的胚， 并将胚轴朝下 ( 盾片 朝上 )， 每个平板有 25 个胚， 置于 560Y 培养基中 5 小时， 然后排列于 2.5cm 靶区域内准备轰 击。
     制备包含玉米 RR5 序列的质粒载体， 所述 RR5 序列可操作地连接于玉米 RAB17 启 动子。该质粒 DNA 和含有 PAT 选择标记的质粒 DNA 沉淀于 1.1μm( 平均直径 ) 的钨球上， 用如下 CaCl2 沉淀法 ： 100μl 制备的钨颗粒水悬液 ； 10μl(1μg)DNA 的 Tris EDTA 缓冲液 (1μg 总 DNA) ； 100μl2.5M 的 CaCl2 和 10μl 0.1M 的亚精胺。
     向钨颗粒悬液依次加入每种试剂， 同时保持于多管振荡器上。将最终的混合液短 暂超声处理并于持续涡旋中孵育 10 分钟。沉淀以后， 将管短暂离心， 去除液体， 用 500ml 100 ％的乙醇洗涤并离心 30 秒。再去除液体并向最终的钨颗粒球中添加 105μl 100 ％ 的乙醇。为了粒子枪轰击， 将钨 /DNA 颗粒短暂超声处理， 并取 10μl 点于每个大载体 (macrocarrier) 的中心， 并允许在轰击前干燥约 2 分钟。
     用 #HE35-1 或 #HE35-2 粒子枪以 5 级水平轰击样品平板。所有的样品以 650PSI 接受一次射击， 总共 10 等份等分试样取自每管制备的颗粒 /DNA。
     轰击后， 将胚于 560Y 培养基中保存 2 天， 然后转移至含有 3mg/L 双丙烯膦的 560R 选择培养基中， 并每两周传代培养。在选择约 10 周后， 将选择抗性愈伤组织克隆转移至 288J 培养基中， 起始植物再生。体细胞胚成熟 (2-5 周 ) 后， 将发育良好的体细胞胚转移至 发芽培养基中， 并转移至光照培养室中。约 7-10 天后， 将发育中的小植物 (plantlet) 转移至管中不含激素的 272V 培养基中 7-10 天， 直至小植物充分建立 (well-established)。随 后将植物转移到含有盆栽土的浅箱的衬垫 (inserts inflats)( 相当于 2.5″的盆 ) 中， 并 于生长室中生长 1 周， 随后于温室中再生长 1-2 周， 随后转移至标准的盆 600 中 (1.6 加仑 ) 并生长至成熟。在各种胁迫条件下， 监测植物并对其评分， 并与对照植物比较。将监测表型 改变， 例如胁迫耐受性的改善。
     轰 击 培 养 基 (560Y) 含 有 5.0g/l 的 N6 基 础 盐 (SIGMA C-1516)、 1.0ml/l 的 Eriksson 维生素混合物 (1000X SIGMA-1511)、 0.5mg/l 盐酸硫胺素、 120.0g/l 蔗糖、 1.0mg/ l 2， 5-D 和 2.88g/l L- 脯氨酸 ( 用 KOH 将 pH 调节至 5.8， 随后用 D-I 水定容 ) ； 2.0g/l Gelrite ( 在用 D-I 水定容后添加 ) ； 和 8.5mg/l 硝酸银 ( 将培养基灭菌并冷却至室温后 添加 )。选择培养基 (560R) 包含 5.0g/l N6 基础盐 (SIGMA C-1516)、 1.0ml/l Eriksson 维 生素混合物 (1000X SIGMA-1511)、 0.5mg/l 盐酸硫胺素、 30.0g/l 蔗糖和 2.0mg/l 2， 5-D( 用 KOH 将 pH 调节至 5.8 后， 用 D-I 水定容 ) ； 3.0g/l Gelrite ( 在用 D-I 水定容后添加 ) 和 0.85mg/l 硝酸银和 3.0mg/l 双丙烯膦 ( 两者都在培养基灭菌并冷却至室温后添加 )。
     植物再生培养基 (288J) 包含 5.3g/l MS 盐 (GIBCO 11117-075)、 5.0ml/lMS 维生 素储备液 (0.100g 烟酸、 0.02g/l 盐酸硫胺素、 0.10g/l 烟酸吡哆醇和 0.50g/l 甘氨酸， 用精 制的的 D-I 水定容 )(Murashige and Skoog， (1962)Physiol.Plant.15 ： 573)、 100mg/l 肌 醇、 0.5mg/l 玉米素、 60g/l 蔗糖和 1.0ml/l 的 0.1mM 脱落酸 ( 在将 pH 值调至 5.6 后， 用精 制的的 D-I 水定容 ) ； 3.0g/l Gelrite ( 在用 D-I 水定容后添加 ) 和 1.0mg/l 吲哚乙酸 和 3.0mg/l 双丙烯膦 ( 将培养基灭菌并冷却至 60℃后添加 )。无激素培养基 (272V) 包含 5.3g/l MS 盐 (GIBCO 11117-075)、 5.0ml/l MS 维生素储备液 (0.100g/l 烟酸、 0.02g/l 盐 酸硫胺素、 0.10g/l 烟酸吡哆醇和 0.50g/l 甘氨酸， 用精制的 D-I 水定容 )、 0.1g/l 肌醇和 50.0g/l 蔗糖 ( 在将 pH 值调到 5.6 以后， 用精制的 D-I 水定容 ) 和 6g/l BactoTM- 琼脂固 化剂 ( 在用精制的 D-I 水定容后添加 )， 灭菌并冷却至 60℃。
     实施例 2 ： 调节植物产量
     对 于 用 MAPKKK 核 苷 酸 序 列 (SEQ ID NO ： 1、 4、 7 或 9) 进 行 的 农 杆 菌 (Agrobacterium) 介导的玉米转化， 所述 MAPKKK 核苷酸序列 (SEQ ID NO ： 1、 4、 7 或 9) 可操 作地连接于玉米泛素启动子或胁迫诱导启动子， 使用 Zhao 的方法 ( 美国专利第 5,981,850 号和 PCT 专利公开号第 WO98/32326 号 ； 通过引用将其内容并入本文 )。简单而言， 从玉米 分离未成熟的胚并将该胚与农杆菌悬液接触， 其中该细菌能将 MAPKKK 核苷酸序列转移至 至少一个未成熟胚的至少一个细胞中 (1 步 ： 感染步骤 )。在该步中， 将未成熟胚浸入农杆 菌悬液中， 起始接种。将该胚与该农杆菌共培养一段时间 (2 步 ： 共培养步骤 )。感染步骤 以后， 将该未成熟胚培养于固体培养基。该共培养时期后， 考虑一可选的 “休眠 (resting) 步骤。在该休眠步骤中， 在至少一种抗生素存在的情况下， 孵育该胚， 已知所述抗生素在没 有添加植物转化体的选择剂时抑制农杆菌的生长 (3 步 ： 休眠步骤 )。为了去除农杆菌和为 了感染细胞的休眠期， 该未成熟的胚培养于有抗生素但没有选择剂的固体培养基上。 然后， 将接种过的胚培养于含有选择剂的培养基中， 并且恢复生长中的转化的愈伤组织 (5 步 ： 选 择步骤 )。 将未成熟胚培养于含有选择剂的固体培养基上， 该选择剂导致转化的细胞的选择 生长。随后将愈伤组织再生为植物 (5 步 ： 再生步骤 )， 并将生长于选择培养基上的愈伤组 织培养在固体培养基上， 以再生为植物。监测与合适的对照植物比较时， 该植物枝条生长、 叶衰老和 / 或光合作用的调节。 还监测植物产量的调节。
     实施例 3 ： 大豆转化
     如下述， 用含有 MAPKKK 序列的质粒轰击大豆胚， 所述 MAPKKK 序列可操作地连接于 玉米泛素启动子。为了诱导体细胞胚， 将从表面消过毒的大豆品种 A2872 的未成熟种子切 下长度为 3-5mm 的子叶， 在光下或黑暗中于 26℃下于琼脂培养基中培养 6-10 周。 随后切下 产生次级胚的体细胞胚， 并置于合适的液体培养基中。在反复选择繁殖为早期球形期胚的 体细胞胚簇后， 按下文所述， 维持悬液。
     将大豆胚胎发生悬浮培养物维持于 26℃下， 维持在 150rpm 旋转振荡器上的 35ml 液体培养基中， 同时按日 / 夜为 16 ∶ 8 小时安排荧光照射。每两周， 通过将约 35mg 的组织 接种至 35ml 液体培养基中， 对培养物进行传代培养。
     大豆胚胎发生悬浮培养物然后用粒子枪轰击方法转化 (Klein， et al.， (1987) Nature(London)327 ： 70-73， 美国专利第 5,955,050 号 )。DuPontBiolistic PDS1000/HE 仪 器 ( 改装氦 ) 可用于这些转化。
     用来促进大豆转化的选择标记基因是转基因， 该转基因由来自花椰菜花叶病毒 35S 启动子 (Odell， et al.， (1985)Nature 313 ： 810-812)、 来自质粒 pJR225 的潮霉素磷酸 转移酶基因 ( 来自 E.coli ； Gritz， et al.， (1983)Gene25 ： 179-188) 和来自根瘤农杆菌的 Ti 质粒的 T-DNA 中的胭脂氨酸合酶基因的 3′端组成。包含 MAPKKK 的表达盒可分离为限 制性片段， 所述 MAPKKK 可操作地连接于玉米泛素启动子。能随后将该片段插入携带标记基 因的载体的唯一限制位点。
     向 50μl 60mg/ml 的 1μm 金粒悬液中加入 ( 依次 ) ： 5μl DNA(1μg/μl)、 20μl 亚精胺 (0.1M) 和 50μl CaCl2(2.5M)。该颗粒制剂随后搅动 3 分钟， 微量离心机中离心 10 秒， 并去除上清。该 DNA 包被的微粒随后在 500μl 70％乙醇中洗涤一次， 并重悬于 50μl 无水乙醇中。将该 DNA/ 微粒悬液超声处理 3 次， 每次 1 秒。随后， 将 5μl DNA 包被的金粒 加载于每个大载体盘 (macro carrier disk) 上。
     将约 300-500mg 两周龄的悬浮培养物放置于空的 60×15mm 的皮氏培养皿中， 并用 吸管从组织中去除残余的液体。对于每次转化实验， 通常轰击约 5-10 个平板组织。膜破裂 压设置在 1100psi， 并将枪膛抽真空至 28 英寸汞。距保留屏 (retaining screen) 约 3.5 英 寸， 放置组织， 并轰击 3 次。轰击后， 将组织分成两半， 并放回至液体中， 并按上述描述培养。
     轰击后 5-7 天， 用新鲜的培养基更换液体培养基， 并且轰击后 11-12 天， 用含 50mg/ ml 潮霉素的新鲜培养基更换。可每周更换该选择培养基。轰击后 7-8 周， 可以观察到绿色 的转化组织从未转化的坏死胚胎簇中长出。去除分离的绿色组织并接种至个体烧瓶中， 以 产生新的无性繁殖的、 转化的胚胎发生悬浮培养物。可以将每个新品系作为独立的转化事 件处理。 这些悬液可随后进行传代培养， 并作为未成熟胚簇维持， 或通过个体体细胞胚的成 熟和发芽再生为完整植物。
     实施例 4 ： 向日葵分生组织转化
     如下述， 用含有 MAPKKK(SEQ ID NO ： 1、 4、 7 或 9) 的表达盒转化向日葵分生组织， 所 述 MAPKKK 可操作地连接于玉米泛素启动子或胁迫诱导启动子 ( 还参见， 欧洲专利申请号第 EP 0 586233 号， 通过引用并入本文， 和 Malone-Schoneberg， et al.， (1995)Plant Science103 ： 199-207)。用单小麦穗脱粒机 (single-wheat head thresher) 将成熟的向日葵种子 (Helianthus annuus L.) 去壳。将种子在 20％ Clorox 漂白剂溶液进行表面灭菌 30 分 钟， 每 50ml 溶液加两滴 Tween20 。将种子用无菌蒸馏水漂洗两次。
     劈开胚轴的外植体通过改良的 Schrammeijer 等 (Schrammeijer， et al.， (1990) Plant Cell Rep.9 ： 55-60) 所述的方法制备。表面灭菌过程后， 将种子在馏水中浸没 60 分 钟。随后折断每粒种子的子叶， 从而在胚轴平面处产生干净的断面。切除根尖以后， 在初 叶间纵向对切外植体。将两等份切面朝上放置于由 Murashige 和 Skoog 矿物元素组成的 GBA 培养基中 (Murashige， et al.， (1962)Physiol.Plant.， 15 ： 573-597)， Shepard 维生 素添加物 (Shepard， (1980)in Emergent Techniques for the Genetic Improvement of Crops(University of Minnesota Press， St.Paul， Minnesota)， 50mg/l 硫酸腺嘌呤、 30g/ l 蔗糖、 0.5mg/l 6- 苄基氨基喋呤 (BAP)、 0.25mg/l 吲哚 -3- 醋酸 (IAA)、 0.1mg/l 赤霉酸 (GA3)pH 5.6 以及 8g/l 植物琼脂。
     在农杆菌处理之前， 外植体进行微粒轰击 (Bidney， et al.， (1992)Plant Mol. Biol.18 ： 301-313)。 将 30-40 株外植体放置于 60×20mm 平板中心围成圆圈进行该处理。 将 约 5.7mg 1.8mm 的钨微粒悬浮于 25ml 无菌 TE 缓冲液 (10mM Tris HCl， 1mM EDTA， pH 8.0) 中， 并且每次轰击用 1.5ml 等分试样。在 PDS 1000 粒子加速装置中， 通过置于样品上方 2cm 处的 150mm nytex 屏幕， 将每一平板轰击两次。
     在所有的转化实验中， 使用无害的根瘤农杆菌菌株 EHA105。包含表达盒的二元质 粒载体， 如 Holsters， et al.， (1978)Mol.Gen.Genet.163 ： 181-187 所述， 通过冻融引入农 杆菌菌株 EHA105， 所述表达盒含有可操作地连接于玉米泛素启动子的 RR6 基因。该质粒还 包含卡那霉素选择标记基因 ( 即 nptII)。将用于植物转化实验的细菌在液体 YEP 培养基 (10gm/l 酵母提取物， 10gm/l Bacto 蛋白胨和 5gm/l NaCl， pH 7.0) 中生长过夜 ( 于 28℃ 和 100RPM 连续搅拌 )， 所述液体 YEP 培养基中有细菌菌株和二元质粒维持所需的合适的抗 生素。当细菌的 OD600 达到约 0.5-0.8 时， 可以使用该悬液。沉淀农杆菌细胞， 并以 0.5 的 最终 OD600 重悬浮于由 12.5mM MES pH 5.7、 1gm/l NH5Cl 和 0.3gm/l MgSO5 组成的接种培养 基中。
     将新近轰击的外植体置于农杆菌悬液中， 混合， 并静置 30 分钟。随后将该外植体 转移至 GBA 培养基中， 于 26℃和日 18 小时下共培养， 切割面向下。共培养 3 天后， 将该外植 体转移至补充有 250mg/l 头孢噻肟和 50mg/l 硫酸卡那霉素的 375B( 不含生长调节剂和蔗 糖水平减少至 1％的 GBA 培养基 ) 中。根据选择， 将该外植体培养 2-5 周， 随后转移至不含 卡那霉素的新 375B 培养基中继续发育 1-2 周。将该外植体转移至含有 250mg/l 头孢噻肟 的 GBA 培养基中， 进行第二次 3 天的植物激素处理， 该外植体具有未形成适于切割枝条的分 化的抗生素抗性生长区域。通过 ELISA 检测来自绿色卡那霉素抗性枝条的叶样品中 NPTII 的存在， 并通过测定 MAPKKK 活性， 检测转基因表达的存在。
     将 NPTII 阳性枝条移植至体外生长的 PIONEER 杂种 6550 向日葵幼苗根茎。表 面灭菌的种子在 58-0 培养基中萌发 ( 半强度 Murashige 和 Skoog 盐、 0.5 ％蔗糖、 0.3 ％ Gelrite pH 5.6)， 并生长于外植体培养所述的条件下。除去幼苗的上部分， 于下胚轴中 制成 1cm 的垂直切片， 并将转化的枝条插入该切口。用 PARA film 包裹整个区域以固定枝 条。在体外培养一周后， 将移植的植物转移至土壤中。土壤中的移植体维持在高湿度条件下， 缓慢适应温室环境。通过叶提取物的 NPTII ELISA 鉴定和 / 或通过 MAPKKK 活性分析， 鉴定温室中成熟的 T0 植物 ( 亲本 ) 的转化部分， 而通过干种子子叶小部分的 MAPKKK 活性 分析来鉴定从 NPTII 阳性 T0 植物收获的转基因种子。
     实施例 5 ： 水稻转化
     本领域技术人员可利用的将 DNA 转化进高等植物细胞中的方法是高速弹道 轰击法， 其使用包被有感兴趣的核酸构建体的金属颗粒 ( 参见， Klein， et al.， (1987) Nature(London)327 ： 70-73， 并 参 见 美 国 专 利 第 4,945,050 号 )。 这 些 补 充 性 实 验 使 用 PDS-1000/He(BioRAD Laboratories， Hercules， CA)。
     赋予抗生素抗性的来自吸水链霉菌 (Streptomyces hygroscopicus) 的细菌潮霉 素 B 磷酸转移酶 (Hpt II) 基因， 可以用作水稻转化的选择标记。在该载体中， Hpt II 基因 可以用来自花椰菜花叶病毒的 35S 启动子和来自根瘤农杆菌的羧乙基精氨酸合酶基因的 终止和聚腺苷酸化信号进行改造。例如， 参见 WO 97/47731 中 pML18 载体的描述， 其公开于 1997 年 12 月 18 日， 通过引用将其公开的内容并入本文。
     来自发芽的水稻种子盾片的胚胎发生愈伤组织培养物作为转化实验的材料来源。 该材料通过在黑暗中于 27-28℃下的愈伤组织起始培养基 (MS 盐、 Nitsch 和 Nitsch 维生 素、 1.0mg/l 2， 4-D 和 10μM AgNO3) 中使无菌水稻种子发芽而产生。将从胚的盾片中增殖 的胚胎发生愈伤组织转移至 CM 培养基 (N6 盐、 Nitsch 和 Nitsch 维生素、 1mg/l 2， 4-D， Chu， et al.， (1985)Sci.Sinica 18 ： 659-668) 中。通过常规传代培养以 2 周间隔将愈伤组织培 养物维持在 CM 上， 用于在起始 10 周内转化。
     通过传代培养 0.5-1.0mm 碎片制备愈伤组织用于转化， 该碎片相隔约 1mm， 排列在 放置于 CM 培养基上的 Whatman #541 纸上环中心约 4cm 直径的圆形区域内。将具有愈伤 组织的平板在 27-28℃于黑暗中培养 3-5 天。轰击前， 将具有愈伤组织的滤纸转移到补充 有 0.25M 甘露醇和 0.25M 山梨醇的 CM 中， 在黑暗中放置 3 小时。在无菌罩内， 使皮氏培养 皿的盖子半开约 20-45 分钟， 驱散组织上的水分。
     将每个基因组 DNA 片段用 pML18( 含有用于水稻转化的选择标记 ) 共沉淀至金颗 粒表面。为完成该步骤， 将总计 10μg 的性状 ： 选择标记 DNA 比例为 2 ∶ 1 的 DNA 添加至已 -1 经以 60mg ml 浓度重悬浮的 50μl 金颗粒的等分试样中。随后将氯化钙 (50μl 2.5M 的 溶液 ) 和亚精胺 (20μl 0.1M 的溶液 ) 添加至涡旋中的金 -DNA 悬液中， 同时试管涡旋 3 分 钟。将该金颗粒于微量离心机中离心 1 秒， 并去除上清。用 1ml 无水乙醇将该金颗粒洗涤 两次， 随后重悬浮于用 50μl 无水乙醇中， 并超声处理 ( 水浴超声器 )1 秒以分散该金颗粒。 将该金颗粒于 -70℃孵育 5 分钟， 如果需要分散该颗粒， 进行超声处理 ( 水浴超声器 )。然 后将 6μl DNA 包被的金颗粒加载至 Mylar 大载体盘上并允许乙醇挥发。
     在干燥阶段结束时， 将含有该组织的皮氏培养皿置于 PDS-1000/He 的腔室中。然 后将该腔室内的空气抽真空至 28-29 英寸汞。使用当冲击管 (shock tube) 中 He 压达到 1080-1100psi 时破裂的安全膜 (rupture membrane， 用氦冲击波使该大载体加速。该组织 置于停止屏约 8cm 处， 并轰击该愈伤组织两次。用 DNA 包被的金颗粒以该方法轰击 2-4 个 平板组织。轰击后， 将该愈伤组织组织转移至没有补充山梨醇或甘露醇的 CM 培养基中。
     轰击后 3-5 天内， 将该愈伤组织转移至 SM 培养基中 ( 含有 50mg/l 潮霉素的 CM 培养基 )。为完成该步骤， 将该愈伤组织从平板转移至无菌的 50ml 圆锥管中并称重。以每100mg 愈伤组织， 2.5ml 顶层琼脂， 添加 40℃溶化的顶层琼脂。通过 10ml 移液管反复吸打， 将愈伤组织团块打碎成直径小于 2mm 的碎块。将每份 3ml 愈伤组织悬液的等分试样平铺至 新鲜的 SM 培养基上， 并将该平板于黑暗中 27-28℃下孵育 4 周。4 周以后， 鉴定转基因愈伤 组织事件， 转移至新鲜的 SM 平板， 并在黑暗中于 27-28℃下再生长 2 周。
     将生长中的愈伤组织转移至 RM1 培养基 (MS 盐、 Nitsch 和 Nitsch 维生素、 2％蔗 糖、 3％山梨醇、 0.4％ Gelrite +50ppm 潮霉素 B) 中， 于黑暗中 25℃下 2 周。两周后， 将该 愈伤组织转移至 RM2 培养基 (MS 盐、 Nitsch 和 Nitsch 维生素、 3 ％蔗糖、 0.4 ％ Gelrite -2 -1 +50ppm 潮霉素 B) 中， 并在冷白光 ( ～ 40μEm s ) 光周期 12 小时的情形下， 置于 25℃和 30-40％湿度下。在光下 2-4 周后， 愈伤组织开始组织起来并形成枝条。将枝条从周围的愈 伤组织 / 培养基中去除并轻轻的转移至 RM3 培养基 (1/2×MS 盐、 Nitsch 和 Nitsch 维生素、 TM 1％蔗糖 +50ppm 潮霉素 B) 中， 该培养基在 PHYTATRAY 一次性植物细胞培养容器中 (Sigma Chemical Co.， St.Louis， MO)， 并用上述步骤描述的相同条件继续孵育。
     当出现足够的根和枝条时， 2-3 周后， 将该植物从 RM3 转移至含有 Metro 混合物 350 的 4” 盆中。
     实施例 6 ： MAPKKK 变体
     A. 不改变编码的氨基酸序列的 MAPKKK 的变异的核苷酸序列 (SEQ ID NOS ： 1、 4、 7、 9)
     SEQ ID NOS ： 1、 4、 7、 9 所示的 MAPKKK 核苷酸序列可以用来产生变异的核苷酸序 列， 该变异的核苷酸序列当与 SEQ ID NOS ： 1、 4、 7、 9 的初始未改变的 ORF 核苷酸序列比较 时， 具有 0％、 75 ％、 80％、 81％、 82 ％、 83 ％、 84 ％、 85％、 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89％、 90 ％、 91 ％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％的核苷酸序列同一性。 用标准密码子表产生 这些功能变体。尽管变体的核苷酸序列发生了改变， 但可读框编码的氨基酸序列并未发生 改变。
     B.MAPKKK 的变异的氨基酸序列
     可以产生 MAPKKK 的变异的氨基酸序列。在本实施例中， 可以改变一个氨基酸。特 别是， 可以检查 SEQ ID NO ： 2、 5、 8 或 10 所示的序列， 以确定适当的氨基酸改变。通过参考 蛋白比对， 可以选择待改变的氨基酸。参见图 2。可以选择认为并未处于高选择压 ( 不是高 度保守的 ) 下并且其相当容易地被有相似化学特征 ( 即， 相似的功能侧链 ) 的氨基酸取代 的氨基酸。用图 2 所示的蛋白比对， 能改变合适的氨基酸。玉米 MAPKKK 蛋白中表现出低百 分比序列同一性的氨基酸残基未突出显示。在图 2 中可发现其他的保守残基。一旦鉴定出 定向氨基酸， 则进行实施例 5A 概括的程序。用该方法可以产生与 SEQ ID NOS ： 2、 5、 8 或 10 具有约 70 ％、 75 ％、 80％、 81％、 82 ％、 83 ％、 84％、 85 ％、 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89 ％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％的氨基酸序列同一性的变体。
     C.MAPKKK 的其他变异的氨基酸序列
     在本实施例中， 产生相对于参照蛋白序列具有 70％、 75％、 80％、 81％、 82％、 83％、 84 ％、 85 ％、 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89 ％、 90 ％、 91 ％、 92 ％、 93 ％、 94 ％、 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98 ％或 99％的同一性的人工蛋白序列。该较后的努力需要根据图 2 所示的比对鉴定保守区和可变 区， 然后正确运用氨基酸取代表。这些部分将在下文进行更详细的论述。
     在很大程度上， 确定可以改变哪个氨基酸序列基于 MAPKKK 蛋白中的保守区。参见图 2。基于序列比对， 能确定可能改变的 MAPKKK 的各个区。应当认识到， 在不改变功能的情 况下， 能在保守区域内进行保守取代。此外， 本领域技术人员应当理解， 本发明 MAPKKK 序列 的功能变体还可以在保守结构域内有较小的氨基酸改变。
     随 后 产 生 人 工 蛋 白 序 列， 其 在 80-85 ％、 85-90 ％、 90-95 ％ 和 95-100 ％ 同 一 性 的间隔内， 不同于原始序列。这些间隔的中点， 例如以减或加 1 ％的自由范围 (literal latitude) 定向。氨基酸取代通过常规 Perl script 实现。下文的表 2 提供了该取代表。
     表 2. 取代表
     氨基酸 I L V A G D E W Y S 高度相似的和最佳的取代 L， V I， V I， L G A E D Y W T 改变的顺序等级 1 2 3 5 5 6 7 8 9 10 备注 50 ∶ 50 取代 50 ∶ 50 取代 50 ∶ 50 取代T K R N Q F MS R K Q N Y L11 12 13 15 15 16 17 第一个蛋氨酸不能改变46102112614 A CN 102112618 H C P
    说明Na Na Na书没有好的取代 没有好的取代 没有好的取代44/51 页首先， 鉴定蛋白中不应当被改变的任何保守氨基酸， 并且 “划分出” 用于与取代隔 离。当然， 起始蛋氨酸将自动地添加至该表。下一步， 进行所述改变。
     H、 C 和 P 在任何条件下不改变。首先， 改变将从异亮氨酸开始， 从 N 末端扫到 C 末 端； 随后是亮氨酸， 并沿列表向下至达到所需的靶标。可以进行中间数量的取代， 以不引起 改变的逆转。列表按 1-17 排列， 以便在亮氨酸前根据需要进行许多异亮氨酸改变， 并如此 继续向下至蛋氨酸。很显然， 按这种方式， 很多氨基酸不需要改变。L、 I 和 V 将包括两种交 替的最佳取代的 50 ∶ 50 的取代。
     变异的氨基酸序列作为输出结果记下。Perl script 用来计算同一性百分比。使 用该程序， 产生的 MAPKKK 变体与 SEQ ID NO ： 3 或 6 的起始未改变的 ORF 序列具有约 70％、 75 ％、 80 ％、 81 ％、 82 ％、 83 ％、 84 ％、 85 ％、 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89 ％、 90 ％、 91 ％、 92 ％、 93 ％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％的氨基酸同一性。 实施例 7 ： 鉴定玉米 NPK1 相关序列
     玉 米 MAPKKK 与 水 稻 NPK1 样 基 因 (dbj|BAB64165.1|(AP003254)NPKl 相 关 蛋 白 激酶样蛋白 [ 水稻 ]E ＝ 0.094[5 ′ (1)， 3 ′ (0)PCL253028(1)cds3f.pk005.d19) 是直系 同源的， 其从两个表达谱分析实验 (expression profiling Agilent experiment) 中首次 得以鉴定， 即 ‘Cold-induced gene expression in B73 seedling shoots with time of 在 B73 幼苗枝条中寒 exposure to low-temperature stress( 随着暴露于低温胁迫的时间， 冷诱导的基因表达 )’ ， 和 ‘Stress-induced gene expression in CML349seedling shoots with time of exposure to stress( 随着暴露于胁迫的时间， 在 CML349 幼苗枝条中胁迫诱 导的基因表达 )’ 。
    这些实验的目的是开发在暴露于脱水胁迫的时间增加的条件下改变基因表达模 式的蓝图， 应用于低温胁迫形式。第一个实验涉及使 B73 幼苗生长 14 天， 从种植开始， 接下 来强迫其接受 10℃的寒冷胁迫， 随后在暴露于低温下 0 小时、 0.5 小时、 1 小时、 4 小时、 8小 时和 24 小时时， 和最后低温胁迫处理即寒冷胁迫 24 小时后， 在 25℃恢复 48 小时时， 收集超 出胚芽鞘的全部枝条组织。进行两两比较， 以便确定相对于 0 时间对照， 在暴露于寒冷后的 每个时间点的基因表达改变的本质。该实验给出， 了解 B73 中各种基因和通路的时控诱导， 所述基因和通路从暴露于寒冷胁迫的早期至晚期被打开。 其还通过以下方式帮助鉴定干旱 和寒冷的候选基因和启动子 ： (1) 确定寒冷胁迫下有关键诱导行为的基因是否在文献中报 道为与干旱胁迫具有相关性， 和 (2) 寒冷胁迫下有关键诱导行为的基因的表达是否在 Lynx MPSS 实验中表现出干旱或激素 (ABA， 乙烯 ) 胁迫的相关诱导。
     用 CML349 代替 B73 重复了上述实验。CML349 是来自 CIMMYT 的热带高原玉米系， 已知所述 CIMMYT 对低温的耐受性获得改善。第二个实验后， 比较 CML349 和 B73 中的基因 时控诱导， CML349 为有耐寒性的墨西哥高原系， B73 为比 CML349 具有较少耐寒性的玉米带 臼齿系。
     在这些基因表达谱分析实验中， 与水稻 NPK1 样激酶同源的玉米 EST 显出有趣的行 为。我们发现， 在 CML349 中， 玉米 EST， cds3f.pk005.d19， 在寒冷暴露后 1 小时的早期时间 点表现出最高的表达水平。而在 B73 中没有诱导出相同的程度 ( 表 3， 附图 1)。Agilent 表 达的强度显示， B73 在正常温度下有高的该基因表达水平， 在暴露于低温胁迫下 4 小时后， 表达水平进一步增加两倍。另一方面， 在正常温度下， CML349 有低水平的该基因表达， 但是 在暴露于寒冷胁迫后很早的 1 小时， 该基因几乎被诱导 36 倍。在胁迫暴露后 1 小时的早期 时间点， 诱导水平比相同时间点的 B73 中的水平要高， 并且也高于暴露于胁迫 4 小时后 B73 中的诱导水平。我们以前的蛋白谱分析实验 ( 与 Oxford GlycoSciences 合作 ) 已经表明， 参与抗氧化胁迫的数种基因的蛋白水平， 在 CML349 中为正常高的水平， 或经诱导， 高于 B73 中的水平。这与报道的 NPK1 的拟南芥直系同源物即 ANP1 的作用一致， ANP1 自身受模拟氧 化胁迫的过氧化氢的诱导， 并当其为组成型活性， 增加了包括 GST6 在内的特异性胁迫应答 基因的启动子活性 (Kovtun， et al.， (2000)Proc Natl Acad Sci 97 ： 2940-2945)。
     表 3.B73 和 CML349 中 ZmNPK1b 的胁迫诱导表达水平。 在暴露于胁迫后不同的时间 段， B73 和 CML349 中的 ZmNPK1b 表达水平， 通过微列阵分析 (Agilent Technologies， Santa Clara， CA) 中颜色强度来检测。强度 2 表示暴露于胁迫后任何给定时间点的基因表达。
    实施例 8 ： 分离玉米 NPK1 相关序列
     在 EST cds3f.pk005.d19 全插入测序 (full-insert sequencing) 后， 显示其含有 部分克隆。以两种方式使用 cds3f.pk005.d19 的序列， 以获得 NPK1 的全序列。
     首先， 对于 cds3f.pk005.d19 部分序列的同源物， 针对 PHI 重叠群， 进行 blast 搜 索。依赖该结果， 将 PCO527001(UC5.1) 或 PCO644860(UC6.0) 鉴定为接近的同源物和代表 性 EST， 将 ctst1s.pk017.e17 全插入测序， 并随后发现是全长的。
     cds3f.pk005.d19 序列也用于 BAC- 文库筛查。鉴定 BAC 克隆 (bacb.pk191.e03) 并测序。使用从 BAC 序列的基因组信息拼接在一起的编码序列信息 PCR 出完全的编码序列 (CDS)。该完全的 CDS 序列表示在 PCO644861 中 (Top Blast UPI00000AA4AE NPK1 相关蛋 白激酶样蛋白 [ 水稻 ( 日本培养组 )]E ＝ 0.0( 参考蛋白 MAR-31-2006)[Members( 成员 )
     ＝ 20， ORFCode ＝ 5NOCXX]UC6.0)。因此， 要求和完成了数个组成性 EST 的全插入测序。使 用 SEQ ID NO ： 12 和 13 所示的引物从 BAC 克隆 p1.bacb.pk191.e03 扩增 Zm NPK1b 互补的 DNA 序列。
     鉴定为与 ctst1s.pk017.e17(PCO644860) 直系同源的水稻 NPK1 相关蛋白激酶是 NP_917080， 并且与 cds3f.pk005.d19(PCO644861) 同系的， 是 NP_917084/BAB64165.1。 来自 前者的玉米 NPK1 序列称为 ZmNPK1a， 且来自后者的玉米 NPK1 序列称为 ZmNPK1b。
     用烟草 NPK1 蛋白进行随后的搜索以在公共结构域中鉴定有最接近的同源性的水 稻序列， 并且这产生了水稻蛋白 BAF24980。该水稻蛋白与烟草蛋白具有 57.5％的共有序 列和 48.2％的同一性。使用该水稻蛋白搜索 Unicorn 6.0， 并且鉴定出的最接近的玉米直 系同源物是 PCO622918。该序列是部分的， 有不完全的 5’ 端， 并称为 ZmNPK1c。此外， 当检 查可能的图谱位置时， 鉴定出， ZmNPK1a 与以 PCO638212 为代表的 NPK1 相关激酶共定位， 该 PCO638212 称为 ZmNPK1d。ZmNPK1a， ZmNPK1b， ZmNPK1c 和 ZmNPK1d 的序列信息分别提供为 SEQ ID NOS ： 1-3、 4-6、 7-8 和 9-11。
     实施例 9 ： 染色体定位， 表达信息和鉴定序列的细胞特异性
     针对公开的和专有的 BAC 序列， 用 BLAST 搜索， 检查与 ZmNPK1a、 ZmNPK1b、 ZmNPK1c 和 ZmNPK1d( 分别为 PCO644860、 PCO644861、 PCO622918 和 PCO638212) 相关的重叠群的可 能的染色体位置。ZmNPK1a(PCO644860)、 ZmNPK1b(PCO644861) 和 ZmNPK1d(PCO638212) 定 位在 3 号染色体上， 而 ZmNPK1c 定位在 2 号染色体上。用专有的关联工具发现 ZmNPK1a 和 ZmNPK1d 与 Staygreen 表型的 QTL 潜在关联。用该同一工具观察到， ZmNPK1c(PCO622918) 表现出与产量 QTL， 还和抽丝开花间隔、 Staygreen 和 Barrencount 的干旱 QTL 显示潜在关 联。应当指出， 该专有关联工具使用专有 QTL 数据， 所述专有 QTL 数据涉及与染色体区的低 分辨率的表型关联， 对一些性状而言， 所述染色体区可以大至 75cM。因此， 这里提出的关联 不能证明， 具体基因控制这些性状， 而是这些关联表明， 存在哪些可供考虑的性状关联。
     在 Lynx MPSS 文库中分析了所有四条序列的天然表达。发现 ZmNPK1a 在茎和根组 织中高表达， 在 B73 茎的叶枕组织中观察到 204ppm 的最高表达。发现 ZmNPK1b 在核和根组 织中高表达， 在授粉后 0 天时的玉米核中表达最高， 为 984ppm， 紧接其后的是玉米初生根中 的 928ppm。 ZmNPK1c 在 Lynx 文库中几乎没有表现度， 并因此具有非常低的该基因表达水平。 最后， ZmNPK1d 的表达在所有组织中均匀分配， 在授粉后 0 天时的玉米核中， 最高为 263ppm。
     用商业上或公众可获得的 TargetP、 ChloroP、 SIGNALP 和 PSORT 搜索工具， 扫描蛋 白序列的典型靶肽， 检查所有四条序列的细胞定位。(Emanuelsson et al.(2007)Nature Protocols 2 ： 953-971 ； Nakai and Horton(1999)Trends Biochem.Sci.24(1) ： 34-36)。该 结果显示， ZmNPK1a、 ZmNPK1b 和 ZmNPK1d 定位于植物细胞的线粒体。任何程度的自信都不 能预测 ZmNPK1c 的定位， 可能是由于其不完全的 N 端区。
     实施例 10 ： 通过胁迫或激素处理诱导天然 MAPKKK
     用 Lynx(MPSSTM) 中的大规模并行信号测序进行玉米基因的胁迫诱导表达谱分析 ( 参见， Brenner， et al.， (2000)Nature Biotechnology18 ： 630-634， Brenner， et al.， (2000)Proc Natl Acad Sci USA 97 ： 1665-1670)。
     玉米杂种 3245 遭受剧烈的水胁迫， 目的是相对于良好水条件下的相同杂种产量 降低约 55-70％。在开花期前， 在约 650-700GDU 时 ( 生长程度单位 )， 强加该胁迫 5 周， 并且开花期后继续 2 周或超过 300GDU。每个小块地有 4 排植物。在该胁迫期， 授粉后 7 天时， 在良好水和干旱胁迫处理下， 从穗叶、 第一次抽丝时未成熟的穗和穗基部和穗顶部核收集 样品。在液氮中研磨样品， 提取 RNA 并进行表达谱分析。
     对于寒冷胁迫诱导研究， 将近交种 B73 或 CML349 的玉米幼苗发芽并在温室中生长 在最适宜的温度条件下。 10 天龄幼苗的叶构成样品材料。 该实验包括三种处理， 即， 对照或 最佳温度、 冷处理和从冰冻中恢复。 将未接受任何寒冷胁迫的对照幼苗迁移至生长室， 该生 长室与温室保持相同的温度条件， 而将进行冷处理的幼苗迁移至维持在 10℃的生长室。用 于从冰冻恢复的幼苗经历 -2℃达 2 小时， 并随后于最佳温度下允许恢复 6 小时。继续冷和 从冰冻中恢复达 6 小时的时间段。在需要的时间段末收获所有的三种处理物， 放入液氮并 进行 RNA 提取， 随后进行表达谱分析。
     对于激素诱导研究， 将近交种 B73 的玉米幼苗生长于温室中， 高达 V5 阶段。这时， 用 0.1mM ABA( 脱落酸 ) 或 1mM 乙烯利植物生长调节剂处理该植物。在 ABA 或乙烯利处理 0 小时、 24 小时和 48 小时， 收获因此而受到处理的六株植物的叶， 在液氮中研磨， 并进行 RNA 提取， 随后进行表达谱分析。在激素处理 0 小时时收获的植物构成对照。
     如表 4 所示， 发现 ZmNPK1b 和 ZmNPK1d 为干旱胁迫和应激激素 ABA 和乙烯处理特 异诱导。ZmNPK1b 为寒冷诱导。
     表 4. 在 Lynx MPSS 文库中， ZmNPK1b 和 ZmNPK1d 的胁迫相关表达
     在 Lynx MPSS 文库中 ZmNPK1b 的胁迫相关表达 ( 标签 ： GATCAGCGGATGCTTCG)
    
    
    在 Lynx MPSS 文库中 ZmNPK1d 的胁迫相关表达 ( 标签 ： GATCCCGGGTGTTGTGT)50102112614 A CN 102112618 名称 Cla24lm-sig Cla48lm-sig Cle24lm-sig Cle48lm-sig Cl0lm-sig Cktsslm-sig Ckbsslm-sig Cktwwlm-sig Ckbwwlm-sig Csdl1lm-chil 16 Csdl1lm-fro
     39 幼苗 幼苗 B73 B73 PPM 99 205 75 19 52 114 29 74 155 组织 叶 叶 叶 叶 叶 种子 种子 种子 种子说基因型 B73 B73 B73 B73 B73 3245 3245 3245 3245明处理书48/51 页玉米， B73， ABA 处理 V5 叶， 24 小时 玉米， B73， ABA 处理 V5 叶， 48 小时 玉米， B73， 乙烯利处理 V5 叶， 24 小时 玉米， B73， 乙烯利处理 V5 叶， 48 小时 玉米， B73， V5 叶片 种子， 3245， 干旱胁迫 7-DAP 顶端核 种子， 3245， 干旱胁迫 7-DAP 基部核 种子， 3245， 水分充足的 7-DAP 顶端核 种子， 3245， 水分充足的 7-DAP 基部核于 10℃遭受冷处理的幼苗 幼苗从 -2℃的冰冻处理中恢复实施例 11 ： 转基因 MAPKKK 的胁迫诱导表达
     将 ZmNPK1a 序 列 并 入 玉 米 转 化 载 体 PHP29013 中 (RAB17::ZmNPK1a+RAB17::ZmCBF1)， 以检验非生物胁迫下的效率。 制作的其他构建体如下 ： RAB17::ZmNPK1b(PHP32420)、 RD29A::ZmNPK1a(PHP32647)、 RD29A::ZmNPK1b(PHP32984) 和 ZmEEP5::ZmNPK1a(PHP36818)。
     如 上 述 指 出， RAB17 和 RD29A 启 动 子 是 胁 迫 诱 导 的。 如 实 施 例 12 所 描 述， 为 了 检 验 MAPKKK 转 基 因 的 胁 迫 诱 导 表 达， 将 含 有 RAB17::ZmNPK1b、 RD29A::ZmNPK1a 或 RD29A::ZmNPK1b 构建体的 T1 植物种植在温室中的干旱胁迫下。从个体植物中取下叶穿孔 物 (leaf punch) 并储存于 -80℃， 用 QIAGEN， Inc.(Valencia， California) 的 RNeasy96 试 剂盒提取 RNA。按照生产者所指导的， 用 QIAGEN 的 QuantiTect 反转录试剂盒从总 RNA 制备 cDNA， 并通过 Q-PCR 分析目的转基因的表达。所有三个构建体的事件都已表现出胁迫诱导 表达。进一步使用干旱条件下的田间检验来评价每一株转基因的效果。田间评价包括评价 胎生现象 (vivipary)， 其与 rab17 的使用有关， 并且其通常是不想要的性状。
     实施例 12 ： 在胁迫条件下检验转基因植物
     表达本发明重组 MAPKKK 的转基因植物， 例如， 用实施例 1 或 2 的方法产生的那 些植物， 可以遭受模拟非生物胁迫的人工环境， 所述非生物胁迫例如， 寒冷、 干旱或有限的 水条件、 干旱和热的组合或盐度胁迫。在应用这些胁迫前， 在对照生长条件下建立植物， 如 下：营养液 ： 以 20 ∶ 10 ∶ 20 的 NPK 化肥混合物配备营养液， 浓度为每 5 加仑水 3.7 盎司。该储备液用水进一步稀释至 1/16 的浓度并应用于植物。
     在移植时或露出 (emergence) 后， 向盆中加半茶匙 Osmocote (NPK15 ∶ 9 ∶ 12) (The Scotts Miracle-Gro Company， OH， USA) 是有用的。
     边界植物 ： 在邻近温室的玻璃墙的坡顶线 (bench-edge) 或邻近小环境易变性的 其他潜在因素例如冷风机处， 放置一排边界植物。
     自动操作 ： 用带有钻孔的 PVC 管浇水， 以便用虹吸设备对系统放置的盆供水。 可用 定时器安排灌溉。
     复制 ： 每次时间， 每次处理， 使用 8-10 株个体植物。
     处理和收集数据后， 将针对不同的胁迫处理情况下转基因事件记录的的植物大 小、 颜色和叶绿素荧光的平均值输出至 Spotfire(Spotfire， Inc.， MA， USA)。用方差分析评 估处理方式。
     A. 低温耐受性
     为了证明凉爽条件下本发明的 MAPKKK 的表达是否赋予增强的发芽能力， 可以使 表达本发明 MAPKKK 多肽的转基因种子在与种子产业所用的标准寒冷发芽检验相似的条件 下发芽。可选择地， 可以将表达这类 MAPKKK 的转基因种子种植于通过人工环境变凉爽的 苗床条件下或田间的天然凉爽苗床下。此外， 可以在种子发育阶段通过凉爽的夜晚时间 温度激发表达 MAPKKK 的植物， 以证明， 在该作物发育的时间内， 由于冷胁迫， 导致叶或冠 (canopy) 活性的抑制降低。
     可 以 使 转 基 因 幼 苗 在 光 期 生 长 于 低 温 下， 例 如 约 13 ℃， 并在黑暗期间生长 于 13 ℃。植物播种于含有温室土壤培养基的 96 槽的浅箱 (96-pod flat) 中。开始用 Seplex(Blackmore Company， Belleville， MI) 供水， 在温室中种植和萌发幼苗后的第一天 浇水。最初供水后， 用 85ppm 的 20 ∶ 10 ∶ 20 肥料水继续给幼苗供水。一旦植物达到 V3 阶 段 ( 约 10-14 天 )， 将其移至生长室并进行 16/8 小时的光 / 暗循环的冷却方案 (chilling regimen)， 其中， 在恒定湿度下， 日 / 夜温度维持在光 15℃ / 黑 13℃， 并且该盆应当放在浅 箱中， 所述浅箱， 在浅箱中没有隙状开口。 用 85ppm 的 20 ∶ 10 ∶ 20 化肥水， 给幼苗底供水， 从而保持幼苗水分充足。 使幼苗再遭受 16 天的冷却条件。 在进入胁迫期 4、 8、 12 和 16 天时， 对可见的泛黄评分， 并还用 Hansatech FMS2 叶绿素荧光计 (Hansatech Instruments Ltd) 记录叶绿素荧光。叶盘能用来确定由于低温结合强光下光氧化损伤导致的 ROS(reactive oxygen species， 活性氧 ) 累积。在胁迫期末， 在土壤水平收获植物并记录鲜重或生物量累 积。包括对低温生长耐受敏感的对照品种， 对跨越实验使观察结果标准化非常重要。转基 因植物对胁迫的耐受性可以基于下述来评估 ： 相对于对照非转基因植物， 转基因植物中增 强的植物生长、 幼苗的鲜重或干重和 / 或增强的光合活性或叶绿素荧光。转基因的和对照 植物生长的物理特征如本文所述进行评估。
     还可以在幼苗阶段以及晚季阶段检测表达本发明 MAPKKK 的转基因植物的增强的 冰冻耐受性。优选在模拟霜冻或冰冻事件的人工环境中进行这些检测。此外， 在自然环境 施加胁迫期间， 例如， 在霜冻出现时， 转基因种子可以种植在户外。
     B. 耐旱性
     还可以在基于盆的研究中在人工干旱胁迫环境下， 或在田间在可控制的干旱胁迫条件下， 检测表达本发明 MAPKKK 的转基因植物， 以便证明该转基因赋予抗旱性或耐旱性。 以下述方式， 通过基于盆的筛查， 筛查含有候选基因的转基因玉米幼苗对干旱胁迫的耐受 性。使转基因玉米植物遭受水分充足的条件 ( 对照 ) 和干旱胁迫的条件。在 T1 代或更晚 筛查转基因玉米植物。在播种 (DAS) 后 10-14 天或移植后 7 天开始， 施加胁迫， 并持续至抽 穗丝。 通过配备有定时器的自动系统对盆供水， 以在整个干旱胁迫处理期以 25 或 50％田间 持水量 (field capacity) 供水。该胁迫的强度和持续时间将允许鉴定对营养生长以及开 花抽穗丝间隔 (anthesis-silking interval， ASI) 的影响。
     盆栽混合土 ： 能使用 1/3 蒙脱石 (Profile Products LLC， IL， USA)、 1/3 沙子和 1/3SB300(Sun Gro Horticulture， WA， USA) 的混合物。能用 Fafard Fine-Germ(Conrad Fafard， Inc.， MA， USA) 替换 SB300， 并且混合物中的沙子比例可以降低。因此， 最终的盆栽 混合土可以是 3/8(37.5％ ) 的蒙脱石、 3/8(37.5％ ) 的 Fafard 和 1/4(25％ ) 的沙子。
     确定田间持水量 ： 检测待用于一个 S200 花盆的土壤混合物的重量 (w1)( 减去花盆 重量 )。如果所有的土壤混合物组分都不是干的， 那么在测定 w1 前， 将土壤于 100℃干燥至 恒重。对花盆中的土壤供水至完全饱和， 并且流出所有的重力水。在漏出所有的重力水后， 测定土壤的重量 (w2)( 减去花盆重量 )。田间持水量是按 w2-w1 而获得的保留于土壤中的 水的重量。其能表示为烘干的土壤重量的百分比。
     胁迫处理 ： 允许植物在水分充足的条件下在最初的 12-14 天的时期内生长， 之后， 将土壤水分含量降低至约 30％的田间持水量， 以给予慢性干旱胁迫。在该早期生长期 ( 水 分充足的观察结果 ) 和对慢性干旱胁迫阶段再浇水而从干旱胁迫恢复期间 ( 干旱胁迫的观 察结果 )， 记录叶绿素荧光的测量结果。在该慢性干旱胁迫处理后， 完全停止给水， 以允许 植物非常接近于永久萎蔫点 ( 约 8％的田间持水量 )， 在该点时， 给它们供水至饱和。植物 从该严重干旱的恢复， 记录为达到 50％恢复的时间， 或干旱胁迫 48 小时后恢复的植物的数 量。在该实验末， 收集枝条测量鲜重和干重。
     作出观察结果 ： 在水分充足生长过程， 以及在从再供水后从干旱胁迫恢复过程中， 以 PhiPSII( 其表示光系统 II 光化学的运行量子效率 (operating quantum efficiency)) 和 Fv’ /Fm’ ( 其为光系统 II 的最大效率 )， 记录叶绿素荧光的观察结果。 用 Hansatech FMS2 仪器 (Hansatech Instruments Ltd.Norfolk， England) 记录这些测量结果。记录最小的完 全展开的叶子的测量结果。还记录极端干旱胁迫后对植物恢复的观察结果， 以及还记录实 验期末枝条鲜重和干重的观察结果。
     测验 rd29a:ZmNPK1b 构建体的六项事件对耐旱性的改善。在水分充足条件下， 对 于该六项事件中的两项， Fv’ /Fm’ 显著高于对照的 Fv’ /Fm’ 。尤其是， 在上文所述的干旱条 件下， 六项事件中的五项显示出显著高于对照的 Fy’ /Fm’ 。干旱条件下， 对于 PSII 荧光， 五 项中四项的评分也显著优于对照。
     恢复评分显示， 植物在干旱胁迫后恢复的能力如上述描述被缓解。在耐旱性改善 的植物中寻找早期恢复或降低的恢复所需的时间。荧光评分改善的事件中的两项还表现 出， 与对照植物相比， 恢复时间显著降低。
     为了研究这些积极数据是否反应了对较小植物的偏爱， 检测了幼苗枝条的湿质量 和干质量。只有一项事件 (3.1 事件 ) 的平均枝条湿质量小于对照。其他所有的相当或更 大 (3.39 事件 )。相对于对照， 该六项事件中的五项的枝条的干质量没变 ； 一项质量降低。表 7.PHP32984 转基因玉米的幼苗干旱筛查
     WW 荧光 WW 荧光 DRT 荧光 DRT 荧光 恢复 湿枝条 干枝条
     事件 Fv′ /Fm′ ？ PSII Fv′ /Fm′ ？ PSII 小时 克 克
     3.39 0.530a 0.420a 0.687a 0.511a 12.3b 2.90a 0.3999a
     3.32 0.488b 0.380a 0.668ab 0.505a 18.7a 2.34b 0.3683a
     3.19 0.464b 0.366a 0.640ab 0.484a 12.8b 2.43b 0.3441b
     2.9 0.489b 0.392a 0.603c 0.452b 21.3a 2.28b 0.3657a
     1.3 0.476b 0.415a 0.615b 0.459b 18.4a 2.32b 0.4004a
     3.1 0.497a 0.420a 0.661ab 0.485a 20.2a 1.99c 0.3946a
     对照 0.475b 0.400a 0.605c 0.460b 19.9a 2.09b 0.3697a
     总之， 相对于对照， 检测的 83％的 rd29a::ZmNPK1b 事件在干旱条件下表现出显著 改善的 Fv’ /Fm’ 。
     氧化胁迫是暴露于胁迫环境条件下的植物损伤的主要原因。 氧化胁迫由在细胞中 产生的活性氧所引起细胞损伤造成。这些活性氧分子能损害细胞膜、 蛋白和核酸。可以分 析表达本发明 MAPKKK 的转基因植物对氧化胁迫抗性的改善。
     可以在人工环境或田间检测表达本发明 MAPKKK 的转基因植物， 以证明转基因赋 予对化学品 ( 例如， 除草剂、 臭氧或污染物 ) 或金属 ( 例如， 铜或锌 ) 的抗性或耐受性。相 对于非转基因植物， 在更高浓度有毒化合物存在下， 生长能力增强的转基因植物在本发明 中是有用的。
     另一方面， 本文所述的本发明 MAPKKK 可以改善作物产量或生产率。用本领域技 术人员熟悉的技术， 表达本发明 MAPKKK 的转基因植物的种子可以种植在试验小区 (test plot) 中， 并且将其农艺学性能与标准植物进行比较。任择地， 将相似遗传背景但无转基因 的的植物包括于该比较中。可以观察产量效益， 并且促进显示产量增加的植物的商品化。
     此外， 在包括但不限于有限的或不充分的可用性水以模仿干旱的条件下， 可以在 田间检测表达本发明 MAPKKK 的转基因植物的农艺学性能。当与非转基因植物相比时， 在非 最佳生长条件下， 表达本发明 MAPKKK 的转基因植物比其非转基因对应物表现出更高的产 量。
     本说明书提到的所有出版物和专利申请表示本发明所属技术领域技术人员的水 平。通过引用将所有出版物和专利申请并入本文， 其引用程度如同特别和单独指出通过引 用并入每一个单个出版物或专利申请。
     尽管出于清楚理解的目的， 通过说明和实施例较详细地描述了上述发明， 但是显 然， 在附加的权利要求的范围内可以实施某些改变和修改。54102112614 A CN 102112618
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