一种蒲葵子的抗肿瘤有效组分的制备方法 【技术领域】
本发明涉及一种抗肿瘤的中药有效组分，具体而言是涉及一种蒲葵子抗肿瘤有效组分的制备方法，该有效组分主要含有小麦黄素、芹菜素两种化合物。
背景技术
肿瘤是威胁人类健康和生命的严重疾病之一，每年死于肿瘤的患者居各类死亡原因的第二位，仅次于心血管疾病，而且肿瘤的发病率呈上升趋势，给个人、家庭和社会带来了巨大的经济和精神负担。据WHO报导目前欧美每年诊断出的癌症新患者达250万，我国每年死于癌症的患者超过80万，专家预测世界抗癌药物的市场年递增13％。因此，研发新型抗肿瘤药物具有非常重要的社会效益和经济效益。长期以来，国际社会花费巨资用于研究治疗癌症的新药。然而由于化疗药物固有的毒副作用，使其在临床应用受到诸多限制，寻找高效低毒的抗癌药物以及抗癌辅助药物是当前肿瘤研究的重要内容。而传统中草药在这方面具有显著的优势，使得各国学者把注意力逐渐转向了中草药领域。欧共体对草药进行了统一立法，加拿大和澳大利亚等国草药地位已经合法化，美国政府也起草了植物药管理办法，这些为中药作为治疗药进入国际医药市场提供了良好的国际环境。我国药用生物资源十分丰富，其生理活性物质是研究和发现新药的先导化合物，是开发新药的天然宝库。
蒲葵子，为植物棕榈科蒲葵Livistona chinensis R.Br.(别名：扇叶葵子、葵扇木子、蒲葵子)的种子。蒲葵为棕榈科葵属常绿乔木，一种野生或人工栽培的常绿乔木。它主产于福建、台湾、广东等地。秋冬果实成熟时采收、晒干，生用。《岭南采药录》、《广州植物志》、《广西中兽医药植》、《陆川本草》等均有收载，其性味平、淡，具有败毒抗癌、消瘀止血之功效。研究表明已知的化学成分：山萘酚-4′-甲醚、牡荆素、β-谷甾醇、豆甾醇、正二十六碳醇(刘志平等，广西植物，2007，27(1)：140-142)。薯蓣皂苷元、β-胡萝卜苷、小麦黄素、芹菜素(刘志平等，中草药，2007，38(2)：178-180)。陈屏等人首次分离得到以下五种化合物：表缅茄儿茶精、表儿茶素、正三十一烷醇、去氢紫堇碱(陈屏等，中草药，2007，38(5)：665-667)。
蒲葵子含药血清对肉瘤细胞(S180)、肝癌细胞(H22)有明显的抑制作用(曾春晖等，广西中医药，2007，30(1)：58-59)。蒲葵子乙醇提取物对人宫颈癌细胞株(Hela)有显著的抑制作用，且具有明显的计量依赖关系(秦盛莹等，西北药学杂志，2007，22(1)：16-18)。蒲葵子乙醇提取物进行化学成分GC-MS分析，主要成分为脂肪酸、脂肪酸酯、植物甾醇及长链烷烃等，且对宫颈癌细胞(Hela)、人胃癌细胞(SGC7901)、人肝癌细胞(Bel7402)均有一定的抑制作用(朱岳麟等，化学与生物工程，2007，24(10)：35-37)。蒲葵子醇提物对蛋白激酶C的抑制率可达到66.6％，降低药物浓度抑制作用减弱(黄才等，中草药，1995，26(8)：415-418)。国内也有利用蒲葵子经破细胞壁后提取的原粉制备抗癌剂的报道(丁庆等，CN 97 100 103.0)。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种蒲葵子具有抗肿瘤作用的有效组分。
本发明的目的在于提供一种蒲葵子具有抗肿瘤作用的有效组分的制备方法。
本发明以如下的技术方案予以实施：
将自然晾干的蒲葵子粉碎，加溶媒加热提取得提取液，将提取液浓缩至干，得蒲葵子粗提取物。粗提物依次分别用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取。乙酸乙酯萃取液减压浓缩至干，经过聚酰胺层析柱，用水和乙醇洗脱，得到洗脱液，将洗脱液干燥后得样品；再经过硅胶柱层析，用氯仿和甲醇洗脱，得到有效组分。
(1)将自然晾干的蒲葵子粉碎后，加入1～3倍60-95％的乙醇，60～100℃加热回流提取，至少提取一次，每次提取时间为1～4小时，得提取液，过滤分离得固相(药渣)和液相(乙醇提取液)；
(2)液相(乙醇提取液)蒸馏回收乙醇，得到蒲葵子粗提物深红色的浸膏A；
(3)浸膏A用适量的水混悬，然后依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，减压回收石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇，得到石油醚浸膏B、二氯甲烷浸膏C、乙酸乙酯浸膏D和正丁醇浸膏E。
(4)乙酸乙酯浸膏D用聚酰胺层析柱，用水-乙醇(依次为纯水、30％、70％乙醇)作为流动相，分别收集合并各种洗脱液，洗脱液浓缩后得样品；再经过硅胶柱层析，用氯仿∶甲醇(5～13∶1)洗脱，浓缩后得到有效组分。
本发明的蒲葵子的有效组分可在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的优势在于：
1.找到了一种蒲葵子具有抗肿瘤作用的有效组分，实验证明，能够有效的抑制人肿瘤细胞的生长，如肝癌细胞、白血病、宫颈癌、鼻咽癌、乳腺癌细胞。因此，在制备抗肿瘤药物具有重要的意义。
2.找到了一种蒲葵子具有抗肿瘤作用的有效组分的制备方法，避免了繁琐的分离出单体。该方法简单、成本低廉、省时，且有益于标准化，在生产中更易于药物的质量控制。
【附图说明】
具体实施方式：
下面将结合实施例进一步详细说明本发明的实质内容和有益效果，该实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。
实施例一：
将自然晾干的蒲葵子粉碎后，加入2倍80％的乙醇，60～100℃加热回流提取，提取3次，每次提取时间为2小时，得提取液，过滤分离得固相(药渣)和液相(乙醇提取液)；液相(乙醇提取液)蒸馏回收乙醇，得到蒲葵子粗提物深红色的浸膏A；浸膏A用适量的水混悬，然后依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，回收石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇，得到石油醚浸膏B、二氯甲烷浸膏C、乙酸乙酯浸膏D和正丁醇浸膏E。
乙酸乙酯浸膏D 20.5g用水稀释后，上聚酰胺层析柱，用水-乙醇(依次为纯水、30％、70％乙醇)作为流动相，分别收集合并各种洗脱液。洗脱液浓缩后得样品5.0g；样品再经过硅胶柱层析，用氯仿∶甲醇(5～13∶1)洗脱，浓缩后得到有效组分500mg。
实施例二：
将自然晾干的蒲葵子粉碎后，加入3倍70％的乙醇，60～100℃加热回流提取，提取3次，每次提取时间为2小时，得提取液，过滤分离得固相(药渣)和液相(乙醇提取液)；液相(乙醇提取液)蒸馏回收乙醇，得到蒲葵子粗提物深红色的浸膏A；浸膏A用适量地水混悬，然后依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，回收石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇，得到石油醚浸膏B、二氯甲烷浸膏C、乙酸乙酯浸膏D和正丁醇浸膏E。
乙酸乙酯浸膏D 22.3g用水稀释后，上聚酰胺层析柱，用水-乙醇(依次为纯水、30％、70％乙醇)作为流动相，分别收集合并各种洗脱液。洗脱液浓缩后得样品6.1g；样品再经过硅胶柱层析，用氯仿∶甲醇(5～10∶1)洗脱，浓缩后得到有效组分615mg。
实施例三：
将自然晾干的蒲葵子粉碎后，加入3倍75％的乙醇，60～100℃加热回流提取，提取2次，每次提取时间为3小时，得提取液，过滤分离得固相(药渣)和液相(乙醇提取液)；液相(乙醇提取液)蒸馏回收乙醇，得到蒲葵子粗提物深红色的浸膏A；浸膏A用适量的水混悬，然后依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，回收石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇，得到石油醚浸膏B、二氯甲烷浸膏C、乙酸乙酯浸膏D和正丁醇浸膏E。
乙酸乙酯浸膏D 24.2g用水稀释后，上聚酰胺层析柱，用水-乙醇(依次为纯水、30％、70％乙醇)作为流动相，分别收集合并各种洗脱液。洗脱液浓缩后得样品5.8g；样品再经过硅胶柱层析，用氯仿∶甲醇(6～8∶1)洗脱，浓缩后得到有效组分378mg。
实施例四：
蒲葵子有效组分的分析
(1)蒲葵子提取物中小麦黄素、芹菜素的含量测定(高效液相色谱法)
色谱条件 色谱柱Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6mm×150mm，5μm)；采用梯度洗脱，流动性A相为0.2％冰醋酸水溶液，流动相B相为乙腈溶液，梯度洗脱程序如下：0分钟时，流动相A相为80％的0.2％冰醋酸水溶液、流动相B相为20％乙腈溶液；15min时，流动相A相为45％的0.2％冰醋酸水溶液、流动相B相为55％乙腈溶液；35min时，流动相A相为5％的0.2％冰醋酸水溶液、流动相B相为95％乙腈溶液；流速0.5ml·min-1；检测波长全波长；柱温30℃；紫外检测器。
供试品溶液的制备 称取本品，用甲醇溶液溶解在容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，即得。
测定方法 精密吸取供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得。
(2)上述蒲葵子有效组分HPLC-UV指纹图谱
测定方法 参见(1)上述蒲葵子提取物中的小麦黄素、芹菜素含量测定(高效液相色谱法)。记录色谱时间为40分钟。
分析结果 蒲葵子有效组分的HPLC-UV分析谱图见图1，图1中的1、2分别为小麦黄素、芹菜素。
本发明中，芹菜素的结构式为：
本发明中，小麦黄素的结构式为：
实施例五：
抗肿瘤生物活性筛选试验：
将对数生长的肿瘤细胞(人肝癌细胞HepG-2、人白血病HL60、宫颈癌细胞Hela、人鼻咽癌细胞CNE-2、人乳腺癌细胞MCF-7)用0.25％的胰蛋白酶消化，然后用含10％(体积百分含量)小牛血清的RPMI1640培养基悬浮细胞，制成细胞悬液，并分别将各肿瘤稀释至1.0×105个/ml，再将其接种至96孔培养板中，每孔200ul，各肿瘤细胞分别接种3个孔，于37℃，5％CO2的培养箱内培养24h；然后倾去各孔培养液。
将实施例1制得的蒲葵子有效组分溶解于DMSO中，然后用RPMI1640培养基进行稀释，得到蒲葵子有效组分溶液，使其终浓度为20ug/ml，使DMSO的浓度为10％(体积百分含量)。
同时设实验组、对照组和空白组进行实验：
实验组：将蒲葵子有效组分溶液依次分别加入上述肿瘤细胞HepG-2、HL60、Hela、CNE-2、MCF-7的培养孔内，各自接种3个孔，每孔加入200ul；
对照组：向上述各肿瘤细胞的培养孔内加入含10％(体积百分含量)DMSO的RPMI1640培养基，各自接种3个孔，每孔加入200ul；
空白组：向不含肿瘤细胞的空培养孔内加入含10％(体积百分含量)DMSO的200ul RPMI1640培养基；
将以上各组的培养板同时置于37℃，5％CO2的培养箱内培养2天。2天后向每孔加入50ul新鲜配制的1mg/ml四甲基偶氮唑蓝(MTT)溶液，并在37℃，5％CO2的条件下继续培养4h；小心弃上清，每孔加入150ul DMSO，充分溶解MTT还原产物；在酶标仪上测定各孔在波长492nm处的光密度值(OD值)，按公式计算肿瘤细胞生长抑制率。抑制率(％)＝1-(OD实验-OD空白)/(OD对照-OD空白)×100％。
实验设三次重复，结果取平均数。蒲葵子有效组分对人不同肿瘤细胞HepG-2、HL60、Hela、CNE-2、MCF-7的抑制作用的结果如表1所示。
表1蒲葵子有效组分对人不同肿瘤细胞的抑制作用
肿瘤细胞 有效组分浓度 (ug/ml) 抑制率(％) 人肝癌细胞HepG-2 20 90.2 人白血病HL60 20 50.6 宫颈癌细胞Hela 20 48.9 人鼻咽癌细胞CNE-2 20 67.8 人乳腺癌细胞MCF-7 20 65.3
蒲葵子活性组分对多种肿瘤细胞的抑制作用实验结果表明(表1)，蒲葵子活性组分在浓度为20ug/ml时对人肝癌细胞HepG-2、人自血病HL60、宫颈癌细胞Hela、人鼻咽癌细胞CNE-2、人乳腺癌细胞MCF-7均有一定程度的抑制作用，对肝癌细胞的抑制率可达90.2％。因此，蒲葵子活性组分可以用于制备肝癌、白血病、宫颈癌、鼻咽癌、乳腺癌的药物。