吡咯并喹啉醌在治疗和预防动脉粥样硬化中的应用.pdf

本发明提供了吡咯并喹啉醌在治疗和预防动脉粥样硬化中的应用，还提供了含有吡咯并喹啉醌的保健品组合物或药物组合物。本发明的吡咯并喹啉醌能够抑制低密度脂蛋白的氧化，保护内皮细胞，且能够减少内皮中脂质的含量和粥样硬化斑块的面积。因此，吡咯并喹啉醌在预防和/或治疗动脉粥样硬化的形成和发展中具有良好的应用前景。

1.  吡咯并喹啉醌活性物质在制备治疗和/或预防对象动脉粥样硬化或其症状的组合物中的应用。

2.  如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述动脉粥样硬化的症状选自下组：动脉粥样硬化斑血栓形成、动脉粥样硬化引起的缺血性综合征、动脉粥样硬化引起的冠心病、动脉粥样硬化引起的脑卒中、动脉粥样硬化引起的腹主动脉瘤或动脉粥样硬化引起的外周动脉疾病。

3.  如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组合物为保健品组合物或药物组合物。

4.  如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述对象是哺乳动物。

5.  如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述吡咯并喹啉醌活性物质占所述组合物总重量的0.001-99.9wt％。

6.  如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组合物的剂型包括：片剂、粉末剂、注射剂、颗粒剂、糖浆、胶囊、溶液剂、栓剂或药膏。

7.  如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组合物还包含治疗和/或预防动脉粥样硬化或其症状的其它活性物质。

8.  一种组合物，其含有：
(1)有效量的吡咯并喹啉醌活性物质；
(2)治疗和/或预防动脉粥样硬化或其症状的其它活性物质；以及
(3)药学上可接受的载体。

9.  如权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述组合物是保健品组合物或药物组合物。

10.  如权利要求8所述的组合物，其特征在于，组分(1)和组分(2)的重量比为0.01∶100～100∶0.01.

吡咯并喹啉醌在治疗和预防动脉粥样硬化中的应用
技术领域
本发明涉及血管疾病领域。更具体的说，本发明涉及吡咯并喹啉醌在治疗和/或预防动脉粥样硬化中的应用。
背景技术
动脉粥样硬化是一种侵袭动脉血管的病变，它所引起的冠心病、脑血管病及周围血管疾病，严重危害人类健康，其发病率和死亡率均居各种疾病前列。流行病学调查显示，心血管病在某些发达国家的发病率已接近10％，世界年死亡人数占人口总死亡数的10％。我国心脑血管病患者超过700万人，而有动脉粥样硬化病变的患者则更多，并且其发病率和死亡率有逐年上升的趋势，发病年龄则成下降趋势。因此，开发预防和/或治疗动脉粥样硬化的药物，不仅能切实解决临床的需要，而且将拥有广阔的市场。
动脉粥样硬化是动脉血管壁的慢性炎症反应，可以有数十年的无症状期，最终可因两种原因发病：第一、动脉管腔代偿性增大，粥样硬化斑块反复破裂愈合而形成栓子，堵塞动脉管腔，造成重要器官供血不足；第二、如果动脉管腔代偿性增大过度，就可能产生动脉瘤。因此，预防粥样硬化斑块形成，延缓疾病进展对于改善发病率和死亡率非常重要。
动脉粥样硬化可由多种因素造成，其中的主要成因包括：巨噬细胞和白细胞的聚集、低密度脂蛋白(LDL)的刺激、以及高密度脂蛋白的缺乏所导致的脂质和胆固醇的清除不足。
正是由于动脉粥样硬化发病机理的复杂性及其病程的漫长，目前对于动脉粥样硬化的治疗，仍然缺乏非常有效而安全的方法。因此，本领域迫切需要开发出针对动脉粥样硬化的安全有效的药物和保健品。
吡咯并喹啉醌(Pyrroloquinoline Quinone，PQQ)是最早从微生物中发现的小分子化合物，在高等真核生物体内也有存在。PQQ呈红褐色粉末状，是一种水溶性化合物，其存在于我们的日常饮食中，广泛分布于人体各组织器官，并在母乳中存在。PQQ的分子式如下：

PQQ是细菌中多种重要酶类的辅基，能影响呼吸链功能和体内自由基的水平。研究表明，PQQ缺乏的小鼠生长缓慢，生殖能力差，并且容易产生关节炎症，可能是体内必需的维生素之一。
研究证实，PQQ是一种对人体健康非常有利的物质。已通过动物实验观察到PQQ的多种功能：纯化的PQQ作为一种抗氧化剂能够保护肝脏免受CCl₄或酒精损伤。纯化的PQQ减少鸡胚发育过程中糖皮质激素诱导的白内障形成，可能是通过恢复谷胱甘肽水平从而降低对皮质激素的反应性来发挥作用。PQQ直接氧化受体的NMDA氧化还原位点，保护细胞免受NMDA毒性影响，从而防止脑部缺血缺氧，避免动物模型发生严重的休克。同时，PQQ还可以保护心脏防止心肌缺血及心肌梗死。对神经系统而言，PQQ具备抗氧化能力和神经保护作用。
然而，在本发明之前，本领域从未对PQQ活性物质用于动脉粥样硬化的预防和/或治疗做出研究。
发明内容
本发明的目的之一正是提供一种可安全、有效地预防和/或治疗动脉粥样硬化的组合物。
在本发明的第一方面，提供了吡咯并喹啉醌活性物质在制备治疗和/或预防对象动脉粥样硬化或其症状的组合物中的应用。
在本发明的一个实施方式中，所述动脉粥样硬化的症状选自下组：动脉粥样硬化斑血栓形成、动脉粥样硬化引起的缺血性综合征、动脉粥样硬化引起的冠心病、动脉粥样硬化引起的脑卒中、动脉粥样硬化引起的腹主动脉瘤或动脉粥样硬化引起的外周动脉疾病。
在本发明的另一个实施方式中，所述组合物为保健品组合物或药物组合物。
在本发明的另一个实施方式中，所述对象是哺乳动物。在一个优选例中，所述哺乳动物是人。
在本发明的另一个实施方式中，所述吡咯并喹啉醌活性物质占所述组合物总重量的0.001-99.9wt％。
在一个优选例中，所述吡咯并喹啉醌活性物质占组合物总重量的1-95wt％，优选5-90wt％，更优选10-80wt％。
在本发明的另一个实施方式中，所述组合物的剂型包括：片剂、粉末剂、注射剂、颗粒剂、糖浆、胶囊、溶液剂、栓剂或药膏。
在一个优选例中，所述组合物为单位剂型或多剂型，其中吡咯并喹啉醌活性物质的含量为1-4000mg/剂，优选100-2000mg/剂。
在另一优选例中，以0.001-10mg/kg体重，较佳地0.01-5mg/kg体重，优选0.01-1mg/kg体重给予所述组合物。
在本发明的另一个实施方式中，所述组合物还包含治疗和/或预防动脉粥样硬化或其症状的其它活性物质。
在一个优选例中，所述治疗和/或预防动脉粥样硬化或其症状的其它活性物质选自：扩张血管的药物；调节血脂的物质，如他汀类药物、消胆胺、烟酸、不饱和脂肪酸等；抗血小板物质，如阿司匹林、潘生丁、抵克立得等；溶栓物质，如尿激酶、重组组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂、肝素等；其它活性物质，如胆碱、卵磷脂合剂、钙美合剂、维生素E、类胡萝卜素、维生素B、维生素C或辅酶Q10。
在本发明的第二方面提供了一种组合物，其含有：
(1)有效量的吡咯并喹啉醌活性物质；
(2)治疗和/或预防动脉粥样硬化或其症状的其它活性物质；以及
(3)药学上可接受的载体。
在一个优选例中，所述吡咯并喹啉醌活性物质占组合物总重量的0.001-99.9wt％，优选1-95wt％，较优选为5-90wt％，更优选10-80wt％。
在另一个优选例中，所述治疗和/或预防动脉粥样硬化或其症状的其它活性物质为选自下组的一种或多种物质：扩张血管的药物；调节血脂的物质，如他汀类药物、消胆胺、烟酸、不饱和脂肪酸等；抗血小板物质，如阿司匹林、潘生丁、抵克立得等；溶栓物质，如尿激酶、重组组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂、肝素等；其它活性物质，如胆碱、卵磷脂合剂、钙美合剂、维生素E、类胡萝卜素、维生素B、维生素C、辅酶Q10等。
在本发明的另一个实施方式中，所述组合物是保健品组合物或药物组合物。
在本发明的另一个实施方式中，组分(1)和组分(2)的重量比为0.01∶100～100∶0.01.
在一个优选例中，组分(1)和组分(2)的重量比为1∶50～50∶1，更优选1∶10～10∶1。
在本发明的第三方面，提供了一种预防和/或治疗对象动脉粥样硬化或其症状的方法，所述方法包括给予所述对象吡咯并喹啉醌活性物质或包含所述活性物质的组合物。
在本发明的一个实施方式中，所述动脉粥样硬化的症状选自下组：动脉粥样硬化斑血栓形成、动脉粥样硬化引起的缺血性综合征、动脉粥样硬化引起的冠心病、动脉粥样硬化引起的脑卒中、动脉粥样硬化引起的腹主动脉瘤或动脉粥样硬化引起的外周动脉疾病。
在本发明的另一个实施方式中，所述组合物为保健品组合物或药物组合物。在本发明的另一个实施方式中，所述对象是哺乳动物。在一个优选例中，所述哺乳动物是人。
在本发明的另一个实施方式中，所述吡咯并喹啉醌活性物质占所述组合物总重量的0.001-99.9wt％。优选1-95wt％，更优选5-90wt％，再优选10-80wt％。
在本发明的另一个实施方式中，所述方法还包括给予治疗和/或预防动脉粥样硬化或其症状的其它活性物质。
在一个优选例中，所述治疗和/或预防动脉粥样硬化或其症状的其它活性物质选自：扩张血管的药物；调节血脂的物质，如他汀类药物、消胆胺、烟酸、不饱和脂肪酸等；抗血小板物质，如阿司匹林、潘生丁、抵克立得等；溶栓物质，如尿激酶、重组组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂、肝素等；其它活性物质，如胆碱、卵磷脂合剂、钙美合剂、维生素E、类胡萝卜素、维生素B、维生素C或辅酶Q10。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1：PQQ对铜诱导的低密度脂蛋白(LDL)氧化的抑制曲线。
横坐标：用硫酸铜诱导LDL氧化的时间(单位：分钟)；
纵坐标：234nm处共轭二烯酸的吸光度。
图2：PQQ对过氧化物引起的内皮细胞损伤的抑制作用(平均值±S.D.，n＝4)。
横坐标：不同分组；
纵坐标：MTT实验测定值；
(^*：P＜0.01，组5、组6相对于组4)。
图3：PQQ对动脉粥样硬化大鼠模型动脉中胆固醇含量的降低作用(平均值±S.D.，n＝6)。
横坐标：不同分组；
纵坐标：主动脉中的胆固醇含量；
(^**：P＜0.01，组3、组4与组2相比；##：P＜0.01，组2与组1相比)。
图4：PQQ对大鼠动脉粥样硬化模型中硬化斑块面积的影响(平均值±S.D.，n＝6)。
横坐标：不同分组；
纵坐标：动脉粥样硬化斑块的面积与主动脉窦面积比值；
(^**：P＜0.01，组3、组4与组2相比；##：P＜0.01，组2与组1相比)。
具体实施方式
本发明基于如下研究结果：吡咯并喹啉醌(PQQ)能够抑制低密度脂蛋白的氧化，保护内皮细胞，在动脉粥样硬化的大鼠模型中，能够减少内皮中脂质的含量和粥样硬化斑块的面积。因此，PQQ在预防和/或治疗动脉粥样硬化的形成和发展中有很好的应用价值。
相关定义
本文中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
本文中，术语“有效量”指按本发明的方式使用时足以获得需要的效果而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)，即有合理的效益/风险比的成分的量。显然，具体的“有效量”因各种因素而异，如所需给予的对象的年龄、病况等。
吡咯并喹啉醌(PQQ)的结构与已知功能
本文中，术语“吡咯并喹啉醌”或“PQQ”指吡咯并喹啉醌或其盐或酯，代表性的盐包括(但并不限于)：钠盐、钾盐、锌盐等。本文中，术语“PQQ活性物质”或“吡咯并喹啉醌活性物质”可互换使用，都包括吡咯并喹啉醌、PQQ的保健品学、生理学或药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物、异构体或其它衍生物形式、或它们的混合物。术语“PQQ衍生物”是指含有吡咯并喹啉醌作为主要结构或通过吡咯并喹啉醌的代谢获得的产物，只要其还具有吡咯并喹啉醌在本发明中的功效。
如背景技术部分中所述：PQQ存在于日常饮食中，并广泛分布于人体各组织器官，并在母乳中存在。并且，其还被确认为是氧化还原反应的一种辅酶，具有维生素活性，可能是一种新型的B族维生素。
因此，PQQ对人体而言是一种天然化合物，无毒副作用，保证了其用药安全性。并且，通过补充PQQ来预防和/或治疗动脉粥样硬化，还可同时产生保肝、保护神经系统等积极作用。
不限于机理，PQQ可能通过多种主要机理来预防和/或治疗动脉粥样硬化：(1)抑制低密度脂蛋白的氧化；(2)保护内皮细胞；(3)减少内皮中脂质的含量；以及(4)减小粥样硬化斑块的面积。
组合物
本发明提供了一种组合物，其包含：(a)吡咯并喹啉醌、其药学上或生理学上可接受的盐和/或酯；以及(b)药学上或生理学上可接受的载体。
本发明中的组合物可为保健品或药品，其可用于有效预防和/或治疗动脉粥样硬化。通常，但所述组合物为保健品时，其中所含的PQQ剂量要低于药物组合物。
如本文所用，术语“药学上或生理学上可接受的载体”指用于保健品或药物制剂的载体，包括各种赋形剂和稀释剂，它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有或没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。例如，药学上可接受的载体详细记载于《雷明顿药物科学》(Remington’sPharmaceutical Sciences，Mack Pub.Co.，N.J.1991)。
在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、pH缓冲物质等。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。
本发明的组合物中活性物质(a)占组合物总重量的0.001-99.9wt％；优选为组合物总重量的1-95wt％，较优选为5-90wt％，更优选10-80wt％。余量为载体以及其它添加剂等物质。
在本发明的另一优选实施方式中，所述组合物为单位剂型或多剂型。如本文所用，术语“单位剂型”是指为了服用或使用方便，将本发明的组合物制备成单次服用或使用所需的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂)、液体剂、胶囊剂、缓释剂。
在本发明的另一个优选例中，每天施用1-6剂本发明的组合物，优选施用1-3剂；在高剂量时优选每天服用1剂。在本发明的一个优选例中，每天给对象施用0.001～10mg/kg体重的本发明组合物，优选0.01～5mg/kg体重，更优选0.01～1mg/kg体重。
应理解，所用活性物质的有效剂量可随需预防或治疗的对象的个体情况(例如对象体重、年龄、身体状况、所需达到的效果)来决定，这在熟练医师或营养师可以判断的范围内。
本发明的组合物，可以为固态(如颗粒剂、片剂、冻干粉、栓剂、胶囊、舌下含片)或液态(如口服液、溶液剂或糖浆剂)或其它合适的形式。
药盒或保健盒
本发明还提供了一种药盒或保健盒，其中含有：(A)装有有效量吡咯并喹啉醌、其药学上或生理学上可接受的盐和/或酯的容器；和(B)装有有效量乙酰胆碱酯酶抑制剂的容器。所述药盒或保健盒用于改善记忆和认知能力、延长对象预期寿命、减少脑内β淀粉样蛋白的产生，从而预防或治疗老年性退行性神经疾病，优选用于预防或治疗老年性痴呆。
如本文所用，术语“保健盒”是指装有可对对象提供具有保健作用的活性物质PQQ的容器的组合，其可作为保健品提供给需要的对象。
施用方式
本发明的组合物、药盒或保健盒可以通过常规途径施用，其中包括(但并不限于)：口服、喷涂、鼻腔内、或透皮等途径。优选口服或注射施用。组合物形式应与施用方式相匹配。本发明组合物的施用量，按活性物质PQQ重量计，通常为每天约0.001～10mgPQQ/kg体重，较佳地约0.01～5mgPQQ/kg体重，优选0.01～1mgPQQ/kg体重。
本发明的组合物、药盒或保健盒可直接使用，也可与其它预防或治疗粥样动脉硬化的物质(如0.0005-0.1克/kg体重/天；优选0.001-0.05克/kg体重/天)联合或组合使用。这些物质包括但不限于：扩张血管、调节血脂、抗血小板、溶解血栓和抗凝等的物质，优选单硝酸异山梨醇、他汀类药物、消胆胺、烟酸、不饱和脂肪酸、阿司匹林、潘生丁、抵克立得等、尿激酶、重组组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂、肝素等。
本发明的组合物还可与除药物治疗外的其它常用于治疗或预防动脉粥样硬化的方法或手段相结合。这些方法或手段包括但不限于：手术治疗、针灸、合理膳食等。
当这些物质或方法与PQQ组合或联合施用时，优选具有优于分别单独给予这些物质或方法的效果。
本发明的优点
本发明的优点包括但不限于：
(a)首次发现了PQQ可抑制低密度脂蛋白的氧化、保护内皮细胞、减少内皮中脂质的含量以及减小粥样硬化斑块的面积，从而可用于预防或治疗动脉粥样硬化；
(b)PQQ在生物体内存在，是天然的化合物，对人体无毒副作用，因此使用PQQ预防或治疗动脉粥样硬化具有高安全性；
(c)PQQ的添加还可补充了体内的内源性吡咯并喹啉醌，缓解了体内因吡咯并喹啉醌的缺乏所引起的症状。
实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另有说明，细胞培育的条件为37℃，5％CO₂。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1：PQQ对低密度脂蛋白(LDL)氧化的抑制作用
实验方法：
1.LDL的制备：取健康成人新鲜血浆(获自志愿者捐献)，通过密度梯度序列超速离心法获得含EDTA的LDL溶液(参考文献5：Lindgren，Jensen等.1969)，将该溶液在PBS溶液(pH7.5)透析脱盐(4℃，4小时)，将所得的LDL溶液稀释至200mg/L，根据Lowry法测定其中蛋白含量；
2.LDL氧化实验：用浓度为5μM的CuSO₄稀释步骤1中所得的LDL溶液至终浓度为15μg/ml，以诱导LDL氧化(参考文献1：Esterbauer，Striegl等，1989)。在反应体系中分别加入25μg/ml和50μg/ml的PQQ，通过测试不同时间点234nm处共轭二烯酸的吸光度(紫外分光光度计，BECKMAN，DU 640)，绘制LDL氧化曲线。
实验结果与分析：
LDL的氧化曲线如图1所示。
结果显示：与对照组相比，PQQ能显著抑制LDL的氧化，且该抑制作用在高剂量时更为明显。
上述结果表明：PQQ可以在体外抑制低密度脂蛋白LDL的氧化，在高剂量时，效果更为显著。
实施例2：PQQ对内皮细胞的保护作用
实验方法：
1.细胞和培养条件：在无菌条件下，于健康产妇分娩后立即取新生胎儿脐带(获自上海市妇产科医院)，用0.1％胶原酶消化，得到的人脐静脉内皮细胞，按照常规贴壁细胞培养方法进行传代培养(参考文献4：Jaffe，Nachman等.1973)；
细胞培养液组成为：DMEM培养基1g，NaHCO₃ 0.36g，青霉素、链霉素各1000u，胎牛血清10mL，加水至100mL。37℃，5％CO₂培养箱中培养，24h后换液，至细胞密度80％左右时，传代消化，取第2-3代细胞用于实验；
2.PQQ预处理：将脐静脉内皮细胞培养于96孔板中，向培养液中加入PQQ至终浓度为50μg/ml和100μg/ml，37℃培养30分钟；
3.H₂O₂处理内皮细胞：在PQQ预处理和对照组细胞培养液中加入H2O2至终浓度为1mM，处理90分钟后进行后续实验；
4.MTT法检测PQQ对人脐静脉内皮细胞的保护作用：
按文献所述方法进行MTT检测(参考文献3：Hansen，Nielsen等.1989)，通过测定线粒体脱氢酶活性来判断细胞的损伤程度和生长状态。96孔板细胞经H₂O₂，处理90分钟后，各孔中加入MTT(1mg/ml)50μl，37℃培养4小时，吸取上清，每孔加入DMSO 150μl，轻摇10min，在酶标仪(Molecular Devices，SpectraMax Plus384)上读取490nm吸光值。
实验结果与分析：
MTT法的检测结果分别如图2所示，其中组1为对照组，组2为单纯PQQ低剂量组(终浓度50μg/ml)，组3为单纯PQQ高剂量组(终浓度100μg/ml)，组4为损伤组(加入终浓度1mM H₂O₂)，组5为PQQ低剂量组(同损伤组，预先加入终浓度50μg/ml的PQQ)，组6为PQQ高剂量组(同损伤组，预先加入终浓度100μg/ml的PQQ)。
从图中可见，组1、组2、组3之间无显著差异(P＞0.05)，组5、组6与组4间差异显著(*，P＜0.01)。
以上结果表明：PQQ能显著抑制过氧化物引起的内皮细胞的损伤。
实施例3：PQQ对动脉粥样硬化大鼠模型动脉中胆固醇含量的降低作用
实验方法：
1.取6周龄，体重在220g左右的SD雄性大鼠数只，在标准条件下饲养；
2.将大鼠随机分为4组，每组6只。分组情况分别为：
组1：对照组：普通SD大鼠饲养饲料；
组2：高胆固醇饮食组(HCD)；
组3：高胆固醇加低剂量PQQ组，随餐给予PQQ。
组4：高胆固醇加高剂量PQQ组，随餐给予PQQ。
其中，组2-组4中高胆固醇饮食的组成为：2％胆固醇，3％猪油，0.5％胆汁酸和0.2％的丙硫脲嘧啶，加入普通饲料中；
低剂量PQQ组中PQQ的口服剂量为：0.5mg/kg/d；
高剂量PQQ组中PQQ的口服剂量为：1.0mg/kg/d。
3.除对照组外，每组大鼠按300,000IU/kg/day的剂量口服维生素D2以诱导动脉粥样硬化斑块的形成；
4.饲养12周后，测定大鼠主动脉组织中的胆固醇含量(参考文献2：Gamble，Vaughan等.1978)：
取各组大鼠主动脉，用眼科镊剔除主动脉壁外的脂肪组织和其它结缔组织，用PBS清洗后称重。将主动脉放入离心管中，加入2ml匀浆液，4℃下进行匀浆，1700g离心5min，上清液转移至另一干净试管中，加入0.4ml 8.8g/L KCl溶液，使上清液分为水层和脂层。将脂层转移至另一离心管中，在37℃下用氮气吹干后，加0.2ml无水乙醇至各管中，于-20℃储存待测。
采用酶法测定胆固醇含量，将0.1ml样品加入到0.9ml胆固醇检测分析液(0.1U/ml胆固醇氧化酶、1U/ml过氧化物酶、0.01U/ml胆固醇酯酶、0.5ml/L TritonX-100、1mM胆酸钠、0.6mg/ml苯乙醇酸，溶于pH 7.4的0.1M磷酸钠缓冲液中)，37℃孵育1h后，于荧光分光光度计(Shimadzu，AA-670，Kyoto)检测荧光强度，测定荧光强度的激发波长为325nm，发射波长为410nm。狭缝宽度激发波长为10nm，发射波长为5nm。
实验结果与分析：
对照组与各动脉粥样硬化模型大鼠试验组的主动脉内胆固醇含量如图3所示。
结果显示：与对照组1相比，给予高胆固醇饮食且加以维生素D2诱导的模型大鼠(组2)的主动脉内胆固醇含量显著增高(##，P＜0.01)；与组2相比，给予PQQ(组3、组4)显著降低了动脉粥样硬化大鼠模型动脉中的胆固醇含量(**，P＜0.01)，且高剂量时该作用更为明显。
上述结果表明：PQQ能有效抑制动脉对胆固醇的摄取。
实施例4：PQQ对大鼠动脉粥样硬化模型中硬化斑块面积的减小作用
实验方法：
1.如实施例3中所示的方法，将SD大鼠分为4组：对照组(正常喂养组，组1)、高胆固醇饮食组(组2)、高胆固醇加低剂量PQQ组(组3)、高胆固醇加高剂量PQQ组(组4)；
2.饲养12周后，处死大鼠，在显微镜下观察主动脉粥样硬化斑块，计算其面积(参考文献6：Paigen，Morrow等.1987)。采用油红染色法，使得动脉粥样硬化斑块呈红色。全自动图像分析系统(数码像机：model Penguin 600CL，Pixera Inc.，美国；Leica全自动显微镜：model DMLA，Leica Inc.，德国；软件Simple PCI：v5.2，Compix Inc.，美国)分析各实验组大鼠主动脉窦动脉粥样斑块面积以及主动脉窦的管腔面积，以动脉粥样斑块面/管腔面积的比值来表示每只小鼠动脉粥样斑块的大小，以其平均值来表示每组动脉粥样硬化斑块面积的大小。
实验结果及分析：
对照组与各试验组大鼠动脉中的动脉粥样斑块面/管腔面积的比值如图4所示。
与对照组1相比，给予高胆固醇饮食(组2)且加以维生素D2诱导的模型大鼠的主动脉内粥样硬化斑块面积显著增大(##，P＜0.01)；与高胆固醇组(组2)相比，给予PQQ显著减小了动脉粥样硬化大鼠模型动脉中粥样硬化斑块的面积，且高剂量时该作用更为明显(**，P＜0.01)。
上述结果表明：PQQ能够显著抑制高脂饮食引起动脉粥样硬化斑块的面积。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
参考文献
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