抗微生物肽系统的激动剂 技术领域 本发明涉及具有刺激先天抗微生物肽系统 (innate antimicrobial peptide system) 药物活性且能作为抗微生物药物使用的化合物。
背景技术 抗微生物肽和蛋白质在先天宿主防御中发挥重要作用， 而且被认为是在形成宿主 与外部环境之间最初屏障的粘膜表面上特别重要的。在结肠上皮中发现大量的此类肽。这 些肽可被视为内源性抗生素， 而且作为立即防御效应器在自然界中分布广泛。它们主要贮 存在粒细胞的液泡中， 随时可在刺激后活化或由上皮细胞直接分泌到粘膜和其它表面上。
已鉴定出一种称作 LL-37 的人抗微生物肽， 即在嗜中性粒细胞、 上皮细胞和淋巴 细胞中存在的具有 37 个残基的肽。分离的和化学合成的 LL-37 都在体外显示出抗微生物 活性。
某些细菌已进化出机制来克服抗微生物肽屏障， 诸如志贺氏菌属 (Shigella) 细 菌， 它们下调结肠上皮中的 LL-37 表达。
Rabbani 等人 (Short-Chain Fatty Acids Improve Clinical， Pathologic， and Microbiologic Features of Experimental Shigellosis.The Journal of Infectious Diseases 1999 ； 179 ： 390-7) 研究了天然存在的在肠中作为发酵产物形成的短链脂肪酸 (short chain fatty acid， SCFA ； 比例为 60 ∶ 30 ∶ 40 的乙酸盐 / 酯、 丙酸盐 / 酯和丁酸 盐 / 酯 )。作者使用志贺氏菌病的家兔模型。他们报告所述混合物 ( 通过结肠灌注到患有 急性志贺氏菌病的家兔中来给药 ) 改善了临床、 病理和细菌学特征。
Hase 等人 (Cell Differentiation Is a Key Determinant of Cathelicidin LL-37/Human Cationic Antimicrobial Protein 18Expression by Human Colon Epithelium.INFECTION AND IMMUNITY， Feb.2002， vol 70， No 2 p.953-963) 报告用肠沙 门氏菌血清变型 Dublin(Salmonella enterica serovar Dublin) 或肠侵染性大肠杆菌 (Escherichia coli) 体外感染的 HCA-7 细胞中度上调了 LL-37/hCAP18mRNA 的表达。作者 得出的结论是， 分化的人结肠上皮表达 LL-37/hCAP18， 作为其先天防御分子全集的一部分。
Schauber 等 人 (Expression of the cathelicidin LL-37 is modulated by short chain fatty acids in colonocytes ： relevance of signalling pathways.Gut 2003 ； 52 ： 735-741) 研究了天然存在的 SCFA 在体内和在体外对 LL-37 表达的影响。这些作 者报告在暴露于丁酸盐 / 酯、 异丁酸盐 / 酯和丙酸盐 / 酯后， LL-37mRNA 在体外结肠细胞中 的表达提高。作者对于抗微生物肽表达提高对共生肠道菌群的可能后果是谨慎的， 这对于 保护粘膜对抗肠致病性微生物是至关重要的。他们注意到的是， 内源性抗生素活性的病理 性提高不会使宿主受益， 但可能具有有害的后果。
Raqib 等 人 (Improved outcome in shigellosis associated with butyrate induction of an endogenous peptide antibiotic.Proc.Natl.Acad.Sci.2006 ； 103 ： 9178-9183) 报告了用丁酸盐 / 酯处理家兔导致临床疾病和粪便中细菌载荷的减少及表面
上皮中 CAP-18(LL-37 的家兔同系物 ) 的显著上调。
还研究了其它分子在刺激天然防卫素中的可能效用。
WO2000-09137(Magainin Pharmaceuticals) 记载了新分离的氨基甾醇化合物， 而 且记载了基于所述氨基甾醇化合物的药物组合物。 还记载了用于治疗各种病症例如微生物 感染的方法。
US2002-0076393(Fehlbaum 等人 ) 记载了异亮氨酸或其活性异构体或类似物在刺 激防卫素生成中的用途。应当注意的是， 权利要求尤其涉及这样一种类似物， 其是丁酸盐 / 酯或其活性衍生物。然而， 对丁酸盐 / 酯进行了测试， 而且它的活性似乎在相似浓度时不如 异亮氨酸 ( 参见其中的图 7)。
US2003-0109582(Zasloff) 记载了异亮氨酸化合物在刺激帕内特细胞释放天然抗 微生物剂 ( 包括肽 ) 以减少或消除哺乳动物 ( 包括人 ) 胃肠道中的病原性生物体中的用途， 其中使用活性异亮氨酸化合物作为促分泌剂。将 “异亮氨酸化合物” 定义为包括 “异亮氨酸 丁酸盐” ， 尽管没有记载或测试此化合物。
US7311925(Zasloff) 记载了在哺乳动物中如下阻断微生物粘附至真核细胞表面 的方法 ： 以微生物阻断量将含有至少一种选自异亮氨酸、 其活性异构体和其活性类似物的 化合物的药理学上可接受的组合物应用至所述表面。 将异亮氨酸的活性类似物定义为包括 “异亮氨酸丁酸盐 (isoleucine butyrate)” ， 尽管没有记载或测试此化合物。 US20080038374(Stahle) 记载了能够特异性直接上调 hCAP18 的维生素 D 化合物在 制备具有抗微生物效果以治疗 LL-37 缺乏病症诸如慢性溃疡和特应性皮炎的药物中的用 途。
WO/2008/073174(GALLO) 记 载 了 通 过 1， 25(OH)2 维 生 素 D3(1， 25D3) 来 调 节 cathelicidin 基因表达和先天免疫应答的方法和组合物。 与非特异性组蛋白脱乙酰基酶抑 制剂 (HDACi)( 包括丁酸盐 / 酯或制滴菌素 A) 一起测试了该化合物。
Hata et al.(2008) “Administration of oral vitamin D induces cathelicidin production in atopic individuals” J ALLERGY CLIN IMMUNOL， VOLUME122， NUMBER 4 记 载了一项研究， 其中 14 名正常对照和 14 名患有中度至重度特应性皮炎的特应性受试者用 口服维生素 D3 处置以观察这是否能克服特应性患者中 cathelicidin 诱导的相对缺乏。历 时 21 天补充 4000IU/d 口服维生素 D 后， 特应性皮炎损害皮肤显示出 cathelicidin 表达的 统计学显著增加。
尽管有上述公开， 但应当领会的是， 提供用于增强先天免疫应答 ( 例如在肠中 ) 的 化合物或化合物组合可对本领域做出贡献。
发明内容 由上述讨论可见， 本领域出版物对于刺激人肠中内源性抗生素效果的 SCFA 化合 物的可能有害后果是谨慎的， 原因在于它们对共生肠道菌群的潜在影响。 另外， 已知丁酸盐 / 酯例如具有实践缺点， 特别是令人不悦的气味和味道， 这使它不适于药物用途。这些原因 可解释以下事实 ： 本领域尚未在人中研究 SCFA 的效果， 但显然对维生素 D 在皮肤中的使用 给予了越来越多的兴趣。
本发明人发现多种药用 SCFA 衍生物和前药具有在人细胞系中刺激先天抗微生物
肽系统的药物活性， 而且能在疾病的动物模型中用作预防性和治疗性抗微生物药物。这些 药用 SCFA 衍生物可比丁酸盐 / 酯更易被接受 ( 就气味和 / 或味道而言 )。这些发现对于这 些化合物在治疗人疾病中代替或补充现有抗生素或其它抗微生物策略的用途具有深刻含 意。
先 前 提 供 的 摘 要 记 载 未 鉴 定 的 药 物 在 支 气 管 上 皮 细 胞 系 VA10 中 刺 激 cathelicidin 抗微生物肽 (CAMP) 和人 β- 防卫素 1(hBD-1) 的基因表达 (“Induction of Antimicrobial Peptide Gene Expression by a approved drug in a Bronchial Epithelial Cell Line” ； Jónas Steinmann and Hrafn Institute of Biology， University of Iceland， Sturlugata 7， 101Reykjavik， Iceland)。
在本申请要求的优先权日之后出现的报道首次显示 4- 苯基丁酸盐 / 酯 (PBA) 在 支 气 管 上 皮 细 胞 系 中 刺 激 cathelicidin 抗 微 生 物 肽 的 基 因 表 达 (“Induction of Antimicrobial Peptide Gene Expression in a Bronchial Epithelial Cell Line” ； Jonas Steinmann and Hrafn Institute ofBiology， University of Iceland， 101Reykjavik， Iceland ； 15th March 2008)。
苯基丁酸钠是一种已知的药物。例如， 它由 Ucyclyd Pharma(Hunt Valley， USA) 以 商 品 名 Buphenyl 销 售 和 由 Swedish Orphan International(Sweden) 以 Ammonaps 销 售。 它已用于治疗尿素循环障碍 (Batshaw et al.(2001)J.Pediatr.138(1Suppl) ： S46-54 ； discussion S54-5)。Scandinavian Formulas， Inc.Sellersville， PA 在 世 界 范 围 内 供 应苯基丁酸钠用于临床试验。苯基丁酸钠还被研究用于治疗一些镰状细胞障碍 (Blood Products Plasma Expanders and Haemostatics) 和在恶性胶质瘤和急性髓样白血病中用 作潜在的分化诱导剂。还对囊性纤维化病理进行了研究， 原因在于其将 δF508- 囊性纤维 化跨膜传导调节因子 (CFTR) 运输至细胞膜及在体外和在体内在 CF 肺细胞质膜处恢复 CFTR 氯化物功能的能力 (Roque et al.J Pharmacol Exp Ther.2008Sep ； 326(3) ： 949-56.Epub 2008Jun 23)。文献认为苯基丁酸盐 / 酯是一种前药， 其在体内通过 β- 氧化被代谢成苯基 乙酸盐 / 酯。
尽管有上述文献， 但在本发明之前， 没有披露或暗示将 PBA 用于本申请要求保护 的用途。
发明详述
因此在第一方面， 本发明提供如式 I 所定义的化合物， 其用作在人和动物中通过 刺激先天抗微生物肽防御系统来治疗、 预防或抵抗微生物感染的药物。
本发明化合物
在第一方面， 本发明提供如式 Ia 所定义的化合物， 其用作在人和动物中通过刺激 先天抗微生物肽防御系统来治疗、 预防或抵抗微生物感染的药物，
其中
R1 表 示 羧 基、 磷 酸 基 团 (phosphate)、 膦 酸 基 团 (phosphonate) 或 磺 酸 基 团 5 5 6 (sulfonate) 或其药用盐、 COOR 、 CONH2、 CONR R 或所述化合物的醛、 亚胺或缩醛受保护的衍 5 6 生物或甘油三酯部分 COOCH2CH(OOCR )CH2(OOCR ) 或甘油二酯部分 COOCH2CH(OOCR5)CH2OH 或 氨基酸基团 CONHCR7COOH 或其盐 ；
m 和 n 各自独立为 0 或 1 ；
R1a、 R1b、 R2a、 R2b、 R3a 和 R3b 各自独立表示氢、 卤素、 氨基、 羟基、 羰基、 具有 1-10 个碳 原子的直链或支链的取代或未取代的饱和或不饱和的烃基 (alkyl) 或取代或未取代的芳 基； 和/或
R2a 与相邻的 R3a 或 R1a 一起可表示碳 - 碳 π 键 ； 和/或 2b 3b 1b
R 与相邻的 R 或 R 一起可表示碳 - 碳 π 键 ；
R4 可为氢、 卤素、 氨基、 羟基、 羰基、 具有 1-10 个碳原子的直链或支链的取代或未取 代的饱和或不饱和的烃基或取代或未取代的芳基 ；
R5 表示具有 1-10 个碳原子的直链或支链的取代或未取代的饱和或不饱和的烃基 或取代或未取代的芳基 ；
R6 表示氢、 具有 1-10 个碳原子的直链或支链的取代或未取代的饱和或不饱和的烃 基或取代或未取代的芳基 ； 且 7
R 为 天 然 存 在 的 氨 基 酸 的 侧 链 或 选 自 CH2CH2CH2NHR8、 CH2CH2CH2CH2NHR8 或 CH2CH2CH2NHC( ＝ NH)NHR8， 其中 R8 为氢或具有 3-5 个碳原子的直链或支链的酰基 ； 且 1 1a 1b 2a 2b 3a 3b 4
其中当 R 为羧基或其盐时， R 、 R 、 R 、 R 、 R 、 R 和 R 中的至少一个选自卤素、 氨基、 羟基、 羰基、 具有 1-10 个碳原子的直链或支链的取代或未取代的饱和或不饱和的烃 基或取代或未取代的芳基。
在一些实施方案中， 所述化合物可以是式 I 的化合物 ：
其 中 优 选 地， R1 表 示 羧 基、 磷 酸 基 团、 膦 酸 基 团 或 磺 酸 基 团 或 其 药 用 盐、 5 5 6 COOR 、 CONH2、 CONR R 或 所 述 化 合 物 的 醛、 亚胺或缩醛受保护的衍生物或甘油三酯部 5 6 分 COOCH2CH(OOCR )CH2(OOCR ) 或 甘 油 二 酯 部 分 COOCH2CH(OOCR5)CH2OH 或 氨 基 酸 基 团 CONHCR7COOH 或其盐，
R2a 表示氢、 羟基、 羰基或具有 1-10 个碳原子的直链或支链的取代或未取代的饱和 或不饱和的烃基或取代或未取代的芳基，
R3a 表示氢、 羟基、 羰基或具有 1-10 个碳原子的直链或支链的取代或未取代的饱和 或不饱和的烃基或取代或未取代的芳基， 只是当 R1 为羧基或其盐时， R3a 不是氢，
R4 表示氢或具有 1-10 个碳原子的直链或支链的取代或未取代的饱和或不饱和的 烃基或取代或未取代的芳基，
x 表示单键、 双键或叁键， 或 3a 4
x-R R 一起表示氢， 在这种情况下 R1 优选为 COOR5、 CONH2、 CONR5R6 或甘油三酯部 分 COOCH2CH(OOCR5)CH2(OOCR6) 或甘油二酯部分 COOCH2CH(OOCR5)CH2OH，
R5 表示具有 1-10 个碳原子的直链或支链的取代或未取代的饱和或不饱和的烃基 或取代或未取代的芳基，
R6 表示氢、 具有 1-10 个碳原子的直链或支链的取代或未取代的饱和或不饱和的烃 基或取代或未取代的芳基， 和 7
R 表示 CH2CH2SCH3、 CH2CH2CH2NHR8、 CH2CH2CH2CH2NHR8、 CH2CH2CH2NHC( ＝ NH)NHR8， 其 8 中 R 为氢或具有 3-5 个碳原子的直链或支链的酰基。
式 I 的化合物是式 Ia 的化合物， 其中 R1a 和 R1b 均为氢， m 和 n 均为 1， 且 R2b 和 R3b 均为氢或一起在位置 ‘x’ 形成 π 键。如果 R2a 和 R3a 也一起形成 π 键， 那么位置 ‘x’ 表示 双键。
也可将其中 R1a、 R1b 和 R2b 均为氢， m 为 0， n 为 1， 且 R4 为氢的式 Ia 的化合物表示 为式 I 的化合物， 其中 x-R3aR4 一起表示氢。
在式 I 的化合物中， ‘x’ 优选为单键。 1
R 的优先选择
在某些优选的实施方案中， 本发明化合物是羧酸， 在这些情况下 R1 表示羧基或其 药用盐。如果 R1 为羧基或其盐， 那么 R1a、 R1b、 R2a、 R2b、 R3a、 R3b 和 R4 中的至少一个为不是氢的 取代基。在其它优选的实施方案中， R1 为羧酸衍生物， 诸如酯基团或酰氨基团。 1
在一些此类实施方案中， 如式 IIa 所表示， R 为式 COOR5 的酯基团， 其中 R5 表示具 有 1-10 个碳原子优选 3-5 个碳原子的直链或支链的取代或未取代的饱和或不饱和的烃基 或取代或未取代的芳基 ( 诸如苯基或苄基 )。特别优选的 R5 基团为甲基和乙基。
在一些优选的实施方案中， R1 为选自甘油三酯部分或甘油二酯部分的酯基团。 如果 R1 是甘油三酯部分， 那么本发明化合物具有下述通式 (IIb) ：
如果 R1 是甘油二酯部分， 那么本发明化合物具有下述通式 (IIc) ：特别关注的实施方案包括三丁酸甘油酯或三丙酸甘油酯。 其它优选的实施方案使 用一种或多种苯基取代的脂肪酸或诸如上述其它短链脂肪酸的相应甘油酯。此类甘油三 酯包括例如但不限于三丁酸甘油酯， 其中丁酸酯酰基链中的一个或多个取代有苯基， 例如 1- 丁酰基氧基 -3-(4’ - 苯基丁酰基氧基 ) 丙 -2- 基丁酸酯、 1， 3-(4’ ， 4” - 二苯基 )- 二 ( 丁 酰基氧基 ) 丙 -2- 基丁酸酯和 1， 3- 二 ( 丁酰基氧基 ) 丙 -2- 基 -4- 苯基丁酸酯。
作为羧基衍生物实施方案的其它实施方案包括式 (IId) 的酰胺， 其中 R1 为式 CONR5R6 的基团， 其中 R5 表示具有 1-10 个碳原子优选 3-5 个碳原子的直链或支链的取代或 未取代的饱和或不饱和的烃基或取代或未取代的芳基 ( 诸如苯基或苄基 )， 且 R6 选自氢、 具 有 1-10 个碳原子优选 3-5 碳原子的直链或支链的取代或未取代的饱和或不饱和的烃基或 取代或未取代的芳基 ( 诸如苯基或苄基 )。
在某些实施方案中， R1 为氨基酸基团， 在这种情况下可将本发明化合物表示为下 述通式 (IIe) 的化合物或其盐 ：其中 R7 为氨基酸侧链。在一些实施方案中， R7 为天然存在的氨基酸的侧链。
例如， R7 可为亮氨酸侧链 (CH2CH2CH2CH3)、 异亮氨酸侧链 (CH(CH3)CH2CH3)、 甲硫氨 酸侧链 (-CH2CH2SCH3)、 赖氨酸侧链 (-CH2CH2CH2CH2NH2) 或精氨酸侧链 (-CH2CH2CH2NHC( ＝ NH) NH2)。在一些实施方案中， 特别是如果 R1a、 R1b、 R2a、 R2b、 R3a、 R3b 和 R4 均为氢且 m 和 n 为 1， 那 么 R7 优选不是异亮氨酸侧链 (CH(CH3)CH2CH3)。
可选择地， R7 可为天然存在的氨基酸侧链的衍生物或类似物， 诸如赖氨酸侧 链 衍 生 物 (-CH2CH2CH2CH2NHR8)、 精 氨 酸 侧 链 衍 生 物 (-CH2CH2CH2NHC( ＝ NH)NHR8) 或 诸 如 -CH2CH2CH2NHR8 那样的基团， 其中 R8 表示氢、 具有 1-10 个碳原子的直链或支链的取代或 未取代的饱和或不饱和的烃基或取代或未取代的芳基。
在某些被发现有用的实施方案中， 本发明化合物是相对小的 SCFA 衍生物。例如其 中 R2a 和 R4 表示氢的式 I 的化合物。在这些实施方案中， R3a 优选为氢、 羟基或取代或未取 1 代的芳基 ( 包括苯基或苄基 )， 在 R 为羧基或其盐的情况下上述限制适用于 R3a。取代的芳 基可为羟基或氨基取代的苯基或羟基或氨基取代的苄基。
优选的链长度
在本发明的一些优选化合物中， m 和 n 各自为 1。可将这些化合物描述为丁酸 / 丁 酸盐 / 酯衍生物， 而且具有通式 (IIIa) ：
其中 R1、 R1a、 R1b、 R2a、 R2b、 R3a、 R3b 和 R4 如先前所定义。
在其它优选化合物中， m 为 1 且 n 为 0。可将这些化合物描述为丙酸 / 丙酸盐 / 酯 衍生物， 而且具有通式 (IIIb) ：
其中 R1、 R1a、 R1b、 R2a、 R2b、 R3a、 R3b 和 R4 如先前所定义。可见如果 m 为 0 且 n 为 1， 那 么这也会得到丙酸衍生物。
在一些实施方案中， m 和 n 均可为 0。这得到具有通式 (IIIc) 的化合物， 可将所述
具有通式 (IIIc) 的化合物描述为乙酸 / 乙酸盐 / 酯衍生物 ：
优选的取代基
本发明的优选实施方案包括如下化合物， 其是通式 (IIIa) 至 (IIIc) 的取代的丁 酸衍生物、 取代的丙酸衍生物或取代的乙酸衍生物， 其中 R1 为如上文所定义的羧酸盐 / 酯 或其衍生物， 且其中 R1a、 R1b、 R2a、 R2b、 R3a、 R3b 和 R4 中的一个或多个为不是氢的取代基， 优选 1a 1b 2a 2b 3a 3b 4 选自烃基或芳基。优选的是， R 、 R 、 R 、 R 、 R 、 R 和 R 中的一个或多个 ( 优选一个 ) 是 1a 1b 2a 芳基， 最优选苯基或取代的苯基。当 R 、 R 、 R 、 R2b、 R3a、 R3b 和 R4 中的一个是芳基时， 优选 1a 1b 2a 2b 3a 3b 4 的是， R 、 R 、 R 、 R 、 R 、 R 和 R 中的其它选自氢或烃基， 所述烃基优选为甲基。 4
最优选的是， R 为芳基， 优选苯基或取代的苯基。 依照这些实施方案的某些优选化 合物具有通式 (IVa) ：
因此， 优选的丁酸衍生物具有通式 (IVb) ：
优选的丙酸衍生物具有通式 (IVc) ：
且优选的乙酸盐 / 酯衍生物具有通式 (IVd) ：在式 (IVa) 至 (IVd) 中， 苯基环可任选取代有一个或多个如下文进一步定义的取 代基。优选的取代基是烃基、 卤素、 羟基和氨基。
可任选将羧酸盐基团衍生为上述酯基团或酰氨基团。在这些实施方案中， R1a、 R1b、 R2a、 R2b、 R3a、 R3b 优选为氢或具有 1-10 个碳原子的烃基， 所述烃基优选为甲基或乙基。 4 1a 1b
在可选择的实施方案中， R 可为氢， 且R 、 R 、 R2a、 R2b、 R3a、 R3b 中的一个或多个 ( 优 选一个 ) 可为芳基 ( 诸如苯基或取代的苯基 )。
相对于羧酸盐 / 酯基团的 α 位上的取代基
R1a 和 R1b 优选选自氢和具有 1-10 个碳原子的烃基， 所述烃基优选为甲基或乙基。 1a 1b 1a 在一些实施方案中， R 和 R 可均为烃基， 但优选的是， R 和 R1b 中的至少一个为氢。
具体而言， 下述化合物依照本发明是有用的 ： 4- 苯基丁酸、 3- 苯基丁酸、 2- 苯基丁 酸、 3- 苯基丙酸、 2- 苯基丙酸、 2- 甲基 -3- 苯基丙酸 [ST7]、 2- 甲基 -4- 苯基丁酸或任意所 述化合物的药用盐、 4- 苯基丁酸甲酯、 4- 苯基丁酸乙酯、 3- 苯基丁酸甲酯、 3- 苯基丁酸乙 酯、 2- 苯基丁酸甲酯、 2- 苯基丁酸乙酯、 3- 苯基丙酸甲酯、 3- 苯基丙酸乙酯、 2- 苯基丙酸甲 酯、 2- 苯基丙酸乙酯、 2- 甲基 -3- 苯基丙酸甲酯、 2- 甲基 -3- 苯基丙酸乙酯、 2- 甲基 -4- 苯 基丁酸甲酯和 2- 甲基 -4- 苯基丁酸乙酯。
这些化合物的代谢产物依照本发明也可以是有用的， 特别是苯基乙酸盐 / 酯。
相对于羧酸盐 / 酯基团的 β 位上的取代基 ( 当存在时 )
在实施方案中， R2a 和 R2b 中的一个或两个可任选为羟基。这在期望本发明化合物 具有提高的代谢 ( 诸如 β- 氧化 ) 抗性及由此原则上具有较长的半衰期的情况下可以是优 选的。
定义和其它优先选择
烃基 (alkyl) ：
除非另有说明， 如本申请所使用的术语 “烃基” 指 C1-10 烃基， 也就是说通过自具有 1-10 个碳原子的烃化合物除去一个氢原子而得到的单价部分， 其可为脂肪族或脂环族或它 们的组合， 其可以是直链或支链的， 且其可以是饱和、 部分不饱和或完全不饱和的。在某些 情况下， C1-4 烃基、 C1-5 烃基、 C1-6 烃基或 C1-7 烃基可以是优选的。
饱和的直链的 C1-10 烃基的例子包括但不限于甲基、 乙基、 正丙基、 正丁基、 正戊基 和正己基。
饱和的支链的 C1-10 烃基的例子包括但不限于异丙基、 异丁基、 仲丁基、 叔丁基和新 戊基。
饱和的脂环族的 C1-10 烃基 ( 其也可称作 “C3-10 环烷基” ) 的例子包括但不限于诸如 环丙基、 环丁基、 环戊基和环己基的基团及取代的基团 ( 例如包含此类基团的基团 ) 诸如甲 基环丙基、 二甲基环丙基、 甲基环丁基、 二甲基环丁基、 甲基环戊基、 二甲基环戊基、 甲基环
己基、 二甲基环己基、 环丙基甲基和环己基甲基。
不饱和的烃基含有一个或多个双键或叁键即一个或多个碳 - 碳 π 键。具有一个 或多个碳 - 碳双键的不饱和的 C1-10 烃基 ( 也称作 “C2-10 烯基” ) 的例子包括但不限于乙烯基 (-CH ＝ CH2)、 2- 丙烯基 ( 烯丙基， -CH-CH ＝ CH2)、 异丙烯基 (-C(CH3) ＝ CH2)、 丁烯基、 戊烯 基和己烯基。
具有一个或多个碳 - 碳叁键的不饱和的 C1-10 烃基 ( 也称作 “C2-10 炔基” ) 的例子包 括但不限于乙炔基和 2- 丙炔基 ( 炔丙基 )。
具有一个或多个碳 - 碳双键的不饱和的脂环族的 ( 碳环的 )C1-10 烃基 ( 也称作 “C3-10 环烯基” ) 的例子包括但不限于未取代的基团， 诸如环丙烯基、 环丁烯基、 环戊烯基和 环己烯基， 及取代的基团 ( 例如包含此类基团的基团 )， 诸如环丙烯基甲基和环己烯基甲 基。
芳基 ：
除非另有说明， 如本申请所使用的术语 “芳基” 指 C5-20 芳基， 也就是说通过自 C5-20 芳香族化合物的芳香族环原子除去一个氢原子而得到的单价部分， 所述化合物具有一个环 或两个或更多个环 ( 例如稠环 )， 且具有 5-20 个环原子， 且其中所述环中的至少一个是芳香 族环。优选的是， 每个环具有 5-7 个环原子。 环原子可均为碳原子， 如在 “碳芳基” 中， 在这种情况下所述基团通常可称作 “C5-20 碳芳基” 。
不具有环杂原子的 C5-20 芳基 ( 即 C5-20 碳芳基 ) 的例子包括但不限于衍生自苯 ( 即 苯基 )(C6)、 萘 (C10)、 蒽 (C14)、 菲 (C14)、 萘并萘 (C18) 和芘 (C16) 的那些 C5-20 芳基。
包含稠环且所述稠环之一不是芳香族环的芳基的例子包括但不限于衍生自茚和 芴的基团。
可选择地， 环原子可包括一个或多个杂原子， 包括但不限于氧、 氮和硫， 如在 “杂芳 基” 中。在这种情况下， 所述基团通常可称作 “C5-20 杂芳基” ， 其中 “C5-20” 指环原子， 无论是 碳原子还是杂原子。优选的是， 每个环具有 5-7 个环原子， 其中 0-4 个是环杂原子。
C5-20 杂芳基的例子包括但不限于衍生自呋喃、 噻吩、 吡咯、 咪唑、 吡唑、 三唑、 唑、
异唑、 噻唑、 异噻唑、 二唑和三唑的 C5 杂芳基 ； 及衍生自异嗪、 吡啶、 哒嗪、 嘧啶 ( 例如胞嘧啶、 胸腺嘧啶、 尿嘧啶 )、 吡嗪、 三嗪、 四唑和 二唑 ( 呋咱 ) 的 C6 杂芳基。
包含稠环的 C5-20 杂芳基的例子包括但不限于衍生自苯并呋喃、 异苯并呋喃、 吲哚、 异吲哚、 嘌呤 ( 例如腺嘌呤、 鸟嘌呤 )、 苯并噻吩、 苯并咪唑的 C9 杂环基 ； 衍生自喹啉、 异喹 啉、 苯并二嗪、 吡啶并吡啶、 喹喔啉的 C10 杂环基 ； 衍生自咔唑、 二苯并噻吩、 二苯并呋喃的 C13 杂环基 ； 衍生自吖啶、 呫吨、 吩噻 、 吩嗪、 吩 嗪、 吩噻嗪的 C14 杂环基。
任选取代 ：
上述烃基和芳基 ( 无论是单独存在还是作为另一取代基的一部分 ) 自身可任选取 代有一个或多个选自它们自身和下述其它取代基的基团。
卤素 ： -F、 -Cl、 -Br 和 -I。
羟基 ： -OH。
醚基团 ： -OR， 其中 R 为醚取代基， 例如 C1-7 烃基 ( 下文也称作 C1-7 烃氧基 )、 C3-20 杂 环基 ( 也称作 C3-20 杂环基氧基 ) 或 C5-20 芳基 ( 也称作 C5-20 芳基氧基 )， 优选 C1-7 烃基。C1-7 烃氧基 ： -OR， 其中 R 为 C1-7 烃基。C1-7 烃氧基的例子包括但不限于 -OCH3( 甲氧 基 )、 -OCH2CH3( 乙氧基 ) 和 -OC(CH3)3( 叔丁氧基 )。
氧代 ( 酮基或 - 酮 ) ： ＝O； 羰基 ( ＞ C ＝ O)。具有氧代基团 ( ＝ O) 作为取代基 的环状化合物和 / 或基团的例子包括但不限于碳环， 诸如环戊酮和环己酮 ； 杂环， 诸如吡喃 酮、 吡咯烷酮、 吡唑啉酮、 吡唑烷酮、 哌啶酮、 哌啶二酮、 哌嗪二酮和咪唑烷酮 ； 环状酸酐， 包 括但不限于马来酸酐和琥珀酸酐 ； 环状碳酸酯， 诸如碳酸亚丙酯 ； 酰亚胺， 包括但不限于琥 珀酰亚胺和马来酰亚胺 ； 内酯 ( 环状酯 )( 在环中具有 -O-C( ＝ O)-)， 包括但不限于 β- 丙 内酯、 γ- 丁内酯、 δ- 戊内酯和 ε- 己内酯 ； 和内酰胺 ( 环状酰胺 )( 在环中具有 -NH-C( ＝ O)-)， 包括但不限于 β- 丙内酰胺、 γ- 丁内酰胺 (2- 吡咯烷酮 )、 δ- 戊内酰胺和 ε- 己内 酰胺。
亚氨基 ( 亚胺 ) ： ＝ NR， 其中 R 为亚氨基取代基， 例如氢、 C1-7 烃基、 C3-20 杂环基或 C5-20 芳基， 优选氢或 C1-7 烃基。亚氨基的例子包括但不限于＝ NH、 ＝ NMe、 ＝ NEt 和＝ NPh。
甲酰基 ( 甲醛 ) ： -C( ＝ O)H。
酰基 ( 酮基 ) ： -C( ＝ O)R， 其中 R 为酰基取代基， 例如 C1-7 烃基 ( 也称作 C1-7 烃基酰 基或 C1-7 烃酰基 )、 C3-20 杂环基 ( 也称作 C3-20 杂环基酰基 ) 或 C5-20 芳基 ( 也称作 C5-20 芳基酰 基 )， 优选 C1-7 烃基。酰基的例子包括但不限于 -C( ＝ O)CH3( 乙酰基 )、 -C( ＝ O)CH2CH3( 丙 酰基 )、 -C( ＝ O)C(CH3)3( 丁酰基 ) 和 -C( ＝ O)Ph( 苯甲酰基、 苯某酮 )。
羧基 ( 羧酸 ) ： -COOH。
酯基团 ( 羧酸酯、 氧基羰基 ) ： -C( ＝ O)OR， 其中 R 为酯取代基， 例如 C1-7 烃基、 C3-20 杂环基或 C5-20 芳基， 优选 C1-7 烃基。酯基团的例子包括但不限于 -C( ＝ O)OCH3、 -C( ＝ O) OCH2CH3、 -C( ＝ O)OC(CH3)3 和 -C( ＝ O)OPh。
酰基氧基 ( 反向酯 ) ： -OC( ＝ O)R， 其中 R 为酰基氧基取代基， 例如 C1-7 烃基、 C3-20 杂环基或 C5-20 芳基， 优选 C1-7 烃基。酰基氧基的例子包括但不限于 -OC( ＝ O)CH3( 乙酰氧 基 )、 -OC( ＝ O)CH2CH3、 -OC( ＝ O)C(CH3)3、 -OC( ＝ O)Ph 和 -OC( ＝ O)CH2Ph。
氨酰基 (amido)( 氨甲酰基、 氨基羰基、 甲酰胺 ) ： -C( ＝ O)NRN1RN2， 其中 RN1 和 RN2 独 立为如就氨基所定义的氨基取代基。氨酰基的例子包括但不限于 -C( ＝ O)NH2、 -C( ＝ O) N1 NHCH3、 -C( ＝ O)N(CH3)2、 -C( ＝ O)NHCH2CH3 和 -C( ＝ O)N(CH2CH3)2 及其中 R 和 RN2 与它们 所连接的氮原子一起形成杂环结构的氨酰基， 如在例如哌啶子基羰基、 吗啉代羰基、 硫吗啉 代羰基和哌嗪子基羰基中。
酰基氨基 ( 酰基氨基 ) ： -NRA1C( ＝ O)RA2， 其中 RA1 为酰胺取代基， 例如氢、 C1-7 烃基、 A2 C3-20 杂环基或 C5-20 芳基， 优选氢或 C1-7 烃基， 且 R 为酰基取代基， 例如 C1-7 烃基、 C3-20 杂环基 或 C5-20 芳基， 优选氢或 C1-7 烃基。酰胺基团的例子包括但不限于 -NHC( ＝ O)CH3、 -NHC( ＝ A1 A2 O)CH2CH3 和 -NHC( ＝ O)Ph。R 和 R 可一起形成环状结构， 如在例如琥珀酰亚氨基、 马来酰 亚氨基和酞酰亚氨基中 ：
酰基脲基 ： -N(RU1)C(O)NRU2C(O)RA3， 其中 RU1 和 RU2 独立为脲基取代基， 例如氢、 C1-7 烃基、 C3-20 杂环基或 C5-20 芳基， 优选氢或 C1-7 烃基。RA3 为如就酰基所定义的酰基取代基。酰 基脲基的例子包括但不限于 -NHCONHC(O)H、 -NHCONMeC(O)H、 -NHCONEtC(O)H、 -NHCONMeC(O) Me、 -NHCONEtC(O)Et、 -NMeCONHC(O)Et、 -NMeCONHC(O)Me、 -NMeCONHC(O)Et、 -NMeCONMeC(O) Me、 -NMeCONEtC(O)Et 和 -NMeCONHC(O)Ph。
氨基甲酸酯基团 ： -NRN1-C(O)-ORO2， 其中 RN1 为如就氨基所定义的氨基取代基， 且 O2 R 为如就酯基团所定义的酯取代基。 氨基甲酸酯基团的例子包括但不限于 -NH-C(O)-O-Me 、 -NMe-C(O)-O-Me、 -NH-C(O)-O-Et、 -NMe-C(O)-O- 叔丁基和 -NH-C(O)-O-Ph。
硫代氨酰基 ( 硫代氨甲酰基 ) ： -C( ＝ S)NRN1RN2， 其中 RN1 和 RN2 独立为如就氨基所 定义的氨基取代基。硫代氨酰基的例子包括但不限于 -C( ＝ S)NH2、 -C( ＝ S)NHCH3、 -C( ＝ S)N(CH3)2 和 -C( ＝ S)NHCH2CH3。
四唑基 ： 具有四个氮原子和一个碳原子的五元芳香族环。氨基 ： -NRN1RN2， 其中 RN1 和 RN2 独立为氨基取代基， 例如氢、 C1-7 烃基 ( 也称作 C1-7 烃 基氨基或二 C1-7 烃基氨基 )、 C3-20 杂环基或 C5-20 芳基， 优选 H 或 C1-7 烃基， 或在 “环状” 氨基 N1 N2 的情况下 R 和 R 与它们所连接的氮原子一起形成具有 4-8 个环原子的杂环基团。氨基的 例子包括但不限于 -NH2、 -NHCH3、 -NHC(CH3)2、 -N(CH3)2、 -N(CH2CH3)2 和 -NHPh。环状氨基的 例子包括但不限于氮杂环丙烷子基、 氮杂环丁烷子基、 吡咯烷子基、 哌啶子基、 哌嗪子基、 吗 啉代和硫吗啉代。
亚氨基 ： ＝ NR、 其中 R 为亚氨基取代基， 例如氢、 C1-7 烃基、 C3-20 杂环基或 C5-20 芳基， 优选 H 或 C1-7 烃基。
脒基团 ： -C( ＝ NR)NR2， 其中每个 R 为脒取代基， 例如氢、 C1-7 烃基、 C3-20 杂环基或 C5-20 芳基， 优选 H 或 C1-7 烃基。脒基团的例子是 -C( ＝ NH)NH2。
肼基羰基 ： -C(O)-NN-RN1， 其 中 RN1 为 如 就 氨 基 所 定 义 的 氨 基 取 代 基。 肼 基 羰 基 的 例 子 包 括 但 不 限 于 -C(O)-NN-H、 -C(O)-NN-Me、 -C(O)-NN-Et、 -C(O)-NN-Ph 和 -C(O)-NN--CH2-Ph。
硝基 ： -NO2。
亚硝基 ： -NO。
叠氮基 ： -N3。
氰基 ( 甲腈 ) ： -CN。
异氰基 ： -NC。
氰酰基 ： -OCN。
异氰酰基 ： -NCO。
硫氰基 ( 硫氰酰基 ) ： -SCN。
异硫氰基 ( 异硫氰酰基 ) ： -NCS。
巯基 ( 硫醇 ) ： -SH。
硫醚基团 ( 硫化物 ) ： -SR， 其中 R 为硫醚取代基， 例如 C1-7 烃基 ( 也称作 C1-7 烃基 硫基 )、 C3-20 杂环基或 C5-20 芳基， 优选 C1-7 烃基。C1-7 烃基硫基的例子包括但不限于 -SCH3 和 -SCH2CH3。
二硫化物基团 ： -SS-R， 其中 R 为二硫化物取代基， 例如 C1-7 烃基、 C3-20 杂环基或 C5-20 芳基， 优选 C1-7 烃基 ( 本申请也称作 C1-7 烃基二硫化物基团 )。C1-7 烃基二硫化物基团的例 子包括但不限于 -SSCH3 和 -SSCH2CH3。
砜 ( 磺酰基 ) ： -S( ＝ O)2R， 其中 R 为砜取代基， 例如 C1-7 烃基、 C3-20 杂环基或 C5-20 芳 基， 优选 C1-7 烃基。 砜基团的例子包括但不限于 -S( ＝ O)2CH3( 甲磺酰基 )、 -S( ＝ O)2CF3( 三 氟甲磺酰基 )、 -S( ＝ O)2CH2CH3、 -S( ＝ O)2C4F9( 九氟丁磺酰基 )、 -S( ＝ O)2CH2CF3( 三氟乙 磺酰基 )、 -S( ＝ O)2Ph( 苯基磺酰基 )、 4- 甲基苯基磺酰基 ( 甲苯磺酰基 )、 4- 溴苯基磺酰 基 ( 溴苯磺酰基 ) 和 4- 硝基苯基磺酰基 ( 硝苯磺酰基 )。
亚磺酰基 ( 亚砜 ) ： -S( ＝ O)R， 其中 R 为亚磺酰基取代基， 例如 C1-7 烃基、 C3-20 杂 环基或 C5-20 芳基， 优选 C1-7 烃基。亚磺酰基的例子包括但不限于 -S( ＝ O)CH3 和 -S( ＝ O) CH2CH3。
磺酰基氧基 ： -OS( ＝ O)2R， 其中 R 为磺酰基氧基取代基， 例如 C1-7 烃基、 C3-20 杂环 基或 C5-20 芳基， 优选 C1-7 烃基。磺酰基氧基的例子包括但不限于 -OS( ＝ O)2CH3 和 -OS( ＝ O)2CH2CH3。
亚磺酰基氧基 ： -OS( ＝ O)R， 其中 R 为亚磺酰基氧基取代基， 例如 C1-7 烃基、 C3-20 杂 环基或 C5-20 芳基， 优选 C1-7 烃基。 亚磺酰基氧基的例子包括但不限于 -OS( ＝ O)CH3 和 -OS( ＝ O)CH2CH3。
磺氨基 ： -NRN1S( ＝ O)2OH， 其中 RN1 为如就氨基所定义的氨基取代基。磺氨基的例 子包括但不限于 -NHS( ＝ O)2OH 和 -N(CH3)S( ＝ O)2OH。
亚磺氨基 ： -NRN1S( ＝ O)R， 其中 RN1 为如就氨基所定义的氨基取代基， 且 R 为亚磺 氨基取代基， 例如 C1-7 烃基、 C3-20 杂环基或 C5-20 芳基， 优选 C1-7 烃基。亚磺氨基的例子包括 但不限于 -NHS( ＝ O)CH3 和 -N(CH3)S( ＝ O)C6H5。
氨亚磺酰基 ： -S( ＝ O)NRN1RN2， 其中 RN1 和 RN2 独立为如就氨基所定义的氨基取代基。 氨亚磺酰基的例子包括但不限于 -S( ＝ O)NH2、 -S( ＝ O)NH(CH3)、 -S( ＝ O)N(CH3)2、 -S( ＝ O)NH(CH2CH3)、 -S( ＝ O)N(CH2CH3)2 和 -S( ＝ O)NHPh。
磺酰氨基 ： -NRN1S( ＝ O)2R， 其中 RN1 为如就氨基所定义的氨基取代基， 且 R 为磺酰 氨基取代基， 例如 C1-7 烃基、 C3-20 杂环基或 C5-20 芳基， 优选 C1-7 烃基。磺酰氨基的例子包括 但不限于 -NHS( ＝ O)2CH3 和 -N(CH3)S( ＝ O)2C6H5。一类特殊的磺酰氨基是衍生自内磺酰胺 的那些磺酰氨基—在这些基团中， RN1 和 R 中的一个为 C5-20 芳基， 优选苯基， 而 RN1 和 R 中的 另一个为与所述 C5-20 芳基相连的二价基团， 诸如衍生自 C1-7 烃基的二价基团。此类基团的 例子包括但不限于 ：
2， 3- 二氢 - 苯并 [d] 异噻唑 -1， 1 二氧化物 -2- 基 唑 -2， 2 二氧化物 -1- 基1， 3- 二氢 - 苯并 [c] 异噻3， 4- 二氢 -2H- 苯并 [e][1， 2] 噻嗪 -1， 1 二氧化物 -2- 基
氨基亚磷酸酯基团 (Phosphoramidite) ： -OP(ORP1)-NRP22， 其中 RP1 和 RP2 为氨基亚 磷酸酯取代基， 例如 -H、 ( 任选取代的 )C1-7 烃基、 C3-20 杂环基或 C5-20 芳基， 优选 -H、 C1-7 烃基 或 C5-20 芳基。 氨基亚磷酸酯基团的例子包括但不限于 -OP(OCH2CH3)-N(CH3)2、 -OP(OCH2CH3)N( 异丙基 )2 和 -OP(OCH2CH2CN)-N( 异丙基 )2。
氨基磷酸酯基团 (Phosphoramidate) ： -OP( ＝ O)(ORP1)-NRP22， 其中 RP1 和 RP2 为氨 基磷酸酯取代基， 例如 -H、 ( 任选取代的 )C1-7 烃基、 C3-20 杂环基或 C5-20 芳基， 优选 -H、 C1-7 烃 基或 C5-20 芳基。 氨基磷酸酯基团的例子包括但不限于 -OP( ＝ O)(OCH2CH3)-N(CH3)2、 -OP( ＝ O)(OCH2CH3)-N( 异丙基 )2 和 -OP( ＝ O)(OCH2CH2CN)-N( 异丙基 )2。
在多种情况下， 取代基自身可以是取代的。 例如， C1-7 烃氧基可取代有例如 C1-7 烃基 ( 也称作 C1-7 烃基 -C1-7 烃氧基 )， 例如环己基甲氧基 ； C1-7 烃氧基可取代有 C3-20 杂环基 ( 也 称作 C3-20 杂环基 -C1-7 烃氧基 )， 例如邻苯二甲酰亚氨基乙氧基 ； 或 C1-7 烃氧基可取代有 C5-20 芳基 ( 也称作 C5-20 芳基 -C1-7 烃氧基 )， 例如苄基氧基。
芳基或烃基的优选取代基可包括 C1-10 烃基、 C5-20 芳基、 羟基、 C1-7 烃氧基、 硝基、 氨 N1 N2 基、 取代的氨基 ( 如上文所定义的 -NR R ) 和卤素。
异构体、 盐、 溶剂化物和受保护形式
某些化合物可按一种或多种特定的几何异构形式、 光学异构形式、 对映异构形式、 非对映异构形式、 差向异构形式、 立体异构形式、 互变异构形式、 构象异构形式或端基异构 形式存在， 包括但不限于顺式和反式 ； E和Z型； c、 t和r型； 内和外型 ； R、 S 和内消旋 - 型 ； D和L型； d和l型； (+) 和 (-) 型 ； 酮、 烯醇和烯醇化物型 ； 顺 (syn) 和反 (anti) 型 ； 顺错 (synclinal) 和反错 (anticlinal) 型 ； α和β型； 直立型和平伏型 ； 船型、 椅型、 扭转型、 信封型和半椅型 ； 及它们的组合， 下文统称为 “异构体” (或 “异构形式” )。
注意， 除下文就互变异构形式所讨论外， 如本申请所使用的术语 “异构体” 明确排 除结构 ( 或构造 ) 异构体 ( 即原子之间连接不同而非仅原子空间位置不同的异构体 )。例 如， 当提到甲氧基 -OCH3 时， 不应当解释为提到其结构异构体羟基甲基 -CH2OH。类似地， 当 提到邻氯苯基时， 不应当解释为提到其结构异构体间氯苯基。然而， 当提到一类结构时， 可 丁基包括正丁 完全包括落在该类中的结构异构形式 ( 例如 C1-7 烃基包括正丙基和异丙基 ； 基、 异丁基、 仲丁基和叔丁基 ； 甲氧基苯基包括邻甲氧基苯基、 间甲氧基苯基和对甲氧基苯 基 )。
上述排除不适用于互变异构形式， 例如酮、 烯醇和烯醇化物形式， 如在例如下述互 变异构对中 ： 酮 / 烯醇 ( 如下所示 )、 亚胺 / 烯胺、 酰胺 / 亚氨基醇、 脒 / 脒、 亚硝基 / 肟基 团、 硫酮 / 烯硫醇、 N- 亚硝基 / 羟基偶氮和硝基 / 异硝基。
注意， 术语 “异构体” 明确包括具有一个或多个同位素代替的化合物。例如， H 可呈 1 2 3 12 13 14 任意同位素形式， 包括 H、 H(D) 和 H(T) ； C 可呈任意同位素形式， 包括 C、 C 和 C ； O 可呈 16 18 任意同位素形式， 包括 O 和 O ； 等。
除非另有说明， 当提到特定的化合物时， 包括所有上述异构形式， 包括其外消旋混 合物 ( 完全或部分 ) 和其它混合物。用于制备 ( 例如不对称合成 ) 和分离 ( 例如分级结晶 和色谱手段 ) 上述异构形式的方法是本领域已知的或是通过以已知的方式使用本申请教 导的方法或已知的方法而易于得到的。
除非另有说明， 当提到特定的化合物时， 也包括其离子、 盐、 溶剂化物和受保护形 式， 例如如下所述。
制备、 纯化和 / 或处理活性化合物的相应盐 ( 例如药用盐 ) 可以是方便或期望的。 Berge， et al.， J.Pharm.Sci.， 66， 1-19(1977) 讨论了药用盐的例子。
例如， 如果化合物是阴离子或具有可形成阴离子的官能团 ( 例如 -COOH 可形 成 -COO )， 那么盐可用合适的阳离子形成。合适的无机阳离子的例子包括但不限于碱金属 离子诸如 Na+ 和 K+， 碱土阳离子诸如 Ca2+ 和 Mg2+， 及其它阳离子诸如 Al3+。 合适的有机阳离子 + + 的例子包括但不限于铵根子 ( 即 NH4 ) 和取代的铵根离子 ( 例如 NH3R 、 NH2R2+、 NHR3+、 NR4+)。 一些合适的取代的铵根离子的例子是衍生自下述物质的那些铵根离子 ： 乙胺、 二乙胺、 二环 己胺、 三乙胺、 丁胺、 乙二胺、 乙醇胺、 二乙醇胺、 哌嗪、 苄胺、 苯基苄基胺、 胆碱、 葡甲胺和氨 + 丁三醇及氨基酸诸如赖氨酸和精氨酸。常见的季铵根离子的例子是 N(CH3)4 。
如果化合物是阳离子或具有可形成阳离子的官能团 ( 例如 -NH2 可形成 -NH3+)， 那 么盐可用合适的阴离子形成。 合适的无机阴离子的例子包括但不限于衍生自下述无机酸的 那些阴离子 ： 盐酸、 氢溴酸、 氢碘酸、 硫酸、 亚硫酸、 硝酸、 亚硝酸、 磷酸和亚磷酸。 合适的有机 阴离子的例子包括但不限于衍生自下述有机酸的那些阴离子 ： 乙酸、 丙酸、 琥珀酸、 羟乙酸、 硬脂酸、 棕榈酸、 乳酸、 苹果酸、 扑酸、 酒石酸、 枸橼酸、 葡糖酸、 抗坏血酸、 马来酸、 羟马来酸、 苯乙酸、 谷氨酸、 天冬氨酸、 苯甲酸、 肉桂酸、 丙酮酸、 水杨酸、 对氨基苯磺酸、 2- 乙酰氧基苯 甲酸、 富马酸、 苯磺酸、 甲苯磺酸、 甲磺酸、 乙磺酸、 乙二磺酸、 草酸、 泛酸、 羟乙磺酸、 戊酸、 乳 糖酸和葡糖酸。 合适的聚合物阴离子的例子包括但不限于衍生自下述聚合物酸的那些阴离 子： 鞣酸、 羧甲基纤维素。
制备、 纯化和 / 或处理活性化合物的相应溶剂化物可以是方便或期望的。 术语 “溶 剂化物” 在本申请中以常规含义用于指溶质 ( 例如活性化合物、 活性化合物的盐 ) 和溶剂的 复合物。 如果溶剂是水， 那么溶剂化物通常可称作水合物， 例如单水合物、 二水合物、 三水合 物等。
制备、 纯化和 / 或处理化学受保护形式的活性化合物可以是方便或期望的。如本
申请所使用的术语 “化学受保护形式” 指其中一个或多个反应性官能团受到保护而免于不 想要的化学反应的化合物， 即呈受保护基团或保护基团的形式 ( 也称作受掩蔽基团或掩蔽 基团或受阻断基团或阻断基团 )。 通过对反应性官能团进行保护， 能进行涉及其它不受保护 的反应性官能团的反应， 而不会影响受保护基团 ； 通常可在后续步骤除去保护基团， 而不会 实质性地影响分子的其余部分。参见例如 Protective Groups in Organic Synthesis(T. Green 和 P.Wuts， Wiley， 1999)。
例如， 可将羟基保护成醚基团 (-OR) 或酯基团 (-OC( ＝ O)R)， 例如保护成叔丁 基醚基团 ； 苄基醚基团、 二苯甲基 ( 二苯基甲基 ) 醚基团或三苯甲基 ( 三苯基甲基 ) 醚基 团； 三甲基甲硅烷基醚基团或叔丁基二甲基甲硅烷基醚基团 ； 或乙酰基酯基团 (-OC( ＝ O) CH3、 -OAc)。
例如， 可将醛基团或酮基团分别保护成缩醛或缩酮， 其中羰基 ( ＞ C ＝ O) 通过与 例如伯醇反应而转化成二醚 ( ＞ C(OR)2)。 醛基团或酮基团易于如下重新形成 ： 在存在酸的 情况下使用大大过量的水来水解。
例 如， 可 将 氨 基 例 如 保 护 成 酰 胺 或 氨 基 甲 酸 酯， 例如保护成甲基酰 胺 (-NHCO-CH3) ；苄 基 氧 基 酰 胺 (-NHCO-OCH2C6H5、 -NH-Cbz) ；叔 丁 氧 基 酰 胺 (-NHCO-OC(CH3)3、 -NH-Boc) ； 2- 联苯基 -2- 丙氧基酰胺 (-NHCO-OC(CH3)2C6H4C6H5、 -NH-Bpo c)、 9- 芴基甲氧基酰胺 (-NH-Fmoc)、 6- 硝基藜芦基氧基酰胺 (-NH-Nvoc)、 2- 三甲基甲硅 烷基乙基氧基酰胺 (-NH-Teoc)、 2， 2， 2- 三氯乙基氧基酰胺 (-NH-Troc)、 烯丙基氧基酰胺 (-NH-Alloc)、 2-( 苯基磺酰基 ) 乙基氧基酰胺 (-NH-Psec) ； 或合适的情况下的 N- 氧化物 ( ＞ NO·)。
例如， 可将羧酸基团保护成酯， 例如保护成 C1-7 烃基酯 ( 例如甲酯、 叔丁酯 ) ； C1-7 卤 代烃基酯 ( 例如 C1-7 三卤代烃基酯 ) ； 三 C1-7 烃基甲硅烷基 -C1-7 烃基酯 ； C5-20 芳基 -C1-7 烃 基酯 ( 例如苄基酯、 硝基苄基酯 ) ； 或酰胺， 例如甲基酰胺。
例如， 可将硫醇基团保护成硫醚 (-SR)， 例如保护成苄基硫醚 ； 或乙酰氨基甲基硫 醚 (-S-CH2NHC( ＝ O)CH3)。
前药
在本发明中， 本发明的一些活性化合物以前药的形式发挥作用， 这意味着它们在 体内被代谢成活性形式。在这些化合物中有酯， 诸如三丁酸甘油酯、 三丙酸甘油酯、 甘油三 (4- 苯基丁酸酯 ) 和 4- 苯基丁酸甲酯。
其它方面和实施方案
在本发明的下述方面或实施方案中， 本发明化合物是如上文例如式 Ia 或式 I 或式 IIIa 中所定义的任意化合物。
优选的是， 所述化合物是丁酸 / 丁酸盐 / 酯衍生物， 诸如酸加成盐、 酯或酰胺， 诸如 式 IIa、 IIb、 IIc、 IId、 IIe 任一所定义。
优选的是， 所述化合物包含至少一个芳基取代基， 其优选位于 R4， 诸如式 IVb 任一 所定义。
本发明的具体方面提供在需要治疗、 预防或抵抗微生物感染的患者中通过对所述 患者给药有效量的如本申请所述的本发明化合物来治疗、 预防或抵抗微生物感染的方法。
所述有效量足以例如通过刺激 cathelicidin LL-37 的合成 ( 例如遏制或抑制其下调 ) 而在体内展现出抗微生物活性。刺激可朝向、 等于或超出基础水平 ( 即在没有感染 的情况下的正常水平 )。
如本申请所使用的术语 “抗微生物活性” 指抑制微生物群落生长或实际杀死微生 物群落的能力， 所述微生物可以是细菌、 病毒、 原生动物或真菌微生物。因此， 应当将 “抗微 生物活性” 解释为既指抑制微生物的活性又指杀死微生物的活性。还应当将抗微生物活性 解释为包括能够抑制微生物感染 ( 即微生物致病能力 ) 的化合物。
本发明化合物通过刺激先天抗微生物肽防御系统而展现出抗微生物效应。
一般而言， 使用本发明会导致相关的肽分泌到上皮表面上 ( 例如在胃肠道中 )。 这 接下来会导致抗微生物活性在表面处的提高 ( 及因此其屏障功能的改善 ) 及对微生物感染 和其所致疾病的治疗。
本发明所针对的微生物靶标和疾病可以是据信受益于本发明的任意微生物靶标 和疾病， 但优选的靶标是传染性结肠炎， 例如由难辨梭菌结肠炎引起。
本发明化合物特别可用于对抗耐受常规抗生素的细菌菌株感染。然而， 本申请所 述化合物与常规抗生素的联用可以是优选的， 而且构成本发明的一部分。
本发明的其它组合治疗包括本申请所述的化合物与据信具有抗微生物效应的其 它化合物的联用。这些其它化合物包括 ： 氨基甾醇类化合物， 例如所述氨基甾醇类化合物 包括亚精胺、 精胺或其它多胺 ( 参见 WO2000-09137) ； 异亮氨酸或其活性异构体或类似物 ( 参见 US2002-0076393 或 US2003-0109582 或 US7311925) ； 及维生素 D 类化合物 ( 参见 US20080038374 或 WO/2008/073174)。通过交叉引用将所有这些参考文献关于这些化合物、 这些化合物的定义和这些化合物的提供的公开内容明确并入本申请。 下文更详细地描述了优选的剂量和剂型。优选的日剂量可为 250μg 至约 25g， 优 选高至约 5g， 更优选低于每天 3g， 所述日剂量可分拆成多剂， 例如以每天 1、 2 或 3 次来给 予。
所述化合物优选以口服剂型来给药， 所述口服剂型为诸如但不限于片剂、 胶囊剂、 溶液剂、 混悬剂、 粉剂、 糊剂、 酏剂和糖浆剂。其它给药形式也是有用的， 这些其它给药形式 包括但不限于局部给药形式， 其特别可用于对抗皮肤感染， 这些局部给药形式包括例如乳 膏剂、 油剂、 洗剂和软膏剂。其它剂型包括递送至呼吸系统 ( 包括肺 ) 的剂型， 诸如气雾剂 和鼻喷雾装置。
本发明的多个方面包括通过给药包含促分泌有效量的至少一种上述本发明化合 物的药物来治疗、 预防或抵抗微生物感染的方法， 所述感染包括细菌感染、 病毒感染、 真菌 感染和寄生虫感染 ( 还包括由耐受当前所用抗生素的细菌菌株引起的感染 )。
在另一方面， 本发明提供用于本申请所述方法例如用于治疗、 预防或抵抗微生物 感染 ( 包括上文所述类型 ) 的药物组合物， 所述药物组合物包含至少一种本发明化合物作 为活性成分且通常包含至少一种药用赋形剂。
在另一方面， 本发明提供本发明化合物在制备用于本申请所述方法的药物中的用 途。
现将更详细地讨论这些方面和实施方案中的一些 ：
宿主防御肽的分泌
哺乳动物的胃肠道 (GI 道 ) 覆盖有一片连续的上皮细胞， 其折叠成绒毛凸起和隐
窝。 在隐窝的基部 ( 其中能发现 GI 道的干细胞 ) 内有称作帕内特细胞的专门颗粒细胞。 肠 细胞和帕内特细胞都生成抗微生物肽。肠细胞合成并分泌抗微生物肽到肠腔中， 这既是组 成性的又是诱导性的。 肠隐窝基部的帕内特细胞分泌 α- 防卫素到隐窝孔中， 这导致以 mg/ mL 水平评估的浓度， 所述 α- 防卫素最终流入肠腔。
这两种系统都有助于肠健康。在患有由志贺氏菌引起的腹泻的儿童和成人中， cathelicidin LL-37 和结肠肠细胞 β- 防卫素 HBD-1 的合成受到显著的抑制 ； 表达在疾病 消退过程中恢复。类似地， 缺乏加工 cryptdin( 鼠帕内特细胞 α- 防卫素 ) 所需要的蛋白 水解酶的小鼠缺乏功能性的 cryptdin 且展现出提高的对口服给予的志贺氏菌的易感性。
哺乳动物躯体的其它上皮表面也具有此类宿主防御分泌系统， 包括但不限于角 膜、 肺、 肾和皮肤。
本发明组合物和方法的使用在人和其它动物中导致对胃肠道和其它上皮表面的 上皮细胞和帕内特细胞的刺激以分泌大量天然存在的广谱抗微生物剂， 包括抗微生物肽， 诸如防卫素、 cryptdin、 LL-37、 HBD1 和 HBD2， 和抗微生物蛋白质， 诸如溶菌酶、 运铁蛋白、 乳 铁蛋白、 磷脂酶和 SLPI( 分泌性白细胞蛋白酶抑制剂 )。 由帕内特细胞贮存的物质展现出对 抗广泛传染性物质的活性， 所述传染性物质包括细菌、 原生动物、 病毒和真菌。
本发明所靶向的上皮细胞可以是这些细胞中的任意一种。 然而， 优选的是， 本发明 用于治疗 GI 道的微生物感染。
微生物感染和疾病
当提到时， 本发明的重要方面提供通过给药包含促分泌有效量的至少一种本发明 化合物的药物来治疗、 预防或抵抗微生物感染的方法。
在有用的实施方案中， 受益于本发明治疗的感染和其它病症具体是涉及以下器官 的那些感染和其它病症， 所述器官所具有的上皮表面具有诸如上文所述的宿主防御肽分泌 系统。
此类感染、 病症和疾病包括但不限于旅行者腹泻 (traveller’ s diarrhoea)、 地 方 性 腹 泻 (endemic diarrhoea)、痢 疾 (dysentery)、病 毒 性 胃 肠 炎 (viral gastroenteritis)、 寄 生 虫 性 肠 炎 (parasitic enteritis)、 克 罗 恩 氏 病 (Crohn’ s disease)、 溃 疡 性 结 肠 炎 (ulcerative colitis)、 肠 易 激 综 合 征 (irritable bowel syndrome)、 胃肠道癌前状态 (precancerous state of the gastrointestinal tract)、 胃肠道癌症 (cancer of the gastrointestinal tract)、 憩室炎 (diverticulitis)、 抗 生素后腹泻 (post-antibiotic diarrhoea)、 难辨梭菌结肠炎 (Clostridium difficile colitis)、乳 糖 不 耐 受 (lactose intolerance)、肠 胃 气 胀 (flatulence)、胃 炎 (gastritis)、 食管炎 (esophagitis)、 胃灼热 (heartburn)、 胃溃疡 (gastric ulcer)、 与 幽门螺旋杆菌有关的溃疡 (ulcer associated with Helicobacter pylori)、 十二指肠 溃 疡 (duodenal ulcer)、 短 肠 综 合 征 (short bowel syndrome)、 倾 倒 综 合 征 (dumping syndrome)、 麸质肠病 (gluten enteropathy) 或食物不耐受 (food intolerance)。
本 发 明 方 法 还 包 括 皮 肤 感 染， 包 括 但 不 限 于 疮 疡 (boil)、 痈 (carbuncle)、 疖 (furuncle)、 蜂 窝 组 织 炎 (cellulitis)、 脓 疮 (abscesse)、 脓 疱 病 (impetigo) 和 丹 毒 (erysipelas) ； 眼 感 染， 包 括 但 不 限 于 结 膜 炎 (conjunctivitis)、 睑 腺 炎 (stye)、 睑 炎 (blepharitis)、 蜂窝组织炎 (cellulitis)、 角膜炎 (keratitis)、 角膜溃疡 (cornealulcer)、 沙 眼 (trachoma)、 葡 萄 膜 炎 (uveitis)、 泪 管 炎 (canaliculitis) 和 泪 囊 炎 (dacryocystitis) ； 呼吸系统感染和肾感染。还包括由耐受经典抗生素治疗的细菌菌株引 起的感染， 包括由多药耐受菌株引起的感染。
本 发 明 的 优 选 靶 标 是 传 染 性 结 肠 炎。 如 本 领 域 公 知 的 那 样， 引起传染性结 肠 炎 的 微 生 物 物 种 包 括 小 肠 结 肠 炎 耶 尔 森 氏 菌 (Yersenia enterocolitica)、 沙门 氏 菌 属 (Salmonella)、 志 贺 氏 菌 属 (Shigella)、 弯 曲 杆 菌 属 (Campylobacter)、 梭菌 属 (Clostridium) 和 大 肠 杆 菌 (E.Coli)。 一 些 细 菌 [ 诸 如 难 辨 梭 菌 (Clostridium difficile)] 可产生导致假膜性结肠炎发生的毒性物质。
本发明化合物特别可用于对抗耐受常规抗生素的细菌菌株感染， 而且根据本申请 化合物的促分泌作用得出的是， 细菌菌株不会发展出针对本发明治疗的抗性。
如所附实施例中所示， 已对所选代表性化合物进行了测试， 而且发现这些化合物 展现出期望的活性。
组合治疗
如上所述， 本申请所述化合物与常规抗生素的联用可以是优选的， 而且构成本发 明的一部分。抗生素的例子包括青霉素类 (Penicillins)、 青霉素 G(Penicillin G)、 苯 氧基甲基青霉素 (Phenoxymethyl-penicillin)、 氟氯西林 (Flucloxacillin)、 阿莫西林 (Amoxycillin)、 甲硝唑 (Metronidazole)、 头孢呋辛 (Cefuroxime)、 力百汀 (Augmentin)、 匹美西林 (Pivmecillinam)、 醋霉素 (Acetomycin)、 环丙沙星 (Ciprofloxacin) 和红霉素 (Erythromycin)。当提到这些具体的抗生素时， 应当理解的是， 可使用通常可得的类似物。
如所附实施例 ( 参见实施例 4-6) 中所示， 发现当本发明化合物与维生素 D 一起给 药时实现了组合效应。因此， 本发明还涵盖上述方法， 其还包括将维生素 D 与本发明的一种 或多种化合物共给药。可共给药的其它化合物包括氨基甾醇类化合物 ； 异亮氨酸或其活性 异构体或类似物 ； 和维生素 D 类化合物。
本申请还提供药物组合物， 其除本发明的一种或多种化合物外还包含维生素 D 或 其它上述化合物之一作为额外成分。可将此类组合物配制成上述制剂和剂型中的任意一 种。
如下文所述， 口服剂型是优选的。
优选的剂量
在本发明方法和组合物中， 活性化合物以有效刺激和 / 或活化所述系统的量来给 药 / 存在。上述量在本申请中也称作 “促分泌有效量” ， 其中术语促分泌指物质提高活性抗 微生物肽在上皮表面中的水平。
如上所述， 先前出售的 PBA 用于治疗与遗传性尿素循环障碍有关的高氨血症。依 照 Buphenyl( 片剂或粉剂 ) 的 SPC， 所述药物以分成三份的 9.9-13.0g/m2/ 天来给药。这总 计 16-23g/ 天或约 5.5-8.0g 三次 / 天。
在不同的研究中， 多项研究中使用的 PBA 的局部剂量为 528mg/ 天至 1.12g/ 天， 这 相当于正常每天结肠内丁酸盐 / 酯生成的 35-60％。这些研究无一报告任何不良效应或反 应。依照一项研究， 在 IBD 患者中历时 6 周给予呈结肠靶向片剂形式的每天口服剂量为 4g 的丁酸钠， 而且同样发现是安全且良好耐受的， 而没有任何不良效应。
在 Dhaka 的 ICDDRB 进行的家兔研究 ( 参见下文 ) 显示给药约 7.5-22.5mg/kg 足以在志贺氏菌病中实现治疗效果。将该剂量放大至体重为 70kg 的人提示最大 720mg 日剂 量可有效地治疗例如志贺氏菌病。
基于这些例子而应该领会的是， 治疗的实际上限可以是量级为 20g/ 天 ( 基于尿素 循环治疗 )， 且可预期下限低于 700mg， 例如等于或接近 600、 500、 400、 300、 200、 100mg/ 天。 潜在地， 可使用甚至更低的量， 例如 90、 80、 70、 60、 50、 40、 30、 20、 10、 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3、 2或 1mg。
然而应该理解的是， 待给药的化合物的合适量可随所选择的具体化合物、 感染的 具体位置和待治疗和 / 或待预防的病症而变化。在一些实施方案中， 待给药的量可为约 10μg 至约 25g。可相应地选择和配制合适的剂型。例如， 为了治疗胃肠系统中的疾病和病 症， 250μg 至约 25g 的剂量可以是合适的， 包括约 1g 至约 25g， 例如约 1g 至 10g， 诸如约 1g、 2g、 5g 或 10g。
所有剂量可以分拆， 或例如以每天 1、 2 或 3 次来给予。
给药和制剂
优选的是， 口服给药药物， 但其它给药途径也在本发明的范围内， 而且可能更适于 某些病症。此类其它给药途径包括局部、 含服、 经鼻、 胃肠外 ( 包括直肠和阴道 ) 给药。
吸入剂包括气雾剂、 吸入器和计量剂量吸入器。眼用剂型包括滴眼剂 ( 溶液剂或 混悬剂 )、 眼用凝胶剂和眼用软膏剂。耳用剂型包括滴耳剂 ( 溶液剂或混悬剂 )。直肠剂型 包括灌肠剂和栓剂。阴道剂型包括灌洗剂、 阴道栓剂和阴道片剂。
适于局部使用的制剂的例子包括乳膏剂、 软膏剂、 凝胶剂、 水性或油性溶液剂或水 性或油性混悬剂。胃肠外给药可例如通过将化合物配制成无菌水性或油性溶液剂 ( 用于静 脉内、 皮下或肌内给药 ) 或栓剂 ( 用于直肠给药 ) 来实现。
用于口服使用的组合物可呈硬明胶胶囊剂的形式， 其中将活性成分与惰性固体稀 释剂 ( 例如碳酸钙、 磷酸钙或高岭土 ) 混合， 或可呈软明胶胶囊剂的形式， 其中将活性成分 与水或油 ( 诸如花生油、 液体石蜡或橄榄油 ) 混合。
可将组合物配制成各种合适的形式， 这取决于它们主要针对哪些病症。在某些实 施方案中， 所述组合物用于口服给药。 此类组合物包括但不限于片剂、 胶囊剂、 溶液剂、 混悬 剂、 粉剂、 糊剂、 酏剂或糖浆剂。
组合物可以是延迟释放组合物或结肠靶向组合物， 如本领域所公知。
适于片剂的药用赋形剂包括例如惰性稀释剂， 诸如乳糖、 碳酸钠、 磷酸钙或碳酸 钙； 制粒剂和崩解剂， 诸如玉米淀粉或海藻酸 ； 粘合剂， 诸如淀粉 ； 润滑剂， 诸如硬脂酸镁、 硬脂酸或滑石 ； 防腐剂， 诸如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸丙酯 ； 及抗氧化剂， 诸如抗 坏血酸。片剂可以是无包衣的， 或是有包衣的以改变它们的崩解和活性成分随后在胃肠道 中的吸收或提高它们的稳定性和 / 或外观， 在任一情况下使用本领域公知的常规包衣剂和 规程。
组合物
本发明的另一方面涉及用于治疗、 预防或抵抗任意上述病症或疾病的药物组合 物。所述组合物包含至少一种本申请所述的化合物及至少一种药用赋形剂。
本发明的口服组合物可被配制成用于延迟释放和 / 或延长释放， 而且可通过本领 域技术人员公知的手段来包衣肠溶衣以在肠道下段释放。功能性食物
还应该领会的是， 特别是当期望给药大量活性化合物 ( 诸如 1-25g) 时， 可将本发 明化合物 ( 分离且然后 ) 配制和包含在功能性食物或饲料产品中。此类功能性食物产品 包括但不限于发酵食物产品， 包括发酵豆类产品例如大豆产品诸如豆豉、 来自发酵燕麦、 发 芽大麦和相似产品的产品。此类产品 ( 一般通过分解 β- 聚糖的微生物发酵来生产 ) 将具 有能加强本发明化合物效果的天然内容物即短链脂肪酸。本发明功能性食物产品的形式 可以是适于所选食物类型的任意形式， 包括饼干、 糕点、 涂抹物、 膏状物、 泥状物、 冻状物、 酸 奶、 饮料浓缩物或任意其它合适的食物产品 ( 可将所选活性化合物容易地配制到所述产品 中 )。
其它物种
本发明方法和组合物可用于治疗人及其它动物 [ 包括伴侣动物、 农场动物和牧场 动物的兽医应用和动物管理应用 ]。这些应用包括但不限于在犬、 猫、 牛、 马、 鹿和家禽 ( 包 括鸡、 火鸡、 鸭、 鹅 ) 中及在家庭宠物 ( 诸如鸟类和啮齿类 ) 中治疗、 预防或抵抗疾病和病 症。对于大型动物， 合适的剂量可大于上文提到的量。
本申请包括的任意小标题仅是出于方便目的， 而不应该被解释为以任意方式限制 所公开的内容。
现将通过参照下述非限制性附图和实施例来进一步描述本发明。 根据这些附图和 实施例， 本领域技术人员会想到本发明的其它实施方案。
通过交叉引用将本申请引用的所有参考文献的公开内容明确地并入本申请， 这是 因为本领域技术人员当实施本发明时可能要用到这些公开内容。 附图说明 图1 ： 用本发明的不同药物处理后， 肺上皮细胞 (VA10) 中 CAMP mRNA( 编码 LL-37) 水平的诱导倍数。柱 c 表示对照 ( 未处理的细胞 )， 柱 3 表示阳性对照即用维生素 D3(1， 25- 二羟基维生素 D3 或 1， 25(OH)2D3) 处理的细胞， 柱 1 是用丁酸钠处理的细胞， 且柱 2 是用 4- 苯基丁酸钠处理的细胞。用 4- 苯基丁酸钠和维生素 D 刺激后 24 小时， 收获细胞， 并分离 mRNA。实时逆转录 PCR 结果显示出人 cathelicidin 基因的表达如何受到 4- 苯基丁酸钠和 维生素 D 处理的影响。
图2： 丁酸盐 (BA) 和 PBA 衍生物对 CAMP mRNA 表达的诱导。A) 所用化学品丁酸盐 (BA)4mM、 4- 苯基丁酸盐 (PBA)4mM、 α- 甲基氢化肉桂酸盐 (ST7)4mM 和 2， 2- 二甲基 - 丁酸 盐 (ST20)4mM 的结构。B) 所示化学品历时 24 小时对 CAMP mRNA 表达的诱导。
图3： PBA 对 CAMP 基因 mRNA 表达的诱导。A)VA10 细胞用所示浓度的 PBA 或溶剂 ( 对照 ) 刺激 24 小时。B)VA10 细胞用 4mM PBA 刺激或单独用溶剂处理， 并在所示时段后 收获。C)A498、 HT-29 和 U937 细胞用 4mM PBA 刺激或仅用溶剂刺激， 并在所示时段后收获。 CAMP mRNA 水平通过实时 RT-PCR 来确定。各样品相对于总 RNA 输入来归一化。结果相对于 对照样品中的表达来归一化， 其中给予对照以任意值 1。以来自至少三次独立实验的均值 +SE 对经归一化的数据进行绘图。
图4： 维生素 D 和 4- 苯基丁酸钠刺激对肺上皮 VA10 细胞中 CAMP mRNA 表达的组 合效应， 如上文就图 1 所述来确定。各柱如下 ： C ＝对照 ； 1 ＝单独的 4- 苯基丁酸钠 ； 2 ＝单
独的维生素 D ； 3 ＝用 4- 苯基丁酸钠与维生素 D 一起处理。
图5： 进一步证明 PBA(4mM) 和 1， 25(OH)2D3(20nM) 对 CAMP mRNA 和 pro-LL-37 表 达的协同诱导。A)VA10 细胞用 PBA(4mM)、 1， 25(OH)2D3(20nM) 或溶剂 ( 对照 ) 刺激 24 小时。 CAMP mRNA 水平通过实时 RT-PCR 来确定。各样品相对于总 RNA 输入来归一化。结果相对于 对照样品中的表达来归一化， 其中给予对照以任意值 1。 以来自三次独立实验的均值 +SE 对 经归一化的数据进行绘图。观察到的差异是显著的 (P ＜ 0.05)。B)VA10 细胞用 PBA(4mM)、 1， 25(OH)2D3(20nM) 或溶剂 ( 对照 ) 刺激 24 小时。总细胞溶胞物和上清液通过 Western 印 迹针对 LL-37 来分析。显示了三幅图中有代表性的一幅图。
图 6A ： 4- 苯基丁酸钠和维生素 D 对编码 LL-37 的基因的诱导受到抑制 MEK/ERK 激 酶途径的抑制剂 U0126 的影响。C ＝对照 ； 1 ＝单独的 4- 苯基丁酸钠 ； 2 ＝单独的维生素 D。 空心柱表示有抑制剂 U0126 的处理。黑色柱表示无所述抑制剂的处理。该图表明信号传导 途径受到维生素 D 和苯基丁酸盐的不同影响。
图 6B ： 如图中所示进一步证明 MAP 激酶抑制剂对 PBA 诱导的 CAMP 基因表达的抑 制， 在有或无 20μM 所示抑制剂的情况下用 4mM PBA 处理 VA10 细胞。CAMP mRNA 水平通过 实时 RT-PCR 来确定。各样品相对于总 RNA 输入来归一化。结果相对于对照样品中的表达 来归一化， 其中给予对照以任意值 1。 以来自三次独立实验的均值 +SE 对经归一化的数据进 行绘图。* ： P ＜ 0.05 ； ** ： P ＜ 0.01 ； *** ： P ＜ 0.001。 图7： 免疫组织化学， 其显示 CAP-18(LL-37 的家兔同系物 ) 表达在健康家兔的表 面上皮细胞中， 志贺氏菌感染导致所述肽下调， 而且此下调能通过口服摄入三丁酰基甘油 来抵消。
图8： 环己酰亚胺对 PBA 诱导的 CAMP 基因表达的抑制显示翻译是必需的。在有或 无 20μg/ml 环己酰亚胺的情况下用 4mM PBA 或丁酸盐 (BA) 处理 VA10 细胞。CAMP mRNA 水 平通过实时 RT-PCR 来确定。 各样品相对于总 RNA 输入来归一化。 结果相对于对照样品 ( 溶 剂 ) 中的表达来归一化， 其中给予对照以任意值 1。 以来自至少三次独立实验的均值 + 所述 均值的标准偏差对经归一化的数据进行绘图。* ： p ＜ 0.05 ； ** ： p ＜ 0.01 ； *** ： p ＜ 0.001。
图9： VA10 细胞用 4mM PBA 或单独用溶剂 ( 对照 ) 刺激 24 小时。组蛋白 H3 和 H4 的乙酰化通过定量 ChIP 使用针对相应乙酰化组蛋白的抗体来分析。结果相对于正常家兔 IgG 和总输入来归一化， 并以有关 IgG 的沉淀倍数绘图。以来自独立实验 (n ＝ 3) 的均值 +SE 对经归一化的数据进行绘图。没有观察到组蛋白乙酰化的显著差异。
图 10 ： PBA 诱导的表达不涉及 VDR 的共活化物。VA10 细胞用 4mM PBA 或单独用溶 剂 ( 对照 ) 刺激 24 小时。相应 VDR 共活化物的 mRNA 水平通过实时 RT-PCR 来确定。将各 样品相对于总 RNA 输入归一化。各样品相对于总 RNA 输入来归一化。结果相对于对照样品 中的表达来归一化， 其中给予对照以任意值 1。数据相对于对照来归一化， 且以来自三次独 立实验的均值 +SE 对数据进行绘图。
图 11 ： PBA 对 hBD-1mRNA 表达的诱导。 VA10 细胞用 4mM PBA 或单独用溶剂 ( 对照 ) 刺激 24 小时。hBD-1mRNA 水平通过实时 RT-PCR 来确定， 显示了 CAMP 诱导以供比较。各样 品相对于总 RNA 输入来归一化。结果相对于对照样品中的表达来归一化， 其中给予对照以 任意值 1。 数据相对于对照来归一化， 且以来自至少三次独立实验的均值 +SE 对数据进行绘 图。
图 12 ： 示意性地显示了所提出的 PBA 处理在被志贺氏菌感染的上皮中的作用机制。 实施例 实施例 1 ： LL-37 在用不同药物处理的肺上皮细胞中的表达
将肺上皮细胞 (VA10) 在标准条件下培养至汇合， 并以所示浓度 ( 参见下文 ) 加入 待测药物。处理后 24 小时分离 mRNA， 并通过实时逆转录 PCR 来测量。
结果显示于图 1， 其中柱 C 表示对照 ( 未处理的细胞 )， 柱 3 表示阳性对照即用维生 素 D3(1， 25- 二羟基维生素 D3 或 1， 25(OH)2D3)(100nM) 处理的细胞， 柱 1 是用丁酸钠 (2mM) 处理的细胞， 且柱 2 是用 4- 苯基丁酸钠 (2mM) 处理的细胞。
结 果 显 示， 4- 苯 基 丁 酸 钠 在 VA10 细 胞 中 是 比 丁 酸 盐 或 维 生 素 D 更 有 效 的 LL-37mRNA 表达诱导剂， 但不具有与丁酸盐有关的气味。在本发明人的研究之前， 不知道有 化合物能以与丁酸盐相同的程度诱导 LL-37 而没有气味和味道问题。特别令人惊讶的是， 相对于丁酸盐 / 酯结构的偏差可以是实质性的， 诸如加入芳香族环 ( 即分子量加倍 )。因 此， 根据本申请可得出的结论是， 丁酸盐 / 酯衍生物 ( 诸如芳香族衍生物 ) 也将具有活性。
在另一项实验中， 测试了另外两种 PBA 类似物诱导 CAMP 基因表达的能力 ( 参见图 2)。 VA10 细胞用 4mMα- 甲基氢化肉桂酸盐 (ST7)( 一种 PBA 类似物 ) 或 2， 2- 二甲基丁酸盐 (ST20)( 一种丁酸盐类似物 ) 刺激。温育 24 小时后， 从细胞中分离总 RNA， 且 CAMP mRNA 表 达水平通过实时 RT-PCR 来分析。ST7 显著提高 CAMP mRNA 表达， 而 ST20 刺激对 CAMP mRNA 表达水平没有明显影响。因此， 可以看出， 季碳原子 ( 至少与羧基相邻的季碳原子 ) 看来应 该是不想要的。 相反地， 在芳基丁酸盐衍生物中， 看来包括不同链或支链的类似物仍具有活 性。
实时 PCR
6 孔板用 1.0×106 细胞 / 孔接种并培养 2 天。 然后更换培养基， 且不同的孔分别不 处理、 补充有 2mM 丁酸钠或补充有 2mM 4- 苯基丁酸钠。将细胞温育 48 小时， 并使用 RNEasy 试剂盒 (Qiagen) 来制备总 RNA。 使用 Quant-iTRiboGreen RNA 测定试剂盒 (Invitrogen) 来 测量总 RNA 浓度。 Superscript III 第一条链合成系统 (Invitrogen) 使用随机引物依照制 造商方案而用于合成 cDNA。在 7500 实时 PCR 系统 (Applied Biosystems) 上使用荧光探针 ( 具有 MGB 淬灭剂的 5’ -6-FAM-TGTTATCCTTATCACAACTGAT-3’ ) 及对 CAMP cDNA 具有特异性 的正向和反向引物 ( 分别为 5 ‘-ACCCAGCAGGGCAAATCTC-3 ‘和 5 ‘-GAAGGACGGGCTGGTGAAG-3 ‘) 来分析编码 LL-37 的 CAMP 基因的表达。结果相对于总 RNA 量来归一化， 且表达为相对于未 处理的对照细胞的诱导倍数。
实施例 2 ： 用不同剂量的 4- 苯基丁酸钠处理的肺上皮细胞中的 LL-37 表达
图 3 显示了用浓度渐增的 4- 苯基丁酸钠处理后 VA10 肺上皮细胞中的 CAMP mRNA 表达的剂量 - 响应。为了确定 PBA 诱导的 CAMP mRNA 表达的时间和剂量依赖性， VA10 细胞 在不同的时间点用 4mM PBA 刺激， 和 VA10 细胞用不同浓度的 PBA 刺激 24 小时。从细胞中 分离总 RNA， 且 CAMP mRNA 表达水平通过实时 RT-PCR 来分析。CAMP mRNA 表达的提高依赖 于 PBA 剂量， 而且随时间而提高。
在较早的实验中， 似乎在与生理学无关的较高浓度 (8mM)， 响应不再是剂量依赖性
的 ( 结果未显示 )。
在较早的实验 ( 其中在有关时间点没有测量对照 ) 中， 在长时间温育后观察到假 象 (48 小时 ； 结果未显示 )。因此， 在所示实验中， 在有关时间点对对照进行测量， 并归一化 为 1。
本实施例表明每天一次的给药方案能实现成功的治疗。
实施例 3 ： PBA 在其它细胞系中对 CAMP 基因表达的诱导
为了研究 PBA 对其它细胞系的影响， HT-29( 人结肠腺癌细胞系 )、 A497( 人肾癌细 胞系 ) 和 U937( 人白血病性单核细胞淋巴瘤细胞系 ) 用 4mM PBA 刺激 8、 24 和 48 小时。从 细胞中分离总 RNA， 且 CAMP mRNA 表达水平通过实时 RT-PCR 来分析。CAMP mRNA 表达在所 有测试细胞系中是显著提高的 ( 图 3C)。
实施例 4 ： 4- 苯基丁酸钠和维生素 D 对肺上皮细胞中 LL-37 表达的协同效应
另一项测试显示 4- 苯基丁酸钠和维生素 D 对 CAMP mRNA 表达具有组合效应。如 上所述培养 VA10 肺上皮细胞， 并用单独的 4- 苯基丁酸钠 (2mM) 处理、 用单独的维生素 D(100nM) 处理或用 4- 苯基丁酸钠和维生素 D( 分别为 2mM 和 100nM) 一起处理。作为对照 包括用丁酸盐 (2mM) 进行的处理。在不同的时间点收获细胞， 并分离 mRNA， 用实时逆转录 PCR 进行分析。用 4- 苯基丁酸钠和维生素 D 二者进行的处理清楚地显示出对 mRNA 表达水 平的组合效应， 这是因为组合的效应比任一单独的化学品高 6 倍。
在图 4 中， 柱 c 表示对照 ( 未处理的细胞 ) 中的 CAMP mRNA 水平， 柱 1 表示用单独 的 4- 苯基丁酸钠进行的处理， 柱 2 表示用单独的维生素 D 进行的处理， 且柱 3 表示用 4- 苯 基丁酸钠与维生素 D 一起进行的处理。
这进一步显示于图 5A 和 5B。 将 VA10 细胞与低剂量的 20nM 1， 25(OH)2D3 和 4mM PBA 一起温育及分别与单独的化合物一起温育。 发现 CAMP mRNA 的表达高于 PBA 和 1， 25(OH)2D3 的诱导倍数之和， 这表明协同效应 ( 图 5)。
实施例 5 ： 4- 苯基丁酸钠和维生素 D 所致的刺激经由不同的信号传导途径来发挥 作用
肺上皮细胞用 4- 苯基丁酸钠或维生素 D 处理。对于每种药物， 处理两份样品， 在 特异性抑制 MEK1 和 MEK2 蛋白质激酶的 MAP 激酶抑制剂 U0126( 浓度为 20μM) 存在和不存 在的情况下。
结果显示于图 6A， 其中柱 C 表示对照 ( 未处理的细胞 )， 柱 1 表示用 4- 苯基丁酸 钠 (2mM) 进行的处理， 且柱 2 表示用维生素 D(100nM) 进行的处理 ( 历时 24 小时 )。空心柱 表示有 MAP 激酶抑制剂 U0126 的处理， 而黑色柱表示无所述抑制剂的处理。
所示结果表明 4- 苯基丁酸钠和维生素 D 所致的诱导涉及不同的信号传导途径 ； 这 可解释所述化学品诱导 CAMP 基因的组合效应。
还研究了 c-Jun N 端激酶 (JNK) 抑制剂、 p38 激酶抑制剂和胞外信号调节激酶 1/2(ERK1/2) 抑制剂对 PBA 诱导的 CAMP 基因表达的影响， 如图 6B 所示。在用 4mM PBA 刺激 之前 1 小时， 将 VA10 细胞与 20μM SP600125、 SB203580 或 U0126 一起预温育以抑制相应的 激酶。温育 24 小时后， 分离总 RNA， 并通过实时 RT-PCR 来分析 CAMP mRNA。ERK1/2 途径的 抑制剂和 JNK 途径的抑制剂显著降低 PBA 诱导的 CAMP 基因表达。
实施例 6 ： 用三丁酸甘油酯处理被志贺氏菌感染的家兔已通过免疫组织化学证实的是， CAP-18(LL-37 的家兔同系物 ) 在健康家兔的表面 上皮细胞中表达 ( 图 7A)， 而且志贺氏菌感染导致肽生成下调 ( 图 7B)。此外， 用三丁酰基 甘油处理后， 志贺氏菌所致的基因表达下调得以恢复和 / 或阻止 ( 图 7C)。
动物模型 ： 所述研究使用任一性别的重 1.8-2kg 的近交新西兰白色家兔。将动物 单独笼养在维持于 22-25℃的房间中。在收入研究之前， 通过体格检查、 粪便和直肠拭样标 本培养及粪便寄生虫检查来确定家兔的健康状态。对没有球虫也没有肠病原体 ( 例如沙门 氏菌、 志贺氏菌、 霍乱弧菌 (Vibrio cholera)) 的健康家兔进行研究。家兔用志贺氏菌感 染， 并分成两组， 一组用三丁酸甘油酯口服处理， 另一组用盐水口服处理。 在健康家兔中、 在 未处理的感染家兔中、 在用三丁酸甘油酯处理的感染健康家兔中分析 CAP-18 肽及其原形 (proform) 在结肠和直肠组织标本中的表达。 为了分析三丁酸甘油酯的毒性效应， 还用该化 合物处理健康家兔。
细菌菌株和接种物制备 ： 从 患 者 的 粪 便 中 分 离 弗 氏 志 贺 氏 菌 (Shigella flexneri)2a 菌株。所述菌株就 Serény 测试和刚果红结合而言呈阳性， 这反映出侵入性 (Berkhoff， H.A. 和 Vinal， A.C.， 1986， Avian Dis.30， 117-121)。自该原种在胰酶解酪蛋白 大豆琼脂 (TSA ； Becton Dickinson， Sparks， MD) 板上传代培养细菌， 并于 37℃培养过夜。 在 胰酶解酪蛋白大豆肉汤中接种 3-5 个平滑菌落， 并于 37℃摇动培养 4 小时。然后在生理盐 水中以 7000rpm 洗涤肉汤 10 分钟， 并在生理盐水中悬浮细菌团粒至浓度为 1×109cfu/7mL， 将其给予家兔。
该研究使用志贺氏菌病的非手术家兔模型， 如先前所述但稍有改动 (Etheridge， M.E.et al.， 1996， Lab.Anim.Sci.46， 61-66)。 简言之， 将家兔禁食 36 小时， 并给予单剂口服 的盐酸四环素 (250mg/kg ； Novartis， Dhaka， Bangladesh) 悬浮液。然后家兔用戊巴比妥钠 (33mg/kg ； Sigma， Chemical Co， St Louis， MO) 麻醉， 并经由耳缘静脉静脉内给予 37.5mg/ kg 体重的 G- 西咪替丁 (Gonoshasthoya Pharmaceuticals， Dhaka， Bangladesh) 以抑制胃分 泌。 15 分钟后， 用无菌塑料饲管 (3.33×465mm， Tycohealthcare Ireland Ltd.， Tullamore， Ireland) 口服给予 7ml 5％碳酸氢钠溶液， 15 分钟后给予第二剂 15ml 5％碳酸氢钠溶液， 9 此后立即给予一剂 7ml 细菌悬浮液 (10 cfu/7ml 生理盐水 (0.9％ w/v， pH7.2))。接种细菌 悬浮液后 20 分钟， 口服导入 7ml 盐酸洛哌丁胺 (0.02mg/kg 体重 ) 在生理盐水中的溶液以 降低肠能动性。然后容许家兔食用和饮用常规食物。通常， 家兔在细菌接种后 24 小时内形 成痢疾。将细菌接种时间视为 0 小时。形成痢疾症状后， 通过口胃饲管给予家兔以三丁酸 甘油酯 (47μmol/kg 体重即 140μmol 丁酸盐当量 /kg)， 每天两次， 间隔 12 小时， 持续 3 天。 细菌接种后 4 天， 给予家兔以过量的静脉内戊巴比妥钠 (66mg/kg ； Sigma) 以安乐死。
为 了 评 估 CAP-18 肽 的 存 在， 使 用 对 CAP-18 具 有 特 异 性 的 鸡 多 克 隆 抗 体 (Innovagen) 来进行免疫组织化学染色。简言之， 将石蜡切片去石蜡， 水合， 且在修复缓冲 液 (Dako laboratories A/S， Glostrup， Denmark) 中微波处理 12 分钟， 接着在磷酸盐缓冲 液 (pH 7.2) 中洗涤。冷却后， 淬灭内源性过氧化物酶活性， 并将切片与 CAP-18 特异性抗体 (2μg/ml) 一起于室温温育过夜。洗涤后， 将切片与偶联有辣根过氧化物酶的驴抗鸡抗体 (1 ∶ 200 ； Jackson ImmunoResearch Laboratories， Inc.) 一起于室温温育 1 小时。然后 洗涤， 并用二氨基联苯胺 (DAB， 褐色 ) 进行显色。作为对照， 用无关的同种型匹配抗体代替 特异性抗体。另外， 将合成的 CAP-18 以高 10 倍的浓度与 CAP-18 抗体一起于 4℃温育过夜，并将混合物如上所述用于免疫染色。这充当特异性染色的对照。在苏木精和曙红中复染色 后， 将载玻片在 Paramount(BDH Chemicals， Poole， England) 中封固。
通过粪便中血的消失、 成形粪便的再现、 体重和体温的正常化、 正常食欲和好动活 动度的恢复表明家兔从志贺氏菌病中的临床恢复。
实施例 7 ： 环己酰亚胺对 PBS 诱导的 CAMP 基因表达的抑制
为了评估 CAMP 基因表达的 PBA 和丁酸盐诱导途径是否是直接的， VA10 细胞在有和 无环己酰亚胺 (CHX) 的情况下用 PBA 或丁酸盐处理。诱导 24 小时后， 分离总 RNA， 且 CAMP mRNA 水平使用实时 RT-PCR 来测量。在刺激之前将细胞与 20μg/ml CHX 一起预温育 1 小 时， 这有效地阻断了 PBA 和丁酸盐二者诱导的 CAMP 基因表达。
这提示 PBA 诱导的 CAMP 基因表达是经由继发效应来诱导的。此继发诱导途径可 能依赖于经由 JNK 和 ERK1/2 的 MAP 激酶信号传导， 如 VA10( 一种支气管上皮细胞系 ) 中所 显示 ( 参见图 6A 和 6B)。
实施例 8 ： PBA 对 CAMP 基因启动子处组蛋白乙酰化的影响
PBA 对组蛋白 H3 和 H4 乙酰化的影响通过定量染色质免疫沉淀来评估。 用 4mM PBA 处理 24 小时后， 在 CAMP 基因近端启动子 ( 转录起始位点上游 1000bp) 处观察不到组蛋白 乙酰化的显著变化 ( 图 9)。
早前假设的是， 组蛋白脱乙酰基酶抑制剂对 CAMP 基因表达的诱导经由组蛋白乙 酰化的提高和染色质结构的松弛而发生， 这促进了其它转录因子的结合。当前数据反对这 种假设。使用定量染色质免疫沉淀来评估 CAMP 近端启动子处的 H3 和 H4 乙酰化， 在用 PBA 处理后可检测到乙酰化的显著变化。此外， 先前显示的是 ( 参见实施例 7)， 使用环己酰亚 胺来抑制蛋白质合成， 这阻断了丁酸盐和 PBA 二者诱导的 CAMP 基因表达。这些结果排除了 这些化合物对 CAMP 近端启动子处组蛋白乙酰化的提高直接促进 CAMP 基因表达。不期望受 限于理论， 认为组蛋白乙酰化的提高促进了其它基因表达， 然后所述其它基因表达提高了 CAMP 基因表达作为继发效应。
实施例 9 ： PBA 对维生素 D 共活化物表达的影响
假设 PBA 和 1， 25(OH)2D3 之间的协同效应是由于 PBA 对 VDR 共活化物基因的诱导， 本发明人分析了 PBA 对 VA10 中数种已知 VDR 共活化物基因的 mRNA 水平的影响。无一基因 在用 4mM PBA 处理 24 小时后显著上调 ( 参见图 10)。因此， 这些共活化物不参与 PBA 诱导 的对基因表达的影响。
实施例 10 ： PBA 对 hBD-1mRNA 表达的诱导
CAMP 不是 PBA 诱导的唯一抗微生物防御基因。另一种公知的肽也被诱导， 只是水 平低于 CAMP( 参见图 11)。这提示 PBA 对粘膜防御具有广泛效应。
实施例 11 ： 三丁酸甘油酯的合成
在 0℃历时 10 分钟将丁酸酐 (164ml， 1.0mol) 加到甘油 (7.34ml， 100mmol) 在吡啶 (300ml) 中的溶液。将混合物于 0℃搅拌 10 分钟， 并于室温搅拌 18 小时。加入水 (200ml)， 并将混合物于 60 ℃加热 15 分钟。蒸发溶剂， 将所得残留物在二氯甲烷 (DCM， 400ml) 和 NaHCO3(20％水溶液， 400ml) 之间分配。水层用 DCM(50ml) 进一步萃取。合并的有机萃取物 首先用饱和 NaHCO3 水溶液 (400ml) 洗涤， 然后用 HCl(1M 水溶液， 400ml) 洗涤。 收集有机层， 1 并用 Na2SO4 干燥， 然后真空浓缩， 得到 29.6g(98％ ) 三丁酸甘油酯。H NMR(CDCl3)， 0.95(t ；J ＝ 7.4Hz ； 2×CH3)， 0.96(t ； J ＝ 7.4Hz ； CH3)， 1.60-1.73(m ； 3×CH2)， 2.31(t ； J ＝ 7.4Hz ； 2×CH2)， 2.32(t ； J ＝ 7.35Hz ； CH2)， 4.16(dd+AB ； J ＝ 11.9， 6.0Hz ； 2×CHa)， 4.31(dd+AB ； J ＝ 11.9， 4.3Hz ； 2×CHb)， 5.29(m ； 5.26-5.31 ； CH)。
实施例 12 ： N- 丁酰基甘氨酸乙酯的合成
将甘氨酸乙酯盐酸盐 (13.96g， 100mmol) 和三乙胺 (34.65ml， 250mmol) 在二氯甲 烷 (DCM， 500ml) 中的溶液于室温搅拌 2 小时， 这产生细微白色沉淀物。历时 5 分钟加入丁 酸酐 (19.63ml， 120mmol) 在 DCM(100ml) 中的溶液， 且反应混合物变成透明溶液。在室温 保持 30 分钟且接着除去溶剂 ( 真空 ) 后， 加入水 (18ml， 1mol)， 接着加入吡啶 (23.73g， 24.26ml， 300mmol)。将溶液于 60℃加热 30 分钟。将混合物在 DCM(200ml) 和 HCl 水溶液 (2.4M， 200ml， 用 NaCl 饱和 ) 之间分配。分离水层， 并用 DCM(50ml) 萃取。合并的有机萃取 物用 HCl( 水溶液， 1M， 250ml) 洗涤， 且水层用另一份 DCM(50ml) 萃取。合并的有机萃取物 用 NaHCO3( 水溶液， 4.2 ％， 200ml) 洗涤， 且水层再用 DCM(50ml) 萃取一次。合并的有机萃 取物用 Na2SO4 干燥， 并真空浓缩， 得到 16.3g(94％ )N- 丁酰基甘氨酸乙酯。1H NMR(CDCl3)， 0.97(t ； J ＝ 7.4Hz ； CH3)， 1.30(t ； J ＝ 7.1Hz ； CH3)， 1.65-1.74(m ； CH2)， 2.23(t ； J ＝ 7.5Hz ； CH2)， 4.05(d ； 4.9Hz ； CH2)， 4.23(q ； 7.2Hz ； CH3)， 5.9( 宽峰 ； NH)。 实施例 13 ： N- 丁酰基甘氨酸的合成
将 N- 丁 酰 基 甘 氨 酸 乙 酯 (16.3g， 94.16mmol) 溶 解 在 NaOH 水 溶 液 (1M， 282ml， 282mmol) 中， 然后于室温搅拌 15 小时。加入 HCl 水溶液 (12M， 15.7ml， 188mmol) 至 pH ＝ 5。然后蒸发水 ( 真空 )， 并将残留物溶解在 HCl 水溶液 (1M， 175ml) 中， 由此得到 pH 为 1。 溶液用 NaCl 饱和， 并用四氢呋喃 (3×100ml) 萃取。合并的有机萃取物用 Na2SO4 干燥， 并 1 真空蒸发， 得到 13g(95 ％ )N- 丁酰基甘氨酸。 H NMR(CDCl3)， 0.97(t ； J ＝ 7.4Hz ； CH3)， 1.64-1.74(m ； CH2)， 2.27(t ； J ＝ 7.5Hz ； CH2)， 4.09(d ； J ＝ 5.1Hz ； CH2)， 6.24( 宽 峰 ； NH)， 8.1( 宽峰 ； COOH)。
实施例 14 ： Nα， Nε- 二丁酰基赖氨酸的合成
将赖氨酸 (1g， 6.1mmol) 溶解在 160ml 四氢呋喃 (THF)- 水 (1 ∶ 1) 中， 然后加入 丁酸酐 (2.89g， 18.3mmol)。在室温对溶液进行搅拌， 1 小时后加入 80ml THF， 并在静置过 夜后加入碳酸钠十水合物 (5.23g， 18.3mmol)。将该混合物搅拌约 30 分钟后， 加入另一份 丁酸酐 (2.89g， 18.3mmol)， 并再次将混合物搅拌过夜。混合物用氯化钠饱和， 并用浓 HCl 酸化 ( 至 pH 为约 1)。分离上层， 并蒸发溶剂。向残留物中加入 400ml 0.125M NaOH( 水 溶液 ) 和 100ml THF。约 15 分钟后， 蒸发 THF， 且溶液用氯仿 (2×200ml) 洗涤。然后水相 用 7ml 浓 HCl( 水溶液 ) 酸化， 并用氯仿 - 甲醇 (4 ∶ 1， 2×250ml) 萃取。有机相用硫酸钠 干燥， 过滤， 并减压浓缩。剩余的丁酸如下除去 ： 反复对所加入的甲酸 - 水 (3 ∶ 1) 进行减 1 0.92-0.98(m， 6H ； 2×CH3)， 1.3-1.48(m， 压蒸发， 得到 1.32g(79 ％ ) 产物。 H NMR(CDCl3)， 2H ； CH 2) ， 1.54(qv ， 2H ， J ＝ 6.8Hz ； CH2) ， 1.62-1.70(m ， 4H ； 2×CH2) ， 1.75-1.83(m ， 2H ； CH2)， 1.85-1.95(m， 2H ； CH2)， 2.18(t， 2H， J ＝ 7.3Hz ； CH2)， 2.25(t， 2H， J ＝ 6.2Hz ； CH2)， 3.17-3.22(m， 1H ； ε-CH2a)， 3.31-3.37(m， 1H ； ε-CH2b)， 4.52-4.58(m， 1H ； αCH)， 6.08(bs， 1H ； ε-NH)， 6.86(d， 1H， J ＝ 7.3Hz ； α-NH)。
实施例 15 ： 证明丁酸盐 / 酯类化合物在人传染性结肠炎 ( 志贺氏菌病 ) 中的有效 性
下述试验用丁酸钠灌肠剂进行， 但可相应地使用口服给药的 PBA 来进行。
对群体的要求
丁酸钠灌肠剂已应用于炎性肠病， 包括溃疡性结肠炎、 改道性结肠炎、 克罗恩氏 病， 但从未应用于传染性结肠炎。
已选择患有志贺氏菌病的成年患者来评估在传染性结肠炎中的效能， 这稍后可在 儿童中进行。
丁酸盐灌肠剂胜过口服片剂的选择
有大量证据显示在患有炎性肠病 (IBD) 的成年患者中历时 2-6 周给予丁酸钠灌肠 剂是安全而没有明显副作用的。 多项先前研究中使用的局部剂量为 528mg/ 天至 1.12g/ 天， 这相当于正常每天结肠内丁酸盐 / 酯生成的 35-60％。这些研究无一报告任何不良效应或 反应。依照一项研究， 在 IBD 患者中历时 6 周给予呈结肠靶向片剂形式的每天口服剂量为 4g 的丁酸钠， 而且同样发现是安全且良好耐受的， 而没有任何不良效应。本研究使用灌肠 剂。
研究设计 ： 具有后续随访的双盲式随机化临床试验。
研究受试者 ： Dhaka 医院和 Matlab 医院 (ICDDR， B) 收治的成年男性和女性患者被 筛选以参与所述研究。 选择标准 ：
·年龄 18-45 岁
·男性和女性
·腹泻持续 0-3 天
·培养物证实登记时的粪便中有志贺氏菌 ( 所有志贺氏菌 )
淘汰标准 ：
·在 ICDDR， B 医院收治前接受过抗微生物治疗
·其它并发感染 ( 诸如慢性呼吸道感染、 其它并发胃肠感染 ) 的临床症状
随机化
依照电脑生成的随机化名单， 将完全满足入围标准的患者随机化分至干预组 ( 匹 美西林加丁酸盐灌肠剂 ) 或对照 / 安慰剂组 ( 匹美西林加生理盐水灌肠剂 )。
灌肠剂的组成和灌肠法的规程
丁酸盐灌肠剂在生理盐水 (pH 7.2) 中含有 80mmol/L 丁酸盐。
安慰剂灌肠剂含有 30mmol/L NaCl(pH 7.2)。
指示患者以左侧位卧于床上 ( 霍乱窄床 )。软直肠导管由护士 / 医生插入， 80ml 丁酸盐溶液经由所述导管用 50ml 塑料注射器缓慢灌输。要求患者通过在给药后保持仰卧 30 分钟来保留灌肠剂至少 1/2 小时。然而， 如果患者未能保留灌肠剂 30 分钟， 那么在排便 后立即给予其以第二轮灌肠剂。
病例管理
登记后， 患者入住 ICDDRB Dhaka 和 Matlab 医院的研究病房。标准临床史和临床 检查由研究医生进行。所有患者接受匹美西林， 400mg， 8 小时一次， 5 天。干预组接受丁酸 盐灌肠剂即 80ml 浓度为 80mM 的丁酸钠， 12 小时一次， 72 小时， 而安慰剂组接受 80ml 生理 盐水， 12 小时一次， 72 小时。所有患者接受普通医院伙食， 每天三次 ( 早餐、 午餐和晚餐 )。
患者在研究病房中逗留 5 天， 从而能够鉴定任意复发病例。
样本量
在 Kabir I 等人 (1984)(Kabir I， Rahaman MM， Ahmed SM， Akhter SQ， Butler T.Comparative efficacies of pivmecillinam and ampicillin in acute shigellosis. Antimicrob Agents Chemother.1984May ； 25(5) ： 643-5) 的研究中已显示的是， 当用匹美西 林治疗时， 志贺氏菌病患者的腹泻持续时间为 3.2±1.8( 均值 ±SD)。 预期当用丁酸盐灌肠 剂与匹美西林一起治疗时腹泻持续时间缩短 30％， 考虑到 5％的显著性水平和 80％的置信 度， 样本量将是 55 人 / 组。考虑到 10％的中途退出， 每组的样本量将是 61。
测量 / 记录的临床参数
1. 食欲
2. 腹部痛性痉挛
3. 直肠里急后重
4. 体温 (8 小时一次 )
5. 日排便频率 ( 排便次数 )
6. 粪便排出量 ( 以克计 )
7. 粪便中 RBC、 脓细胞和巨噬细胞的存在 ( 通过 RME)
8. 入院时、 住院期间每天和 14 天后 ( 随访时 ) 的体重
9. 乙状结肠镜检查结果
其它分析
1. 粪便培养， 通过连续稀释法， 用于细菌计数 ( 每天两次 )， 4天
2. 粪便， 用于检测 LL-37， 通过 Western 印迹
3. 粪便， 用于确定 LL-37， 通过 ELISA
4. 直肠活检 ( 仅来自 Dhaka 患者 )， 用于炎症的组织学分级
5. 直肠活检， 用于对 LL-37 进行免疫组织化学染色和图像分析
6. 直肠活检， 用于评估组织中的 LL-37 转录物， 通过实时 PCR
7. 血清， 用于测量丁酸盐
数据分析
对于正态分布的数据， 意图使用适宜的参数检验 ( 例如 t 检验 ) 来比较各组之间 的结果。如果数据是偏斜的， 那么将使用非参数检验。然后可使用双因素 ANOVA 来进行 统计学分析以确定时间和治疗之间的显著性相互作用， 且如果存在任何显著性相互作用， 那么将进行事后 Tukey 规程。对于不是正态分布的数据， 将使用对秩进行的 ANOVA。对于 组内 ( 各天之间 ) 比较， 将进行单向 ANOVA。将使用统计学软件 SigmaStat 3.1(Jandel Scientific， San Rafael， Calif.) 和 SPSS 13 来进行统计学计算。