一种治疗肺癌的中药组合物及其制备方法和应用 技术领域 本发明涉及中药复方及其制备方法和应用， 具体涉及治疗肺癌的中药组合物及其 制备方法和应用。
背景技术 随着我国人口自然增长和人口老龄化进程的加剧， 肺癌的发展与死亡将在相当一 段时间内居我国恶性肿瘤的首位。 目前临床上颇感棘手的晚期肺癌生存率和生存质量虽然 有了一定程度的提高和改善， 但仍不能令人满意。 中医药治疗非小细胞肺癌的报道较多， 其 前景备受关注， 中医中药与手术、 放疗、 化疗结合对晚期非小细胞肺癌的治疗能有效延长生 存期和改善生活质量， 体现了中医药的特色和优势。
肺癌常见的证型剂治法为 ： 气滞血瘀 ： 活血化瘀， 行气散结 ； 阴虚内热 ： 滋阴清热， 润肺止咳 ； 气阴两虚 ： 益气养阴， 化痰散结 ； 气虚痰湿 ： 健脾补中， 燥湿化痰 ； 热毒炽盛 ： 清 热宣肺， 化痰散结。常用方剂 ： 沙参麦冬汤， 二妙散， 清金化痰汤， 千金苇茎汤， 二陈汤， 藿曲 平胃散。
我国临床肿瘤学起步虽然较晚， 但由于与美欧发达国家频繁的学术交流， 所以在 发达地区的大型医院临床肿瘤治疗水平与发达国家是接轨的。这就造成了以下局面 ： 中国 人一旦不幸得了肿瘤以后， 病人自己或社会必须耗去大笔药费从国外制药企业进口极其昂 贵的抗肿瘤新药用于治疗。病人不堪经济重负、 社会不堪经济重负。即使在美国本土， 昂贵 的抗肿瘤新药也使美国的社会保险业不堪重负， 更何况我国！我国民族制药业目前大多只 能仿制国际上部分超过专利保护期的药物， 比较而言， 滞后、 被动。
努力开发具有我国独立自主知识产权的抗肿瘤新药一直是我国医药学者们孜孜 不倦努力研究的重要方向。 抗肿瘤化疗药物大多来源于天然药物， 然后才经过修饰、 人工合 成等加工过程。中药是源于我国的独特的天然药物宝库。在我国， 中药制剂治疗恶性肿瘤 十分普遍， 但是被现代医学证实具有肯定抗癌作用的药物不多， 其抗癌作用能够与化疗药 物相媲美的更少。如果在中医药理论的指导下， 通过大样本的临床验证和基础实验进行中 药复方制剂抗肿瘤作用的研究， 无疑是我国抗肿瘤新药研究的优势所在。
发明内容
本发明所要解决的技术问题， 是提供一种治疗肺癌的中药组合物。
本发明还要解决的技术问题， 是提供上述治疗肺癌的中药组合物的制备工艺。
本发明最后要解决的技术问题， 是提供上述治疗肺癌的中药组合物在制备治疗肺 癌药物中的应用。
为解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案如下 ：
一种治疗肺癌的中药组合物， 它包含如下重量份数的组分 ：
黄芪 10 ～ 20 份、 斑蝥 5 ～ 8 份、 壁虎 10 ～ 30 份、 山豆根 10 ～ 30 份、 水蛭 10 ～ 30 份、 莪术 10 ～ 30 份、 土鳖虫 10 ～ 30 份。上述治疗肺癌的中药组合物优选包含如下重量份数的组分 ：
黄芪 10 ～ 15 份、 斑蝥 6 ～ 8 份、 壁虎 20 ～ 30 份、 山豆根 10 ～ 20 份、 水蛭 10 ～ 15 份、 莪术 20 ～ 30 份、 土鳖虫 20 ～ 30 份。
上述治疗肺癌的中药组合物的制备工艺， 将配方量的黄芪、 斑蝥、 壁虎、 山豆根、 水 蛭、 莪术和土鳖虫混合， 加药材总重量的 5-15 倍的水， 浸泡 10 ～ 60 分钟， 煎煮 1 ～ 4 次， 每 次 1 ～ 3 小时， 滤过， 合并滤液， 滤液减压浓缩至相对密度 1.05 ～ 1.25g/mL(60℃ ) 的浸膏， 加乙醇至含醇量为 60 ～ 90％ (v/v)， 静置 24 小时， 取上清液， 回收乙醇至无醇味并浓缩， 即 得。
通过上述制备方法可以得到液体的药物， 如果要制备成固体制剂， 则可加入药用 辅料， 如淀粉、 糊精等混合后再制备成片剂、 胶囊、 丸剂等固体剂型。
上述治疗肺癌的中药组合物在制备治疗肺癌药物中的应用。
有益效果 ： 本发明的治疗肺癌的中药组合物， 方中斑蝥、 壁虎、 山豆根消癥散结、 解 毒抗癌 ； 水蛭、 莪术、 土鳖虫活血祛瘀、 破积通络 ； 重用黄芪以益气扶正， 使祛邪不伤正， 助 正以祛邪。诸药合用， 共奏解毒抗癌、 软坚散结、 活血祛瘀、 益气扶正之功效。临床、 实验研 究均显示对肺癌细胞有明显抑制作用。 附图说明 图 1 为薄片周围毛细血管生长情况显微镜照片， 其中， a 为本发明组方 10mg/ml， b 为本发明组方 5mg/ml， c 为本发明组方 2.5mg/ml， d 为环磷酰胺 0.4mg/ml， e 为生理盐水。
具体实施方式
根据下述实施例， 可以更好地理解本发明。然而， 本领域的技术人员容易理解， 实 施例所描述的仅用于说明本发明， 而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发 明。
实施例 1 ：
一种治疗肺癌的复方组合药物， 包括以下重量份数的各组分 ： 黄芪 10 份、 斑蝥 5 份、 壁虎 10 份、 山豆根 10 份、 水蛭 10 份、 莪术 10 份、 土鳖虫 10 份。
按重量份数称取以上七味药， 加 5 重倍的水浸泡 60 分钟， 煎煮 3 次， 每次 2 小时， 滤 过， 合并滤液， 滤液减压浓缩至相对密度 1.05g/mL(60℃ ) 的浸膏， 加乙醇至含醇量为 70％ (v/v)， 静置 24 小时， 取上清液， 回收乙醇至无醇味并浓缩至适量， 加水至 5000mL， 搅匀， 分 装， 流通蒸汽灭菌 35min， 即得合剂。
实施例 2 ：
一种治疗肺癌的复方组合药物， 包括以下重量份数的各组分 ： 黄芪 10 份、 斑蝥 8 份、 壁虎 30 份、 山豆根 20 份、 水蛭 10 份、 莪术 20 份、 土鳖虫 20 份。
按重量份数称取以上七味药， 加 8 倍重量的水浸泡 30 分钟， 煎煮 3 小时， 滤过， 滤 液减压浓缩至相对密度 1.15g/mL(60℃ ) 的浸膏， 加乙醇至含醇量为 80％ (v/v)， 静置 24 小 时， 取上清液， 回收乙醇至无醇味并继续浓缩至相对密度约 1.20g/ml(80℃测 )， 真空干燥， 制粒， 压片， 即得片剂。
实施例 3 ：一种治疗肺癌的复方组合药物， 包括以下重量份数的各组分 ： 黄芪 10 份、 斑蝥 6 份、 壁虎 30 份、 山豆根 15 份、 水蛭 13 份、 莪术 30 份、 土鳖虫 30 份。
按重量份数称取以上七味药， 加 15 倍重量的水浸泡 45 分钟， 煎煮 2 次， 每次 1 小 时， 滤过， 合并滤液， 滤液减压浓缩至相对密度 1.10g/mL(60 ℃ ) 的浸膏， 加乙醇至含醇量 为 60 ％ (v/v)， 静置 24 小时， 取上清液， 回收乙醇至无醇味并浓缩至相对密度约 1.20g/ ml(80℃测 )， 真空干燥， 制粒， 装胶囊， 即得胶囊剂。
实施例 4 ：
一种治疗肺癌的复方组合药物， 包括以下重量份数的各组分 ： 黄芪 15 份、 斑蝥 6 份、 壁虎 20 份、 山豆根 15 份、 水蛭 13 份、 莪术 20 份、 土鳖虫 30 份。
按重量份数称取以上七味药。取其中一半， 加 10 倍重量的水浸泡 25 分钟， 煎煮 2 次， 每次 1.5 小时， 滤过， 合并滤液， 滤液减压浓缩至相对密度 1.10g/mL(60℃ ) 的浸膏。另 一半饮片粉碎成 80 至 100 目细粉， 与上述浸膏混匀， 塑制法制丸， 即得丸剂。
实施例 5 ： 本发明组方治疗晚期非小细胞肺癌的临床研究
1 临床资料
1.1 一般资料本研究将符合入选标准的患者按随机分组法， 分为 A 组 ( 实施例 4 组 )、 B 组 ( 化疗组 )、 C 组 ( 化疗联合实施例 4 组 )。最终完成试验的患者 121 例。A 组 41 例： 男 23 例， 女 18 例 ； 平均年龄 (63.02±10.81) 岁 ； IIIa 期 9 例， IIIb 期 14 例， IV 期 18 例 ； 腺癌 23 例， 鳞癌 14 例， 腺鳞癌 4 例。 B 组 40 例 ： 男 25 例， 女 15 例 ； 平均年龄 (60.72±10.86) 岁； IIIa 期 8 例， IIIb 期 15 例， IV 期 17 例 ； 腺癌 25 例， 鳞癌 12 例， 腺鳞癌 3 例。C 组 40 例： 男 26 例， 女 14 例 ； 平均年龄 (60.60±10.26) 岁 ； IIIa 期 8 例， IIIb 期 17 例， IV 期 15 例； 腺癌 22 例， 鳞癌 15 例， 腺鳞癌 3 例。3 组间患者的性别、 年龄、 肿瘤分期及病理类型分 布情况差异均无统计学意义 (P ＞ 0.05)， 具有可比性。
1.2 诊断标准 (1) 西医诊断标准 ： 非小细胞肺癌的诊断标准以中华人民共和国卫 生部医政司编写的 《中国常见恶性肿瘤诊治规范》 [1] 所制定的标准为依据。分期标准参照 《国际抗癌联盟 1997 年 TNM 分期标准》 制定。(2) 中医辨证标准 ： 参照 《中药新药临床研究 指导原则》 (2002 版 )[3] 及新世纪全国高等中医药院校规划教材 《中医内科学》 (2003 版 ) [4] 制定， 辨为瘀毒内蕴证 ： 咳嗽， 气急， 胸痛， 痰黄或痰血暗红， 可伴有低热， 舌质紫暗或有 瘀点、 瘀斑， 苔薄黄， 脉涩或弦细。
1.3 纳入与排除标准 (1) 纳入标准 ： 经过病理组织学和 ( 或 ) 细胞学检查确诊的 非小细胞性肺癌患者， 不宜手术或拒绝手术， 或手术后复发患者， 中医辨证属瘀毒内蕴证， 接受随机分组治疗 ； 虽经化疗但疗效不佳， 使用化疗达 4 周以上时间 ； 具有双径可测量的病 灶， 体格检查、 CT 或 MRI 扫描要求病灶≥ 10mm×20mm ； 年龄在 18 ～ 75 岁之间 ； Karnofsky 评分≥ 60 分， 预计生存期≥ 3 个月 ； 重要脏器组织功能基本正常。(2) 排除标准 ： 肺癌脑或 脑膜转移的患者， 其他肿瘤的肺部转移癌 ； 具有严重的心血管病变、 肝肾疾病 ； 合并其它严 重疾病或明显出血倾向者。
2、 治疗方法 A 组 ： 采用实施例 4 丸剂， 每次 5g， 每日 3 次， 以 4 周时间为 1 个周期 ； B组： 采用 NP 或 GP 方案。NP ： 异长春花硷 (NVB)， 25mg/m2， 静脉推注 ( 生理盐水冲洗 )， d1、 d5 ； 顺铂 (DDP)， 20mg/d， 静脉滴注， d1-d5 ； GP ： 吉西他滨 1.0/m2， 静脉滴注， d1、 d8， 顺铂 20mg/d， d1-d5， 以 4 周时间为 1 个周期 ； C组： 采用实施例 4 丸剂联合化疗治疗， 用法、 剂量分别同 A 组、 B 组。3 组均以连续 2 个周期为 1 个评价单位。
3、 疗效观察
3.1 观察指标疗效性观察项目 ： 影像学 (CT/MRI) 瘤体检查治疗前 2 周内、 观察终 点各检查 1 次 ； 临床症状体征每周记录 1 次 ； 全身一般状况 (Karnofsky) 评分治疗前、 每个 周期后记录 1 次。安全性观察项目 ： 肝功能、 肾功能、 心电图每周期前后各检查 1 次 ； 尿常 规、 大便常规每周期前后各检查 1 次 ； 血常规每周检查 1 次。临床试验过程中应密切观察可 能出现的任何不良反应和不良事件， 如实记录。
3.2 近期客观疗效标准治疗前后通过 CT 或 MRI 检测， 观察瘤体大小变化， 参照卫生 部 WHO 客观疗效评定标准分为完全缓解 (CR)、 部分缓解 (PR)、 稳定 (SD)、 进展 (PD)。
3.3 临床证候疗效标准将咳嗽、 咯痰、 痰血、 胸闷、 胸痛、 气急、 发热等常见症状按 轻、 中、 重分为 3 级 ( 参照卫生部 《中药新药临床研究指导原则》 [3])， 分别记为 2、 4、 6 分， 在 治疗前后进行累积对比， 按积分比法评价疗效。显效 ： 治疗后症状体征积分值下降≥ 2/3 ； 有效 ： 治疗后症状体征积分值下降≥ 1/3， 但＜ 2/3 ； 无效 ： 达不到有效标准者。
3.4 近期客观疗效 B 组患者采用 GP 方案 22 例、 NP 方案 18 例， C 组患者采用 GP 方 案 20 例、 NP 方案 20 例， 经 χ2 检验， 差异无统计学意义 (P ＞ 0.05)， 具有可比性。治疗后， B 组、 C 组的缓解率 (CR+PR) 分别为 35.00％、 42.50％， 高于 A 组 (2.44％ ))P ＜ 0.01)， C组 的疾病控制率 (CR+PR+SD) 为 80.00％， 高于 A 组 (56.10％ )、 B 组 (57.50％ )(P ＜ 0.05)。 3.5 治疗后出现新转移灶的情况治疗后出现新转移灶 ( 淋巴结转移及远处转移 ) 者 A 组为 7 例， B 组为 13 例， C 组为 5 例。B 组新转移灶的发生率高于 A 组、 C 组， 经 χ2 检 验， B 组与 C 组比较差异有统计学意义 (P ＜ 0.05)， 而 A 组与 B 组比较差异无统计学意义 (P ＞ 0.05)。
3.6 治疗后临床证候改善状况治疗后 3 组证候疗效， A 组、 C 组的总有效率分别为 73.17％、 77.50％， 均高于 B 组 (50.00％ )(P ＜ 0.05)， 说明本发明组方具有较好的改善临 床证候的作用。
3.7 主要症状疗效对咳嗽、 咯痰、 胸痛、 胸闷、 气急等临床主要症状进行积分统计分 析， 治疗后 C 组患者的咳嗽、 胸痛、 气急症状的改善率为均高于 B 组 (P ＜ 0.05)。
3.8 一般状况改善情况治疗前 3 组患者的一般状况 Karnofsky 评分无统计学差异 (P ＞ 0.05)。治疗后 A 组的 Karnofsky 评分稳定率 ( 上升 + 稳定 ) 为 75.61％， 高于 B 组 (52.50％ ) 和 C 组 (70.00％ )， 经 χ2 检验， A 组与 B 组比较差异有统计学意义 (P ＜ 0.05)。 说明单独使用本发明组方治疗在改善患者的一般状况方面优于单独使用化疗。
3.9 不良反应根据 WHO 抗癌药毒副反应的分度标准进行判定， 分为 0 度、 I 度、 II 度、 III 度、 IV 度， A 组患者在服药后除 2 例出现 I 度恶心外， 余未见其他副反应。B 组及 C 组的主要不良反应为贫血、 白细胞减少、 血小板减少、 恶心呕吐、 便秘、 血清转氨酶升高等， 2 组比较差异无统计学意义 (P ＞ 0.05)， 考虑由化疗药物引起。
实施例 6 ： 本发明组方体外对人肺癌细胞株 A549 的抑制作用。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
实验细胞株 ： 人肺腺癌 A549 细胞株为本实验室常规培养， 生长于含 10％新生牛血 清的 RPMI1640 完全培养液中， 37℃恒温， 5％ CO2， 饱和湿度培养箱中生长。取对数生长期细
胞用于实验。试剂 ： RPMI1640 培养液 ； MTT( 以生理盐水配制成 5mg/ml 浓度 ) ； 二甲基亚砜。 本发明组方 ： 按实施例 4 的配方制备。主要仪器设备 ： 二氧化碳培养箱、 超净工作台、 酶标 仪、 倒置显微镜、 水浴箱、 聚光灯等。
1.2 方法与步骤
1.2.1 采用四甲基偶氮唑蓝 (MTT) 显色法 [1] 在含 10％小牛血清的 RPMI 1640 培 养液中培养细胞， 在细胞达到指数增长期时用于实验。记数细胞浓度为 2.5×104/ml， 接种 于无菌的 96 孔培养板中。每孔加入肿瘤细胞悬液 200μl， 培养 24h 后吸去原有的培养液， 分别加入各 200μl 的 5 种不同浓度本发明组方， 设空白对照孔加完全培养液， 每组均为 5 复孔。混匀后置于 37℃、 5％ CO2 培养箱中继续培养 24h。于结束前 4h 每孔加入 20μl 浓 度为 5mg/mlMTT， 继续培养 4h 后吸去全部上清液， 每孔加入二甲基亚砜 200μl 溶解液， 微型 混合器振荡 10-15min， 充分溶解， 用酶联免疫检测仪于 630nm 波长处测定光密度 OD 值， 按抑 制率计算公式计算抑制肺癌细胞的百分率。
1.2.2 确定最佳药物浓度用上述方法得出本发明组方不同浓度对肺癌细胞的作 用， 选取的不同药物作用浓度分别为 ： 20mg/ml、 10mg/ml、 5mg/ml、 2.5mg/ml、 1.25mg/ml。
1.2.3 确定最佳药物作用时间用上述方法得出本发明组方不同时间对肺癌细胞的 作用， 选取的不同药物作用时间分别为 ： 12、 24、 36、 48、 72h。 1.4 肿瘤细胞抑瘤率计算公式抑瘤率＝ 1-(OD 实验组 -OD 空白组 )/(OD 实验对照 组 -OD 空白组 )×100％
表 1 本发明组方对体外培养肺癌细胞株的抑制作用
实施例 7 ： 本发明组方对鸡胚尿囊膜血管生成的抑制作用
1. 材料与方法
1.1 实验材料 ： 甲基纤维素 M20 ： 购自 Amersco 公司。注射用环磷酰胺系江苏恒瑞 医药股份有限公司产品， 批号 ： 06060121。受精 WhiteLeghorn 鸡蛋 (50g 左右， 第6天)购 自南京市药械厂。
主要仪器设备 ： 二氧化碳培养箱、 超净工作台、 倒置显微镜、 聚光灯、 手术剪、 无齿 镊本发明组方 ( 实施例 1) 用生理盐水于实验前稀释后得 3 种终浓度 ： 10mg/ml、 5mg/ml、 2.5mg/ml 供实验用。
1.2 方法与步骤将鸡受精卵在正常孵育条件下孵化， 第 7 天在聚光灯下找出气室 和毛细血管稀疏区域 ( 此处新生血管形成旺盛 ) 并做出记号 ； 75％乙醇消毒鸡卵， 在气室顶 端钻出小孔， 在标记区蛋壳上开窗 ( 直径约 1em)， 显露内膜， 此时在气室端小孔负压吸引， 使内膜与尿囊膜剥离， 撕去内膜既可见上有血管生长的尿囊膜 ； 在甲基纤维素薄片上滴加 10μl 含不同受试药物的生理盐水溶液并以不含药物的生理盐水为阴性对照， 以环磷酰胺
(0.4mg/m1) 为阳性对照， 覆于暴露的尿囊膜上。用无菌透明胶布封闭窗孔以免污染 ； 继续 孵育 72h， 每天追加相同剂量的药品 ； 72h 后解剖鸡胚， 将薄片周围 3cm 直径区域内的尿囊膜 剪下， 显微镜下观察薄片周围毛细血管生长情况 ( 见图 1)， 计算 10 个经药物作用的鸡胚尿 囊膜血管新生的抑制率。
2. 结果
表 2 本发明组方和环磷酰胺对鸡胚尿囊膜血管新生的影响
实施例 8 ： 本发明组方对 Lewis 肺癌生长转移及 VEGF、 MVD 表达的影响。
1. 实验材料 ： C57BL/6 小鼠， 雄性， 体重 18.0-22.0g， 本发明组方 ( 实施例 4)， 口服， 成人日用量 15g/60kg， 由江苏省中医院制剂部实验室提供， 临用前用蒸馏水配成 所需浓度。顺铂， 南京制药厂有限公司出品， 批号 20070409， 用生理盐水配制成 0.25mg/ ml 浓 度 药 液。CD34 ： 购 自 BIOLEGEND 公 司 (Cat.No119301)。VEGF ： 购 自 US-BIOLOGICAL 公司 (V2110-11)。即用型快速免疫组化 MaxVisionTM 试剂盒 ： 福州迈新生物公司提供 (KIT-5030)。DAB 显色试剂等均由福州迈新生物公司提供。
2. 实验方法
2.1 操作步骤
将培养好的 Lewis 细胞以 0.25％胰酶消化收集， 以生理盐水配制 1×107 个 /ml 细 胞悬液， 接种至 4 只 C57BL/6 小鼠两侧前肢腋下各 0.2ml， 10 天后成瘤， 约 1cm3， 处死， 置于 75％乙醇溶液中， 移入超净台内， 剪开局部皮肤， 取出瘤组织。 4℃生理盐水洗两遍， 剪碎， 匀 浆， 匀浆液放入无菌小瓶内， 生理盐水 1 ∶ 3 调整浓度， 0.2ml/ 只鼠接种于小鼠右上肢腋下。 共 60 只， 随机分为六组， 每组 10 只， 分别为 ：
(1) 模型组 ： 给予生理盐水 ；
(2) 阳性对照组 ： 给予顺铂 0.1mg/20g 小鼠， 腹腔注射 d1、 3、 5；
(3) 联合用药组 ： 给予顺铂 0.1mg/20g 小鼠， 腹腔注射 d1、 3、 5， 同时给予本发明组 方中剂量组 (5g/kg) ；
(4) 本发明组方大剂量组 ： 按 10g/kg 灌胃 ；
(5) 本发明组方中剂量组 ： 按 5g/kg 灌胃 ；
(6) 本发明组方小剂量组 ： 按 2.5g/kg 灌胃。
上述各组除顺铂外均连续灌胃 14 天， 每天一次， 灌胃容量为 0.4ml/20g。第 15 天 处死小鼠， 解剖剥离瘤块， 称瘤重， 计算抑瘤率。
取出小鼠完整的肺， 用 BOUIN 氏液固定 24h， 然后放入无水乙醇中， 漂洗至黄色褪 去， 转移灶成白色小点， 在 10× 放大镜下计数各肺叶表面的 Lewis 肺癌转移灶数， 计算转移 率。
处死小鼠后摘取胸腺和脾脏称重， 以胸腺和脾脏重量 (mg) 与体重 (g) 之比作为胸
腺和脾指数。比较各组药物对小鼠免疫功能的作用。
免疫组化染色 ： 取肿瘤组织， 固定， 脱水包埋， 4μm 连续切片， 检测肿瘤微血管密 度 (MVD) 及血管内皮细胞生长因子 (VEGF) 值的测定。
2.2 肿瘤抑制指标测定
2.2.1 抑瘤率的测定 ： 抑瘤率＝ (1-T/C)×100％， 公式计算抑瘤率， 式中 T 为给药 组平均瘤重， C 为对照组平均瘤重。
2.2.2 转移率的测定 ： 转移率＝ 1- 给药组平均转移灶数 / 对照组平均转移灶 数 ×100％〕
2.2.3 微血管密度 (MVD) 及血管内皮细胞生长因子 (VEGF) 的测定 ： 肿瘤组织固定 于 10％多聚甲醛中， 石蜡包埋， 连续切片 (4μm) 切片行免疫组织化学染色， 采用快速免疫 组化方法， 即用型快速免疫组化 MaxVisionTM 试剂盒是根据多聚合酶技术把多分子量过氧 化物酶与抗鼠或 / 和抗兔 IgG 分子结合在聚合物上形成多聚物分子。在实验过程中加空白 对照 ( 以 PBS 代替各种一抗 ) 以监测抗体特性。主要染色过程如下 ： ① 4μm 石蜡切片脱蜡 水化， 将切片于柠檬酸缓冲液中微波中档抗原修复 10 分钟。 自然冷却， 用 PBS 液 (0.01mol/ L PH7.4) 冲洗 3 次 ×2min。 ②正常山羊血清封闭， 室温孵育 10 分钟。 倾去血清， 勿洗， 滴加 1 ∶ 50-100 比例稀释的一抗， 37℃孵育 1 小时。③ PBS 冲洗， 2 分钟 ×3 次。④滴加即用型 快速免疫组化 MaxVisionTM 二抗， 37℃或室温孵育 10-15 分钟。⑤ PBS 冲洗， 2 分钟 ×3 次。 ⑥滴加新鲜配制的显色剂 (DAB)3-5 分钟， 显微镜下观察。⑦自来水充分冲洗， 苏木素复染， 自来水冲洗返蓝。⑧梯度酒精脱水、 二甲苯透明， 中性树胶封片。分析方法 ： 免疫组化标记 ： CD34 和 VEGF 定位于细胞浆， 以细胞浆着色呈棕黄色为阳性细胞。MVD 微血管计数的方法 ： CD34 标记微血管， 计算肿瘤内着色的毛细血管和微小血管。 按照 Weidner 的判断标准， 凡呈 现棕色单个内皮细胞或内皮细胞簇均作为一个血管计， 但肌层较厚及官腔面积大于 8 个红 细胞直径的血管不计数。计数方法， 首先在低倍镜下 (10×10) 扫视整张切片， 选取 3 个微 血管密度最高的区域视野 ( 新生血管热点区 )， 然后在高倍镜 (10×40) 放大的视野下计数 每一区中的微血管， 取其平均值。VEGF 采用免疫组化染色采用 SP 法， 对各组标本每个切片 观察 5 个视野， 并记录各抗体的表达情况， 通过评分对它们的染色强度进行分级。根据组织 中细胞免疫组织化学染色的深浅和阳性细胞百分数对每个切片逐一评分， 取其平均值为该 片染色强度。每张组织切片染色强度 ： 阴性 0 分， 浅棕黄色为 1 分， 棕黄色为 2 分， 深棕黄色 为 3 分。阳性细胞比例 ： 0％为 0 分， ≤ 25％为 1 分， 26％ -50％为 2 分， ＞ 50-75％为 3 分， ＞ 76％为 4 分。2 项得分相加为最后评分。
3. 实验结果
3.1 本发明组方对 Lewis 肺癌小鼠肿瘤抑瘤率的影响 ： 大剂量、 中剂量组和小剂量 组均有抑制 Lewis 肺癌小鼠的肿瘤生长作用， 使瘤重减轻， 其中大剂量组， 中剂量组和小剂 量组抑瘤率分别达 60.60％， 55.76％和 48.01％， 和生理盐水组相比有高度统计学意义 (P ＜ 0.01)。联合用药组抑制率高达 97.72％。
3.2 本发明组方对 Lewis 肺癌肺转移抑制率的影响 ： 大剂量、 中剂量组和小剂量组 均能抑制 Lewis 肺转移灶数， 抑制率分别为 46.63％、 29.45％和 23.93％。其中大剂量、 中 剂量组和生理盐水组相比差别有高度统计学意义 (P ＜ 0.01)。
3.3 本发明组方对 Lewis 肺癌鼠重的影响 ： 实验结果表明， 生理盐水组、 本发明组方各剂量组给药后体重均有增加， 由于体重是生活质量的重要指标， 说明给药后小鼠生活 质量未受明显影响。而顺铂组和联合用药组， 体重均明显下降， 与给药前相比， 差异有高度 统计学意义 (P ＜ 0.01)。顺铂组和联合用药组第七天各死亡一只小鼠， 考虑为给药后恶液 质， 逐步衰竭所致。
表 3 本发明组方对 Lewis 肺癌小鼠鼠重、 肿瘤抑瘤率、 肺转移抑制率的影响注： 与 NS 比较＊＊ P ＜ 0.01
3.4 本发明组方对 Lewis 肺癌小鼠免疫器官 ( 胸腺、 脾脏 ) 的重量的影响
与生理盐水组相比， 本发明组方大、 中、 小剂量组对 Lewis 肺癌的胸腺重量、 胸腺 指数和脾脏指数无影响， 差别均无统计学意义 (P ≥ 0.05)， 本发明组方大剂量组脾脏重量 略低于对照组 (P ＜ 0.05)， 而含顺铂组胸腺重量、 胸腺指数、 脾脏重量和脾脏指数均明显低 于对照组 (P ＜ 0.01)。提示顺铂对 Lewis 肺癌的免疫功能有一定的抑制作用。
3.5 本发明组方对微血管密度 (MVD) 的影响
实验结果表明 ： 本发明组方大剂量组、 联合组的微血管密度的计数与 NS 对照组相 比明显减少， 差异具有高度统计学意义 (P ＜ 0.01)。 本发明组方中剂量组、 小剂量组的微血 管密度的计数与 NS 对照组相比差异有统计学意义 (P ＜ 0.05)。
表 4 本发明组方对 Lewis 肺癌小鼠肿瘤的 MVD 影响
注： 与 NS 比较＊ P ＜ 0.05， ＊＊ P ＜ 0.01 3.6 本发明组方对 VEGF 水平的影响 实验结果表明 ： 本发明组方大剂量组、 联合组对 VEGF 表达较 NS 对照组显著下调，差异具有高度统计学意义 (P ＜ 0.01)。 本发明组方中剂量组、 小剂量组对 VEGF 表达的抑制 作用与 NS 对照组相比差异具有统计学意义 (P ＜ 0.05)。
表 5 本发明组方对 Lewis 肺癌小鼠肿瘤的 VEGF 的影响
注： 与 NS 比较＊ P ＜ 0.05， ＊＊ P ＜ 0.01 实施例 9 ： 本发明组方对小鼠移植性肝癌 H22 腹水转实体瘤的抑制作用 1 一般资料实验材料 ： 实验动物 ： 昆明种小鼠， 雌雄各半， 体重 18 ～ 22g， 南京中医药大学实验 动物中心提供。瘤株 ： 肝癌 H22， 江苏省肿瘤医院提供。取接种 7 天后肝癌 H22 腹水∶生理 盐水＝ 1 ∶ 3 的悬液备用。药物 ： 5- 氟尿嘧啶 (5-FU) 用生理盐水配制成 2.5mg/ml 浓度药 液。本发明组方 ( 实施例 4) ： 用蒸馏水研磨配制成 0.2g/ml 的混悬液， 然后按需用蒸馏水 稀释成 0.25g/ml、 0.125g/ml、 0.0625g/ml 3 个浓度药液。
2 实验方法
将肝癌 H22 悬液以 0.2ml/ 只的量注射到小鼠前肢腋部皮下， 24 小时后将小鼠随 机分为对照组、 5-FU 组、 本发明组方 3 个剂量 ( 分别为 5g/kg、 2.5g/kg、 1.25g/kg) 组， 每 组 10 只， 每天给小鼠 ig 给药 1 次， 每次 0.4ml/20g× 体重。5-FU 组为腹腔注射， 每天 1 次 0.4ml/20g× 体重 ； 对照组 ig 等量生理盐水。连续给药 7 天， 停药 1 天后称重， 拉颈处死， 剥取瘤块称重， 按 “抑瘤率＝ (1-T/C)×100％” 公式计算抑瘤率， 式中 T 为给药组平均瘤重， C 为对照组平均瘤重。
3 结果
实 验 结 果 表 明， 本 发 明 组 方 各 组 瘤 重 与 对 照 组 瘤 重 比 较 均 有 统 计 学 意 义 (P ＜ 0.01)。本发明组方 5g/kg、 2.5g/kg 组抑瘤率均大于 30％， 有较好的抑瘤作用。
表 6 本发明组方对荷瘤 (H22) 瘤体生长的影响
注： F ＝ 13.098， P ＜ 0.01**P ＜ 0.01 与对照组比较。 实施例 10 ： 本发明组方对移植性肉瘤 S180 小鼠体质量胸腺脾脏质量及指数的影响。 1 实验材料
实验动物 ： ICR 小鼠， 雄性， 体质量 18 ～ 22g， 随机分为 5 组， 每组 10 只。瘤株 ： 肉 瘤 S180 瘤株， 由江苏省肿瘤医院提供。 选择接种 S180 瘤株 7 ～ 10d， 肿瘤生长旺盛且无溃破， 动物状况较好的瘤源动物， 颈椎脱臼， 在无菌操作下取瘤块， 1g 瘤块加 3ml 生理盐水配制成 为匀浆备用。药物 ： 环磷酰胺江苏恒瑞医药股份有限公司出品， 批号 990210， 用生理盐水配 制成 1mg/ml 浓度药液。称取定量的本发明组方 ( 实施例 4) 用蒸馏水研磨配制成 0.2g/ml 的混悬液， 然后按需用蒸馏水稀释成 0.25g/ml， 0.125g/ml， 0.0625g/ml3 个浓度药液。
2 实验方法
将 S180 匀浆悬液以 0.2ml/ 只的量注射到小鼠前肢腋部皮下， 24h 后将小鼠随机 分为对照组、 环磷酰胺组、 本发明组方三个不同剂量组 ( 分别为 0.64mg/kg、 0.32mg/kg、 0.16mg/kg)， 每组 10 只。各组均为腹腔注射， 每天 1 次， 每次 0.4ml/20g× 体质量， 连续给 药 7d， 停药次日， 称重后处死小鼠， 摘取胸腺和脾脏称重， 以胸腺和脾脏重量 (mg) 与体质量 (g) 之比作为胸腺指数和脾指数。
3 实验结果
本发明组方各组对 S180 小鼠体质量没有明显作用 ； 本发明组方大剂量组能提高 胸腺质量， 与对照组比较统计学意义 (P ＜ 0.05)， 提示大剂量本发明组方有提小鼠免疫 功能的作用。环磷酰胺组给药后小鼠胸腺质量及指数、 脾脏质量及指数均低于对照组 (P ＜ 0.05、 P ＜ 0.01)， 说明环磷酰胺对 S180 小鼠的免疫功能有一定抑制作用。
讨论 ： 由于历史条件的限制， 中医古代文献中虽无恶性肿瘤之名， 但对恶性肿瘤的 成因及症状早有一定的认识。如 《医宗必读》 云： “积之成者， 正气不足而后邪气踞之” 。 《血 证论》 “瘀血在经络脏腑之间， ： 则结为癥瘕” 。 《医门法律》 云： “胀病亦不外水裹、 气结、 血 瘀” 。 《医林改错》 云： “气无形不能结块， 结块者， 必有形之血也。 ” 故中医学认为， 肿瘤病多有 正虚、 气结、 血瘀等病理变化， 我们亦以此作为本发明组方的立方依据。方中斑蝥、 壁虎、 山 豆根消癥散结、 解毒抗癌 ； 水蛭、 莪术、 土鳖虫活血祛瘀、 破积通络 ； 重用黄芪以益气扶正， 使祛邪不伤正， 助正以祛邪。诸药合用， 共奏解毒抗癌、 软坚散结、 活血祛瘀、 益气扶正之功 效。