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3,15- 二羰基赤霉酸甲酯在逆转肿瘤多药耐药中的用途
    技术领域 本发明涉及到新合成的赤霉酸甲酯的用途， 具体是 3， 15- 二羰基赤霉酸甲酯在逆 转肿瘤多药耐药中的用途。
     背景技术 恶性肿瘤严重危害人类生命和健康， 已成为当今疾病死亡的主要原因之一。随着 对恶性肿瘤本质认识的加深， 恶性肿瘤是全身而非局部性疾病的认识已被普遍认同。 因此， 较手术和放射疗法相比， 肿瘤的药物治疗即化疗在治疗肿瘤、 延长生存时间和提高患者的 [1] 生活质量方面具有肯定的和不可替代的作用 。但是， 在肿瘤的化疗过程中产生的多药耐 药 (Multi-drug resistance， MDR) 是肿瘤化疗失败的主要原因之一 [9]。
     MDR 是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生耐药性的同时， 对结构和作用机制不同 的抗肿瘤药物产生交叉耐药性。MDR 多针对天然药物， 如阿霉素、 柔红霉素、 长春新碱、 长春 [11] 碱、 紫杉醇、 鬼臼毒素等产生 。MDR 是肿瘤化学治疗的主要障碍， 也是肿瘤化疗亟待解决 的难题。 MDR 形成的机制复杂， 肿瘤细胞可通过不同途径导致 MDR 产生。 MDR 的产生与 P- 糖 蛋白 (P-gp) 的过度表达有关， 还与多药耐药相关蛋白 (MRP)、 肺耐药蛋白 (LRP)、 耐药细胞 的抗凋亡机制、 拓扑异构酶 II(TOPO II)、 蛋白激酶 C(PKC)、 金属硫蛋白、 谷胱甘肽 (GSH)、 [2] 谷胱甘肽 -S 转移酶 (GST) 等有关 。但多数肿瘤细胞 MDR 的产生主要与 P-gp 的过表达或 与 MDR 介导的抗凋亡机制有关。 P-gp 表达在细胞膜上， 为一能量依赖性转运蛋白， 类似于药 泵， 能将多种结构和作用机制不同的天然药物排出细胞外， 使细胞内药物浓度降低， 导致肿 [10] 瘤细胞对多种化疗药物不敏感， 产生 MDR 。而抗凋亡基因过表达和促凋亡基因的低表达 均能抑制肿瘤细胞凋亡， 并影响化疗药物对肿瘤细胞的杀伤， 从而亦能产生 MDR[3]。其中以 抑制凋亡基因 Bcl-2 和促凋亡基因 Bax 的表达失衡为多见。
     人类 P-gp 分为两类， 分别由 mdr-1 和 mdr-3 基因编码。mdr-1 编码的 P-gp 与 MDR 有关， 分子量为 170kD， 是一能量依赖性的药物外排跨膜蛋白， 有 12 个跨膜区， 膜内有两个 ATP 结合区。多数 MDR 逆转剂能抑制 P-gp 活性， 恢复或部分恢复肿瘤细胞对抗癌药物的敏 [4] 感性 。近年来研究的 MDR 逆转剂大致可分为①钙离子通道阻滞剂 ： 其代表是维拉帕米 (verapamil， VER)， 是最早发现的 MDR 逆转药物， 其逆转 MDR 作用与钙拮抗作用无关， 而是通 过竞争性地与 P-gp 结合， 成为 MDR 细胞外排泵的竞争性底物， 从而增加细胞内药物的聚积 量来实现逆转作用。但本类药物由于严重的心血管系统毒性， 妨碍了其临床应用。②环 孢 菌素类药物 ： 是一种高度亲脂性物质， 可与抗肿瘤药物竞争 P-gp 上的结合位点， 从而抑制 跨膜泵作用， 使细胞内药物累积增加， 逆转 MDR。其代表药物为环孢菌素 A(CsA) 及其衍生 物 Valspodar(SDZ-PSC833) 和 bircodar(Vx710)。临床观察发现 CsA 比传统的逆转剂维拉 帕米有更强的逆转作用。但由于 Valspodar 和 Bircodar 是细胞色素氧化酶 P4503A4 的底 物， 因此也抑制该酶的活性， 导致经该酶代谢相关药物的体内代谢和消除受抑制， 用药者体 内相关药物浓度升高而产生严重的毒性反应。由于这些药物间的相互作用极其复杂， 在临 [12] 床上难以确定安全有效的给药剂量， 限制了此类药物的应用 。③新近通过构效关系和组
     合化学原理研制的对 P-gp 更具有特异性和更强作用的 P-gp 抑制剂 Tariquidar(XR9576)， 能高亲和性地结合 P-gp， 强效抑制其活性。不同于前两类竞争性抑制机制， Tariquidar 与 P-gp 的结合是特异性、 非竞争性的， 其亲和力远大于其它底物。Tariquidar 在临床研究中 观察到其抑制 P-gp 的能力和时间明显超过前两类 MDR 逆转剂， 并在Ⅰ期和Ⅱ期临床实验中 均收到良好的效果。但在Ⅲ期临床实验中发现其与一线化疗药物联用时毒性增强， 甚至出 [5] 现严重的毒副反应， 以致最终临床疗效依然不理想 。
     在研究的 MDR 逆转剂中， 绝大多数均为非抗癌药， 而对于已知的抗癌药， 肿瘤细胞 又几乎都可产生耐药性， 即使是应用时间不长、 疗效又很好的抗癌药紫杉醇也是如此。 迄今 [6] 几乎没有对耐药肿瘤有效的抗癌药， 更无法得知其逆转肿瘤耐药的机制 。 有报道， 治疗慢 性粒细胞性白血病的有效成分 - 靛玉红显示出逆转耐药的作用， 临床试验中， 其在剂量小 于其它抗癌药时却有高于它们的疗效， 表现出逆转耐药和抗肿瘤的双重效应， 此类药物值 [7] 得期待， 是寻找抗耐药肿瘤新药的重要方向 。
     诱导细胞凋亡是众多化疗药物杀伤肿瘤细胞的共同通路， 从这个意义上说， 凋亡 [8] 受抑或凋亡逃逸可能是肿瘤细胞产生耐药的机制之一 。目前， 细胞凋亡调控基因与肿瘤 多药耐药的关系已被许多学者所证实。Bcl-2 基因家族是目前研究较深入的细胞凋亡相关 基因， 与肿瘤细胞耐药密切相关 [3]。 而 Bax 作为凋亡促进基因的代表， 其过度表达可诱导多 种肿瘤细胞产生凋亡， 反之则产生耐药。
     化合物 3， 15- 二羰基赤霉酸甲酯 (GA13315) 是从合成的一系列赤霉素衍生物中筛 选出的新四环二萜类化合物， 已获中国发明专利保护， 专利名称 ： 3， 15- 二羰基赤霉酸类化 合物及其酯和盐， 专利号 ： ZL 200410021939.2。 发明内容 本发明的目的是提供 3， 15- 二羰基赤霉酸甲酯在制备治疗肿瘤药物中的应用。
     前期发明人在对 GA 逆转肿瘤 MDR 的探索中发现， 耐多柔比星 (ADM) 的人慢性粒细 胞性白血病细胞株 -K562/A02， 在对多种结构和作用机制不同的经典化疗药产生耐药的情 况下， 对化合物 GA 仍然敏感， 其半数抑制浓度 IC50 明显低于其它化疗药， 并呈现较好的剂量 依赖性。
     本申请在此基础上， 以化疗药 ADM 耐药的细胞株 K562/A02 和相应的敏感株 K562 为模型， 以维拉帕米 (VER) 为阳性对照， 在验证 K562/A02 模型的 MDR 特性及程度的基础上， 进一步检测 GA 作用于 K562/A02 细胞的药物敏感性以及逆转其 ADM 耐药的效应及机制。采 用流式细胞术 (FCM)、 直接免疫荧光法、 AnnexinV/PI 双染法、 实时定量逆转录聚合酶链反 应 (RQ-PCR) 多种细胞分子生物学方法， 检测 GA 对 K562/A02 细胞 P-gp 表达、 功能、 MDR 细 胞凋亡抗性的缓解及 mdr-1 基因 mRNA 转录各方面的影响。
     本发明对于寻找同时兼有抗肿瘤和克服肿瘤多药耐药的候选化合物， 研发新的具 有自主知识产权的肿瘤多药耐药逆转剂， 提高肿瘤治疗的疗效奠定基础， 具有重要的科学 意义。此外， 由于化合物 GA 的合成原料价廉易得、 反应步骤少、 产物得率高， 因此本发明亦 具有可期待的应用前景。
     本发明所述的 GA 在制备肿瘤药物中的应用的有益效果如下 ： 化疗药 ADM、 表阿霉 素 (EPI) 和依托泊苷 (VP-16) 对 K562/A02 细胞生长的半数抑制浓度 (IC50) 均＞ 100μg/
     ml， 而对 K562 细胞的 IC50 分别为 0.33、 2.08 和 2.21μg/ml， K562/A02 对各化疗药的耐药指 数 (RI) 分别为 303.03， 48.08， 45.25， 表明 K562/A02 为 MDR 细胞模型， K562 即为相应的敏 感细胞模型。化合物 GA 对 K562/A02 细胞的 IC50 仅为 4.43μg/ml， 提示在对多种化疗药耐 药的同时， K562/A02 对 GA 仍然具有较高的敏感性。ADM 与 10μg/mlVER 联合或与 3.125、 6.25、 12.5μg/ml 浓度的 GA 联合作用于 K562/A02 细胞的 IC50 分别为 1.68， 24.13， 2.38， 0.84， 逆转倍数 (FR) 分别为 32.4， 2.26， 39.45， 64.81 倍， 提示化合物 GA 能显著逆转 K562/ A02 对 ADM 的耐药 (P ＜ 0.01) ； 在蓄积实验中， ADM 与 VER 或 GA 联用均能显著提高 ADM 在 K562/A02 细胞内的蓄积量， 且 GA 显示出较为明显的剂量依赖性 (p ＜ 0.01)， 而相同浓度的 GA 和 VER 在同等条件下与 ADM 联用对 K562 敏感株无此效应 (P ＞ 0.05) ； RH-123 外排实验 结果显示， K562 细胞内的 RH-123 含量显著高于 K562/A02 细胞 (P ＜ 0.01)， 而 6.25μg/ml 的 GA 即可明显提高 P-gp 高亲和力底物 RH-123 在 K562/A02 细胞内的含量 (P ＜ 0.05)， 并呈 现良好的剂量依赖性 ； P-gp 表达检测结果显示， K562/A02 较 K562 高表达 P-gp(P ＜ 0.01)， 而 12.5μg/ml 的 GA 对 K562/A02 细胞 P-gp 表达的影响与阴性对照组比较无显著差异 (P ＞ 0.05) ； 凋亡检测结果显示， ADM 自身并不能缓解 K562/A02 细胞由于耐药所引发的凋亡受阻 (P ＞ 0.05)。但 ADM 在与 GA 联合作用于 K562/A02 细胞后， 即可剂量依赖性地缓解由 MDR 所导致的 K562/A02 细胞的抗凋亡作用，12.5μg/ml 的 GA 联合 ADM 作用于 K562/A02 细胞 48h 后， 耐药株由 10μg/ml ADM 引发的凋亡从 20.15％增加到 74.41％， P ＜ 0.05 ； RQ-PCR 结果显示， ADM 单独或与 GA 联合作用于 K562/A02 细胞后， 其 mdr-1mRNA 的表达出现轻微下 调， 但与对照组相比， 此下调作用不明显 (P ＞ 0.05)。 因此， 新四环二萜类化合物 GA 具有逆 转 K562/A02 细胞多药耐药的效应， 此作用与增加耐药细胞内化疗药的含量、 阻止其外排及 促进耐药细胞凋亡有关， 但与下调耐药基因 mdr-1 的表达无明显相关， 提示其作用机制与 抑制耐药细胞 P-gp 的外排泵功能及诱导耐药细胞凋亡有关。 附图说明
     图 1 为化合物 GA 对 K562 和 K562/A02 细胞增殖的 IC50(μg/ml) ；
     图 2 为化合物 GA 对 K562/A02 细胞中 ADM 蓄积量的影响 ； 图中从左往右各峰依次 为： 阴性对照组， GA-3.125， 6.25， VER( 阳性对照 )-10， GA-12.5(μg/ml) ；
     图 3 为化合物 GA 对 K562 细胞中 ADM 蓄积量的影响 ；
     图 4 为化合物 GA 对 K562/A02 细胞中 ADM 蓄积量的影响 ( 三次实验平均值 ) ；
     图 5 ～图 8 为 GA 对 K562/A02 细胞 P 糖蛋白 (P-gp) 表达的影响 ；
     图 9 为 GA 对 K562/A02 和 K562 细胞内 RH123 含量的影响 ；
     图 10 为 GA 对 P-gp 蛋白泵外排功能的影响 ；
     图 11 ～图 15 为 GA 对 ADM 诱导的 K562/A02 细胞凋亡的影响 ；
     图 16 为 RQ-PCR 中各实验组溶解曲线图 ；
     图 17 为 RQ-PCR 中各实验组扩增曲线图 ；
     图 18 为 RQ-PCR 检测 GA 对 K562/A02 细胞 mdr-1mRNA 表达的抑制作用。 具体实施方式
     下面结合具体实施例及附图对本发明作进一步说明。一、 实验材料
     ( 一 ) 细胞株
     K562(The Drug Sensitive Human Myelogenous Leukemia Cell line) ： 人慢性髓 系白血病细胞株 ；
     K562/A02(The Drug Resistant Human Myelogenous Leukemia Cell line) ： 耐多 柔比星的人慢性髓系白血病细胞株。
     两株细胞均引自中国科学院上海药物研究所。K562 细胞置于含体积分数 10％胎 牛血清 RPMI1640 培养液中， 37℃， 5％ CO2， 饱和湿度下培养。K562/A02 细胞培养基中加入 1μg/ml 的多柔比星 (ADM) 维持培养， 并于实验前 2 周去除 ADM、 用常规 RPMI1640 完全培养 液进行 培养。
     ( 二 ) 样品与试剂
     1、 样品
     化合物 GA13315， 化学名 3， 15- 二羰基赤霉酸甲酯， 为新四环二萜类化合物， 分子 量为 370.4， 由云南大学提供。
     2、 主要药品及试剂 (1) 注射用盐酸多柔比星 (ADM) ： 浙江海正药业股份有限公司， 批号 ： 080202B ；
     (2) 依托泊苷注射液 (VP-16) ： 江苏恒瑞医药股份有限公司， 批号 ： 08020691 ；
     (3) 注射用硫酸长春新碱 (VCR) ： 浙江海正药业股份有限公司， 批号 ： 070501 ；
     (4) 盐酸维拉帕米注射液 (VER) ： 哈药集团三精制药， 批号 ： 080107A8 ；
     (5) 连接有荧光素 PE 的 P-gp 单克隆抗体 (Anti-Pgp-PE) ： BD 公司 ；
     (6) 罗丹明 123 试剂 (RH-123) ： Sigma 公司， 127k5752 ；
     (7) 改良型 RPMI 1640 培养基 ： 赛默飞世尔生物化学制品 ( 北京 ) 有限公司， 批号 ： NTE0099 ；
     (8) 二甲基亚砜 (DMSO) ： Amresco 产品， 批号 ： 0718A01 ；
     (9) 碘化丙啶 (PI) ： Sigma 公司生产 ；
     (10) 核糖核酸酶 A(RNase A) ： Sigma 公司生产 ；
     (11) 无水乙醇 ： 天津市北方天医化学试剂厂生产， 批号 ： 20090515 ；
     (12) 胎牛血清 ： 杭州四季青生物工程材料有限公司生产， 批号 ： 080619 ；
     (13) 二甲基四氮唑蓝 (MTT) ： Amresco 公司生产， 批号 ： 1708B015 ；
     (14) 十二烷基硫酸钠 (SDS) ： 汕头市达濠精细化学品公司生产， 批号 ： 20080210 ；
     (15) 异丁醇 ： 上海化学试剂公司生产， 批号 ： 0804253 ；
     (16) 浓盐酸 (HCl) ： 成都市欣海兴化工试剂厂生产 ；
     (17)0.9％氯化钠注射液 (N·S) ： 昆明南疆制药有限公司生产， 批号 ： 0806270 ；
     (18)NaCl ： 重庆川东化工 ( 集团 ) 有限公司生产， 批号 ： 20080901 ；
     (19)TRIzol 试剂， invitrogen 公司生产， Lot.No ： 50300413 ；
     (20) 焦碳酸二乙酯 (DEPC)， Promega 公司产品 ；
     (21)M-MLV Reverse Transcriptase(200U/ul) 试 剂 盒， invitrogen 公 司 生 产， Cat.No ： 28025-021 ；
     (22)5XFirst-Strand Buffer[250Mm Tris-HCl ， 375Mm KCl ， 15mm MgCl2] ，
     invitrogen 公司 产品， Cat.No ： 28025-021 ；
     (23)DTT(0.1mM)， invitrogen 公司产品， Cat.No ： 28025-021 ；
     (24)Random primer， 中国上海生物工程技术有限公司产品， Lot.No ： 0701 ；
     (25)dNTPs(10mM)， 中国上海生物工程技术有限公司产品， Lot.No ： 3080901 ；
     (26)β-actine 及 mdr-1 上、 下游引物， 中国上海生物工程技术有限公司合成 ；
     (27)SYBR Green I(20×)， Generay 公司产品， Lot.No ： RS0975 ；
     (28)MgCl2(25mM)， Fermentas 公司产品， Lot.No ： 00031664。
     (29)TaqDNA 聚合酶、 PCR 反应缓冲液 (10x)， 北京 BioDev
     (29)Platinum Taq DNA Polymerase(5U/ul)， invitrogen 公 司 产 品， Lot.No ： 266632。
     ( 三 ) 主要仪器和设备
     1.CO2 培养箱 ： 德国 Hereaus 公司生产 ；
     2. 电子天平 ： 常熟市双杰测试仪器厂生产， JJ200 型 ；
     3. 医用净化工作台 ： 苏州净化设备公司生产， YJ-1450 型 ；
     4. 低温高速离心机 ： 德国 Hereaus 公司生产， Biofuge 15R 型 ； 5. 倒置相差显微镜 ： 日本 Olympus 公司生产， BH-2 型 ；
     6. 酶标板自动读数仪 ： 美国伯乐公司生产， Bio-Rad 680 型 ；
     7. 热空气干燥消毒箱 ： 德国 Hereaus 公司生产， D-6450 型 ；
     8. 一次性 6 孔、 96 孔培养板 ： 美国 Corning 公司生产 ；
     9. 超低温冰箱 ： 美国 Thermo Electron 公司生产， Forma-86C991 型 ；
     10. 光学显微镜 ： 德国莱卡 (Leica) 公司生产， DM400B 型 ；
     11. 流式细胞仪 ： Beckman coulter 公司生产， Coulter Epics×L 型 ；
     12. 台式高速低温离心机， 德国 Heraeus 公司产品， 型号 Biofuge Stratos ；
     13. 常温高速离心机， 美国热电公司产品， 型号 IEC Multi ；
     14. 实时荧光定量 PCR 仪， 美国 ABI 公司产品， 型号 7300 ；
     15. 海尔冰箱 (4℃ )， 中国青岛海尔集团产品 ；
     16.UV2000 紫外分析仪， 上海天能科技有限公司产品 ；
     17. 电泳仪、 电泳槽， 上海天能科技有限公司产品 ；
     18. 紫外分光光度仪， BIO-RAD 有限公司产品 ；
     19. 漩涡混合器， 其林贝尔仪器制造公司产品， QL-901。
     ( 四 ) 试剂配制
     1.RPMI 1640 完全培养液的配制 [11] ：
     RPMI 1640 培养液中加入 10％胎牛血清、 青霉素 (100μg/ml) 和链霉素 (100μg/ ml)， pH 为 7.4。
     2.0.1mol PBS 平衡盐溶液配制。
     NaCl 8.00g、 KCl 0.20g、 Na2HPO4·H2O 2.89g、 KH2PO40.20g， 用 1L 三蒸水溶解后 调 pH 值 7.2 左右。
     3. 三联液配制 ：
     0.012mol/l 盐酸、 10％ SDS、 5％异丁醇， 即加 1.2ml 36％ -37％浓盐酸、 100g SDS、
     50ml 异丁醇， 用 1L 三蒸水溶解。
     4.MTT 配制 ：
     取 5mgMTT 粉末， 加入 1mlPBS 配成 5mg/ml 浓度溶液。
     5. 配制多柔比星 (ADM) 溶液 ：
     注射用多柔比星 ： 规格 10mg， 加入 10ml 灭菌生理盐水 (N.S) 于安瓿瓶内， 溶解后 浓度为 1mg/ml， 分装至 1.5ml ep 管内， 于 0℃冰箱保存待用， 每次取 1ep 管内的 ADM 使用， 融化后不可再冻存， 作 K562/A02 细胞株的维持培养和实验用。
     6.TAE 储存液 (50x) ：
     24.2gTris 碱 ( 三羟甲基铵基甲烷 )， 57.1ml 冰醋酸， 37.2gNa2EDTA.2H2O， 加水至 1000ml， 4℃保存。用时加水稀释至 lx 工作液。
     7. 溴酚蓝上样缓冲液 (6X) ：
     0.25 ％溴酚蓝， 0.25 ％二甲苯青， 30 ％甘油溶于水中， 4 ℃保存。用时和样品以 1 ∶ 5 混合上样。
     8. 琼脂糖凝胶配制 ：
     2％琼脂糖凝胶 ： 0.9g 琼脂糖干粉， 45ml 去离子水， 900ulTAE 混合于烧瓶中， 于微 波炉中煮沸， 待凝胶温度降至 60℃左右加入 EB， 使终浓度达 10mg/ml。 摇匀后立即倒入准备 好的胶膜中， 待冷却后， 拔出上样梳， 取出凝胶于 4℃冰箱中保存。 二、 实施方式
     实施例一 K562/A02 的多药耐药特性及程度
     1. 药物及配制
     化疗药 ADM、 EPI、 VP-16 均设 100、 50、 25、 12.5、 6.25μg/ml 5 个受试浓度， 此浓度 根据预试验结果设定。具体配制如下 ： 称取一定量药物加入一定量的 N.S 溶解后， 再加 入 一定量的 RPMI1640 完全培养液配制成高浓度溶液， 其余浓度等比稀释配制而成。
     2. 实验方法
     参照文献 [13]， 以改良 MTT 法测定各化合物对细胞增殖的影响。取处于对数生 长期的 K562 及 K562/A02 细胞株调整为一定浓度的细胞悬液接种于 96 孔培养板， 90μl/ 孔， 种板后立即加入不同受试药物， 各受试物均设 100、 50、 25、 12.5、 6.25μg/ml 5 个受试 浓度， 每种浓度设 3 个平行复孔， 10μl/ 孔。阴性对照为等体积培养基。加药后继续置于 37℃， 5％ CO2 培养箱培养， 在药物作用 48h 后， 每孔加入 MTT(5mg/ml)20μl， 继续培养 4h， 每孔加入三联液 [10％ SDS-5％异丁醇 -0.012mol/L HCl(W/V/V)]100μl 溶解还原产物甲 臜。用酶标仪在 570nm 单波长下测定各孔的 OD 值。
     3. 结果处理
     (1) 计算各受试样品不同浓度的平均 OD 值及标准差， 按下列公式计算细胞增殖抑 制率 ：
     抑制率 (％ ) ＝ (OD 值对照孔 -OD 值加样孔 )/OD 值对照孔 ×100％
     采用 Microsoft Excel 2003 计算抑制率， 采用 Logit 法计算半数抑制浓度 IC50 ；
     (2) 按下列公式计算以上三种化疗药物的耐药指数 (Resistance Index， RI) ：
     结果 ： 化疗药 ADM、 EPI、 VP-16 在对 K562 敏感株作用时均表现出良好的药物敏感 性， 其 IC50 值分别为 0.33， 2.08， 2.21μg/ml。而同等实验条件作用于 K562/A02 耐药细胞 的半数抑制浓度 IC50 均＞ 100μg/ml。按公式计算各化疗药物的 RI 均大于 30(IC50 值大于 100μg/ml 时按 100 计 RI)( 表 1)。参照文献证实耐药细胞模型成立。
     表 1K562/A02 细胞对各化疗药物的耐药指数 (RI)
     实施例二 K562/A02 细胞对化合物 GA 的敏感性
     1. 药物及配制
     ADM、 VCR、 VP-16、 GA 均设 100、 50、 25、 12.5、 6.25μg/ml 5 个受试浓度 ( 此浓度根 据预试验结果设定 )， 具体配制方法同前。
     2. 实验方法
     改良的 MTT 法同前。
     结果 ： 化合物 GA 作用于 K562/A02 细胞表现出较高的药物敏感性， IC50 值仅为 4.43μg/ml( 表 2)， 而对于其它三种结构和作用机制不同的化疗药， K562/A02 细胞对其药 物作用均不敏感。提示 K562/A02 细胞在对多种化疗药耐药的同时， 对化合物 GA 仍然具有 较高的敏感性， 为后续实验提供了依据。
     表 2K562/A02 细胞对各受试物的药物敏感性
     组别 IC50(μg/ml)
     ADM ＞ 100
     VCR 72.74
     VP-16 ＞ 100
     GA 4.43
     实施例三化合物 GA 逆转 K562/A02 细胞 ADM 耐药的效应及强度
     1. 药物及配制
     (1) 化合物 G
     设 12.5、 6.25、 3.125μg/ml3 个受试浓度 ( 此浓度根据预试验结果设定 )。 具体配 制如下 ： 称取一定量 GA， 加入一定量的 DMSO 待其溶解后， 再加入一定量的 RPMI1640 完全培 养液配制成高浓度溶液， 各低浓度溶液则按比例稀释配制而成 ；
     (2) 阳性对照 VER
     VER 为初始浓度 2.5mg/ml 的注射用液体制剂， 加入一定量的 RPMI1640 完全培养液 将其稀释为 10μg/ml 浓度的工作液 ；
     (3)ADM
     原液浓度 1mg/ml， 加入一定量的 RPMI1640 完全培养液将其稀释为 10μg/ml 浓度 的工作液。
     2. 实验方法
     将 K562 及 K562/A02 细胞悬液以 2×105/ml 接种于 96 孔板， 并将其分为五个实验 [14] 组 ： A 组 ( 阴性对照组 ) ： cell+10μg/mlADM ；
     B 组 ( 阳性对照组 ) ： cell+10μg/mlADM+10μg/ml VER ；
     C 组 ( 低剂量组 ) ： cell+10μg/mlADM+3.125μg/ml GA ；
     D 组 ( 中剂量组 ) ： cell+10μg/mlADM+6.25μg/ml GA ；
     E 组 ( 高剂量组 ) ： cell+10μg/mlADM+12.5μg/ml GA。
     加药后置于 37℃， 5％ CO2 培养箱中孵育 48h， 采用改良的 MTT 法检测药物对肿瘤 细胞生长增殖抑制的影响， 方法同前。 3. 计算公式 ：
     (1) 计算 IC50， 软件及公式同前 ；
     (2) 通 过 下 列 公 式 计 算 化 合 物 GA 逆 转 K562/A02 细 胞 MDR 的 逆 转 倍 数 (Fold Resistance， FR) ：
     结果显示 ： K562/A02 较 K562 耐受 ADM ； 通过对照阳性药 VER， GA 能显著逆转 K562/ A02 对 ADM 的耐药作用 ； GA 在 3.125、 6.25、 12.5μg/ml 浓度、 VER 在 10μg/ml 浓度均能显 著逆转 K562/A02 对 ADM 的耐受， 使其 IC50 降低， 并呈现良好的剂量依赖性。逆转倍数分别 为： 2.26、 39.45、 64.81 及 32.4 倍。 经统计学处理， 化合物 GA 低、 中、 高剂量组及阳性对照组 与阴性对照组比较， 其差异具有显著性 P ＜ 0.01， 见表 3、 图 1， 图 1 从左往右各峰依次为阴 性对照组， GA-3.125， 6.25， VER( 阳性对照 )-10， GA-12.5(μg/ml) ； 相应地， GA 和 VER 在此 浓度均对 K562 无此作用。见图 3。其中峰①为 K562/A02 对照组， 峰值平均荧光强度为 10， 后三峰均为 K562 细胞， 从上至下依次为 VER 10μg/ml， K562 阴性对照， GA-12.5μg/ml。各 峰值平均荧光强度分别是 32， 34， 40。
     表 3 化合物 GA 逆转 K562/A02 细胞 ADM 耐药的效应及强度
     IC50 值为三次实验的均数 ± 标准差。** 为 p ＜ 0.01， * 为 p ＜ 0.05。
     实施例四 GA 对 K562 和 K562/A02 细胞内 ADM 蓄积量的影响
     1. 受试物配制
     化合物 GA 设 12.5、 6.25、 3.125μg/ml 3 个受试浓度 ； ADM 及 VER 工作浓度均为 10μg/ml， 此浓度根据 MTT 试验结果设定， 配制方法同前。
     2. 实验方法
     参照文献 [15]， 采用流式细胞术 (FCM) 对 K562 及 K562/A02 细胞内 ADM 的含量进行 检测， 操作步骤如下 ：
     (1) 设立六组 ：
     A 组 ( 敏感细胞阴性对照组 ) ： K562+10μg/mlADM ；
     B 组 ( 耐药细胞阴性对照组 ) ： K562/A02+10μg/mlADM ；
     C 组 ( 阳性对照组 ) ： K562/A02+10μg/mlADM+10μg/ml VER ；
     D 组 ( 低剂量受试组 ) ： K562/A02+10μg/mlADM+3.125μg/ml GA ；
     E 组 ( 中剂量受试组 ) ： K562/A02+10μg/mlADM+6.25μg/ml GA ；
     F 组 ( 高剂量受试组 ) ： K562/A02+10μg/mlADM+12.5μg/ml GA ；
     (2) 调整 K562 及 K562/A02 细胞浓度为 1×106/ml， 种于六孔板内， 每孔 900μl， ADM 单独或联合不同浓度 GA 及 VER 加入细胞中， 每孔 100μl ；
     (3) 置于 37℃， 5％ CO2 培养箱孵育 90min 后， 1000rpm 离心 5min， 去上清， 收集细 胞；
     (4) 冰 PBS 液洗 2 次， 去除细胞外 ADM 的浮色 ；
     (5) 经上述处理的细胞重悬于 200μl 的冰 PBS， 4℃孵育 30min ；
     (6) 采用流式细胞仪对 K562 及 K562/A02 细胞内 ADM 的含量进行检测， 于激发 波 长 为 488nm， 发 射 波 长 为 615nm 处 测 定 ADM 的 平 均 荧 光 强 度 值 (Mean Fluorescence Intensity， MFI)。
     结果 ： 流式细胞技术测定结果显示 ： ADM 联合 GA 或 VER 能显著提高其在 K562/A02 细胞内的蓄积量。平均荧光强度 (MFI) 结果显示， GA 比 VER 更能促进 K562/A02 细胞内 ADM 的蓄积量， 并呈现较好的剂量依赖性 ； 化合物 GA 低剂量组 (3.125μg/ml) 与阴性对照组比 较， 统计学分析其差异具有显著性 P ＜ 0.05， 且化合物 GA 的中、 高剂量组及 VER 阳性对照与 阴性对照组比较， 统计学分析其差异具有高度显著性 P ＜ 0.01 ； 然而， GA 和 VER 对 K562 敏
     感株无此作用。本实验重复 3 次， 见图 4。从左往右依次为 ： 对照组， GA-3.125， 6.25， 12.5， VER( 阳性对照 )-10(μg/ml)。
     实施例五 GA 对 K562/A02 细胞 P 糖蛋白 (P-gp) 表达的影响
     1. 受试物配制
     化合物 GA 设 12.5、 6.25μg/ml 2 个受试浓度， 配制方法同前。
     2. 实验方法
     参照文献 [15]， 采用连接有荧光素 PE 的 P-gp 单克隆抗体 (Anti-Pgp-PE) 标记细胞 并结合流式免疫荧光技术检测带有荧光标记的抗原抗体复合物的 MFI 值。具体实验步骤如 下：
     (1) 设以下四组 ：
     A 组 ( 敏感细胞阴性对照组 ) ： K562+Pgp-PE ；
     B 组 ( 耐药细胞阴性对照组 ) ： K562/A02+Pgp-PE ；
     C 组 ( 低剂量组受试组 ) ： K562/A02+6.25μg/ml GA+Pgp-PE ；
     D 组 ( 高剂量组受试组 ) ： K562/A02+12.5μg/ml GA+Pgp-PE。
     (2) 调整细胞浓度为 1×106/ml， 将 K562 及 K562/A02 细胞种于六孔板内， 每孔 900μl。随即加入不同浓度 GA， 使其终浓度为 12.5、 6.25μg/ml， 每孔 100μl ； (3) 置于 37℃， 5％ CO2 培养箱孵育 48h 后， 1000rpm 离心 5min， 去上清收集细胞， 并用 200μl 的 PBS 重悬细胞 ；
     (4) 于避光条件下采用 Aiti-Pgp-PE 单克隆抗体标记细胞， 5μl/ 组 ；
     (5) 避光孵育 15min 后， 1000rpm 离心 5min， 去除残留的染料和液体 ；
     (6) 冰 PBS 液洗 2 次， 去除细胞外浮色， 之后重悬于 200μl 的 PBS ；
     (7) 采用流式细胞仪进行检测， 于激发波长为 488nm， 发射波长为 525nm 处测定细 胞内荧光素 PE 的 MFI 值。
     结果显示， K562/A02 较 K562 细胞高表达 P-gp， 其 MFI 值分别为 101.4±5.04 及 7.28±1.02(P ＜ 0.01)， 证明 K562/A02 细胞株确实为高表达 P-gp 的耐药模型 ； 然而， GA 在 6.25， 12.5μg/ml 浓度时对 K562/A02 细胞的 P-gp 表达无显著影响， 统计结果显示， 化合物 GA 的两个剂量组与 K562/A02 阴性对照组比较， 其差异并不具有显著性 P ＞ 0.05， 见图 5 ～ 8。
     实施例六 GA 对 P-gp 蛋白泵外排功能的影响
     1. 药物及配制
     (1) 化合物 G
     设 12.5、 6.25、 3.125μg/ml 3 个受试浓度。配制方法同前。
     (2) 罗丹明 -123(RH-123) 工作液 ：
     精密称取一定量的 RH-123， 用 N.S 溶解， 使其工作液浓度为 100μg/ml。 现用现配， 避光保存。
     2. 实验方法
     参照文献 [16]， 该项实验采用 FCM 与 P-gp 特异性荧光底物 RH-123 相结合的方法， 通过测定 K562/A02 细胞内 RH-123 的 MFI 值， 间接检测化合物 GA 对 P-gp 蛋白泵外排功能 的影响， 具体步骤如下 ：
     (1) 设以下六组 ：
     A 组 ( 空白对照组 ) ： cell only ；
     B 组 ( 敏感细胞阴性对照组 ) ： K562+RH-123 ；
     C 组 ( 耐药细胞阴性对照组 ) ： K562/A02+RH-123 ；
     D 组 ( 低剂量组受试组 ) ： K562/A02+RH-123+3.125μg/ml GA ；
     E 组 ( 中剂量组受试组 ) ： K562/A02+RH-123+6.25μg/ml GA ；
     F 组 ( 高剂量组受试组 ) ： K562/A02+RH-123+12.5μg/ml GA ；
     (2) 调整细胞浓度为 1×106/ml， 按照六个不同组别， 分别将两种细胞同时种于 六孔板内， 每孔 900μl， 加入不同浓度 GA， 使其终浓度为 12.5、 6.25、 3.125μg/ml， 每孔 100μl ；
     (3) 置于 37℃， 5％ CO2 培养箱孵育 60min 后， 避光条件下加入 P-gp 特异性荧光底 物 RH-123 工作液， 10μl/ 组 ；
     (4) 继续孵育 60min 后， 1000rpm 离心 5min， 去上清， 收集细胞 ；
     (5) 冰 PBS 液洗 2 次， 去除细胞外 RH-123 的浮色 ；
     (6) 经上述处理的细胞重悬于 200μl 的冰 PBS， 4℃孵育 30min ；
     (7) 采用流式细胞仪进行检测， 于激发波长为 488nm， 发射波长为 530nm 处测定细 胞内滞留的 RH-123 的 MFI 值。
     结 果 显 示， K562 细 胞 内 RH-123 含 量 显 著 高 于 相 应 的 K562/A02 耐 药 细 胞 (P ＜ 0.01) ； 受化合物 GA 作用后， K562/A02 细胞内 RH-123 的浓度较 K562/A02 阴性对照组 呈剂量依赖性增高， 化合物 GA 在浓度为 6.25μg/ml 及 12.5μg/ml 剂量时 K562/A02 细胞 内 RH-123 的含量与 K562/A02 阴性对照组比较， 统计学差异具有显著性。6.25μg/ml 时， P ＜ 0.05 ； 12.5μg/ml 时， P ＜ 0.01。见图 9 ～ 10。
     实施例七联合运用 GA 和 ADM 诱导的凋亡
     1. 受试物配制
     (1) 化合物 GA
     设 12.5、 6.25、 3.125μg/ml 3 个受试浓度。配制方法同前。
     (2) 结合缓冲液
     按照 AnnexinV/PI 试剂盒要求， 配制结合缓冲液。 原液为 4 倍浓缩液 (4×binding buffer)， 取原液 120μl 加入 480μl 超纯水， 即为稀释 4 倍后的工作液浓度， 混匀于 4℃保 存待用。
     (3)AnnexinV-FITC 和 PI
     按照试剂盒要求操作。
     2. 实验方法
     参照文献 [17]， 采用 FCM 结合 AnnexinV/PI 双染法检测 ADM 与 GA 联用时对 K562/ A02 细胞凋亡的影响， 具体步骤如下 ：
     (1) 实验设立空白， 阴性， 以及化合物 GA 低、 中、 高剂量五个组， 方法同前 ； 6
     (2) 调整细胞浓度为 1×10 /ml， 根据不同组别设置加入相应的药物， 调整 ADM 终 浓度为 10μg/ml， 化合物 GA 终浓度为 3.125、 6.25、 12.5μg/ml， 使 ADM 单独或联合 GA 加入 K562/A02 细胞中 ；(3) 置于 37℃， 5％ CO2 培养箱孵育 24h 后， 900rpm 离心 8min， 去上清， 收集细胞 ；
     (4) 冰 PBS 液充分洗涤细胞 2 次， 去除细胞外 ADM 的浮色 ；
     (5) 用新鲜配制好的结合缓冲液重悬细胞， 每组细胞加入 250μl 结合缓冲液， 并 5 重新调整细胞浓度为 2-5×10 /ml ；
     (6) 每组取出 195ml 的细胞悬液， 加入 5μl 的 AnnexinV-FITC， 轻轻混匀后常温避 光 3min ；
     (7) 避光加入浓度为 20μg/ml 的碘化丙啶 (PI) 试液， 10μl/ 组 ；
     (8) 振荡混匀后于室温避光孵育 10min ；
     (9) 再次加入结合缓冲液， 300μl/ 组， 轻轻混匀， 立即采用流式细胞仪检测分析 细胞的凋亡率。
     结果显示， ADM 自身并不能缓解 K562/A02 细胞由于 MDR 所引发的凋亡受阻， P＞ 0.05 ； 而与 GA 联合作用于 K562/A02 细胞后， 即可显著缓解 MDR 所导致的 K562/A02 细胞抵 抗， 并能剂量依赖性地增加 ADM 诱导的细胞凋亡。6.25， 12.5μg/ml 的 GA 和 10μg/ml 的 ADM 共同作用 48h 后， K562/A02 细胞由 10μg/ml ADM 引发的凋亡从 20.15％增加到 69.94％ 及 74.41％， P ＜ 0.05， 见图 11 ～ 15。
     实施例八 RQ-PCR 法检测 GA 对 K562/A02 细胞内 mdr-1 基因转录的影响
     1. 受试物配制及实验前准备
     (1) 化合物 GA 设 12.5、 6.25、 3.125μg/ml 3 个受试浓度 ；
     (2) 提取 RNA 所用水、 Tip 及 ep 管均用 0.1％ DEPC 水浸泡过夜， 以防 RNA 酶污染。 并用 高温高压去除残留的 DEPC， 将器材置于烤箱 50℃烤干残留水分， 备用 ；
     (3)RNA 电泳所用的电泳槽、 倒胶板等装置， 应用洗衣粉、 纯水洗净， 并用经 DEPC 处 理的水配制成电泳液方可进行电泳。
     2. 实验方法
     (1) 组别设置同凋亡实验， 共5组；
     (2) 调整细胞浓度为 1×106/ml， 根据组别设置不同加入相应的药物， 调整 ADM 终 浓度为 10μg/ml， 化合物 GA 终浓度为 3.125、 6.25、 12.5μg/ml， 使 ADM 单独或联合 GA 加入 K562/A02 细胞中 ；
     (3) 置于 37℃， 5％ CO2 培养箱孵育 48h 后， 收集细胞， PBS 洗两次， 转至上述方法处 理过的 ep 管中 ；
     (4) 调整每个实验组细胞浓度为 1×106/ml， 加入 Trizol 试液， 1ml/ 组， 充分振荡 混匀， 冰上放置 5min， 使其充分裂解， 促使核蛋白复合物完全分离 ；
     (5) 采用低温高速离心机， 4℃， 12000rpm， 5min， 将上清液移入 1.5ml 的新离心管 内， 待用 ；
     (6) 加入氯仿试液， 200μl/ 组， 盖紧 ep 管管盖， 手动振摇混匀后， 于冰袋上放置 10min， 此步操作不可采用漩涡振荡器， 以防将 mRNA 振断 ；
     (7) 采用低温高速离心机， 4℃， 12000rpm， 15min。 离心后的混合物呈明显的三层分 化： 红色底层为苯酚 - 氯仿层， 中间层， 以及上层无色透明的水样层。用移液枪转上层水相 ( 约 500-600ul) 于另一个干净的 1.5ml ep 管中。此步骤操作时应注意避免吸入中间层物 质， 否则将会出现蛋白质污染 ；(8) 加入等体积的异丙醇 ( 约 500-600μl)， 轻轻颠倒混匀， 于冰袋上静置 10min。 观察若无明显沉淀出现， 则可置于 -20℃过夜 ；
     (9) 采用低温高速离心机， 4 ℃， 12000rpm， 10min， 弃上清， 管底白色沉淀即为总 RNA ；
     (10) 小心弃上清， 缓慢地沿管壁， 加入 75％乙醇， 1ml/ 组。 颠倒混匀， 悬浮沉淀， 从 而洗净残留盐类 ；
     (11) 采用低温高速离心机， 4℃， 7500rpm 离心 5min， 小心弃去乙醇液体。 室温干燥 5-10min， 使乙醇自然挥发 ；
     (12) 用经 DEPC 处理过的超纯水 30μl 溶解 RNA 样品， 50℃孵育 10min， 以促进 RNA 溶解。待 RNA 沉淀完全溶解后， 可于 -80℃保存待用 ；
     (13)RNA 的浓度测定 ： 采用紫外分光光度仪测定所提 RNA 在 260nm 与 280nm 处的 吸光 度并计算其比值 (A260/A280)， 据此判断 RNA 样品的纯度 (A260/A280 值在 1.8-2.0 之 间时可将所抽提的 RNA 视为高纯度样品 )。按 1OD ＝ 40μg 计算 RNA 产率， 根据抽提的 RNA 在 260nm 的吸光度计算其浓度。立即进行逆转录反应， 剩余样品继续置于 -80℃保存 ；
     (14)RNA 电泳 ： 常规琼脂糖凝胶电泳， 胶浓度为 1％， 电场强度为 8V/cm， 当溴酚蓝 跑出 5cm， 大约 10min 时， 停止电泳， 将凝胶置于紫外分析仪下观察 RNA 电泳结果， 拍照记录 结果。质量比较好的 RNA 电泳即可见到三条带 ： 200bp 附近 5SRNA 带、 1000bp 附近 18SRNA 带、 1500bp 后 28SRNA 带， 并且 28S 的亮度约为 18S 亮度的 2 倍， 说明总 RNA 提取完整无降 解， 满足后续实验要求 ；
     (15) 逆转录合成 cDNA ： ①在无菌 ep 管中加入以下试剂
     ② 65℃加热 5min， 立即置于冰上 1min， 使单链自然卷曲 ； ③短暂离心后， 按顺序依次加入以下试剂
     总反应体积为 20μl， 轻轻振荡混匀 ；④ 42℃温厢孵育 1h ；
     ⑤ 95℃， 5min， 灭活酶 ；
     ⑥获取 cDNA 进行 PCR 扩增反应。
     (16)RQ-PCR 反应 ：
     ①引物序列 ： 引物设计参照文献 [18]， 并经查对 Genebank 和 blastn 证实其准确性 及可靠性。交由上海生物工程有限公司对所需引物进行合成、 分离、 纯化， mdr-1 引物合成 碱基序列如下 ：
     mdr1 ： 309bp
     Sense ： AGGCCAACATACATGCCTTC
     Anti-sense ： GCTCCTTGACTCTGCCATTC
     β-actin ： 204bp
     Sense ： AACTGGGACGACATGGAGAA
     Anti-sense ： AGAGGCGTACAGGGATAGCA
     ② PCR 扩增反应体系如下 ：
     ③反应条件如下 ： 预 变 性 95 ℃ 10min， 变 性 95 ℃ 15s， 退 火 59 ℃ 20s， 延伸 68℃ 1min， 共 40 个循环 ；
     4. 结果分析
     (1) 实时定量 PCR 结果的分析 ：
     采用标准曲线法的相对定量法， 以 β-actin 为内参照， 由软件分析扩增曲线和产 物熔解曲线， 按照相对定量法计算出目的基因 mRNA 的拷贝数。即根据目的基因 (mdr-1) 及 管家基因 (β-actin) 在的 Ct 值， 按照 2-ΔΔCt 法计算目的基因参照管家基因的相对含量， 比 较目的基因的表达情况。
     (2) 计算公式如下 ：
     ΔCt ＝ Ct(Target)-Ct(β-actin) ；
     目的基因相对含量＝ 2-ΔΔct ；
     ΔΔCt ＝ [CtGl( 待 测 样 品 )-CtGAPDH( 待 测 样 品 )-[CtGl( 校 正 样 品 )-CtGADPH( 校正样品 )〕 。
     结果 ： 由溶解曲线图 ( 图 16) 可以看出， 各实验组仅有唯一主峰， 提示各组 mRNA 纯 度良好， 可排除非特异性扩增产物及引物二聚体对 RQ-PCR 结果影响 ； 另外， 该实验的扩增 曲线图 ( 图 17) 显示， 各组曲线拐点清楚， 指数期明显。基线平无上扬现象， 则说明扩增效 率高， 试剂灵敏度好 ； 图上的基线代表阴性样本的扩增曲线， 平直而无上扬趋势， 则阴阳性 对照清楚， 不易造成阴性标本误判。
     RQ-PCR 检测 GA 对 K562/A02 细胞 mdr-1mRNA 表达的影响结果显示， 对照组与 ADM 组 mRNA 表达分别为 ： 2.28， 2.05， 提示 ADM 自身并不能抑制 K562/A02 细胞 mdr-1 mRNA 的 表达， P ＞ 0.05 ； 而与 GA 联用后可轻微下调 K562/A02 细胞 mdr-1mRNA 的表达 ： 3.125μg/ ml、 6.25μg/ml、 12.5μg/ml 的 GA 和 10μg/ml 的 ADM 共 同 作 用 K562/A02 细 胞 48h 后， 其 mdr-1mRNA 的表达分别为 2.15， 1.82， 1.77， 与对照组相比， 下调 mdr-1mRNA 的作用不明 显， 不具备统计学意义 P ＞ 0.05， 图 18， 从左到右依次为 ： 对照组， ADM 组， GA-3.125， 6.25， 12.5(μg/ml)。
     以上实施例说明 ： 化合物 GA 是一个具有显著体内外抗肿瘤活性的新四环二萜类 化合物。前期发明人在对 GA 逆转肿瘤 MDR 的探索中发现， 耐化疗药多柔比星 (ADM) 的人慢 性髓系白血病细胞 (K562/A02) 在对多种结构和作用机制完全不同的化疗药产生耐药的情 况下， 对化合物 GA 仍然具有较高的敏感性。 本研究是在前期工作的基础上， 以耐药的 K562/ A02 及其相应的敏感细胞 K562 为模型， 检测了耐药 K562/A02 细胞的多药耐药 (MDR) 特性及 耐药的程度及 GA 逆转 K562/A02 细胞 ADM 耐药的效应及强度， 并在 GA 逆转 MDR 的基础上， 对逆转作用的机制进行了探索 ： 检测了 GA 对 K562/A02 细胞 P 糖蛋白 (P-gp) 表达和功能、 细胞凋亡抗性及 mdr-1 基因编码 P-gp 表达等方面的影响。
     结果显示， 化疗药 ADM、 表阿霉素 (EPI) 和依托泊苷 (VP-16) 对耐药 K562/A02 细 胞的生长增殖未显示明显的抑制作用， 其半数抑制浓度 (IC50) 均大于 100μg/ml， 而对 K562 细胞的 IC50 分别为 0.33、 2.08 和 2.21μg/ml， K562/A02 对以上各化疗药的耐药指数 (RI) 分别为 303.03， 48.08 和 45.25， 表明本申请中的 K562/A02 具备 MDR 特性， 而实验中同时采 用的 K562 细胞为进行对照性研究的相应敏感细胞。
     药敏检测结果显示， 与其它化疗药相比， 化合物 GA 作用于 K562/A02 细胞则显示了 显著的抑制活性， 其 IC50 为 4.43μg/ml， 表现出良好的药物敏感性。提示 K562/A02 细胞在 对多种化疗药耐药的同时， 对化合物 GA 仍然具有较高的敏感性， 为 GA 逆转 K562/A02 的后 续实验研究提供了可行性依据。
     为了证实化合物 GA 是否为一潜在的 MDR 逆转剂， 本申请采用 MTT 法检测 GA 与 ADM 联用对 K562/A02 及 K562 细胞增殖生长的影响。实验结果显示 ： K562/A02 较 K562 耐受 ADM，IC50 值分别为 54.44 及 0.29μg/ml(P ＜ 0.01) ； 通过对照 ADM 单独作用的阴性组， GA 在 3.125、 6.25、 12.5μg/ml 浓度和阳性对照 VER 在 10μg/ml 浓度分别与 ADM 联用， 均能显 著逆转 K562/A02 对 ADM 的耐受， 并呈现较好的剂量依赖性， 其 IC50 值分别降至 24.13， 1.38， 0.84 和 1.68μg/ml。从实验结果可以看出， 与仅经过 ADM 处理的对照组相比， K562/A02 加入化合物 GA 或 VER 后各组的 IC50 值均有较大幅度的降低， GA 在 3.125、 6.25、 12.5μg/ml 浓 度、 VER 在 10μg/ml 浓度时对 K562/A02MDR 的逆转倍数分别为 2.26、 39.45、 64.81 及 32.4 倍， 其差异经统计学分析均具有显著性 P ＜ 0.01。
     以上实施例均是基于稳定的 MDR 细胞模型进行的， 初步证实了 GA 逆转 K562/A02 细胞 MDR 的效应， 提示 GA 可能为一潜在的肿瘤 MDR 逆转剂。随后的实施例中， 发明人从 GA 逆转 K562/A02 细胞 MDR 效应的机制入手， 通过采用 FCM、 直接免疫荧光法、 AnnexinV/PI 双 染法、 RQ-PCR 等各种细胞分子生物学方法， 进一步探索 GA 逆转 K562/A02 耐药的分子机制。
     产生 MDR 的原因是多方面的， 它包括 ： 药物外排增加引起细胞内药物浓度降低 ； [8] P-gp 蛋白的过表达 ； 细胞凋亡受抑等 。白血病的传统治疗手段是联合化疗， 但 20 ％～ 30％的患者并不能获得缓解或容易复发， 其原因为白血病细胞对化疗药物产生 MDR， P-gp 高表达是白血病细胞 MDR 的重要机制， 最近研究发现， P-gp 的转录子上调导致 P-gp 过表达 是产生 MDR 的主要原因， 而多药耐药相关蛋白 (MRP) 和肺耐药相关蛋白 (LRP) 仅起到次要 作用， 因此降低 P-gp 表达可逆转部分白血病的 MDR。近年来人们还认识到细胞凋亡的抑制 也是白血病细胞产生耐药的重要机制， 采取适当的方式促进耐药的白血病细胞凋亡或抑制 其抗凋亡基因的表达可以达到部分缓解白血病 MDR 的作用 [6]。据此， 本申请从以上三条主 要通路来探索 GA 逆转 K562/A02 细胞 MDR 的作用机制。
     ADM 本身具备发出荧光的特性， 可用 FCM 技术直接对其在细胞内的含量进行测定 [19] 。通过检测加入 VER 或 GA 前后 K562/A02 细胞内 ADM 含量的变化发现， GA 能显著增加 K562/A02 细胞内 ADM 的蓄积量， 并呈现较好的剂量依赖性。且作用强于较阳性对照药 VER。 化合物 GA 在 3.125μg/ml 浓度时与阴性对照组比较， 统计学差异具有显著性 P ＜ 0.05， 且 化合物 GA 在 6.25μg/ml、 12.5μg/ml 及 VER 在 10μg/ml 与阴性对照组比较， 其差异具有 高度显著性 P ＜ 0.01 ； 但是相同浓度的 GA 和 VER 对 K562 敏感细胞株却无此作用。
     细胞凋亡是机体为调控自身发育， 维持内环境稳定， 由其内在基因编程调节， 通过 主动的生化过程， 使细胞自杀死亡的现象。诱导细胞凋亡是众多化疗药物杀伤肿瘤细胞 的共同通路， 从这个意义上说， 凋亡受抑或凋亡逃逸可能是肿瘤细胞产生耐药的机制之一 [6]。在正常 细胞中磷脂酰丝氨酸 (PS) 只分布在细胞膜脂质双层的内侧， 而在细胞凋亡早 期， 细胞膜中的 PS 由脂膜内侧翻向外侧。 AnnexinV 是一种分子量为 35-36KD 的 Ca2+ 依赖性 磷脂结合蛋白， 与 PS 有高度亲和力， 故可通过外侧暴露的 PS 与凋亡早期细胞的胞膜结合。 因此 AnnexinV 被作为检查细胞早期凋亡的灵敏度指标之一。将 AnnexinV 进行 FITC 标记， 以标记了的 AnnexinV 作为荧光探针， 利用流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。而碘化丙啶 (PI) 是一种核酸染料， 它不能透过完整的细胞膜， 但对凋亡晚期的细胞和死细胞， PI 能够 透过细胞膜而使细胞核染红。 因此将 AnnexinV 与 PI 匹配使用， 就可以将处于不同凋亡时期 的细胞区分开来。 因此该项申请即是采用 FCM 结合 AnnexinV/PI 双染法检测 ADM 与 GA 联用 时对 K562/A02 细胞凋亡的影响。实验结果显示， 化疗药 ADM 诱导的 K562/A02 耐药细胞可 通过逃逸凋亡或拮抗凋亡获得生存， 它不能明显诱导 K562/A02 细胞发生凋亡， 与对照组相 比， 差异无统计学意义 P ＞ 0.05， 证明 ADM 自身并不能缓解 K562/A02 细胞由于 MDR 所引发 的凋亡受阻。但 ADM 与 GA 联合作用于 K562/A02 细胞后， 即可明显缓解 MDR 所导致的抗凋 亡作用， 并呈现较好的剂量依赖性 ； GA 能显著提高 ADM 诱导 K562/A02 细胞凋亡， 12.5μg/ ml 的 GA 和 10μg/ml 的 ADM 联合作用 48h 后， 耐药株由 ADM 引发的凋亡从 20.15％增加到74.41％， P ＜ 0.05。另外， Bcl-2 基因家族是目前研究较深入的细胞凋亡相关基因， 与肿瘤 细胞耐药密切相关。而 Bax 作为凋亡促进基因的代表， 其过度表达可诱导多种肿瘤细胞产 生凋亡， 反之则产生耐药。目前， 本申请已经开始探寻化合物 GA 逆转 K562/A02 细胞抗凋亡 作用的分子机制， 结果有待进一步验证。
     P-gp 具 有 能 量 依 赖 性 药 物 外 排 泵 的 功 能， 属 于 ATP 结 合 盒 (ATP binding cassette， ABC) 转运蛋白超家族成员。 它受 ATP 分子能量驱动， 将进入细胞的化疗药物 “泵” 至胞外， 从而降低胞内药物浓度， 使之达不到杀灭肿瘤细胞的浓度阈值而产生耐药。 P-gp 介 导的肿瘤多药耐药被认为是经典耐药机制。P-gp 与药物的结合具有普适性， 能运输多种结 [20] 构不同的底物， 因此肿瘤细胞能针对结构和作用机制不同的药物而产生 MDR 。
     本申请探索了化合物 GA 对 K562/A02 细胞 P-gp 表达及功能的影响， 寻找到 GA 通 过 P-gp 途径逆转 K562/A02 细胞 MDR 效应的分子机制。其原理是通过细胞表面的抗原 ( 或 细胞膜受体 ) 与相关的荧光抗体结合， 形成带有荧光的抗原抗体复合物， 随后采用流式细 胞仪测定其荧光量， 即可得到细胞群的不同抗原位点表达情况。采用连接有荧光素 PE 的 P-gp 单克隆抗体 (Anti-Pgp-PE) 标记细胞后， 结合流式免疫荧光技术检测相关的带有荧光 的抗原抗体复合物的平均荧光强度 (MFI) 值， 即可反应 GA 使用前后 K562/A02 细胞 P-gp 蛋 白的表达量。结果显示， K562/A02 较 K562 细胞高表达 P-gp， 其 MFI 值分别为 101.4±5.04 及 7.28±1.02 (P ＜ 0.01)， 证明 K562/A02 细胞株确实为高表达 P-gp 的耐药模型 ； 然而， 化合物 GA 在 12.5μg/ml 及 6.25μg/ml 两个剂量时均对 K562/A02 细胞株的 P-gp 表达无 显著影响， 与 K562/A02 阴性对照组比较， 其差异并不具有显著性 P ＞ 0.05。提示化合物 GA 并不能抑制 K562/A02 细胞内 P-gp 蛋白的表达。
     RH-123 为 P-gp 的特异性底物， K562/A02 耐药细胞中， 由于 P-gp 的存在， 势必将 其特异性的作用底物 RH-123 排出细胞外。据此发明人采用 FCM， 通过测定 K562/A02 细胞 内 RH-123 的 MFI 值， 间接检测化合物 GA 对 P-gp 蛋白泵外排功能的影响。结果显示， K562 细胞内 RH-123 浓度显著高于相应的 K562/A02 耐药细胞 (P ＜ 0.01) ； 受化合物 GA 作用后， K562/A02 细胞内 RH-123 的浓度较 K562/A02 阴性对照组明显增高， 化合物 GA 在 6.25μg/ ml 及 12.5μg/ml 剂量时 K562/A02 细胞内 RH-123 的含量与 K562/A02 阴性对照组相比， 统 计学差异具有高度显著性， P ＜ 0.01。并呈现出较好的量效关系。提示化合物 GA 能够剂量 依赖性地抑制 K562/A02 细胞 P-gp 的外排泵功能， 减少 P-gp 外排其底物至细胞外的作用。 以上两项实验结果提示， GA 通过 P-gp 途径逆转 K562/A02 细胞 MDR 效应的分子机制可能通 过抑制 P-gp 外排泵功能， 而非抑制其表达实现。
     mdr-1 为编码 P-gp 蛋白的基因， 其在肿瘤细胞内的过度表达被认为是介导 MDR 的 经典机制。近几十年来已从耐药肿瘤细胞株中分离出 mdr1 及其表达产物。研究表明， p-gp 水平随 mdr1 基因扩增及 mRNA 增加而增加， MDR 效应亦与其正相关。RQ-PCR 技术， 是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团如 SYBR Green I 等荧光染料， SYBR Green 是一种 DNA 结合染 料。在退火及引物延伸阶段， 染料与双链 DNA 结合， 荧光强度增加， 当 DNA 变性时， 信号又会 降下来。因此， 在一个体系内， 其信号强度基本能够代表了双链 DNA 分子的数量。在 RQ-PCR 中， 通过荧光检测设备对整个 PCR 扩增反应过程进行实时的监测和连续地分析扩增相关的 荧光信号， 随着反应的进行， 监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。可以在 PCR 反 应处于指数期的某一点上来检测 PCR 产物的量， 并且由此来推断待测基因参照管家基因的相对含量， 即模板最初的含量。 为了便于对所检测样本进行比较， 需设定一个荧光信号的强 度阈值， 达到此阈值时荧光信号可被从本底的背景噪声中识别出来。通过阈值来定义样本 的阈值循环数 (Ct)， Ct 值的含义是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值并于此后呈 持续指数增长时所经历的反应循环数， 因此， PQ-PCR 与传统 PCR 比较， 更能准确的反应基因 的表达情况。RQ-PCR 检测 GA 对 K562/A02 细胞 mdr-1mRNA 表达的结果显示， 对照组与 ADM 组测得的 mRNA 表达值分别为 ： 2.28， 2.05， 二者相比， 差异无统计学意义 P ＞ 0.05， 提示 ADM 自身并不能抑制 K562/A02 细胞 mdr-1mRNA 的表达 ； ADM 联合 GA 作用于 K562/A02 细胞 能 轻微抑制 K562/A02 细胞 mdr-1mRNA 的表达。3.1251、 6.25、 12.5μg/ml 的 GA 和 10μg/ml 的 ADM 联合作用 K562/A02 细胞 48h 后， 其 mdr-1mRNA 的表达分别为 2.15， 1.82， 1.77， 但与 对照组相比， 下调 mdr-1mRNA 的作用不明显， 无统计学意义 P ＞ 0.05。该项实验结果与之 前所检测到的 GA 并无下调 K562/A02 细胞内 P-gp 表达的实验结果相符， 再次验证了 GA 通 过 P-gp 途径逆转 K562/A02 细胞 MDR 效应的分子机制并非是通过抑制 P-gp 蛋白表达或其 上游编码基因 mdr-1 的途径来实现的。
     综上， 本申请证实了 GA 能有效逆转 K562/A02 的 MDR 效应， 同时， GA 联合应用 ADM， 能促进 K562/A02 经 ADM 诱导的凋亡， 并能增加 ADM 的胞内蓄积浓度， 抑制 MDR 细胞 P-gp 的 外排泵功能。这些结果说明 GA 具有显著的 MDR 逆转效应， 为肿瘤多药耐药逆转剂的制备和 临床应用提供了广阔的前景。
     无需进一步详细阐述， 相信采用前面所公开的内容， 本领域技术人员可最大限度 地应用本发明。 因此， 工艺过程、 质量指标的各种测量方法及其它类似的变更都属于本发明 范围。
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