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1、10申请公布号CN101940591A43申请公布日20110112CN101940591ACN101940591A21申请号201010265648322申请日20100827A61K35/14200601A61K35/28200601C12N5/0789201001A61P9/00200601A61P9/1020060171申请人上海士腾生物技术有限公司地址201203上海市晨晖路377弄169号701室申请人杨子江72发明人杨肖泱杨子江顾丽娅54发明名称促血管再生或新生的制剂及其制备方法57摘要本发明涉及一种促进血管组织再生或新生的制剂及其制备方法，该制剂的制备方法是通过诱导单核细胞获得。
2、血管内皮祖细胞ENDOTHELIALPROGENITORCELLS，EPC，进而在低血清及低氧条件培养上述EPC细胞，最后分离EPC细胞获得无细胞培养基，并对该无细胞培养基进行相应后处理，即可获得所述制剂。体外和体内实验表明，本发明所述的促进血管组织再生或新生的制剂能够显著的促进血管组织的新生或受损血管组织的修复。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书8页附图2页CN101940595A1/2页21一种促进血管再生或新生的制剂的制备方法，其特征在于，该制剂的制备方法包括如下步骤步骤1从健康人血液中通过密度梯度离心的方法或白细胞置换LEUKAPHERE。
3、SIS获取外周血单核细胞，或从骨髓中通过密度梯度离心的方法获取骨髓单核细胞；步骤2培养单核细胞以获得EPC细胞；步骤3在特定条件下培养EPC细胞使其分泌促血管生成的生长因子和细胞活素，分离EPC细胞和培养基，获得富含促血管生成因子和细胞活素的无细胞培养基；步骤4对步骤3中所获得的无细胞培养基进行后处理，该后处理步骤包括过滤细胞碎片、纯化该无细胞培养基、检测各有效生长因子成分及含量、对该培养基进行冻干处理或冷冻保存，即获得促血管再生或新生制剂。2根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1所述的健康人血液的来源可以是自体来源，或异体来源，或通过血库购买的健康人白细胞悬液样本，或通过临床白细胞。
4、置换。3根据权利要求12任一所述的制备方法，其特征在于，步骤1所述的从血液中或骨髓中通过密度梯度离心获取外周血单细胞的方法为使用梯度剂为FICOLLPAQUE、HISTOPAQUE1077或其他同类产品，温度为1525，离心力为200G500G，时间2040分钟，离心完成后，吸取当中不透明层，即为单核细胞悬液。4根据权利要求13任一所述的制备方法，其特征在于，步骤2中的培养单核细胞以获得EPC细胞时，所用的培养基为M119、DMEM、RPMI1640、EBM、EBM2中的一种，并添加有051的生长因子添加剂EGM、EGMMV、EGM2或EGM2MV中的一种由瑞士LONZA公司购买，其中含血管内。
5、皮生长因子VEGF1、碱性成纤维细胞生长因子FGF2、表皮生长因子EGF，和胰岛素样生长因子IGF1；培养基中另含有质量比为5至20的胎牛血清或者人血清白蛋白；培养条件为温度37，二氧化碳浓度为5。5根据权利要求14任一所述的制备方法，其特征在于，步骤2所述的培养单核细胞以获得EPC细胞的方法为以下所述方法、或中的一种方法将单核细胞以每平方厘米5105至2106个细胞的密度培养24天，将贴壁细胞用胰蛋白酶消化收集后以每平方厘米1105至2105个细胞的密度重新培养37天，获I型EPC细胞；方法将单核细胞以每平方厘米5105至2106个细胞的密度培养2天，收集悬浮细胞，并以每平方厘米1105至2。
6、105个细胞的密度重新培养37天，获II型EPC细胞；方法将单核细胞以每平方厘米5105至2106个细胞的密度培养16天，将贴壁细胞用胰蛋白酶消化收集后以每平方厘米1105至2105个细胞的密度重新培养1021天，获III型EPC细胞；方法将单核细胞通过CD34特异性抗体进行磁珠分选，筛选出富含CD34的单核细胞亚群，将此CD34单核细胞亚群在步骤2中所描述的培养基及培养条件下以每平方厘米1105至1106个细胞的密度培养26天，获IV型EPC细胞。6根据权利要求15任一所述的制备方法，其特征在于，步骤3所述的在特定条件下培养EPC细胞的方法为将步骤2所获得的EPC细胞置于不含任何生长因子的培。
7、养基内，在氧浓度为05至2的环境中培养1至3天，所用的培养基为M119、DMEM、RPMI1640、权利要求书CN101940591ACN101940595A2/2页3EBM、EBM2、PH值为74的磷酸盐缓冲液PBS或09的医用生理盐水，并添加1的医用人血清白蛋白。7根据权利要求16任一所述的制备方法，其特征在于，不添加1的医用人血清白蛋白。8根据权利要求17任一所述的制备方法，其特征在于，所述EPC细胞为I型EPC细胞。9一种由权利要求18任一所述的方法制备获得的制剂。10权利要求9所述的制剂在制备治疗缺血性疾病的药物中的应用。权利要求书CN101940591ACN101940595A1/。
8、8页4促血管再生或新生的制剂及其制备方法技术领域0001本发明涉及一种可以促进血管再生或新生的制剂及其制备方法。背景技术0002心血管疾病是世界上致死率和发病率最高的疾病。根据2010年美国心脏学会的统计报告指出，2005年全世界大约有1750万人死于各类心血管疾病，大约占死亡总人数的30。预计到2020年，全球因心血管疾病死亡人数将达2500万人。另据WHO的报告指出，在2006年到2015年的10年之间，中国在因心血管病及糖尿病而导致的收入损失将高达5580亿美元。在2004年欧洲有430万人死于各类心血管疾病，高达总死亡人数的48。在各类心血管疾病中，动脉粥样硬化所导致的血栓及血管堵塞是。
9、最常见和最重要的发病机理。在疾病初期，由活性氧激发的对低密度脂蛋白的修饰会逐渐导致血管内皮机能障碍。机体的免疫系统对此产生慢性炎症并持续分泌富含T细胞，巨噬细胞，肥大细胞的白血球细胞群，并形成脂纹，纤维斑块，粥样斑块，使血管腔狭窄并导致血流量减少。当最终粥样斑块破碎后，脱落的碎斑会导致血小板聚集并产生大规模的闭合性血栓及其他继发性改变，包括由该动脉所供应养份的组织或器官的缺血或坏死。由动脉粥样硬化所导致的缺血性心血管疾病主要包括有冠心病，中风，以及外周闭塞性动脉疾病。其中冠心病是世界上致死率最高的单项疾病，2005年全球有760万人死于此病；全球每年的中风患者有1500万人，并导致500万人终。
10、身残疾及570万人死亡；在北美和欧洲有将近2700万人患有各种程度的外周闭塞性动脉疾病，一项2003年的研究表明，全球有将近20的成年人患有无症状的轻度外周闭塞性动脉疾病。尽管有保守锻炼，化学药物，和手术搭桥的传统治疗手段，大部分由动脉粥样硬化所导致的缺血性心血管病患者依然无法获得有效的治疗，究其原因，主要是因为对保守治疗和化学药物的不敏感，以及身体或疾病条件而无法进行有效的手术搭桥等。0003干细胞疗法是近年来在治疗癌症和心血管疾病等领域最受人期待的新发展方向。从理论上讲，干细胞可以用于各种疾病的治疗，但其最适合的疾病主要是组织坏死性疾病如缺血引起的心肌坏死，退行性病变如帕金森综合征，自体免。
11、疫性疾病如胰岛素依赖型糖尿病等。尤其是其具有的促进血管再生和器官功能恢复的特殊功效，在心血管疾病的治疗中有着巨大疗效。0004在全球现阶段开展的临床试验中，针对缺血性心血管疾病的促血管再生干细胞移植作为一种极有希望替代传统疗法的再生疗法已取得了很好的效果。然而，考虑到异体移植所带来的免疫应答及其严重的组织排斥甚至致死后果，包括患者自身的免疫系统对异体干细胞的排斥及异体干细胞群落中不可避免的含有的异源免疫细胞亚群对患者组织的排斥，此类临床试验都使用了患者自体同源的细胞。另外，在检测了不同器官组织来源的干细胞种群之后发现，来源于骨髓及外周血液的成体CD34干细胞亚类具有极强的促血管再生能力，在治疗。
12、缺血性血管疾病中有较好的效果，也免除了采用胚胎干细胞所带来的伦理问题。然而，现阶段一系列技术和应用上的不足极大的限制了干细胞疗法在临床上的进一步推广和应用，这些限制包括并不局限于1此类干细胞在骨髓及血液中的极低含量说明书CN101940591ACN101940595A2/8页5大约001；2此类细胞疗法所需细胞的极大数量11051106个/千克体重；3细胞移植入体内后的极低存活率和存活细胞的实际效率低于10；以及4患者自体干细胞因慢性疾病及长期大量心血管危险因子的影响所导致的功能失常。0005基于上述事实，特别是现有的干细胞疗法应用于临床时的缺陷和不足，有必要提供更为有效、普适的促血管再生型药。
13、物，以改善现有的由动脉粥样硬化所导致的缺血性疾病的临床治疗状况。0006血管内皮祖细胞ENDOTHELIALPROGENITORCELLS，EPC是调节和诱导新血管生成的主要干细胞亚类。动物体内实验数据表明，EPC参与血管生成的过程主要有1少量细胞分化为成熟的内皮细胞，形成新的血管内壁以及2大部分细胞分泌出大量促血管新生的生长因子和细胞活素，激发缺血组织内部的内皮细胞，平滑肌细胞，壁细胞及其他干细胞亚群及祖细胞亚群共同参与新血管的形成。事实上，此类EPC在缺血组织中分泌出的生长因子和细胞活素，可借由EPC在体外特定环境中所分泌的条件培养基中获得，并完全可能将其应用于受损血管的修复和再生，从而恢。
14、复缺血性坏死的组织的相应功能。因此，EPC在体外人工环境中分泌的促血管新成的生长因子和细胞活素在临床上有巨大的潜力，可以作为干细胞疗法的有效替代品或辅助药物。发明内容0007本发明的目的在于提供一种能够有效的促进血管再生或新生的制剂，用于克服现有药物的不足，为临床治疗缺血性疾病提供一种新的治疗药物。0008上述缺血性疾病主要指由于动脉粥样硬化或其他类血栓，血脂异常导致的血管阻塞类缺血性疾病，具体包括并不局限于在冠状动脉中产生粥状硬化所引起的冠心病，心绞痛、心肌梗塞、心律失常；脑动脉硬化引起的中风，脑缺血、脑梗塞，脑萎缩，；外周动脉粥样硬化引起的肢端缺血，坏疽，坏死，间歇性跛行；以及继发性高血压。
15、，糖尿病，慢性炎症，缺血性肠炎，表皮缺血，颈动脉闭塞，及局部或系统性缺血引起的梗塞性痴呆等。0009本发明的目的还在于提供一种制备能够有效的促进血管组织再生或新生的制剂的方法，该方法步骤为00101从健康人血液中通过密度梯度离心的方法或白细胞置换LEUKAPHERESIS获取外周血单核细胞，或从骨髓中通过密度梯度离心的方法获取骨髓单核细胞；00112培养单核细胞以获得EPC细胞；00123在特定条件下培养EPC细胞使其分泌促血管生成的生长因子和细胞活素，分离EPC细胞和培养基，获得富含促血管生成因子和细胞活素的无细胞培养基；00134对步骤3中所获得的无细胞培养基进行后处理，该后处理步骤包括过。
16、滤细胞碎片、纯化该无细胞培养基、检测各有效生长因子的成分及含量、对该培养基进行冻干处理或冷冻保存，即获得促血管再生或新生制剂。0014本发明所述制备能够有效的促进血管组织再生或新生的制剂的方法中，步骤1所述的健康人血液的来源可以是自体来源仅局限于无症状的轻度外周闭塞性动脉疾病或异体来源，获得途径可以是直接抽血，或由血库直接购买的健康人白细胞悬液样本，或通过临床白细胞置换。血液提供者的限制范围为50岁以下，无烟酒史，无传染性疾病，血液疾病的健康人群。所述的梯度离心以获取单核细胞的步骤为将所获得的血液或白说明书CN101940591ACN101940595A3/8页6细胞悬液在密度梯度剂中梯度离心。
17、，所用的梯度剂可为FICOLLPAQUEGEHEALTHCARE、HISTOPAQUE1077SIGMA，或其他公司同类产品，优选为HISTOPAQUE1077；适用温度范围为15到25，优选为25；每15MLHISTOPAQUE可分离15至30ML全血样品。具体操作为将含有血液及梯度剂的容器在200G500G下离心2040分钟，分层后，用无菌一次性针管吸取当中不透明层，即为富含单核细胞的悬浮液，经鉴定，此单核细胞群体来源于骨髓髓系干细胞，丰富表达单核细胞特异性受体CD14，其内所含多种细胞亚群，呈多形性。0015本发明所述制备能够有效的促进血管组织再生或新生的制剂的方法中，步骤2中的培养单核。
18、细胞以获得EPC细胞时，所用的培养基可为M119、DMEM、RPMI1640、EBM、EBM2中的一种，并添加有051的生长因子添加剂EGM、EGMMV、EGM2或EGM2MV中的一种由瑞士LONZA公司购买，其中含血管内皮生长因子VEGF1、碱性成纤维细胞生长因子FGF2、表皮生长因子EGF，和胰岛素样生长因子IGF1；或添加有内皮细胞生长因子ECGF10100G/ML。培养基中另含有质量比为5至20的胎牛血清或者人血清白蛋白。在预设条件为培养温度37，二氧化碳浓度为5的细胞培养箱中培养。0016本发明所述制备能够有效的促进血管组织再生或新生的制剂的方法中，步骤2中的培养单核细胞以获得EPC。
19、细胞的步骤为以下所述方法，或中的一种0017方法将单核细胞以每平方厘米5105至2106个细胞的密度培养24天，将贴壁细胞用胰蛋白酶消化收集后以每平方厘米1105至2105个细胞的密度重新培养37天。所获I型EPC为纺锤状细胞，具有内吞乙缩醛化的低密度脂蛋白ACETYLATEDLDL及结合荆豆凝集素UEA1LECTIN的典型内皮细胞特性，并且大量表达血管内皮细胞生长因子受体KDR，CD31，单核细胞受体CD14，造血细胞受体CD45，少量表达干细胞特有受体CD34，CD133。0018方法将单核细胞以每平方厘米5105至2106个细胞的密度培养2天，收集悬浮细胞，并以每平方厘米1105至210。
20、5个细胞密度重新培养37天。所获II型EPC为细胞集落，其中心分布为圆形细胞，周围为纺锤状细胞。此II型EPC具有典型内皮细胞特性并表达内皮细胞特有受体KDR，CD31及TIE2。0019方法将单核细胞以每平方厘米5105至2106个细胞的密度培养16天，将贴壁细胞用胰蛋白酶消化收集后以每平方厘米1105至2105个细胞的密度重新培养1021天。所获III型EPC为细胞集落，并可持续培养及增殖12个星期以上，此III型EPC具有典型内皮细胞特性并表达内皮细胞特有受体KDR，CD31，TIE2，及VECADHERIN。0020方法将单核细胞通过CD34特异性抗体进行磁珠分选由德国MILTENYI。
21、BIOTEC公司生产，筛选出富含CD34的单核细胞亚群，将此CD34单核细胞亚群在步骤2中所描述的培养基及培养条件下以每平方厘米1105至1106个细胞的密度培养26天。所获IV型EPC为CD34细胞集落，此IV型EPC具有典型内皮细胞特性并表达内皮细胞特有受体KDR及干细胞特有受体CD34。0021本发明所述制备能够有效的促进血管组织再生或新生的制剂的方法中，步骤3中的在特定条件下培养EPC细胞的方法为将步骤2所获得的I、II、III或IV型EPC置于不含任何生长因子的培养基内，在氧浓度为05至2的环境中培养1至3天，所用的培养基为M119、DMEM、RPMI1640、EBM、EBM2、PH。
22、74的磷酸盐缓冲液PBS或09的医用生理盐水，并可添加1的医用人血清白蛋白。说明书CN101940591ACN101940595A4/8页70022培养完成后收集富含细胞生长因子的条件培养基，弃去EPC细胞。0023本发明所述制备能够有效的促进血管组织再生或新生的制剂的方法中，步骤4所述的后处理步骤包括0024对步骤3中所收集的无细胞培养基进行过滤，可通过高速离心或过滤器将细胞杂质及碎片去除。0025对过滤后的无细胞培养基进行成分鉴定，并对其中所含的代表性促血管生长因子及细胞活素如MCP1，EGF，MMP9，IL8，ANGIOGENIN，VEGF的含量进行鉴定，鉴定方法可为蛋白组学PROTEO。
23、MICS，细胞活素阵列CYTOKINEARRAY，酶联免疫吸附测定ELISA，或BIOPLEXTM细胞因子测试。0026对过滤后的无细胞培养基进行冻干或分装冷冻保存，以便长期保存其中的生长因子及细胞活素成分的活性。附图说明0027图1本发明所述促血管再生或新生制剂对成体内皮细胞的保护及激发作用。0028图2本发明所述促血管再生或新生制剂对体外微血管生成的激发功效。0029图3本发明所述促血管再生或新生制剂对裸大鼠缺血性损伤的修复。具体实施方式0030以下通过具体的实例对本发明的内容作进一步的阐述说明，本发明包括但不限于下述步骤和内容。0031实施例1单核细胞的制备。0032将100ML血液加入。
24、密度梯度剂HISTOPAQUE1077SIGMA，每15MLHISTOPAQUE中加入30ML血液。将含有血液及梯度剂的试管在400G的速度下常温离心30分钟。分层后，用无菌一次性针管吸取当中不透明层，即为富含单核细胞的悬浮液。视具体情况，每100ML血液可以获得1X1081X1010个单核细胞。0033实施例2EPC细胞的获取。0034针对I类EPC细胞的获取方法将富含单核细胞的悬浮液在添加有10人血清白蛋白及添加有1的生长因子添加剂EGM由瑞士LONZA公司购买，其中含血管内皮生长因子VEGF1、碱性成纤维细胞生长因子FGF2、表皮生长因子EGF，和胰岛素样生长因子IGF1的EBM2培养基。
25、下以每平方厘米1106细胞的密度培养4天，将贴壁细胞用胰蛋白酶消化收集后以每平方厘米2105的密度重新培养2天。所获I型EPC为纺锤状细胞，具有内吞乙缩醛化的低密度脂蛋白ACETYLATEDLDL及结合荆豆凝集素UEA1LECTIN的典型内皮细胞特性，并且大量表达血管内皮细胞生长因子受体KDR、CD31、CD14、CD45、少量表达CD34、CD133及血管内皮钙粘蛋白VECADHERIN。0035针对II类EPC细胞的获取方法将富含单核细胞的悬浮液在添加有10人血清白蛋白及添加有1的生长因子添加剂EGM由瑞士LONZA公司购买，其中含血管内皮生长因子VEGF1、碱性成纤维细胞生长因子FGF2。
26、、表皮生长因子EGF，和胰岛素样生长因子IGF1的EBM2培养基下以每平方厘米1106细胞的密度培养2天，收集悬浮细胞，并以每平方厘米2105个细胞的密度重新培养3天。所获II型EPC为细胞集落，其中心分布说明书CN101940591ACN101940595A5/8页8为圆形细胞，周围为纺锤状细胞。此II型EPC具有典型内皮细胞特性并表达内皮细胞特有受体KDR，CD31及TIE2。0036针对III类EPC细胞的获取方法将富含单核细胞的悬浮液在添加有10人血清白蛋白及添加有1的生长因子添加剂EGM由瑞士LONZA公司购买，其中含血管内皮生长因子VEGF1、碱性成纤维细胞生长因子FGF2、表皮生。
27、长因子EGF，和胰岛素样生长因子IGF1的EBM2培养基下以每平方厘米1106个细胞的密度培养3天，将贴壁细胞用胰蛋白酶消化收集后以每平方厘米2105个细胞的密度重新培养20天。所获III型EPC为细胞集落，具有典型内皮细胞特性并表达内皮细胞特有受体KDR，CD31，TIE2，及VECADHERIN。针对IV类EPC细胞的获取方法将单核细胞通过CD34特异性抗体通过磁珠分选由德国MILTENYIBIOTEC公司生产，筛选出富含CD34的单核细胞亚群，将此CD34单核细胞亚群在在添加有10人血清白蛋白及添加有1的生长因子添加剂EGM由瑞士LONZA公司购买，其中含血管内皮生长因子VEGF1、碱性。
28、成纤维细胞生长因子FGF2、表皮生长因子EGF，和胰岛素样生长因子IGF1的EBM2培养基下以每平方厘米5105个细胞的密度培养2天。所获IV型EPC为CD34细胞集落，此IV型EPC具有典型内皮细胞特性并表达内皮细胞特有受体KDR及干细胞特有受体CD34。0037视具体情况，所获得的各型EPC细胞的量约为单核细胞量的110。0038实施例3促血管再生或新生制剂的获取。0039将实施例2所获得的I型EPC细胞置于不含任何生长因子的磷酸盐缓冲液PBS内每平方厘米2105个细胞，在氧浓度为15的环境中培养2天，并添加1的医用人血清白蛋白。培养完成后收集富含细胞生长因子的无细胞培养基，弃去贴壁的EP。
29、C细胞。将收集的无细胞培养基通过孔径为02微米的过滤器将细胞杂质及碎片去除并分装于80冷库冷藏备用。视具体情况，每1X106个EPC细胞可以制备25ML所述促血管再生或新生制剂。0040实施例4促血管再生或新生制剂中的生长因子及细胞活素的鉴定。0041实施例3所制得的促血管再生或新生制剂中含有的生长因子及细胞活素成分通过细胞活素阵列CYTOKINEARRAY鉴定由RDSYSTEMS购买，此促血管再生或新生制剂的有效成分包含并不局限于以下生长因子MCP1、EGF、IL8、MMP9、PAR、ANGIOGENIN、SDF1、HGF、VEGF以及PDGF。通过BIOPLEXTM细胞因子测试检测由BIO。
30、RAD公司生产，其中有效成分的含量为，IL814G/ML；SDF150100NG/ML；HGF510NG/ML；ANGIOGENIN15NG/ML；PDGFBB15NG/ML；VEGF011NG/ML。其他成分组成见表1。0042表1本发明所述促血管再生或新生制剂中的成分列表包含并不局限于以下成分0043说明书CN101940591ACN101940595A6/8页9ACTIVINAFGF4IL1RAMMP9AGRPFGF9IL1RIIMPIF1ANGIOGENINGITRIL2RALPHANAP2B71CD80GITRLIGANDIL2RBETANT4BMP4GMCSFIL2RONCOSTA。
31、TINMBMP5GROIL4PDGFBMP6HCC4IL6RRANTESBNGFHGFIL8SCFCARDIOTROPHIN1ICAM1IL9SDF1CD14ICAM3LEPTINRSIGLEC5CTACKIGFBP3LIFSTNFRICXCL16IGFILSELECTINSTNFRIIDTKIGFIIMCP1TECKEGFIGFISRMCP2TGFBETA2ENA78IL10MCP4THROMBOPOIETINEOTAXINIL10RBETAMCSFTIMP1EOTAXIN2IL12P40MCSFRTRAILR4EOTAXIN3IL13RALPHA2MDCUPARERBB3IL18BPALP。
32、HAMIFVECADHERINFAS/TNFRSF6IL18RBETAMIP1VEGFFASLIGANDIL1R4/ST2MMP13VEGFD0044实施例5体外检测促血管再生或新生制剂对成体内皮细胞的存活影响。说明书CN101940591ACN101940595A7/8页100045将人脐静脉内皮细胞HUVEC此细胞可通过商业途径购买，例如ATCC细胞库以每孔3103个细胞的密度接种于96孔板中，在含10人血清白蛋白及添加有1的生长因子添加剂EGM由瑞士LONZA公司购买，其中含血管内皮生长因子VEGF1、碱性成纤维细胞生长因子FGF2、表皮生长因子EGF，和胰岛素样生长因子IGF1的EBM。
33、2培养基下中培养24小时，弃去原培养基，将细胞重新置于本发明所述的促血管再生或新生制剂或阴性对照培养基即只含有1人血清白蛋白的PBS，PH74中，于37，5二氧化碳浓度的细胞培养箱中继续培养24小时，用NF细胞增殖试剂盒由INVITROGEN公司购买检测活细胞含量结果见图1A。结果显示，此促血管再生或新生制剂能够显著增加HUVEC细胞在低血清环境中的存活率，在发明所述的促血管再生或新生制剂中培养的HUVEC细胞的存活量为阴性对照组的143006倍P00001。0046使用HOMOGENEOUSCASPASE3/7试剂盒由PROMEGA公司购买，此试剂盒能检测细胞凋亡过程中的执行者效应凋亡蛋白酶。
34、CASPASE3和CASPASE7的活性，此蛋白酶活性越大则细胞凋亡率越高对HUVEC细胞在低血清培养下的细胞凋亡率进行检测结果见图1B。结果显示，本发明所述的促血管再生或新生制剂能够显著的降低HUVEC细胞在低血清环境中的凋亡率，在发明所述的促血管再生或新生制剂中培养的HUVEC细胞的凋亡率仅为阴性对照组的59643P00001。0047实施例6体外检测促血管再生或新生制剂对成体内皮细胞的刮伤愈合SCRATCHWOUNDHEALING功效及迁移功效。0048将HUVEC细胞以每孔5104个细胞的密度接种于24孔板中，在含10人血清白蛋白及添加有1的生长因子添加剂EGM由瑞士LONZA公司购买。
35、，其中含血管内皮生长因子VEGF1、碱性成纤维细胞生长因子FGF2、表皮生长因子EGF，和胰岛素样生长因子IGF1的EBM2培养基下中培养24小时，弃去原培养基并用移液管尖将在板底的细胞层上划出一道细胞空白区域，将细胞重新置于本发明所述的促血管再生或新生制剂或阴性对照培养基即只含有1人血清白蛋白的PBS，PH74中继续培养20小时后检测此刮伤愈合SCRATCHWOUNDHEALING的程度即面积比；结果见图1C。结果显示，本发明所述的促血管再生或新生制剂能够显著的加快HUVEC细胞在低血清环境中的刮伤愈合速度，相比对照组的愈合速度刮伤面积减少至77055，本发明所述的促血管再生或新生制剂能够以。
36、更快的速度减小刮伤面积至39544P0001。0049使用适用于24孔板的TRANSWELL内室系统由CORNING公司购买可测量HUVEC细胞的迁移速率。将5104个HUVEC细胞悬浮于200微升阴性对照培养基即只含有1人血清白蛋白的PBS，PH74中，置于8微米孔径的内室底部多聚碳酸盐滤膜上，外室则加入500微升本发明所述的促血管再生或新生制剂或阴性对照培养基即只含有1人血清白蛋白的PBS，PH74。37孵育6小时后，弃去培养液，用4多聚甲醛同定细胞10MIN。用棉签轻轻擦去内室上层未迁移的细胞，下层用01结晶紫染色并计算迁移细胞数量结果见图1D。结果显示，本发明所述促血管再生或新生制剂具。
37、有引导HUVEC细胞加速迁移的功效，本发明所述促血管再生或新生制剂能够显著的加快HUVEC细胞的迁移速率，达到对照组的193012倍P00001。0050实施例7体外促微血管生成功效检测。0051将大鼠腹腔主动脉切成1毫米的环状，置于24孔板中，并用1MG/ML浓度的胶原蛋说明书CN101940591ACN101940595A8/8页11白包被，置于37下凝胶化5分钟。将包被后的主动脉环置于500L本发明所述的促血管再生或新生制剂或阴性对照培养基内即只含有1人血清白蛋白的PBS，PH74培养10天，计算主动脉环外伸展出的再生或新生微型血管状结构的数量结果见图2。结果显示，本发明所述的促血管再生。
38、或新生制剂具有激发血管新生或再生的功效，培养10天后，促血管新生制剂组图2B中的新生微型血管状结构的数量显著多于阴性对照培养基图2A，P00001。0052实施例8裸大鼠缺血性损伤的修复。0053在后肢缺血性损伤的裸大鼠模型上验证本发明所述的促血管再生或新生制剂对体内缺血性组织损伤的修复以及促新血管生成的作用。具体方法为对裸大鼠进行了单边的后肢股动脉切除手术，使其缺血后肢的血流量，肌肉线粒体活性及毛细血管数量保持在稳定的水平50于正常值并出现明显的功能化萎缩。在术后的第14，17，20天，肌肉注射本发明所述的促血管再生或新生制剂每次总注射量为250L，均匀注射入缺血组织附近的5个随机肌肉注射点。
39、，即每注射点50L，结果显示对比安慰剂对照组即方法相同，但注射的制剂为只含有1人血清白蛋白的PH74的PBS，本发明所述促血管再生或新生制剂显著的增加了缺血后肢的血流量见图3。结果显示，此促血管再生或新生制剂在体内具有显著的促进新生血管生成以及提高血流量的作用。肌肉注射本发明所述的促血管再生或新生制剂至裸大鼠的缺血后肢中的35天后，该缺血后肢的血流量具有显著的提高运用多普勒激光成像技术显示血流量，红色代表血流量，见图3A。相对于安慰剂组只能达到的55031正常血流量，本发明所述的促血管再生或新生制剂从第14天后即增加了缺血后肢的血流量，并在第35天达到了正常后肢血流量的91470见图3BP001。说明书CN101940591ACN101940595A1/2页12图1说明书附图CN101940591ACN101940595A2/2页13图3说明书附图CN101940591A。