用于阿尔茨海默氏病死亡前诊 断以及体内成像和防止淀粉 样蛋白沉积的偶氮化合物 本发明使用the National Institute of Ageing基金，拨款号AG-05443，AG-05133和AG-08974，而完成。本申请为1995年5月1日提交的美国专利申请流水号08/432,019的后续部分申请，后者为1994年7月29日提交的美国专利申请流水号08/282,289的后续部分申请。
【发明背景】
本发明涉及适用于在患者活体内显示淀粉样蛋白沉积的化合物的鉴定。更具体地说，本发明涉及一种，在活体大脑内使淀粉样蛋白沉积成像阿尔茨海默氏病死亡前诊断的方法。本发明也涉及此类化合物在治疗中的用途。
阿尔茨海默氏病(“AD”)是一种神经变性疾病，其特征是丧失记忆和其他认识能力的缺损。Mckhann等，神经病学(Neurology)34：939(1984)。在美国它是一种最常见的痴呆的原因。AD可能侵袭40-50岁的较年青者，但是，由于难以进行无危害大脑活组织检查，因而很难知道发病时间。AD地流行随年龄而增加，估计85-90岁的人群中有高达45-50％的受其影响。Evans等，JAMA 262：2551(1989)；Katzman，神经病学(Neurology)43：13(1993)。
根据定义，AD通常在尸检时通过脑组织的检查而明确地被诊断。Khachaturian，神经病学总论(Arch.Neurol.)42：1097(1985)；Mckhann等，神经病学(Neurology)34：939(1984)。根据神经病理学，该疾病的特征为存在神经炎斑(NP)，神经原纤维缠结(NFT)，和神经元损失，以及各种其他发现。Mann，衰老发生机理(Mech，Ageing Dev.)31：213(1985)。死于阿尔茨海默氏病的患者的脑组织的尸体解剖切片中存在具有AD特征的神经炎斑的蛋白质性质的细胞外核中的淀粉样蛋白。
这些神经炎斑的淀粉样蛋白核由称为β-淀粉样蛋白(Aβ)的蛋白组成，该蛋白排列在β-折叠叶占优的结构中。Mori等，生物化学杂志(Journal of Biological Chemistry)267：17082(1992)；Kirschner等，PNAS 83：503(1986)。神经炎斑为该疾病的早期恒定的特征。Mann等，神经病学杂志(J.Neurol.Sci.)89：169：Mann等，衰老发生机理(Mech.Ageing Dev.)31：213(1985)；Terry等，神经病理学实验杂志(J.Neuropathol.Exp.Neurol.)46：262(1 987).
Aβ的初期的沉积可能发生在临床症状出现前的很长一段时间。通常用于诊断AD的“最低(显微)镜检标准”基于在脑中发现的神经炎斑的个数。Khachaturian，神经病学总论(Arch.Neurol.)，Supra(1985)。不幸的是，神经炎斑的数量必须在死后方能测量。
含淀粉样蛋白的神经炎斑为AD和Downs综合症患者以及很可能发展为AD的阿朴脂蛋白E4等位基因纯合子大脑选择性区域的重要特征。Corder等，科学(Science)261：921(1993)；Divry，P.，神经病及精神病学杂志(J.Neurol，Psych.27：643-657(1927)；Wisniewski等，inZimmerman，H. M.(ed)：神经病理学的发展(PROGRESS INNEUROPATHOLOGY)，(Grune and Stratton，N.Y.1973)pp.1-26。通过用硫黄素S或刚果红对脑切片染色可容易地检测脑中的淀粉样蛋白。Puchtler等，组织化学和细胞化学杂志(J.Histochem.Cytochem.)，10：35(1962)。被刚果红染色的淀粉样蛋白在二色性显示中表现为黄绿色极化色。二色性结合是淀粉样蛋白β-折叠的叶状结构的结果。Glenner，医学杂志(N.Eng.J.Med.)302：1283(1980)。对淀粉样蛋白的生物化学和组织化学的详细讨论可参阅Glenner，医学杂志(N.Eng.J.Med.)302：1333(1980)。
到此为止，AD的诊断主要通过临床标准评估，脑活组织检查和尸解组织研究而实现。改进在活体内诊断阿尔茨海默氏病方法的研究包括(1)遗传学试验，(2)免疫测定法和(3)成像技术。
根据在数个具有AD正染色体显性形式的罕见家族中发现的Aβ前体蛋白的突变点可以推断Aβ代谢异常是AD形成的必要及充分条件。Hardy，天然遗传学(Nature Genetics)1：233(1992)；Hardy等，科学(Science)256：184(1992)。这些突变发生在从其前体蛋白产生Aβ所必需的N-和C-末端裂分点附近。St.George-Hyslop等，科学(Science)235：885(1987)；Kang等，自然(Nature)325：733(1987)；Potter WO 92/17152。然而，大量AD家庭的遗传学分析已经证明AD是异质的。St.George-Hyslop等，自然(Nature)347：194(1990)。染色体21标记上的连锁仅在一些AD早期发作的家族中出现而未在AD晚期发作的家族中出现。最近，其产物预见含有多重转移膜区域并类似一个完整膜蛋白的染色体14基因已被Sherrington等鉴定，自然(Nature)375：754-760(1995)。该基因可达占早期发作正染色体显性AD的70％。初步的数据显示染色体14突变导致Aβ产生的增加。Scheuner等，神经科学会提要(Soc.Neurosci.Abstr.)21：1500(1995)。与之非常相似的基因的突变已在具有早期发作AD的Volga German宗族的染色体1上被鉴定。Levy-Lahad等，科学(Science)269：973-977(1995)。
对阿朴脂蛋白E基因型的筛分已被推荐为AD诊断的辅助。Scott，自然(Nature)366：502(1993)；Roses，神经学年报(Ann.Neurol.)38：6-14(1995)。但是，这项技术难以实施，这是因为阿朴脂蛋白E4等位基因仅仅是AD的危险因子，而不是疾病的标志。它在很多AD患者中并不存在，而在很多未痴呆的老人中存在。Bird，神经学年报(AnnNeurol.)38：2-4(1995)。
免疫测定法已被应用于AD患者神经化学标记的检查，用于检查与脑脊液中淀粉样蛋白有关的AD。Warner，分析化学(Anal，Chem.)59：1203A(1987)；Potter，WO 92/17152；Glenner等，美国专利No.4,666,829。这些诊断AD的方法还未能发现所有的AD患者，特别是在疾病的早期，并且是侵害性的，需要脊柱穿刺。而且，已经开发了单克隆抗体，用于Aβ成像的探头。Majocha等，核医学杂志(J.Nucl.Med.)，33：2184(1992)；Najocha等，WO 89/06242和Majocha等，美国专利5,231,000。抗体探头的主要缺点是难于使这些大分子通过血脑屏障。使用抗体在活体内诊断AD需显著异常的血脑屏障，以便使其进入脑中。没有令人相信的功能上的证据证明AD患者血脑屏障确实存在异常。Kalaria，脑血管和脑代谢评论(Cerebrovascular & BrainMetabolism Review 4：226(1992)。
Aβ抗体用于AD诊断也有缺点，这是因为它们在神经炎斑之外典型地使扩散沉积的Aβ染色，而且该扩散斑常常占优势。Yamaguchi等，神经病理学(Acta Neuropathol.)，77：314(1989)。扩散斑可以是单独的一类损伤，不一定包括于AD的痴呆过程中，这可通过在同族正常对照组和老年狗中发现扩散斑看出。Moran等，临床医学(MedicinaClinica)98：19(1992)；Shimada等，兽医学杂志(Journal of VeterinaryMedical Science)54：137(1992)；Ishihara等，脑研究(Brain Res.)548：196(1991)；Giaccone等，神经病学(Neurosci.Lett)144：178(1990)。甚至如果扩散斑为神经炎斑的前兆，AD的关键的病理活动可能为显然良性的扩散斑转化为与卤素变性有关的神经炎斑的过程。因此，需要证明神经炎斑和NETs是比同样也标记扩散斑的抗体更具特征的AD病理生理学标记。
最近，放射性标记Aβ肽已被用于标记AD脑切片中的扩散的，紧密的及神经类型的斑点。Maggio等，WO93/04194。这些肽具有抗体的所有缺点。特别是肽不能以成像所需的量正常地通过血脑屏障，和因为这些探头与扩散斑反应，它们可能对AD不是专一性的。
刚果红可用于活体内非脑实质组织中淀粉样变性的诊断。刚果红可能不适于活体内脑中Aβ沉积的诊断，这是因为只有O.03％注射剂量的碘化刚果红可以进入脑实体。Tubis等，美国药学杂志(J.Amer.Pharm.Assn.)49：422(1960)。与刚果红有关的放射性碘化的双偶氮联苯胺类化合物，如Benzo Orange R和Direct Blue 4，已被公开用于体外及活体内的患者器官内淀粉样蛋白沉积的存在与所在部位的检查。Quay等，美国专利Nos.5,039,511和4,933,156。但是，与刚果红相似，Quay公开的所有化合物都含有强酸性磺酸基，它严格地限制了这些化合物进入脑中，使其难于在脑实体中达到成像有效量或检测有效量。
死亡前不能测定AD淀粉样蛋白沉积妨碍了这种致命疾病的研究。死亡前定量测定淀粉样蛋白沉积的方法，既作为一种轻度的或临床意识模糊状况下的诊断工具又作为以防止Aβ沉积为目的的治疗效果的探测手段而被需要。因此，目前最重要的仍是寻找一种通过对活体大脑实体中的淀粉样蛋白成像而在死前诊断AD的安全特效的方法。目前虽然进行了各种活体内诊断AD的尝试，但是仍然没有死前探测脑中淀粉样蛋白的方法。没有一种方法使用了低毒性，可通过血脑屏障，并且比正常大脑更易与AD大脑有效地结合的高亲和力的针对淀粉样蛋白的探测物，以利于在患者死前测定脑中AD淀粉样蛋白的沉积。因此，尚无活体内诊断AD的方法证明已达到这些判别标准。
近期的数据显示淀粉样蛋白结合化合物具有治疗AD和类型2糖尿病的可能性。如上所述，在AD脑中存在两种宽型的斑，扩散斑和神经炎斑(典型的)。扩散斑看起来不诱导形态学反应如反应性星形细胞，营养不良轴突，小神经胶质细胞，突触丧失，以及在神经炎斑中发现的全部补体激活。Joachim等，美国病理学杂志(Am.J.Patho1.)135：309(1989)；Masliah等，loc.cit.137：1293(1990)；Lue和Rogers，痴呆(Dementia)3：308(1992)。这些形态学反应都意味着在邻近神经炎斑紧密的Aβ沉积的区域发生了神经中毒及细胞变性反应。Aβ-诱导的神经中毒和细胞变性已在一些体外细胞模型中有所报导。Yankner等，科学(Science)250：279 1990)；Roher等，BBRC 174：572(1991)；Frautschy等，Proc.Natl.Acad.Sci.88：83362(1991)；Shearman等，loc.cit.91：1470(1994)。现已发现Aβ肽的凝集必然造成体外神经中毒。Yankner，神经生理学年报(Neurobiol.Aging)13：615(1992)。扩散斑和神经炎斑中Aβ凝集状态的差异可说明扩散斑周围神经中毒反应较少。Lorenzo和Yankner，Proc.Natl.Acad.Sci.，91：12243(1994)。最近，三个实验室都报导了刚果红体外抑制Aβ-诱导的神经中毒和细胞变异的结果。Burgevin等，神经学报告(NeuroReport)5：2429(1994)；Lorenzo和Yankner，Proc.Natl，Acad.Sci.91：12243(1994)；Pollack等，神经科学快报(Neuroscience Letters)184：113(1995)；Pollack等，神经科学快报(Neuroscience Letters)197：211(1995)。其机理似乎包括抑制原纤维的形成及防止形成原纤维的神经中毒性质。Lorenzo和Yankner，Proc.Natl.Acad.Sci.91：12243(1994)。刚果红也显示了保护胰岛细胞免受糊精(amylin)导致的神经中毒的作用。Lorenzo和Yankner，Proc.Natl.Acad.Sci.91：12243(1994)。糊精是一种与Aβ相似的纤维肽，它在2型糖尿病患者的胰脏累积。
本领域技术人员已知某些偶氮染料可导致癌症。Morgan等，环境卫生透视(Environmental Health Perspectives，102(supp.)2：63-78(1994)。这种潜在的致癌力很大程度上是由于这样一个原因。偶氮染料通过肠内细菌大量地代谢到游离人体胺中。Cerniglia等，生化生理研究(Biochem，Biophys.Res.Com.)，107：1224-1229(1982)。在使用某些联苯胺染料(以及很多其他取代的联苯胺)时，游离胺便是致癌剂。这些事实对将极小量的高特异活性放射性标记的染料直接注射到血液中的淀粉样蛋白成像研究略有启发。在这种情况下，使用剂量微不足道，染料避开了肠内细菌。
在治疗用途中，这些因素非常重要。从治疗化合物中释放一种已知的致癌剂是不能接受的。偶氮染料代谢带来的第二个问题是服用的大量药品在吸收前被肠内细菌所代谢。其缺点是，即使没有释放代谢物质，它也降低了生物利用度。
因此，需要寻找淀粉样蛋白结合的化合物，它与刚果红相似，但可进入脑中(刚果红不能)。这样的化合物可用于防止与原纤维形成有关的细胞变性，因而可治疗与淀粉样蛋白有关的疾病的病理状态，治疗2型糖尿病胰岛细胞中毒。
进一步需要寻找无毒、生物利用度高，因而可用于治疗的与淀粉样蛋白结合的化合物。
发明概要
因此，本发明的目的是提供一种通过在活体内对脑实体中的淀粉样蛋白成像，从而在死前诊断AD的安全特效之方法。本发明的另一个目的是提供一种使用低毒性的，对淀粉样蛋白高亲和性，可通过血脑屏障，并能区别AD脑和正常脑的探测剂，在病人死前鉴定脑中AD淀粉样蛋白沉积的方法。另一个目的是提供一种防止Aβ沉积或毒性的AD治疗方法。另一个目的是提供一项在活组织中或死后组织样本中对淀粉样蛋白沉积进行染色并检测的技术。另一个目的是提供一种在活体组织或死后组织样本匀浆中定量测定淀粉样蛋白沉积的方法。
为了达到这些目的或另外的目的，根据本发明的一个方面，这里提供与淀粉样蛋白结合的式I化合物或其水溶性无毒盐：其中：为N＝N，C≡C，或CR′＝CR′(其中R′表示H或低级烷基)；X为C(R″)2
(其中R″各自独立地为H，F，Cl，Br，I，低级烷基，CF3，CH2-CH2F，O-CH2-CH2F，CH2-CH2-CH2F，O-CH2-CH2-CH2F，CN，(C＝O)-R′，N(R′)2，NO2，(C＝O)N(R′)2O(CO)R′，OR′，COOR′，三烷基锡，如下所示的四唑或噁二唑：
其中R′为H或低级烷基)或X为CH＝CH，N＝N，C＝O，O，NR′(其中R′表示H或低级烷基)，S，或SO2；R1和R2各自独立地为H，F，Cl，Br，I，低级烷基，CF3，CH2-CH2F，O-CH2-CH2F，CH2-CH2-CH2F，O-CH2-CH2-CH2F，CN，(C＝O)-R′，N(R′)2，NO2，(C＝O)N(R′)2O(CO)R′，OR′，COOR′，三烷基锡，如下所示的四唑或噁二唑：
(其中R′为H或低级烷基)，或如下所示的三氮烯：
(其中R8和R9为低级烷基)或如下所示的基团：Q各自独立地选自下列结构之一，各含一个羧酸或酸样官能度：IA，IB，IC，ID，IE，IF和IG，其中
IA具有如下所示的结构：
其中R3，R4，R5，R6，或R7各自独立地为H，F，Cl，Br，I，低级烷基，CF3，CH2-CH2F，O-CH2-CH2F，CH2-CH2-CH2F，O-CH2-CH2-CH2F，CN，(C＝O)-R′，N(R′)2，NO2，(C＝O)N(R′)2O(CO)R′，OR′，COOR′，三烷基锡，如下所示的四唑或噁二唑：
(其中R′为H或低级烷基)，或如下所示的三氮烯：
(其中R8和R9为低级烷基)或如下所示的基团：其中在两个Q′上都是其R3，R4，R5，R6，或R7有至少一个为羟基，四唑，噁二唑，NO2，或羧基；以及当R5为羟基而R6为羧基或其低级烷基酯时R1，R2，R3，R4，或R7至少有一个不为H；当R5为氨基，R6为羧基或其低级烷基酯，而R7为羟基时，R1，R2，R3，或R4至少一个不为H；当R2为CH3，R5为羟基，而R6为羧基或其低级烷基酯时，R1，R3，R4，或R7至少一个不为H；当R3，R4，或R7为CH3，R5为羟基而R6为羧基或其低级烷基酯时，R1或R2至少一个不为H或CH3；
IB具有如下所示的结构：其中：R10，R11，R12，R13，R14，R15，或R16各自独立地为H，F，Cl，Br，I，低级烷基，CF3，CH2-CH2F，O-CH2-CH2F，CH2-CH2-CH2F，O-CH2-CH2-CH2F，CN，(C＝O)-R′，N(R′)2，NO2，(C＝O)N(R′)2O(CO)R′，OR′，COOR′，三烷基锡，如下所示的四唑或噁二唑：
(其中R′为H或低级烷基)，或如下所示的三氮烯：
(其中R8和R9为低级烷基)或其中在两个Q′上都是其R10，R11，R12，R13，R14，R15，或R16至少有一个为羟基，四唑，噁二唑，NO2或羧基，
IC具有如下所述的结构：其中：R17，R18，R19，R20，或R21中至少一个为H，F，Cl，Br，I低级烷基，CF3，CH2-CH2F，O-CH2-CH2F，CH2-CH2-CH2F，O-CH2-CH2-CH2F，CN，(C＝O)-R′，N(R′)2，NO2，(C＝O)N(R′)2O(CO)R′，OR′，COOR′，三烷基锡，如下所示的四唑或噁二唑：
(其中R′为H或低级烷基)，或如下式所示的三氮烯：
(其中R8和R9为低级烷基)或
ID具有如下所示的结构：其中：R22，R23，或R24各自独立地为H，F，Cl，Br，I，低级烷基，CF3，CH2-CH2F，O-CH2-CH2F，CH2-CH2-CH2F，O-CH2-CH2-CH2F，CN，(C＝O)-R′，N(R′)2，NO2，(C＝O)N(R′)2O(CO)R′，OR′，COOR′，三烷基锡，如下所示的四唑或噁二唑：
(其中R′为H或低级烷基)，或如下所示的三氮烯：
(其中R8和R9为低级烷基)或
表示下列六式中之一的杂环基：
IE具有如下所示的结构：
其中：R25，R26，或R27各自独立地为H，F，Cl，Br，I，低级烷基，CF3，CH2-CH2F，O-CH2-CH2F，CH2-CH2-CH2F，O-CH2-CH2-CH2F，CN，(C＝O)-R′，N(R′)2，NO2，(C＝O)N(R′)2O(CO)R′、OR′、COOR′，三烷基锡，如下所示的四唑或噁二唑：
(其中R′为H或低级烷基)，或如下所示的三氮烯：
(其中R8和R9为低级烷基)或
表示下列六式中之一的杂环基：
IF具有如下所示的结构：
其中：R28，R29，R30，R31，或R32之一为上述式I定义的连接基，其余的R28，R29，R30，R31，或R32各自独立地为H，F，Cl，Br，I，低级烷基，CF3，CH2-CH2F，O-CH2-CH2F，CH2-CH2-CH2F，O-CH2-CH2-CH2F，CN，(C＝O)-R′，N(R′)2，NO2，(C＝O)N(R′)2O(CO)R′，OR′，COOR′，三烷基锡，如下所示的四唑或噁二唑：
(其中R′为H或低级烷基)，或如下所示的三氮烯：
(其中R8和R9为低级烷基)或其中两个Q′上都是其R28，R29，R30，R31或R32至少有一个为羟基，四唑，噁二唑，NO2或羧基，
IG具有如下所示的结构：其中R33，R34，R35，R36，R37，R38，或R39之一为正如上述式I定义的连接基，其余的R33，R34，R35，R36，R37，R38，或R39各自独立地为H，F，Cl，Br，I，低级烷基，CF3，CH2-CH2F，O-CH2-CH2F，CH2-CH2-CH2F，O-CH2-CH2-CH2 F，CN，(C＝O)-R′，N(R′)2，NO2，(C＝O)N(R′)2O(CO)R′，OR′，COOR′，三烷基锡，如下所示的四唑或噁二唑：
(其中R′为H或低级烷基)，或如下所示的三氮烯：
(其中R8和R9为低级烷基)或其中两个Q′上都是R33，R34，R35，R36，R37，R38，或R39至少有一个为羟基，四唑，噁二唑，NO2或羧基，
本发明的另一个目的是提供定义如上的与淀粉样蛋白结合的式I化合物，或其水溶性无毒盐，其中取代基R1-R7和R10-R39中至少有一个选自由131I，123I，76Br，75Br，18F，19F，125I，CH2-CH2-18F，O-CH2-CH2-18F，CH2-CH2-CH2-18F，O-CH2-CH2-CH2-18F以及式I中限定的含碳取代基(其中至少一个碳为11C或13C)构成的一组。
本发明的另一个目的是提供定义如上的与淀粉样蛋白结合的式I化合物，或其水溶性无毒盐，其中当通过与合成的Aβ肽或阿尔茨海默氏病脑组织结合而进行测量时，化合物与Aβ结合的离解常数(KD)在0.0001到10.0μM之间。
本发明的另外的目的是提供一种合成定义如上的，且其中至少一个取代基R1-R7和R10-R39选自由131I，123I，76Br，75Br，18F和19F构成的一组，能与淀粉样蛋白结合的式I化合物或其水溶性无毒盐的方法，其中包括使其中至少一个取代基R1-R7和R10-R39为三烷基锡的定义如上的与淀粉样蛋白结合的式I化合物或其水溶性无毒盐与含131I，123I，76Br，75Br，18F或19F的卤化试剂反应之步骤。
本发明另外的目的是提供一种用于活体内淀粉样蛋白沉积成像的药物组合物，其中包括(a)取代基R1-R7和R10-R39中至少有一个选自由131I，123I，76Br，75Br，18F，19F和式I中限定的含碳基团(其中至少一个碳为11C或13C)构成的一组，或其水溶性无毒盐以及(b)药学上可接受的载体。
本发明另外的目的是提供一种活体内检测淀粉样蛋白沉积的方法，包括以下步骤：(a)施用可检测量的上述药物组合物，以及(b)在该活体中检测该化合物与沉积淀粉样蛋白的结合。本发明的一个目的还提供一种在活体内检测淀粉样蛋白沉积的方法，其中淀粉样蛋白沉积发生于被检测者脑中。本发明的方法可用于怀疑患有选自阿尔茨海默氏病，Down氏综合症，以及阿朴脂蛋白E4等位基因纯合子这一类与淀粉样变性有关的疾病和综合症的患者。
本发明的另一个目的涉及预防与淀粉样变性有关的症状如AD和2型糖尿病中与原纤维形成伴生的细胞变性和毒性的药物组合物和方法。这样的药物组合物包含柯胺G(Chrysamine G)或其上述衍生物以及药学上可接受的载体。这样的化合物是无毒的。
本发明的另一个目的涉及作为对活组织或死后组织样本中淀粉样蛋白沉积造影而染色及测定的探测物的应用。
本发明的另一个目的涉及对活组织或死后组织样本中淀粉样蛋白沉积定量测定的放射性标记探测物的应用。
本发明的另一个目的涉及一种区别阿尔茨海默氏病脑与正常脑的方法。
本发明的其他目的，特征和优点将从下列详细描述中变得更加明显。但是，应当清楚这些表示本发明的优选方案的详细描述和实施例只是以举例说明的方式被给出的，因此从该详细描述出发，本发明的基本精神和范围之内的各种变化和修饰对本领域技术人员来说都是显而易见的。
附图的简要描述
图1A表示柯胺G(Chrysamine G)和已被合成并试验的数种柯胺G类似物或衍生物，包括3-碘衍生物(3-JCG)，3-碘二甲氧基衍生物(3-JCG(OM)2)，二甲基酯衍生物(CG(COOMe)2)，酚衍生物，水杨酸(SA)，苯胺衍生物(1/2 CG)，刚果红，3，3′-二碘衍生物(3，3′- I2CG)，3，3′-二溴衍生物(3，3′-Br2CG)，3，3′-二氯衍生物(3，3′-Cl2CG)，3-溴衍生物(3-溴BrCG)，和5-氟水杨酸衍生物((5-FSA)CG)的化学结构。图中数字指各化合物抑制[14C]柯胺G与合成肽，Aβ(10-43)结合的Ki(以μM计)。
图1B表示数种已被合成和试验的柯胺G类似物或衍生物，包括3，3′-二羧酸衍生物(3，3′-(COOH)2CG)，柯胺G的2，2′-二磺酸衍生物(2，2′-(SO3)2CG)，3-溴，3-异丙基水杨酸衍生物(3-Br-(3-iPrSA)CG)，3-异丙基水杨酸衍生物((3-iPrSA)CG)，2，4-二苯酚衍生物(2，4-Diphenol)，γ-二羟基苯甲酸衍生物((6-OHSA)CG)，3，3′，5，5′四甲基联苯胺衍生物(3，3′，5，5′-(CH3)4CG)，3，3′-二甲基衍生物(3，3′-(CH3)2CG)，2，2′-二甲基衍生物(2，2′-(CH3)2CG)，苯并异噁唑衍生物(CGBenzisoxazole)，和3-羧基炔衍生物(3-(COOH)-C3C)的化学结构。图中数字指各化合物抑制[14C]柯胺G与合成肽，Aβ(10-43)结合的Ki(以μM计)。
图2A-2K表示柯胺G和柯胺G类似物，特别杂环类似物的三烷基锡衍生物的化学结构。注意这些结构式表示一个分子的一半，该分子以右上方的波状键为中心是对称的，除非三烷基锡部分仅在联苯基的一边。三烷基锡衍生物为制备高比放射性卤代放射性衍生物的稳定的中间体和瞬间前体。杂环类似物表示在柯胺G的中等酸性羧酸基团的相同结构位置上取代弱酸性部分的选择性方式。这些三烷基锡前体化合物以其质子化形式表示，但本领域技术人员明白这些图也包括它们的非质子化形式和互变异构形式。2A)柯胺G。2B)柯胺G三烷基锡衍生物。2C)3-羟基-1，2-苯并异噁唑类似物三烷基锡衍生物。2D)邻苯二甲酰亚胺或异吲哚-1，3(2H)-二酮类似物三烷基锡衍生物。2E)邻苯二甲酰肼或2，3-苯并哒嗪-1，4(2H，3H)-二酮类似物三烷基锡衍生物。2F)2，3-苯并噁嗪-1，4(3H)-二酮类似物三烷基锡衍生物。2G)(2H)1，3-苯并噁嗪-2，4(3H)-二酮类似物三烷基锡衍生物。2H)(3H)2-异喹啉(benzazine)-1，3(2H)-二酮类似物三烷基锡衍生物。2I)1，8-萘二甲酰亚胺类似物三烷基锡衍生物。2J)四唑类似物三烷基锡衍生物。2K)噁二唑类似物三烷基锡衍生物。
图3由数种柯胺G的结构类似物做出的[14C]柯胺G与Aβ(10-43)结合的取代曲线。缩写为图1中使用过的。图3A)柯胺G(空三角)；(5-FSA)CG(实菱形)；3，3′-(COOH)2CG(实正方形)；2，2′-(SO3)2CG(实圆形)。图3B)柯胺G(空三角)；刚果红(空圆形)；苯胺衍生物(空倒三角)；苯酚衍生物(空正方形)；水杨酸(X)。在高浓度显示结合增强的曲线表明形成了胶粒。Bedaux，F等，药学周报(Pharm，Weekblad)98：189(1963)。
图4A柯胺G与Aβ(10-43)结合的Scatchard曲线。该曲线表示对两种独立的结合位置模型的非线性最小二乘方。直线表示单一组分。
图4B为[14C]CG与典型对照物(菱形)和AD脑样品(方形)结合的Scatchard分析。虚线斜率与AD线相同，以便于与对照物斜率比较。AD脑样品为48NP/×200倍率，0.35μM KD，和790fmol/μg Bmax的蛋白。对照物为0.48μM KD及614fmol/μgBmax的蛋白。
图5为表示结合测定相对于肽浓度的线性关系的曲线。大约0.9μgAβ(10-43)用于典型的测定。
图6A为表示柯胺G与Aβ(10-43)结合的时间过程的曲线。
图6B为结合速度常数(K1)测定曲线图。
图6C为柯胺G从Aβ(10-43)上解离的时间过程曲线。
图7为柯胺G和Aβ之间相互作用的分子模型示意图。
图8A为表示被结合的[14C]柯胺G的量与AD脑样品中神经炎斑(NP)个数之间的关系的示意图。
图8B为表示被结合的[14C]柯胺G的量与AD脑样品中神经原纤维缠结(NFT)个数之间的关系的示意图。在图8A和8B中，x-轴表示在上/中额(n＝10)或上颞皮质(n＝10)的Bielschowsky染色切片中以×200的放大倍率的平均NP或NFT数，实心符号和实线表示无淀粉样蛋白血管病的脑，空心符号和虚线表示有淀粉样蛋白血管病的脑。Y轴表示在与用于染色的脑相邻的脑样品的匀浆中总的，纯的结合的[14C]柯胺G(fmol/μg蛋白)。大约使用了75μg蛋白和150nM[14C]柯胺。
图9A，9B和9C图9A显示具有超过20NPs/x200放大倍率的AD脑样品，即“高斑AD脑”样品，中结合到各个脑区域的柯胺G。图9B显示具有低于20NPs/x200放大倍率的AD脑样品，即“低斑AD脑”样品，中结合到各个脑区域的柯胺G。数据点表示结合在指定的脑区域的[14C]柯胺G与结合在同一脑的小脑中的[14C]柯胺G的比率。水平条形图表示方式，误差条形图表示对照物(圆环)，和AD脑(9A和9B中的菱形)中标准差。脑区域包括额极(FP)，尾状核头(CAU)，上/中额(SMF)，上颞(ST)，下壁(IP)，和视部(OC)皮质。星号指与对照物比有明显差异(*P＜0.05；**P＜0.001)。图9C表示两个Down’s综合症脑样品。9C中菱形表示未发现AD症状的23岁Down’s综合症患者的脑。9C中三角表示51岁Down’s综合症患者的脑。该患者如同大多数Down’s综合症患者一样在40岁时发展为AD。
图10为将[14C]柯胺G从外侧尾静脉注射并在图中所示时间处死的小鼠组织中柯胺G的水平的曲线。空心符和细线表示单位cpm/g组织中的绝对放射性(左轴)。实心符和实线表示脑放射性与肾脏(上图)或血液(中图)的比。比率标在右轴。
图11上图：使用Stokes和Triokey，临床病理学杂志(J.Clin.Pathol.)26：241-242(1973)的方法用柯胺G染色的AD脑下颞叶切片。两个神经炎斑清晰可见。下图：伴有淀粉样蛋白血管病的AD患者的相邻的颞叶切片。左图：用Puchtler的刚果红法染色的脑切片。Puchtler等，组织化学与细胞化学杂志(J.Histochem.Cytochem.)10：35(1962)。条状图形表示20微米。右图：用柯胺G代替Puchtler法中刚果红染色的相邻的脑切片。两个切片都容易地显示了相同的淀粉样蛋白充满的脉管。红细胞和脂褐质的小量背景自体荧光也清晰可见。所有显微照片都使用荧光素异硫氰酸酯(FITC)滤器获得。
图12显示有无柯胺G存在下增加Aβ(25-35)浓度对兔嗜铬细胞瘤(PC-12)细胞的氧化还原活性的影响的条形图，它是通过溴化3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑鎓，MTT，还原作用来测量的。MTT还原产物在560nm处的吸收标于垂直的轴。只有Aβ(25-35)的效果显示于实心条形图，图中显示剂量决定于MTT还原的减少。与对照组(无Aβ(25-35)，无柯胺G)的显著差异显示于实心条形图中的空白处。20μM柯胺G的保护作用显示于空心条形图中。有无柯胺G存在时MTT还原的显著差异以黑字显示于空心条形图中。
图13。显示增加柯胺G的浓度对Aβ(25-35)诱导的兔嗜铬细胞瘤(PC-12)细胞氧化还原活性的还原作用的保护效果的条形图，它是通过溴化3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑鎓，MTT，还原作用来测量的。MTT还原产物在560nm处的吸收标于垂直的轴。无Aβ(25-35)时柯胺G的效果显示于实心条形图中。对照组(无Aβ(25-35)，无柯胺G)在无Aβ(25-35)存在下与任何浓度的柯胺G之间无明显差异。在存在1μMAβ(25-35)以浓度增加的柯胺G时的MTT还原作用显示于空心条形图中。各浓度柯胺G条件下，在有无Aβ(25-35)存在之间的MTT还原作用的显著差异显示于实心条形图的白色处，在Aβ(25-35)对照组(无柯胺G)和Aβ(25-35)加增加浓度的柯胺G之间的MTT还原作用的显著差异显示于空心条形图的黑色处。
图14柯胺G与其非活性酚衍生物对由Aβ(25-35)诱导的毒性作用的比较。除对照组外，所有实验中Aβ(25-35)的浓度为1μM。浓度为0.1和1μM的柯胺G显示了保护作用，但酚衍生物未显示保护作用，也许还增加了Aβ的毒性。
优选方案的详细描述
本发明开发了柯胺G及其放射性标记的衍生物通过活体内的血脑屏障并与神经炎(但非扩散)斑中沉积的Aβ，与脑血管淀粉样蛋白中沉积的Aβ，以及与由NFT中沉积的蛋白构成的淀粉样蛋白结合的能力。柯胺G为刚果红的衍生物，其重要的结构差异是刚果红的磺酸部分在柯胺G(图1)中被羧酸基团取代。这种结构改变使柯胺G比刚果红和大分子如抗体更易进入脑中。Tubis等，美国药学会志(J.Am.Pharmaceut.Assn.)49：422(1960)。并且，柯胺G可能是比抗体更特异的AD病理生理学标志，后者也标记扩散性斑，这是由于柯胺G对神经炎斑和NFTs具有明显的特异性。
本发明的柯胺G衍生物具有下列特征：(1)与活体内合成Aβ的特异性结合，(2)在脑切片中与神经炎非扩散斑结合，(3)活体内通过难逾越的血脑屏障的能力。
本发明的方法可测定患者器官或躯体区，特别是脑中淀粉样蛋白沉积的发生和位置。该方法包括对患者使用测定有效量的含上面定义的被称为“测定化合物”的式I化合物或其药学上可接受的水溶性盐的药物组合物。“测定有效量”指使用后能满足对化合物与淀粉样蛋白的结合测定所需的测定化合物之量。“成像有效量”指使用后能满足对化合物与淀粉样蛋白的结合成像测定需要之化合物量。
本发明使用淀粉样蛋白探测剂，该探测剂与无神经损伤成像技术如磁共振光谱(MRS)或磁共振成像术(MRI)，或γ成像术，如正电子发射X线断层照相术(PET)或单光子发射计算X线断层照相术(SPECT)一起用于活体内淀粉样蛋白沉积的定量测定。术语“活体内成像”指可以测定标记的柯胺G，标记的柯胺G衍生物或者如上所述的标记的本发明式I化合物的方法，就γ成像而言，测量从被检查的器官或区域发射出的射线，并将其以总结合值或一种比值来表达，所述比值是被标准化的一个组织中的总结合与(例如相除)进行同样体内成像法期间内同一被测者的另一个组织中的总结合之比。活体内总的结合是以通过活体成像技术在一个组织中测定的总的信号定义的，该技术不需要通过第二次注射等量标记化合物以及过量未标记，但其他化学性质相同的化合物来校正。“受测者”为哺乳动物，优选人，最优选怀疑患有痴呆症的人。
为了实现活体成像的目的，可得到的测定仪器的类型是选择给定标记的重要因素。例如，放射性同位素和19F特别适用于本发明方法中的活体内成像。所使用仪器的类型将决定放射性核素或稳定的同位素的选择。例如，所选择的放射性核素必须具有可被所给定类型仪器测定的衰变形式。需要考虑的另一因素是核素的半衰期。半衰期应该长到足以在被测者摄入时间达极大值的情况下仍可测定，短到不至于对被测者产生持久的有害放射性。本发明放射性标记化合物可使用γ成像术测定，其中对发射的合适波长γ射线进行测定。γ成像法包括(但不限于)SPECT和PET。对于SPECT测定，优先选择的放射性标记缺乏微粒发射，而在140-200keV范围产生大量光子。对于PET测定，放射性标记将是发射正电子的放射性核素，如19F，它将消除两条511keV的γ射线，这可通过PET摄影仪测定。
本发明使用与淀粉样蛋白结合的化合物/探测剂在活体内对淀粉样蛋白沉积进行成像及定量测定。这些化合物可与无损伤神经成像技术如磁共振光谱(MRS)或磁共振成像(MRI)，正电子发射X射线断层照相术(PET)，和单光子发射计算X线断层照相术(SPECT)协同使用。根据本发明，可通过本领域已知的普通有机化学技术将柯胺G衍生物用19F或13C标记而用于MRS/MRI。见，例如，March，J.“高等有机化学：反应，机理，和结构(ADVANCED ORGANIC CHEMISTSY：REACTIONS，MECHANISMS，AND STRUCTURE)(第三版，1985)”，特此将其内容纳入参考文献。对于PET也可通过本领域已知技术以及Fowler.J.和Wolf. A.在“正电子发射X线断层照相术和放射自显影”(POSITRON EMISSION TOMOGRAPHY AND AUTORADIOGRAPHY)(Phelps，M，Mazziota，J.，and Schelbert，H.eds.)391-450(Raven Press，NY1986)中所述的方法用18F，11C，75Br，或76Br将柯胺G衍生物标记，特此将上述文献的内容作为参考文献。对于SPECT也可通过本领域的几种技术中的任何一种用123I标记柯胺G衍生物。参见，例如，Kulkarni，放射性应用与原理杂志(Int.J.Rad.Appl.& Inst.)(Part B)18：647(1991)，特此将其内容作为参考文献。另外，可用任何合适的放射性碘同位素，例如，但不限于131I，125I，或123I，通过直接碘化重氮化氨基衍生物，经碘化重氮物标记柯胺G衍生物，参见Greenbaum，F.美国药学杂志(Am.J.Pharm.)108：17(1936)，或使用本领域已知方法中的任何一种通过将不稳定的重氮化胺转化成稳定的三氮烯，或通过将非放射性的卤代前体转化成稳定的三烷基锡衍生物，然后将其转化成碘化物而标记柯胺G衍生物，参见，Satyamurthy和Barrio有机化学杂志(J.Org.Chem.)48：4394(1983)，Goodman等，有机化学杂志(J.Org.Chem.)49：2322(1984)，Mathis等，标记化合物和放射性药物杂志(J.Labell.Comp.and Radiopharm.)1994：905；Chumpradit等，医用化学杂志(J.Med.Chem.)34：877(1991)；Zhuang等，医用化学杂志(J.Med.Chem.)37：1406(1994)；Chumpradit等，医用化学杂志(J.Med.Chem.)37：4245(1994)。例如柯胺G的稳定的三氮烯或三烷基锡衍生物或其类似物与含131I，125I，123I，76Br，75Br，38F或19F的卤化剂反应。因此，柯胺G稳定的三烷基锡衍生物及其类似物为用于合成本发明的很多放射性标记的化合物的新的前体。因此，这些三烷基锡衍生物为本发明的一个优选方案。
也于用已知的金属放射性标记物，如锝-99m(99mTc)标记柯胺G衍生物。放射性标记领域普通技术人员无需太多实验便可修饰取代基引入结合这样的金属离子的配位体。然后，可使用金属标记的柯胺G衍生物测定淀粉样蛋白沉积。
本发明的方法可使用可被核磁共振光谱测定的同位素，从而实现活体内成像及光谱分析。磁共振光谱中特别有用的元素包括19F和13C。
适用于本发明目的的放射性同位素包括β-发射体，γ-发射体，正电子发射体，和X-射线发射体。这些放射性同位素包括131I，123I，18F，11C，75Br，和76Br。根据本发明，适用于磁共振成像(MRI)或光谱(MRS)的合适的稳定同位素包括19F和13C。适用于活组织匀浆或死后组织匀浆中淀粉样蛋白体外定量分析的放射性同位素，包括125I，14C，和3H。用于活体内PET成像的优选的放射性标记物为18F，用于SPECT成像的是123I，用于MRS/MRI的是19F，以及用于体外研究的是3H或14C。但是，根据本发明，任何用于显影诊断探查的常规方法都可被使用。
该方法可被用来诊断轻度的或临床精神混乱状况下的AD。该技术也将开拓淀粉样蛋白沉积高危人群如Down’s综合症，家族AD，以及阿朴脂蛋白E4等位基因纯合子中的淀粉样蛋白沉积的纵向研究。Corder等，科学(Science)261：921(1993)。遵循淀粉样蛋白沉积时间顺序的方法可测定沉积是否在痴呆开始前很长时间发生，或者沉积是否与痴呆无关。该方法可用于监测以防止淀粉样蛋白沉积为目的的治疗效果。
一般说来，测定标记柯胺G衍生物的剂量将有很大变化，可由本领域有经验的医生根据各种因素如年龄，状况，性别，以及病人的病情，禁忌，任何可能的同时进行的治疗和其他可变因素来调节。剂量可从0.001mg/kg到1000mg/kg，优选0.1mg/kg到100mg/kg内变化。
对患者的给药可以是局部给药，也可以是系统给药，完成给药的方式有静脉给药，动脉给药，鞘内给药(经脑脊液)等。根据检查时的体位也可以是真皮内给药或体腔内给药。化合物与淀粉样蛋白结合后足够长的一段时间，例如30分钟到48小时之后。通过常规成像技术例如MRS/MRI，SPECT，平面闪烁成像，PET，和出射成像技术，等，检查受试者的特定区域。精确的原始记录必然取决于如上所述的患者的特殊的因素，取决于检查时的体位，给药方法和所使用的标记物的类型；对本领域技术人员来说具体给药方法是显而易见的。对于脑部成像，优选地测量结合的放射性标记的柯胺G或柯胺G衍生物或类似物的量(总的或特异结合的)并将其与结合到患者小脑上的标记柯胺G或柯胺G衍生物的量比较。然后将该比率与年龄相当的正常脑的同一比率比较。
本发明的药物组合物优选地以注射组合物的形式给药。用于该目的典型的组合物包含药学上可接受的载体。例如，该组合物可在每毫升含NaCl的磷酸盐缓冲液中含约10mg人体血清白蛋白和从约0.5到500微克被标记的柯胺G或柯胺G衍生物。其他药学上可接受的载体包括水溶液，无毒赋形剂，包括盐，防腐剂，缓冲剂以及如在REMINGTON’S药物科学(REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES)，15thEd.Easton：Mack Pubishing Co.PP.1405-1412和1461-1497(1975)以及美国国家药品集十四版(THE NATIONAL FORMULARY XIV.)，14thEd.Washington：美国药学会(American Pharmaceutical Association)(1975)中所述的赋形剂，特此将上述文献的内容作为参考文献。
非水溶剂的例子有丙二醇，乙二醇，植物油和注射用有机酯如油酸乙酯。含水载体包括水，醇/水溶液，盐水溶液，肠胃外载体如氯化钠，Ringer’s右旋糖，等。静脉内载体包括流动的和营养的显影液再生剂。防腐剂包括抗微生物剂，抗氧剂，螯合剂和惰性气体。药物组合物的pH值和各组分的确切浓度可根据本领域常规技术调节。参见，Goodman和Gilman’s治疗的药理学基础(THE PHARMACOLOGICALBASIS FOR THERAPEUTICS)(7th Ed)。
特别优选的本发明药物组合物为除了在活体内可与淀粉样蛋白特异性结合并能通过血脑屏障外，而且在适当剂量水平下无毒并具有令人满意的有效期的药物组合物。分子模型
分子模型根据Evans和Sutherland PS-300计算机图解系统制作，运行计算机模型程序MacroModel(版本2.5可从哥伦比亚大学(ColumbiaUniversity)C.Still得到)。以反平行β-折叠形式产生Aβ肽链。Kirschner等，Proc.Natl.Acad.Sci. U.S A.83：503(1986)。所使用的淀粉样蛋白肽无需进一步结构修饰。Aβ肽的排列应使相间的链的间隔为4.67，这是β-折叠原纤维的特征。Kirschner，supra。将柯胺G能量最低化并与原纤维模型一起排列，使其最大限度地与Aβ(10-43)赖氨酸-16和疏水性苯丙氨酸-19和-20区接触。
与Aβ合成肽特异性结合的特征鉴定：亲和性，动力学
特征，最大程度的结合
首先使用称为Aβ(10-43)的合成Aβ肽分析柯胺G及结合的柯胺G衍生物的特征。选择10-43肽是因为已有报导显示该肽能提供一个包含Aβ肽全部结构特征的模型系统。Hilbich等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)218：149(1991)。具有9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)化学特征的Aβ的10-43氨基酸片段由匹兹堡大学肽合成实验室合成。该肽由质谱鉴定，主要组分的MR为3600g/mole(计算值3598)。使用Hiblich等的方法进一步纯化该肽，简言之，该方法由下述步骤组成：用70％甲酸在Biogel P10柱(2×180cm，200-400目，Biorad，Richmond，CA)洗脱，接着用1M乙酸在Biogel P4柱(2×180cm，200-400目)第二次洗脱进行顺序大小排阻层析。Hiblich等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)218：149(1991)。将该肽在-80℃冻干并贮存到用于结合测定。Aβ(10-43)的氨基酸序列如下： 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala 22 23 24 25 26 27 28 29 30 3 1 32 33 Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr
对合成Aβ(10-43)的结合测定
结合测定在12×75mm的硼硅酸盐玻璃管中进行。在10％乙醇/水中加入各种浓度的无放射性的柯胺G衍生物。加入乙醇是为了防止胶粒的形成。这种情况经常发生于偶氮染料衍生物中，而这些胶粒甚至在无肽的情况下都会被滤器截获。在上述溶液中，加入25μl 0.36mg/ml的Aβ(10-43)在H2O中的悬浮液，并加入10％乙醇使体积达到950μl。室温下温育10分钟后，加入50μl存在于40％乙醇中的[14C]柯胺G，达到使用的[14C]柯胺G制剂所要求的100-125nM的最终[14C]柯胺G浓度。将结合混合物在室温下温育30分钟。在室温下通过使用BrandelM-24R Cell Harvester(Gaithersburg，MD)的Whatman GF/B滤器进行真空过滤分离结合的与游离的放射性物质，接着每份用3ml的10％乙醇洗涤两次。将滤器在装入7.0ml塑料闪烁小瓶的4ml Cytoscint-ES闪烁体(ICN Biomedicals，Inc.Irvine，CA)中平衡过夜。上述测定及所有的结合测定中，温育液至少配制三份，其结果以平均±标准差表示。
动力学研究
与Aβ(10-43)结合的[14C]柯胺G的动力学研究在13×100mm硼硅酸盐玻璃试管中按上述过滤测定法进行。对于结合的动力学，将25μl0.36mg/ml Aβ(10-43)溶于475μl10％乙醇并在0时间将4.5ml 125nM[14C]柯胺G加入该溶液。将该混合物在室温下迅速涡旋并在5，10，20，30，45，60，75，135，240，和300秒的时间通过使用Brandel M-24R CellHarvester(Gaithersbug，MD)的Whatman GF/B滤器真空过滤以停止结合反应，接着用每份3ml的10％乙醇洗涤两次；结合的放射性按上述测定。
对于解离动力学，将25μl 0.36mg/mlAβ(10-43)溶于450μl10％乙醇，接着加入25μl2.5μM的40％乙醇中的[14C]柯胺G。将该混合物涡旋并在室温温育30分钟。在0时间将该混合物用45ml 10μM的10％乙醇中的无放射性的柯胺G稀释，将该混合物迅速涡旋并在0.5，1.5，3，5，和15分钟的时间按上述过滤方法停止解离，按上述测定结合的放射性。与阿尔茨海默氏病脑的特异性结合的特征鉴定
柯胺G与AD和对照脑匀浆的结合
尸检脑样品从匹兹堡大学阿尔茨海默氏病研究中心神经病理学基础教研室(Neuropathology Core of the Alzheimer’s Disease ResearchCenter of the University of Pittsburgh)得到。根据公开的NIA会议报告规定的标准，对照样品被限定为未达到AD的神经病理学判别标准(足够的NPs或NFTs数)的样品，Khachaturian，神经病学概论(Arch.Neurol.)42：1097(1985)。被研究的脑样品为八个对照样品(年龄58-75)。十一个AD(年龄61-84)和两个Down综合症脑(年龄23和51)。AD脑中有六个为高斑数(＞20 NPs/×200放大倍率)，五个为低斑数(＜20 NPs/×200放大倍率)。两个对照样品为临床表现为痴呆但无NPs或NFTs并已被诊断为“缺乏明显的组织学特征的痴呆”的脑样品。见Knopman痴呆(Dementia)4：132(1993)。另一个对照样品具有痴呆和橄榄体脑桥小脑的萎缩的症状。其他对照样品无神经疾病的临床或组织学的迹象。将尸检样品迅速在-70℃冷冻并在此温度下贮存直到被匀浆。对五份位于被研究脑的上和中前回与上颞同形皮质的连接点的皮层中的2和4层之间分离但又相邻的区域(×200放大率)的切片中的NPs和NFTs计数。定性评定上/中额皮层中存在的淀粉样蛋白血管病。使用Bielschowsky银浸渗法鉴定NPs和NFTs，使用刚果红染色法鉴定大脑淀粉样蛋白血管病。这些方法已被详细公开。见Moossy等，神经病学概论(Arch.Neurol.)45：251(1988)。用于与CG在上/中额或上颞皮层结合的样品大体上与用于NP和NFT计数的皮层相邻。
将大约100mg存在于10％乙醇中浓度为10-20mg脑/ml的取自上和中额皮层连接点，上颞皮层，额极，尾状核头，下壁皮层，枕部皮层，或小脑用Polytron组织匀浆器(PT10/35，Brinkman InstrumentsInc.Westbury，NY)在位置6匀浆30秒。不是所有的区域都可从各脑中得到。将25-150μl组织等分试样(按Lowry等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)193：265(1951)的方法，约25-300μg)与在最终体积为1.0ml的10％乙醇中的10-750nM[14C]CG(26.8 Ci/mole)一起置于12×75mm硼硅酸盐玻璃试管中在室温下温育30分钟。正常情况下，对于小脑比率研究大约使用150μg蛋白和75nM[14C]CG，对于与NPs，NFTs，以淀粉样蛋白血管病有关的研究大约使用75μg蛋白和150nM[14C]CG。为了防止与双偶氮染料衍生物形成胶粒需要使用乙醇，因为甚至在无组织的情况下该胶料都被滤器截获。室温下通过使用BrandelM-24R Cell Harvester(Gaithersburg，MD)的Whatman GF/B滤器真空过滤而分离结合的和游离的放射性物质，接着每份用3ml 10％乙醇洗涤两次。将滤器在装入7.0ml塑料闪烁小瓶的4ml Cytosint-ES闪烁体(ICN Biomedicals，Inc.，Irvine，CA)中平衡过夜然后计数。饱和的(特有的)结合定义为在20μM未标记的CG存在下总结合减去剩余(未饱和的)的结合。除非另有说明，在所有结合测定中，温育液至少配制三份，其结果以±标准差表示。结果既可以所给脑区中fmol结合的[14C]CG/μg蛋白的绝对值表示，也可以该脑区中fmol/μg蛋白与同一脑的小脑中的fmol/μg蛋白的比来表示。辛醇/水分配
在5.0ml 1-辛醇中制备大约75μM的柯胺G或其类似物的溶液。加入5ml磷酸盐缓冲的盐水(0.15M NaCl，5mM磷酸钾，pH7.4)并将其迅速涡旋混合。然后在1,000g离心促使该混合物形成明显的两相。用分液漏斗分离各层，在各600μl的各层中用400μl乙醇稀释，测定389nm处柯胺G的吸收度以及各类似物的λmax。校正两种溶剂中的摩尔吸收系数差后，测定浓度，分配系数表示在辛醇层中的浓度除以在水层中的浓度。实验分三份进行。柯胺G与阿尔茨海默氏病脑淀粉样蛋白沉淀结合的成像
为了更清楚地说明CG与组织的结合，按照Puchtler等，组织化学细胞化学杂志(J.Histochem.Cytochem.)10：355(1962)的碱性刚果红方法和Stokes和Trickey，临床病理学杂志(J.Clin.Pathol.)26：241-242(1973)的方法，用CG和刚果红对脑血管淀粉样蛋白严重沉积的AD脑的相邻的8微米石蜡切片染色。在CG染色过程中，除用CG代替刚果红外，其他程序相同。使用异硫氰酸荧光素(FITC)滤器检查被染色的载片。化合物通过血脑屏障的测定
小鼠研究 通过侧尾静脉给雌性Swiss-Webster小鼠注射0.9％NaCl溶液中的大约0.03μCi/g[14C]柯胺G。注射后以15分钟，35分钟，1小时，4小时，和24小时的间隔通过颈脱位处死小鼠。迅速收集颈动脉血，脑，肝，和肾，称重并使用毛玻璃匀浆器在蒸馏/去离子H2O中匀浆，取等分试样称重装入一个18.0ml的塑料闪烁小瓶(Beckman Poly-Q-Vial)并在加入10.0ml闪烁合剂(Cytoscint-ES(ICN))及平衡过夜后计数。组织中的[14C]柯胺G含量以cpm/mg组织表示。
除注射0.05μCi/g[14C]柯胺G以及在60分钟处死小鼠外，按上述进行从组织中提取放射性物质的实验。然后将脑和肝移出并用Folch的方法提取。Folch等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)226：447(1957)。在两种组织中，95％以上的被提取的放射性物质含于有机层。将有机层蒸干，再悬浮于少量10％甲醇/90％ACN中，并注射到硅胶柱上(Prep Nova Pak HR Silica，7.8×300mm，Waters，Milford，MA)并用相同的溶剂进行同溶剂(isocratically)洗脱。在上述条件下，99％的放射性物质在较早的溶剂馏份中洗脱出来，但大部分脂类保留时间较长，这使较早的馏份可以合适地注射到上述反相C4柱系统中。将所有较早的溶剂馏份收集，干燥，并再悬浮于10％ACN/90％磷酸钠缓冲液(5mM，pH6)中，将其与鉴定过的无放射性的柯胺G一起注射到C4柱上。收集一分钟的馏份，加入10mlCytoscint-ES后计数。
在另一优选方案，本发明涉及防止与某种“伴有淀粉样变性的”状况下的原纤维形成有关的细胞变性成中毒的药物组合物和方法，上述“伴有淀粉样变性的”状况包括如阿尔茨海默氏病，Down’s综合症和2型糖尿病，遗传性大脑出血性淀粉样变性(Dutch)，淀粉样蛋白A(反应性)，继发性淀粉样变性，家族地中海热，伴有荨麻疹和耳聋的家族淀粉样蛋白肾病(Muckle-Wells综合症)，淀粉样蛋白λL-链或淀粉样蛋白KL-链(自发的，与骨髓瘤或巨球蛋白血症有关的)Aβ2M(慢性血液透析)，ATTR(家族淀粉样蛋白多神经病(葡萄牙的，日本的，瑞典的)，家族淀粉样蛋白心肌病(丹麦的)，分离的心脏淀粉样蛋白，(系统性老年淀粉样变性)，AIAPP或支链淀粉胰岛瘤，心钠素(atrial naturetic factor)(分离的心房淀粉样蛋白)，原降钙素(甲状素髓样癌)，凝溶胶蛋白(家族淀粉样变性(法国的))，抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C(具有淀粉样变性的遗传性大脑出血(冰岛的))，AApo-A-I(家族淀粉样变性多神经病-衣阿华)，AApo-A-II(加速小鼠衰老)，与淀粉样蛋白有关的纤维蛋白质，以及Asor或PrP-27(scrapie，Creutzfeld Jacob病，Gertsmann-Straussler-Scheinker综合症，牛海绵状脑炎)或作为阿朴脂蛋白E4等位基团纯合子的人。该方法包括对患有或极有可能发展为上述与淀粉样变性有关的疾病的治疗对象使用包含柯胺G或其一种如上所述的衍生物的药物组合物。
由于某些二偶氮化合物可能是致癌物，因此本发明的治疗化合物只包括无毒，无致癌作用的化合物。即，本发明提出的通过仅使用基于3，3′，5，5′-四甲基联苯胺的二偶氮化合物(解决)潜在的致癌性的问题。很多研究已证明3，3′，5，5′-四甲基联苯胺为无诱变性，无致癌性的取代的联苯胺。Holland等，四面体(Tetrahedron)，30：3299-3302(1974)。De Serres和Ashby(eds.)致癌剂短期试验评估(Evaluation of Short-Term Test for Carcinogens)，Elsevier North-Holland，1981。3，3′，5，5′-四甲基联苯胺已在偶氮染料中用作联苯胺取代产物。Josephy和Weerasooriya，化学生物学相互作用(Chem.-Biol.Interactions)，1984：375-382，(1984)。Ashby等，癌的产生(Carcinogenesis)3：1277-1282(1982)。本发明人已合成了柯胺G的四甲基类似物(4，4′-二(3-羧基-4-羟苯基偶氮基)-3，3′，5，5′-四甲基联苯)并已发现它与合成的Aβ(10-43)结合的Ki值为0.75±.09μM，该值约为柯胺G的两倍。
使用偶氮化合物的链烯和炔衍生物可避免生物利用度低的潜在问题。这些化合物不是细菌或哺乳动物偶氮基还原酶还原的底物。
实际上，用于治疗目的的本发明化合物优于已知化合物是因为它们既包含无诱变性，无致癌性的联苯胺衍生物，又包含非细菌偶氮还原酶底物的链烯基或炔基连接的联苯胺衍生物。
体外研究已经证明Aβ神经中毒性需要原纤维的形成并且它可被刚果红抑制。特别地，现已证明与淀粉样蛋白原纤维结合的刚果红通过抑制原纤维形成或通过与形成的原纤维结合而抑制原纤维的Aβ神经中毒性。Lorenzo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：12243-12247(1994)。已证明刚果红可抑制与糖尿病有关的支链淀粉，另一类淀粉样蛋白原纤维的胰岛细胞毒性。Lorenzo等，supra.也可参见，Burgevin等，神经学通讯(NeuroReport)5：2429(1994)；Pollack等，神经学快报(Neurosci.Letters)184：113-116(1995)；Pollack等，神经学快报(Neuroscience Letters)197：211(1995)。这些文献显示与淀粉样蛋白结合的化合物如柯胺G及其衍生物与刚果红相似，可有效地防止淀粉样变性症状中与原纤维有关的细胞变性和中毒，所不同的是，这些化合物更易进入脑中。
实施例8和图12和13显示具有与前面报导的刚果红极其相似的与剂量有关的防止大鼠嗜咯细胞瘤的作用。因此，这些体外测定提供了一种选择用于防止与原纤维形成有关的细胞变性和中毒的药物组合物的化合物的方法。
根据本发明，在动物模型，如大脑淀粉样变性的“老年动物”模型，Wisniewski等，神经病理与神经学实验杂志(J.Neuropathol.& Exp.Neurol.)32：566(1973)，家族地中海热小鼠模型(神经化学(Neurochem.)，Inc.Kingston，Ontario，Canada)和阿尔茨海默一型神经病理学突变小鼠模型，Games等，自然(Nature)373：523-527(1995)中，通过测量营养不良性轴突形成，突触的损失，神经原纤维缠结形成和神经胶质增生，试验例如柯胺G及其上述衍生物的化合物在活体内防止淀粉样蛋白原纤维形成或与此有关的细胞变性的效果。在家族地中海热模型中，动物发生了全身蛋白样变性。在根据本发明的活体内测定中，对用和未用本发明化合物处理的动物进行一系列尸体解剖以比较评估淀粉样蛋白形成的抑制作用。在大脑淀粉样蛋白形成的动物模型中，除了顺序试验淀粉样蛋白的生成外，也通过一系列用和未用本发明化合物处理的动物的尸检测量营养不良性轴突形成，突触损失，神经原纤维缠结形成和神经胶质增生，从而测定与淀粉样蛋白有关的神经变性。
根据本发明，对预期出现淀粉样蛋白或淀粉样蛋白原纤维形成，细胞变性和中毒的受治疗者使用含柯胺G或其衍生物的药物组合物。在优选方案中，受治疗者包括，例如，极可能产生大脑淀粉样蛋白的人，包括早期的，未表现为痴呆的群体或具有与淀粉样变性有关的疾病和2型糖尿病的患者。术语“防止”的意义包括与原纤维形成有关的细胞变性和中毒的好转。“好转”指防止早期出现中毒症状，如痴呆的患者发生更严重的细胞变性和中毒。
用于防止淀粉样变性疾病中与原纤维形成有关的细胞变性和中毒用的药物组合物包含柯胺G或其上述衍生物和药学上可接受的载体。在一个优选方案中，这样的药物组合物包括血清白蛋白，柯胺G或柯胺G衍生物以及含NaCl的磷酸盐缓冲液。其他药学上可接受的载体包括水溶液，无毒赋形剂，包括例如REMINGTON’s PHARMACEUTTCALSCIENCES，15th Ed.，Easton：Mack Publishing Co.，pp.1405-1412和1461-1487(1975)和美国国家药品集十四版(THE NATIONALFORMULARY XIV.)，14th Ed.Washington：American PharmaceuticalAssociation(1975)，以及美国药典十八版(the UNITED STATESPHARMACOPEIA XVIII，)，18th Ed.Washington：AmericanPharmaceutical Association(1995)，中所述的盐，防腐剂，缓冲液等，特此将上述文献的内容作为参考收编于此。
非水溶剂的例子有丙二醇，聚乙二醇，植物油和注射用有机酯如油酸乙酯。含水载体包括水，醇/水溶液，盐水溶液，非肠道载体如氯化钠，Ringer’s右旋糖，等。静脉内载体包括流动的和营养的显影再生剂。防腐剂包括抗微生物剂，抗氧剂，螯合剂和惰性气体，药物组合物的pH和各组分的精确的浓度可根据本领域常规技术调节。参见，Goodman和Gilman’s THE PHARMACOLOGICAL BASIS FORTHERAPEUTICS(7th Ed.)。
根据本发明，这样的药物组合物可以液体或固体的形式口服给药，以悬浮液或溶液的形式静脉注射或肌肉注射。术语“药学有效量”是指防止与原纤维形成有关的细胞变性和中毒的量，该量随患者的年龄，体重和状况而有变化，可由本领域普通技术人员根据已知的常规方法调节。优选方案中，剂量为每天0.1到100mg/kg，或者分成更小的剂量每天使用二到四次。这样的剂量制度可持续到患者生命的每一天。选择性地，可以每天1到100mg/kg的剂量将该药物组合物肌肉注射给药六周。
在另一方面，本发明涉及在活组织或死后组织中测定淀粉样蛋白沉积的方法。该方法包括用上述式I化合物的溶液温育福尔马林固定的组织。优选该溶液可用式I化合物饱和的25-100％乙醇溶液，(其余为水)。温育过程中，化合物将组织中沉积的淀粉样蛋白染色或标记，被染色或标记的沉积物可按任何标准方法测定或显影。这样的测定方法包括显微技术如明视场，萤光，激光-共焦点和交叉偏振显微镜。
另一方面，本发明涉及一种定量分析活组织或死后组织中淀粉样蛋白的方法。该方法包括温育标记的柯胺G衍生物，优选式I化合物或其水溶性无毒盐，与活组织或死后组织的匀浆。该组织按本领域已知的方法获得并匀浆。尽管技术人员熟悉各种标记物质如酶，化学发光和免疫荧光化合物，但优选的标记物质为放射性标记物。优选的放射性标记物为125I，14C或3H，式I化合物优选的标记取代基至少为R1-R7，R10-R27中的一个。含淀粉样蛋白沉积物的组织将与标记的柯胺G衍生物结合。然后按任何技术人员已知的方法，如过滤，将已结合的组织与未结合的组织分离。然后按任何技术人员已知的方法定量分析已结合的组织。见实施例3。然后通过与由温育已知量的淀粉样蛋白与放射性标记的柯胺G衍生物制作的标准曲线比较而将与被标记的柯胺G衍生物结合的组织的单位转化成每100mg组织中淀粉样蛋白的微克数。
另一方面，本发明涉及一种区别阿尔茨海默氏病脑与正常脑的方法，该方法包括从(i)小脑和(ii)用一脑中小脑之外的其他区域，从正常受试者和怀疑患有阿尔茨海默氏病的受试者获得脑组织。见实施例3。使用本领域技术人员已知的方法将该组织分别制成匀浆，然后与放射性标记的柯胺G衍生物一起温育。然后计算各组织类型(例如小脑，非小脑，正常的，不正常的)中与放射性标记的柯胺G衍生物结合的组织的量，并计算正常组织中和怀疑患有阿尔茨海默氏病的受试者的组织中的非小脑部分与小脑部分组织结合的比率。然后比较这些比率。如果怀疑患有阿尔茨海默氏病的脑的比率比正常脑比率高90％，就可诊断的确患有阿尔茨海默氏病。实施例1.柯胺G及其衍生物的合成
柯胺G的合成
柯胺G(即4，4′-二(3-羧基-4-羟苯基偶氮)-联苯)的合成需要下列反应步骤。这些反应步骤将作为“柯胺G合成”的一般方法。将联苯胺●2HCl(28.9mg，0.11mmole，Sigma Chemical Company，St.Louis，MO)加入装有1.5ml 1∶1的DMSO：蒸馏/去离子H2O的50cc圆底烧瓶中。除非另外指出，各步反应均在0℃进行。加入二十九μl浓盐酸，搅拌得到透明溶液。在联苯胺溶液中滴加15.5mg(0.22mmole)NaNO2在300μl1∶1 DMSO/H2O中的溶液，所得溶液pH约为2-3。将反应混合物搅拌45分钟；，然后在该四氮联苯胺混合物中，在10分钟的时间内，滴加溶于2.0ml含250mg/ml Na2CO3的100％DMSO中的24.8mg(0.18mmole)水杨酸甲酯(Aldrich)，保持该悬浮液的pH为约10.5。将所得混合物在0℃搅拌1小时，然后在室温下搅拌过夜。
之后，将pH调节至约7，用每份50ml的氯仿将该混合物萃取三次。将合并的氯仿萃取液用每份50ml的H2O洗涤三次，然后浓缩至干，得到柯胺G二甲酯(即4，4′-二(3-甲氧羰基-4-羟苯基偶氮)-联苯)，将其通过氯仿/己烷重结晶进一步纯化。然后通过在含四当量NaOH的约100ml1∶1乙醇∶H2O中回流三小时而水解该酯。蒸发乙醇后，将H2O冷冻干燥，得到柯胺G的四钠盐。通过将该四钠盐溶于水，用氯仿洗涤一次除去未水解的二甲酯，将pH值降至约2而形成柯胺G游离酸，用每份50ml的乙酸乙酯萃取三次。将合并的乙酸乙酯萃取液用每份50ml的H2O洗涤三次并浓缩至干。
在上述条件下得到的产物中，已不存在水杨酸甲酯，水杨酸、或联苯胺，而仅微量的单取代的产物，4-羟基-4′-(3-羧基-4-羟苯基偶氮-联苯，这可通过使用C4柱(Vydac 214-TP510)的反相MPLC，以3.5ml/分钟的流速，首先使用磷酸钠缓冲液(5mM，pH6)∶乙腈(ACN)90∶10的溶剂系统，洗脱10分钟，然后将乙腈增加到50％接着洗脱20分钟而鉴定。将该柱的洗脱液用290nm 365nm双波长，用二极管矩阵检测器(Perkin Elmer，235C)监测。这些条件下，柯胺G在17.6分钟被洗脱。
柯胺G及其衍生物的结构通过用TMS作内标用DMSO-d6作溶剂的500MHz质子NMR确定。柯胺G四钠盐峰位置归属如下，其中SA指水杨酸部分特定环位置的质子，BZ指联苯胺部分特定环位置的质子：SA-3，在6.75百万分之一单位(ppm)处，双重峰，J＝8.73Hz，SA-4，双重双重峰，J＝8.73和2.72Hz；7.82ppm；BZ-2/6，双重峰，J＝8.44Hz，7.91ppm；BZ-3/5，双重峰，J＝8.44Hz，7.95ppm；和SA-6，双重峰J＝2.72Hz，8.28ppm。在40％乙醇中的UV/可见光谱的λmxa在389nm处。通过与NMR内标比较峰面积而计算柯胺G的浓度并迅速将NMR样品的等分试样在40％乙醇中稀释测定UV/可见光谱而得到柯胺G的摩尔吸收系数。在389nm处在40％乙醇中的摩尔吸收系数为5.5×104AU/cm·M。
通过上述方法的改进方法可合成[14C]柯胺G。除使用100％H2O外，按上述进行联苯胺的四氮化。将50μl 2.5M的Na2CO3水溶液加入装入0.5ml锥形玻璃瓶中的50μCi结晶水杨酸-羧基-14C(Sigma)中。在该锥形瓶中加入60μl四氮化的联苯胺混合物，涡旋并在0℃保持1小时。为防止形成单取代的联苯胺副产物，在反应混合物中加入存在于2.5M Na2CO3中的12.5μl 250mM无放射性的水杨酸(Sigma)，并在0℃下保持1小时。将该锥形瓶在室温下放置过夜。将全部混合物溶于少量35％ACN，并将其按上述注射入C4柱上。收集与柯胺G标准晶相对应的峰并冻干。通过测定389nm处的吸收，然后对同一样品的等分试样的放射性计数，而计算26.8Ci/mole处的比放射性。将[14C]柯胺G贮存于40％乙醇中。然后将纯化的[14C]柯胺G再注射到C4柱上以3.5ml/分钟的速度用21％ACN洗脱，在10.4分钟得到与标准柯胺G共同洗脱的＞98％的放射性物质。除下面的说明例外情况外，使用上述“柯胺G合成”的一般方法可合成很多柯胺G衍生物。这些衍生物的结构可通过NMR检定。图1显示柯胺G和数种衍生物的化学结构。
柯胺G的3-异丙基水杨酸衍生物的合成
通过用3-溴联苯胺(见下文)代替联苯胺和用3-异丙基水杨酸甲酯代替水杨酸甲酯，按上述合成柯胺G的方法可合成4，4′-二(3-羧基-4-羟基-5-异丙苯基偶氮基)-3-碘联苯。将所得到的溴衍生物转化为三烷基锡衍生物，然后按下文的详述再转化为碘代衍生物。
柯胺G的吡啶和二嗪衍生物的合成
通过用3-溴联苯胺(见下文)代替联苯胺和用2-羟基烟酸(或有关的衍生物，6-羟基烟酸，3-羟基吡啶甲酸，或羟基二嗪羧酸如4-羟基嘧啶-6-羧酸)代替水杨酸甲酯，按上述合成柯胺G的方法可合成4，4′-二(5-羧基-6-羟基-3-吡啶基偶氮基)-3-碘代联苯以及有关的柯胺G的羟基吡啶羧酸或羟基二嗪羧酸衍生物。将所得到的溴代衍生物转化为三烷基锡衍生物，然后按下文的详述再转化为碘代衍生物。
柯胺G的萘，喹啉，和苯并二嗪衍生物的合成
通过用3-溴联苯胺(见下文)代替联苯胺和用1-羟基-2-萘酸(或有关的衍生物，其他羟基萘酸异构体，羟基喹啉羧酸如犬尿喹啉酸，或羟基苯异二嗪羧酸如5-羟基喹喔啉-6-羧酸)代替水杨酸甲酯，按上述合成柯胺G的方法可合成4，4′-二(3-羧基-4-羟基-萘基偶氮基)-3-碘代联苯及有关的柯胺G的羟基萘酸，羟基喹啉羧酸，或羟基苯并二嗪羧酸衍生物。将所得到的溴代衍生物转化为三烷基锡衍生物，然后按下文的详述再转化为碘代衍生物。
柯胺G的硝基苯酚衍生物的合成
通过用3-溴联苯胺(见下文)代替联苯胺和用2-硝基苯酚(或与衍生物相关的其他硝基苯酚异构体)代替水杨酸甲酯，按上述合成柯胺G的方法可合成4，4′-二(3-硝基-4-羟基-苯基偶氮基)-3-碘代联苯及相关的柯胺G的硝基苯酚衍生物。将所得到的溴代衍生物转化为三烷基锡衍生物，然后按下文的详述再转化为碘代衍生物。
合成二偶氮基化合物的选择性方法
作为一种形成偶氮化合物的选择性方法，可使亚硝基化合物在冰醋酸中通过Mills反应与胺偶合。Badger，G等，澳大利亚化学杂志(Aust.J.Chem.)17：1036(1964)。亚硝基化合物可按Coleman等，有机合成汇编(Organic Synthesis Collective)Vol.III：p668的方法制备。例如，将3-硝基苯甲酸(Aldrich Chem.Co.，Milwaukee，WI)(2.44mmoles)和150mg NH4Cl在5ml水中的溶液合并，加入一个50ml的圆底烧瓶中并且剧烈搅拌。在5分钟的时间里以小份加入锌粉(372mg)。加完锌粉后，温度开始升高，但使用冰浴使温度保持在50和55℃之间。。将该混合物在此温度下搅拌20分钟。然后滤掉残留的锌并用沸水洗涤。将合并的滤液和洗液置于烧杯中通过加入冰冷却至0℃。搅拌的同时，在上述冷却的羟胺混合物中加入冷却的硫酸溶液(750μl浓硫酸加足量冰使温度冷却至-5℃)。搅拌的同时，将冰冷却的170mg重铬酸钠二水合物在750μl水中的溶液全部一次加入。将所得3-亚硝基苯甲酸与二分之一当量的联苯胺，2，7-二氨基芴或另外的联苯胺衍生物在冰醋酸中合并并在70-80℃温热7小时，然后在室温下放置过夜。将该混合物用水稀释并用乙酸乙酯萃取，得到4，4′-二(3-羧基-苯基偶氮基)联苯，2，7-二(3-羧基-苯基偶氮基)-芴，或使用特定的联苯胺衍生物所产生的相应二(3-羧基-苯基偶氮基)衍生物。
甲氧基衍生物的合成
所有酚类化合物的甲氧基衍生物可按下面的方法合成。在一当量溶于丙酮，浓度大约为5mg/ml的具有酚基的柯胺G酯衍生物中加入10当量的碘甲烷(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，WI)和10当量的K2CO3。将该悬浮液回流6-24小时，用旋转蒸发器浓缩至干，并用氯仿提取。通过加入1∶1 THF/0.1 N NaOH至大约1mg/ml的浓度并在室温下搅拌24-27小时将酯水解。通过用氯仿萃取除去未水解的甲氧基-酯，将pH值调节至～2，并将甲氧基-酸萃取入乙酸乙酯。
取代的联苯胺衍生物的合成
为了合成取代的联苯胺化合物，除了用3，3′-二氯联苯胺(Pfaltz& Bauer，Waterbury，CT)，4，4′-二氨基八氟联苯，3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，WI)，3，3′-二甲基联苯胺(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，WI)， 3，3′-二甲氧基联苯胺(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，WI)，联苯胺-3，3′-二羧酸(Pfaltz & Bauer，Waterbury，CT)或其低级烷基酯，或3，3-二硝基联苯胺(Fluka Chemical Corp.，Ronkonkoma，NY)代替未取代的联苯胺外，按上述合成柯胺G的一般方法进行反应。按参照方法合成也可用于代替未取代的联苯胺的其他取代的联苯胺包括，但不限于：3，3′-二溴联苯胺和3，3′-二碘联苯胺(Snyder，H.等，美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)71：289-291，1994)；3-溴联苯胺和3-碘联苯胺(Badger，G.等，澳大利亚化学杂志(Aust.J.Chem.)17：1036-1049，1964；Holland.V.等，四面体(Tetrahedron)30：3299-33201974)。
菲(Phenanthracene)，苯并(c)噌啉，芴，芴酮，咔唑，
氧芴，硫芴和硫芴-9，9-二氧化物衍生物的合成
在四氮化步骤中用2，7-二氨基芴(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，WI)，代替联苯胺，然后使用同一个用于四氮化联苯胺的步骤偶合制得柯胺G的芴(2，2′-亚甲基联苯基)衍生物。同样，也可在标准的四氮化和偶合步骤中用2，7-二氨基菲，2，7-二氨基-3，6-二甲基苯并[c]噌啉，2，7-二氨基芴酮，9-甲基-2，7-二氨基咔唑，3，7-二氨基氧芴(不同于其他此类多环化合物，常规环系中氧芴的氧桥原子在5位而不是9-位，因此，氨基取代基在3，7-位而不是如其他化合物中的2，7-位，，尽管位置是相当的，2，7-二氨基硫芴，和2，7-二氨基硫芴-9，9-二氧化物(“联苯胺砜”)代替联苯胺。如果需要未取代的咔唑，可在偶合后使9-甲基-2，7-二氨基咔唑化合物N-去甲基。按Ullmann和Mallet Ber.31：1694-1696，1898和Nunn.A.等，化学会志(J.Chem.Soc.)1952：2797-2803的方法，通过还原由2-氨基-3′，5-二硝基-顺式-芪制备的2，7-二硝基菲而合成2，7-二氨基菲。按Snyder等，美国化学会志(J.Amer.Chem.Soc.)71：289(1949)的方法，通过用NaOBr氧化用NaOH水溶液中的锌还原3，3′-二甲基-6，6′-二硝基联苯胺(Aldrich ChemicalCompany，Milwaukee，WI)，而形成的相应亚肼基化合物可制备2，7-二氨基-3，6-二甲基苯并[c]噌啉。选择性地，可首先用3，3′-二甲基-6，6′-二硝基联苯胺代替联苯胺四氮化和偶合，然后按上述用Zn/NaOH和NaOBr处理。按Ullmann和Mallet Ber.31：1694-1698，1898和Nunn，A.等，化学会志(J.Chem.Soc.)1952：2797-2803的方法，通过还原由2-氨基-3′，5-二硝基二苯酮制备的2，7-二硝基芴酮可合成2，7-二氨基芴酮。按Saunders，K.H.和Allen，R.L.M.AROMATIC DIAZO COMPOUNDS 625-640(Edward Arnold，London，1985)中所述，通过还原由N-甲基化从2-氨基-3′，5-二硝基联苯胺制备的2，7-二硝基咔唑而制备的9-甲基-2，7-二硝基咔唑可合成9-甲基-2，7-二氨基咔唑，该文献的全部内容特此收编为参考文献。按Saunders，K.H.和Allen，R.L.M.AROMATIC DIAZOCOMPOUNDS 625-640(Edward Arnold，London，1985)，中所述，通过还原由2-氨基-3′，5-二硝基联苯醚制备的3，7-二硝基氧芴可合成3，7-二氨基氧芴，该文献的全部内容特此收编为参考文献。按照Courtot和Evain Bull，Soc.Chim.49(iv)：528，1931和Cullinane和DaviesRec.Trav.Chim.55：881-886(1936)的方法可制备2，7-二氨基硫芴，和2，7-二氨基硫芴-9，9-二氧化物。
柯胺G炔基(C≡C)和烯基(CH＝CH)衍生物的合成
按上述通过在K2CO3存在下与碘甲烷反应而将5-溴水杨酸(Aldrich Chemical Copany，MilwauKee，WI)转化成甲基酯/甲基醚。钯存在下使所得到的2-甲氧基-5-溴甲酸甲酯与(三甲基甲硅烷基)乙炔(Aldrich Chemical Copany，MilwauKee，WI)反应。除去三甲基甲硅烷基，按上述在钯存在下使两当量所得2-甲氧基-5-乙炔基苯甲酸甲酯与4，4′-二溴联苯(Aldrich Chemical Company，MilwauKee，WI)反应。按上述通过水解该酯制备柯胺G炔基类似物，4，4′-二(3-羧基-4-甲氧苯基乙炔基)-联苯。通过常规方法将炔基类似物还原成柯胺G烯基类似物。
柯胺G二碘水杨酸衍生物的合成
通过5-碘水杨酸(Aldrich Chemical Company，MilwauKee，WI)在3-位的碘化接着在5-位的选择性脱碘化合成柯胺G3-碘水杨酸衍生物，4，4′-二(3-羧基-4-羟基-5-碘苯基偶氮基)-联苯。形成甲基酯并重结晶后，将淡棕色，蜡状3-碘衍生物按上述合成柯胺G的步骤用水杨酸甲酯取代。通过用75％CHCl3/25％己烷从硅胶柱上洗脱而分离所需产物。然后通过在含四当量NaOH的1∶1乙醇∶H2O溶解回流三小时而将该酯水解。
二氟柯胺G的合成
用5-氟水杨酸(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，WI)代替水杨酸可合成5-氟衍生物，4，4′-二(2-羟基-3-羧基-5-氟苯基偶氮基)-联苯。在Schiemann反应中，通过用18F标记的前体如[18F]LiBF4取代，经过Cs[18F]三氮烯分解，或经18F对X的亲核取代，其中X＝甲苯磺酰基，三氟甲磺酰基，NO2，+N(CH3)，或卤素，可制备柯胺G的[18F]芳基氟衍生物。参见Fowler，J.和Wolf，A在POSITRONEMISSION TOMOGRAPHY AND AUTORADIOGRAPHY(Phelps，M.，Mazziota，J.，和Schelbert，H.eds.)391-450(Raven Press，NY，1986)和Kilbourn，M.氟-18标记放射性药物。(Fluorine-18 labeling ofradiopharmaceuticals)。(Natl，Acad.Press，Washington，D.C.)(1990)。
芳族氟烷基和氟烷氧基衍生物的合成
使用Bishop等，医用化学杂志(J.Med.Chem.)34：1612(1991)的方法可合成芳族氟烷基衍生物，其中合适的O-烯丙基链Claisen重排生成芳族烯丙基衍生物，它可被进一步官能化，得到氟乙基或氟丙基衍生物。选择性地，使用Sonogashira等，四面体通讯(TetrahedronLetters)4467-4470(1975)的钯催化的偶合方法可将芳族碘化物容易地转化成长度由二到五个碳原子组成的芳香炔。随后由该炔转化成氟烷基衍生物。按Chumpradit等，医用化学杂志(J.Med.Chem.)36：21(1993)的方法可制备氟烷氧基衍生物，其中用1-溴(或碘或磺酰氧)-ω-氟烷将合适的酚烷基化得到相应的氟烷基衍生物。
芳烷磺酰氧和烷氧磺酰氧衍生物的放射性氟化
按Mathis等，核医学生物学(Nucl.Med.Biol.)19：571(1992)的方法进行放射性氟化，其中用[18F]氟化物取代芳烷基-或烷氧磺酰氧(例如烷氧基甲苯磺酰酯)衍生物，得到芳[18F]氟烷基和[18F]氟烷氧基衍生物。
通过三烷基锡途径的柯胺G衍生物的放射性碘化和放射性溴化
柯胺G三烷基锡衍生物的合成
图2B显示了柯胺G的三烷基锡衍生物的一般结构。一般说来，三烷基锡基将在联苯基部分一边的3-位取代，但其他位置，包括水杨酸或杂环基部分也是潜在的目标。这些三烷基锡衍生物为制备用于人的放射性碘化的和放射性溴化的化合物的稳定的直接前体。更特别地，这些三烷基锡衍生物可用于制备在活体内对淀粉样蛋白成像中使用的卤代放射性化合物。
合成三烷基锡衍生物的一般方法
按已公开的方法，包括Kosugi，M.，等，化学通报(Chem.Lett.)1981：829；Heck.R.纯化学和应用化学(Pure and Appl Chem.)1978：691；Echararren，A.和Stille，J.美国化学会志(J.Am.Chem Sco.)1987：5478；Mitchell，T.金属有机化学(J.Organometallic Chem.)1986：1；以及Stille，J.纯化学和应用化学(J.Pure and Applied Chem.)1985：1771，可由合适的芳基卤，[(C6H5)3P]3Pd(O)，和六烷基二锡制备三烷基锡衍生物。也可按Mathis等，标记化合物和放射性药物(J.Labell.Comp.and Radiopharm.)1994：905的方法，使用n-BuLi和氯化三烷基锡得到这些衍生物。
4，4′-二(3-甲氧羰基-4-羟苯基偶氮基)联苯的3-三烷
基锡衍生物合成
通过合成3-溴或3-碘联苯胺(见上文)，像合成柯胺G一样四氮化及与水杨酸甲酯偶合，并且当需要甲氧基化合物时，按上述将酚甲基化，而制备3-溴或3-碘-4，4′-二(3-甲氧羰基-4-羟苯基偶氮基)联苯或其由二甲基醚。氩气氛下，将1mmol酚酯或甲氧基酯，[(C6H5)3P]3Pd(0)(0.1到0.2mmol)，六丁基二锡或六甲基二锡(1.25mmol)，和二噁烷(25ml)在70℃加热16小时。将反应混合物冷却并将溶剂蒸发。用KF水溶液除去三烷基锡卤化物。用乙酸乙酯萃取有机物，用硫酸镁干燥，过滤，减压蒸除溶剂。通过硅胶纯化残留物，得到3-三烷基锡-4，4′-二(3-甲氧羰基-4-羟苯基偶氮基)联苯。
三烷基锡衍生物的放射性碘化或放射性溴化
按已公开的方法，如Mathis等，标记化合物和放射性药物杂志(J.Labell.Comp.and Radiopharm.)1994：905；Chumpradit等，医用化学杂志(J.Med.Chem.)34：877(1991)；Zhuang等：医用化学杂志(J.MedChem.)37：1406(1994)；Chumpradit等，医用化学杂志(J.Med，Chem.)37：4245(1994)所述的方法，将三丁基或三甲基锡衍生物由Na[125I]或Na[123I]放射性碘化或由Na[75Br]或Na[76Br]放射性碘化。一般说来，将0.5mg三烷基锡化合物，0.2ml无水乙腈，10μl 2M H3PO4，2-100μl高特异性(＞2000 Ci/mmol)Na[125I]或[123I](或Na[75Br]或Na[76Br]在pH9-12的NaOH中的溶液，和二氯胺-T(DCT)(20μl2.5mg/ml乙腈中的DCT)置于1ml反应瓶中。盖上该瓶，室温下在暗处搅拌该混合物。通过HPLC监测反应，并在30分钟后用50μl2M Na2S2O3将其猝灭。按一般色谱技术纯化产物。Mathis等，标记化合物与放射性药物(J.Labell.Comp.and Radiopharm.)1994：905。同样，按类似方法可制备低特异性18F衍生物。
制备无放射性I，Br，Cl，F和-SH衍生物的一般方法
一般说来，用亚硝酸钠和HCl或H2SO4可将图2中显示的水杨酸3-或4-氨基衍生物，或水杨酸的杂环类似物的相应的衍生物转化成相应的二偶氮化合物。通过形成碘化二偶氮鎓然后将其转化成芳基碘化物；或通过三氮烯中间体的方法可直接制备碘衍生物。见，例如，Greenbaum，F.美国药学杂志(Am.J.Pharm.)108：17(1936)，satyamurthy，N.和Barrio，J.，有机化学杂志(J.Org.Chem.)48：4394(1983)和Goodman，M.等，有机化学杂志(J.Org.Chem.)49：2322(1984)。根据Sandmeyer反应用CuCl或CuBr处理或经过如制备碘衍生物的三氮烯，可从二偶氮化合物制备芳基溴化物和氯化物。根据Schiemann反应用NaBF4，HBF4，或NH4BF4处理二偶氮鎓化合物或经与碘衍生物相似的三氮烯分解可制备芳基氟化物。用含硫的亲核试剂如HS-，EtO-CSS-，和S22-，处理二偶氮化合物可制备芳基硫酚。选择性地，用含硫的亲核试剂取代芳基卤化物也可制备芳基硫酚，参见March，J.ADVANCED ORGANIC CHEMYSTRY：REACTIONS，MECHANISMS.，AND STRUCTURE(3rd Edition，1985)。
制备放射性C，F和Tc衍生物的一般方法
除以上方法外，根据本领域已知的文献方法，可以用SPECT的99mTc或用正电子发射放射性核素11C，18F，75Br和76Br进行高特异性放射性标记。下文将描述一些潜在的特别方法，但还有一些本领域技术人员显而易见的已知方法在文献中有描述，如Fowler，J.和Wolf，A.正电子发射标记化合物(Positron emitter-labeled compounds)POSITRONEMISSION TOMOGRAPHY AND AUTORADIOGRAPHY(Phelps，M.，Mazziota，J.，and Schelbert，H.eds.)P391-450(Raven Press，NY)(1986)，Coenen，H.等，Radiochimica Acta 34：47(1983)，和Kulkarni，Int J.Rad.Appl.& Inst(PartB)18：647(1991)，将此将其内容作为参考文献收编。
通过用芳基硫酚配位可制备99mTc衍生物。使用11C的放射性标记可按上述对合适的柯胺G类似物用[11C]碘甲烷取代，[11C]烷基化，或[11C]羧基化的方法容易地通过N-甲基化，O-甲基化而进行。[18F]芳基氟化物衍生物可通过用18F标记的前体如上述Schiemann反应中的[18F]LiBF4取代，经过Cs[18F]三氮烯分解，或经18F对X的亲核取代，其中X＝甲苯磺酰基，三氟甲磺酰基(triflate)，NO2，+N(CH3)3，或卤素，而制备。使用75Br和76Br的放射性溴化可使用类似放射性碘化技术的亲电(Br+)或亲核(Br-)取代技术完成，见Coehen，H.，Supra。
3-羟基-1，2-苯并异噁唑衍生物及有关衍生物
(见图2C)的合成
按照Bshagen(Chem.Ber 100：954-960；1967)的方法、通过使用羟胺盐酸盐，使2，6-二羟基苯甲酸(γ-二羟基苯甲酸)甲酯(TCIAmerica，Portland，OR)转化成异羟肟酸。还是按照Bshagen(Chem.Ber 100：954-960，1967)的方法，先使用SOCl2，然后使用三乙胺将异羟肟酸转化成相应的3-羟基-1，2-苯并异噁唑。然后经与用于水杨酸衍生物相同的步骤将该化合物与联苯胺，3-溴联苯胺，或其他联苯胺衍生物偶合。然后可按上文所述将溴化衍生物转化成三烷基锡和碘化衍生物。
选择性地，可按常规使水杨酸甲酯与联苯胺偶合并按上述Bshagen的方法将所得4，4′-二(3-甲氧羰基-4-羟苯基偶氮基)联苯(或柯胺G二甲酯)转化成异羟肟酸，然后转化成苯并异噁唑。第三类3-羟基-1，2-苯并异噁唑由数种异构的二羟基苯二羧酸包括4，6-二羟基-1，3-苯二甲酸，3，6-二羟基邻苯二甲酸和2，5-二羟基对苯二甲酸(Aldrich Chem，Co.，Milwaukee，WI)合成。按标准方法与联苯胺或其衍生物偶合后，按上述Bshagen的方法，通过与羟胺反应而将二羟基/二酯转化成二羟基/二异羟肟酸。还按上述Bshagen的方法，通过用SOCl2和三乙胺处理而转化成双苯并异噁唑。
邻苯二甲酰亚胺或异吲哚-1，3(2H)-二酮衍生物
(见图2D)的合成
按与用于水杨酸衍生物的方法相同的方法使3-羟基邻苯二甲酸酐(Aldrich Chemical Company Milwaukee，WI)与联苯胺或其衍生物偶合而制备3-羟基邻苯二甲酰亚胺，然后按上述转化成三烷基锡和碘-衍生物。
邻苯二甲酰肼或2，3-苯并二嗪-1，4(2H，3H)
-二酮衍生物(见图2E)的合成
与用于水杨酸衍生物相同的方法使3-羟基邻苯二甲酸酐(Aldrich Chemical Company Milwaukee，WI)与联苯胺或其衍生物反应而制备3-羟基邻苯二甲酰肼，然后按上述转化成三烷基锡和碘-衍生物。
2，3-苯并噁嗪-1，4(3H)-二酮衍生物(见图2F)的合成
用羟胺将3-羟基邻苯二甲酸酐(Aldrich Chemical CompanyMilwaukee，WI)转化成2，3-苯并噁嗪。然后按与用于水杨酸衍生物相同的方法使苯并噁嗪衍生物与联苯胺或其衍生物偶合，然后按上述转化为三烷基锡和碘-衍生物。
(2H)1，3-苯并噁嗪-2，4(3H)-二酮衍生物(见图2G)的合成
该化合物按Effenberger等的方法(Chem.Ber.105：1926-1942；1972)合成。简单说来，按与用于水杨酸衍生物相同的方法使苯酚与联苯胺或其衍生物偶合。然后通过在三乙胺存在下与乙氧羰基异氰酸酯(O＝C＝N-CO-O-Et)反应而将该加成物转化成氨基甲酸酯。通过在二苯基醚中加热而将该取代的氨基甲酸酯(或N-乙氧羰基-氨基甲酸苯酯)转化成苯并噁嗪二酮。然后按上述将苯并噁嗪二酮转化成三烷基锡和碘-衍生物。
(3H)2-苯并吖嗪(benzazine)-1，3(2H)-二酮
衍生物(见图2H)的合成
将3-羟基苯乙酸(Aldrich Chemical Company MilWaukee，WI)转化成酰胺，然后按与用水杨酸衍生物相同的方法使其与联苯胺或其衍生物偶合。然后通过与氯甲酸乙酯反应而将该加合物转化成N-(3-羟苯基乙氧基)-氨基甲酸乙酯衍生物。通过在二苯基醚中加热而使取代的氨基甲酸酯转化成联苯胺二酮。然后按上述将联苯胺二酮转化成三烷基锡和碘-衍生物。
1，8-萘二甲酰亚胺衍生物(见图2I)的合成
按芳胺二偶氮偶合的标准方法，如Saunders，K.H.和Allen，R.L. M.AROMATIC DIAZO COMPOUNDS(Edward Arnold，London，1985)所述，特此将其内容作为参考文献收编，使4-氨基-1，8-萘二甲酰亚胺与联苯胺或其衍生物偶合。然后按上述将二偶氮萘二甲酰亚胺转化为三烷基锡和碘-衍生物。
四唑和噁二唑衍生物(见图2J和2K)的合成
根据Holland和Pereira医用化学杂志(J.Med.Chem.)10：149(1967)和Holland的美国专利No.3,448,107中的方法，通过与叠氮化钠或叠氮化铝反应而将2-氰基苯酚(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，WI)转化成四唑。简言之，氩气氛下用叠氮化钠(10mmol)和三乙胺盐酸盐(10mmol)处理40ml DMF中的柯胺G的2-氰基酚或氰基酚衍生物(1mmol)。将该混合物在120℃搅拌2小时，然后将该混合物冷却并按与上述柯胺G处理类似的方式处理。
通过用酸酐(如乙酸酐)处理以上制备的四唑而合成噁二唑。一种选择性方法为Bamford等，医用化学杂志(J.Med.Chem.)38：3502(1995)中的方法，在该方法中，在二环己基碳化二亚胺存在下用异硫氰酸甲酯处理柯胺G肼衍生物或水杨酸肼衍生物(用肼分别处理各酯而获得)。
用作对照物的柯胺G衍生物的合成
通过用两当量的苯胺(Fisher Chemical Co.，Fair Lawn，NJ)代替每当量的联苯胺可合成苯胺衍生物。通过用联苯胺-2，2′-二磺酸(Pfaltz&Bauer，Inc.，Waterbury，CT)代替联苯胺可合成2，2′-二磺酸酸衍生物。通过用一当量苯酚代替每当量的水杨酸可合成苯酚衍生物。刚果红(Aldrich合格质量)可从市场购得。实施例2.柯胺G和柯胺G衍生物与Aβ的特异性结合
与合成的Aβ(10-43)的结合
柯胺G在体外可与合成的Aβ(10-43)很好地结合。图4A显示了柯胺G与Aβ(10-43)结合的Scatchard分析。较高亲和性的组分的KD为0.257μM，Bmax为3.18nmoles柯胺G/mg Aβ(10-43)。较低亲和性的组分不能很好地由这些数据限定，但看来KD为4.01μM而Bmax为18.7nmoles柯胺G/mg Aβ(10-43)。低亲和性组分表现出柯胺G在高浓度与独特的，低亲和性部位的结合，未与制剂中的杂质结合。活体内注射的柯胺G的量是如此之低，以致于与低亲和性组分无任何结合。在极低浓度下，高与低亲和性结合的比率非常大。
如图5所示，使用范围内结合的柯胺G的量与肽的浓度呈线性关系。
结合的动力学特征
动力学研究显示了明显快速的结合(图6A)，在[柯胺G]＝112μM时，t1/2为8 9±1.8秒，1分钟内基本完成以及有些缓慢的解离(图6C)，t1/2＝55±9.4秒[解离速度常数(k-1)＝1.26×10-2秒-1]。图6B显示根据Bennett和Yamamura，Bennett，J.P.和Yamamura，H.I.在NEUROTRANSMITTER RECEPTOR BINDING(N.Y.：Raven Press1985)pp.61-89的方法的结合动力学数据的转换。图6A中的结合曲线的线性部分被移至图6B的直线中，其中ln[Beq/(Beq-Bt)]与时间对应，其中Beq为平衡时(4分钟)结合的柯胺G的量而Bt为时间＝t时的结合的量。该线的斜率等于kobserved而k-1＝(kobserved-k-1)/[柯胺G]，其中k-1为图6C中数据测定的解离速率常数。图6C中曲线遵循下列等式：At=A0e-k-1t]]>其中At为在时间＝t时，保持结合的柯胺G的量，A0为在时间＝0时结合的柯胺G的量，而k-1为解离速率常数。从这个分析中计算出的结合速率常数(k1)为3.75×104M-1秒-1，所得KD＝k-1/k1＝0.34μM，与Scatchard分析完全一致。
能抑制柯胺G与Aβ结合的柯胺G衍生物
具有图1中显示的化学结构的柯胺G类似物抑制[14C]柯胺G与Aβ(10-43)结合的Ki值和几条置换曲线如图3所示。Ki被定义为IC50/(1+[L]/KD)，其中[L]为测定中[14C]柯胺G的浓度(.100-.125μM)，KD为0.26μM，柯胺G的KD值通过上述Scatchard分析测定。柯胺G本身的Ki值为0.37±0.04μM，与由Scatchard和动力学分析所得结果非常一致。刚果红的Ki值为2.82±.84μM。柯胺G的二氟衍生物，(5-FSA)CG(图1)的作用是柯胺G本身的三分之一(Ki＝1.16±0.19μM)。二氟柯胺G衍生物的活性提示18F二氟柯胺G衍生物适于PET成像，而19F二氟柯胺G衍生物适于脑的MRS/MRI成像。
3-ICG的作用比柯胺G略强。3-ICG衍生物的活性提示125I二氟代柯胺G衍生物适于SPECT成像。3-ICG(OMe)2中，甲基化的3-ICG酚的亲和性降低10倍。CG(COOMe)2中由于羧基被甲基化，使得亲和性降低的更多(约200倍)。完全除去酸基部分，如酚衍生物，则完全破坏了结合亲和性。
这些结果提示柯胺G类似物的酸基部分在与Aβ结合中扮演重要角色，而酚基部分起促进作用。酚基部分的作用可能是通过与酸结合的氢有利于酸基部分结构定位的稳定。在邻位存在的酚基既可能通过氢结合也可能通过改变整个芳香系统的电荷分布而改变酸基部分的电荷分布。选择性地，酚基可能通过酚基和酸基与淀粉样蛋白结合点面的双-配位基连接而直接参与与淀粉样蛋白的结合。如二羟基苯甲酸衍生物(6-OHSA)CG中那样在羧酸盐的邻位加入第二个酚基便产生了本系列中亲和性最强的化合物，其Ki值为0.094±.02μM。
提高联苯基主链的亲脂性看来可增加一些亲和性。二卤代衍生物，3，3′-I2CG，3，3′-Br2CG，和3，3′-Cl2CG的Ki值都很相近，约为柯胺G的一半。
由2位取代导致的联苯基苯环间双面夹角的畸变明显地降低了亲和性。柯胺G的2，2′-二磺酸衍生物，2，2′-(SO3)2CG无亲和性可证明这一点。因为3，3′-二羧基衍生物，3，3′-(COOH)2CG，仅显示比柯胺G低7-倍的活性，因此增加酸基部分可能不是导致2，2′-二磺酸活性丧失的唯一原因。该2，2′-衍生物很独特，其中2-位空间位阻很大的磺酸基使联苯基偏离平面。分子模型研究显示2，2′-二磺酸衍生物中两个联苯基苯环间的双面夹角为83°。在柯胺G和所有其他活性衍生物中，该夹角大约为35-40°。
为了探索柯胺G官能团二配位基的重要性质，我们研究了表示柯胺G分子一半的苯胺衍生物的结合(图1)。结合能可通过下列等式近似地计算：
ΔG＝-RT ln Keq其中ΔG为结合反应的能量，R为摩尔气体常数[8.31441J/(mole·°K)]，T为°K温度，而Keq为下述反应的平衡常数。
[探测剂]+[肽][探测剂·肽]并且Keg＝1/KD≈1/Ki。使用KD为0.26μM的柯胺G，结合能大约为38KJ/mole。如果苯胺以该能量的一半结合，那么期望的结合能约为19KJ/mole。对Ki值为73μM的苯胺衍生物，结合能为23KJ/mole，它与预期值相当一致。柯胺G和苯胺衍生物的疏水区的重要性可通过水杨酸本身完全没有结合活性这一事实而证明。
柯胺G对Aβ的亲和性似乎比刚果红对该肽的亲和性高数倍。不论通过Scatchard分析，动力学方法，还是结合抑制法测量，解离常数约为250-400nM的结合都是可逆的。由于淀粉样蛋白原纤维非结晶，难溶解的性质，刚果红或柯胺G与淀粉样蛋白的复合结构仍不能通过精确的结构技术如x-射线结晶衍射或多维NMR确定。刚果红与淀粉样蛋白相互作用的模型已被提出。Cooper，Lab.Invest.31∶232(1974)；Romhanyi，Virchows Arch.354∶209(1971)。该文献认为刚果红不是与单独的淀粉样蛋白肽分子结合，而是横过由于β-折叠原纤维而定向的数个Aβ分子结合的。Klunk等，J. Histochem.Cytochem.37：1273(1989)。
图7显示了使用MacroModel2.5制作的该模型的图解，其中柯胺G横跨了反平行β-折叠构型中的5个肽链。所使用的肽未进一步结构修饰。这些肽排成一行使交替的链的距离为4.76，这是β-折叠原纤维的特征。交替的肽链被绘成黑的和白的。柯胺G(黑)为能量最低状态并与原纤维模型排成一行以实现与赖氨酸16(上图中淡灰色椭圆)和疏水的苯基苯胺19/20位(下图)实现最大程度的接触。两图表示相互间的角度大约为90°的同一模型。白色箭头指示另一示图观察的方向。
柯胺G羧酸部分之间19.1的距离正好与横跨5条链19.0的距离相配(Kirschner等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83：503(1986)显示相邻链之间的距离为4×4.76)。如果Aβ的天然结构含有如Hilbich等提出的(Hilbich等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)218：149(1991))发夹环结构，那么链1和2，3和4，5和6，等，将与同一分子中的另一半对折，除非该模型在其他方面是相同的。应当注意，该模型中带正电荷的氨基酸残基，如Aβ中的赖氨酸-16，是必需的。在先文献已显示刚果红的结合与淀粉样原纤维样品中带正电荷的氨基酸的数量很有关系。Klunk等，组织化学与细胞化学杂志(J.Histochem.Cytochem.37：1273(1989)。图7模型的双配位基的性质和疏水基相互作用的重要性可通过柯胺G单配位基苯胺类似物亲和性的降低和水杨酸的无活性以及在联苯胺部分具有两个卤原子的亲脂性更强的化合物(见图1)活性更强的事实来证明。联苯基接近平面的重要性可通过2，2′-二磺酸衍生物无活性这一事实而证明。实施例3.用柯胺G区分阿尔茨海默氏病脑与正常脑
柯胺G与AD脑结合的特征
为了弄清楚柯胺G与AD脑增强的结合而进行柯胺G和柯胺G衍生物与AD脑样品结合的Scatchard分析。(图4B，表1)。在所使用的条件下，对照物和AD脑显示单一的结合组分。AD脑中KD比对照物低16％但差异并不明显(p＝.29)。AD脑中Bmax比对照脑高36％，但差异同样不明显(p＝.09)。因此，AD脑中增加的结合似乎主要是由于存在更多的与对照脑中相同的结合组分，而不是存在某种独特的组分。
表1.AD与对照脑结合参数的比较 KD(μM) Bmax(pmol/μg prot) 对照(n＝6) 0.47±.049 0.576±.092 AD(n＝5) 0.39±.048 0.784±.061
CG与AD脑的结合显然与相关的脑皮层中的NPs数有关。图8A显示[14C]CG结合与AD脑上/中额和上颞皮层NPs数的关系。不论包括对照物(r＝0.69；p＝0.001)还是单独考虑AD脑(r＝0.59；p＝0.007)，与NPs的关系是十分明显的。图8显示了与NFT数的相似的关系。正如NPs，不论包括对照物(r＝0.60；p＝0.001)还是单独考虑AD脑(r＝0.50；p＝0.026)，与NFTs的关系是十分明显的。与NFTs相关不使人吃惊，因为CG是可使NFTs染色的刚果红的衍生物。NPs数显然与NFTs数有关(r＝0.82；p＝.0001)。
对用于该研究的脑来说仅可得到有或无淀粉样蛋白血管病的定性数据，因而不能研究CG结合与脑血管淀粉样蛋白水平的相似的关系。在CG结合与NP数之间的关系中，淀粉样蛋白血管病的存在似乎令人捉摸不透。图8A显示无淀粉样蛋白血管病的脑(r＝0.79；p＝0.01)比具有脑血管淀粉样蛋白沉淀(r＝0.49；p＝0.15)有更密切的CG结合与NP数的关系。在NFT数的关系中也发现了相似的现象。
[14C]柯胺G与AD脑结合的KD值与体外实验中[14C]柯胺G与合成的Aβ结合的KD值相似，说明在脑匀浆中的结合也可表示与Aβ的相互作用。柯胺G结合与NFTs的关系说明在脑匀浆中柯胺G也与这些结构结合。选择性地，由于NFTs数与NPs数密切相关，所以[14C]柯胺G结合与NFTs的关系正好可能是柯胺G结合与NPs的副现象。
按与合成的Aβ肽或阿尔茨海默氏病脑组织的结合的测量，本发明提供的有用的柯胺G衍生物或类似物具有KD至少在0.01到10.0μM范围的结合亲和性；KD范围为0.0001到0.01μM的高亲和性化合物也可用于本发明的方法。
从上述考虑，柯胺G结合对Aβ可能不是特异性的。换句话说，柯胺G结合可能反映胺中存在的总的淀粉样蛋白的“负荷”，包括神经炎斑中所有的Aβ沉积物和脑血管中的淀粉样蛋白。NFTs中磷酰T形蛋白沉积也可能参与与柯胺G的结合，Goedert，M.等，PNAS85：4051(1988)。NFTs也由四级结构与Aβ原纤维相似的反平行β折叠原纤维组成。Kirschner等，Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.83：503(1986)。
区别AD和正常脑的总的和相关的柯胺G结合
如上文和下文所述的体外结合测定方法可作为筛选活体内与脑结合的化合物及预示随后活体内成像研究的模型广泛地应用于本领域。参见，Young，A.等，受体测定：体外与体内(Receptor Assays：In Vitro和In Vivo.) in POSITRON EMISSION TOMOGRAPHY ANDAUTORADIOGRAPHY(Phelps，M.，Mazziota，J.，and Schelbert，H.eds)PP.73-111(1986)。本发明的标记的柯胺G和柯胺G衍生物也可用于上下文所述的定量表示活组织或死后组织中淀粉样蛋白沉积的体外结合测定。
AD脑和对照脑匀浆中都可观察到[14C]柯胺G的可饱和的(特异性的)结合，在AD脑该结合占总结合的60-80％。AD脑和对照脑中非可饱和的结合非常相似。AD脑中无论可饱和的还是总的结合都比对照脑中的大。尽管使用总结合得较低的灵敏度，但该参数更能预示活体内研究的成功，而后者为本发明的最终目的。而且为了扩展到活体内研究，可将皮层区中的柯胺G结合标准化到AD和正常脑中的柯胺G结合非常相似的脑区。这样做避免了在体内很难进行的结合的绝对量的计算。我们可以检查作为潜在的对照区的小脑中的结合，因为在这个脑区中典型的NPs极其罕见。(Joachim等，美国药理学杂志(Am.J.Pathol.)135：309(1989))。
[14C]柯胺G结合到对照物小脑上的平均量几乎等于结合到AD小脑上的量(表2)，这使小脑可用作内部对照物。因此，小脑结合比(CBR)精确地反映了结合的[14C]柯胺G的绝对量并给各脑提供了一个体内对照物。无论以fmol/μg蛋白的绝对量(表2)表示，还是以与同一脑的小脑中的结合的比率表示(表3)，AD脑中的结合量都比较大。CBR为灵敏度更高的测量数据，可显示各种脑之间很小的变化。总结含量与CBRs的使用大大促进了这些体外结果向体内研究的扩展。相应地，合适时下述结果都用这些单位表示。
表2.AD和对照脑中总的结合的比较* 脑区 对照物(fmol/μg蛋白) AD(fmol/μg蛋白) p值 小脑 75±13(n＝8) 73±9(n＝11) p＝0.91 额极 58±8(n＝6) 124±16(n＝10) p＜0.006 上/中额 54±10(n＝8) 130±21(n＝1 1) p＜0.005 上颞 66±17(n＝8) 121±14(n＝11) p＜0.02 尾状核头 73±11(n＝4) 123±22(n＝7) P＝0.14 下壁 76±13(n＝8) 137±19(n＝11) p＜0.03 枕部 64±16(n＝8) 95±12(n＝11) p＝0.15*高-和低-斑数AD脑兼有。表3.按与小脑的比例表示的AD和对照脑中总的结合的比较* 脑区 对照(CBR) AD(CBR) p值 额极 0.87±.04(n＝6) 1.87±.25(n＝10) p＜0.004 上/中额 0.73±.02(n＝8) 1.84±.18(n＝11) p＜0.001 上颞 0.86±.08(n＝8) 1.63±.17(n＝11) p＜0.002 尾状核头 0.95±.04(n＝4) 1.76±.31(n＝7) P＜0.004 下壁 0.90±.08(n＝8) 1.93±.20(n＝11) p＜0.001 枕部 0.77±.13(n＝8) 1.44±.20(n＝11) p＜0.02
*各样品的CBR值通过该样品中［14C]柯胺G结合的绝对值除以同
一脑的小脑样品中[14C]柯胺G结合的绝对值而得到。表中的数值
为各脑区的平均CBRs(±SEM)。高-和低-斑数AD脑兼有。
图9A和9B显示按同一脑的小脑标准化的六个脑区与［14C]柯胺G的结合。图9A显示柯胺G与具有超过20NPs/x200放大倍数的AD脑，“高斑数AD脑”，中AD脑区的结合。图9B显示柯胺G与具有低于20NPs/x200放大倍数的AD脑，“低斑数AD脑”，中AD脑区的结合。在所有脑区中，与AD脑的结合显然多于与对照物的结合(见表3)。在上/中额皮层，对照物与任何一个AD脑样品之间无重合。在除枕部皮层外的所有脑区中，对照物与具有＞20NPs/×200放大倍数的AD样品之间无重合。在典型的NPs沉淀最少的脑区，如枕部皮层(或小脑)中，可观察到AD和对照物之间的最大重合。
图9C显示来自两名Down’s综合症患者的数据。Down’s综合症患者在其第四个十年都会产生Aβ沉积，很多人会发展为AD。Wisniewski等，神经病学(Neurology)35：957(1985)；Schapiro等，神经生物学衰老(Neurobiol.Aging)13，723(1992)。这些病人都显示超过对照范围的[14C]柯胺G结合。由于较年轻的患者(23岁)已有淀粉样蛋白沉积但还未见临床痴呆症状，因此图9C说明柯胺G可在痴呆的临床症状出现很久以前测定未痴呆但肯定要发展为AD的病人与对照组的差异。
本发明的化合物和方法提供了两种有用的测量AD脑与正常脑差异的方法；(1)总的柯胺G结合(表2)或(2)给定脑区中的柯胺G结合与同一脑的小脑中的柯胺G结合的比(表3)。这些测量对AD神经炎斑的活体内定量分析具有两大优点。首先，通过提供一种测量总的Aβ结合，而不是特异性Aβ结合的方法，本发明可在不用为了测量非特异性结合而使患者面临第二次注射放射性物质的情况下定量分析Aβ沉积。由于这个原因，数据仅表示总的结合。在本发明所有的实验中，甚至在AD和对照脑差异很大的情况下，也未给出特异性结合的数据。
第二，柯胺G衍生物在脑中吸收的变化将影响脑中柯胺G的绝对浓度。因此，需要发现解释受试者间的这些变化的机理。通过寻找很少显示Aβ沉积的脑区(即，实验中的“空白”)，每位患者都可作为他/她自己的对照。因为小脑中典型的NPs极其罕见(Joachim等，美国病理学杂志(Am.J.Pathol.)135：309(1989))，柯胺G与小脑的结合可用作各个被研究脑的对照。结果用给定脑区中的柯胺G结合与同一脑的小脑中的柯胺G结合的比来表示(图9和表3)。
为了活体内定量测定AD中的淀粉样蛋白，应该考虑脑萎缩的影响。因此，当我们使用柯胺G和柯胺G衍生物活体内定量测定淀粉样蛋白时，可以根据MRI体积测量来校正脑萎缩。与本发明方法协同进行的MRI体积测量类似于本领域常规进行的此类方法。参见，Pearlson，G.和Marsh，L.MAGNETIC RESONANCE IMAGING IN PSYCHIATRYin Annual Review of Psychiatry(Vol.12)Oldham，J.等eds.P.347-381(1993)。因此测定每体积脑区总的放射性的方法将使用下列等式：
将该测量指定为信号/脑区“A”体积或S/VA意味着小脑比将按下式表示： 其中S/VCB为同一成像研究期间同一受试者小脑中信号/体积。然后可将怀疑有AD或其他以淀粉样蛋白沉积为特征的病理状态的患者的小脑以外的任何脑区的该比例与年龄相当的正常对照组受试者的同一脑区的正常范围内的同类比例加以比较。神经炎斑高沉积的脑区与小脑的结合的比例可用作区别阿尔茨海默氏病患者与对照组受试者的参数。实施例4 柯胺G，柯胺G衍生物，和刚果红 的辛醇-水分配系数
辛醇-水分配系数是与化合物亲脂性有关的度量。化合物的亲脂性越高，越容易通过血脑屏障。参见，Goodman和Gilman’s THEPHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICS(7th Ed.)。柯胺G的辛醇/水分配系数为60.22±3.97而刚果红的该系数为0.665±0.037(P＜0.001)。这说明柯胺G的亲脂性比刚果红强90倍，因此理论上更易通过哺乳动物的血脑屏障。柯胺G的3-碘和3，3′-二碘衍生物(图1)的辛醇/水分配系数分别是72.53±.74和112.9±7.3。这些辛醇/水分配系数显示这些用于活体内研究的一些放射性标记的柯胺G衍生物的非放射性类似物的亲脂性比刚果红强170倍，比柯胺G强两倍。这说明它们比刚果红或柯胺G更易进入脑中。实施例5 柯胺G和柯胺G衍生物通过血脑屏障的能力 以及柯胺G的代谢
使用淀粉样蛋白探测剂活体内诊断AD要求它们能够通过血脑屏障并接近淀粉样蛋白沉积实体。
柯胺G通过血脑屏障的能力是用Swiss-Webster小鼠研究的。i.v.注射后15分钟测得的脑/血比超过10∶1，35分钟时达到20∶1(图10)。从这以后，脑中放射性几乎保持恒定，但血中的降低而肝中的增加。脑/肾比在15分钟(取样后)时最高，达0.5。i.v.注射[14C]柯胺G后60分钟时提取脑和肝，在反相HPLC上与可靠的柯胺G共同被洗脱，重新得到＞95％的放射性物质，说明在这段时间里柯胺G没有发生明显的代谢作用。
柯胺G进入正常小鼠脑中，而脑/血比很高。第一个30分钟后脑中放射性保持相对的恒定。而血中的降低，肝中的升高。这说明比起进一步在脑中积累来，高脑/血比更能导致柯胺G通过肝从血液中有效地除去。在60分钟，从脑和肝中探测到的所有放射性证明柯胺G基本上没有变化。刚果红不易通过血脑屏障。Tubis等，J.Amer.Pharm.Assn.49：422(1960)。大部分刚果红通过肝和脾清除，荷兰猪中达到的脑/肾比约为0.07。Tubis等，supra。柯胺G也可被肝清除，但更多的进入脑。
活体动物实验提供进一步测定剂量范围的依据，通过血脑屏障的转运效率和结合能力。为实现上述目的特别优选Games等，(自然Nature373：523(1995))的突变小鼠模型，而大脑淀粉样变性“老年动物”模型；即，已知产生数量可变的阿尔茨海默型大脑神经炎斑的动物如突变的小鼠和年老的狗或猴，见Wisniewski等。神经病理学和实验神经病学杂志(J.Neuropathol.& Exp.Neurol.)32：566(1973)，Selkoe等，科学(Science)235：873(1987)，被用来试验结合和检测效率。上述活体内测定要求监测对照的活组织或尸检组织以证实并定量分析淀粉样蛋白沉积的存在。
其他适用于试验本发明组合物和方法的动物模型可用突变的方法产生。例如，Quon等，自然(Nature)，352：239-241(1991)使用兔子神经特异性烯醇酶助催化剂抑制剂区制造突变小鼠。也参见，Wirak等，科学(Science)，253：323-325(1991)。还有其他模型已通过对动物直接颅内使用β/A4肽而被制造(Tate等，Bull.Clin.Neurosci.)，56：131-139(1991)。
值得注意的是尚没有活体内动物模型可被证明是AD神经病理学的极好的模型。换句话说，它们更适于作正常年龄的淀粉样蛋白沉积的模型。对老年动物模型来说更是如此。所有这些模型都显示了如上述老年狗模型所讨论的扩散斑的优势。但是除Games等的突变小鼠模型外，仍有一些脑血管淀粉样蛋白很少产生神经炎斑。其他突变小鼠模型常常仅显示扩散斑。因此，在这些模型可用于研究脑中探测剂分布的同时，这些模型却明显地难以显示在根据上述柯胺G与AD脑结合的体外研究的AD脑中所期望看到的相同的定量差异。
柯胺G衍生物通过人血脑屏障能力的评估
将具有大约500Ci/mole特异活性或更高的剂量大约为10mCi的被适当地标记过的柯胺G衍生物静脉注射到正常受试者或怀疑患有AD的受试者体内，并通过SPECT或PET成像监测分析脑中该衍生物相对于其他器官的可检测性并测定在脑中可检测性的时间过程。可容易地检测的剂量被定义为“成像有效剂量”。
柯胺G和柯胺G衍生物区别人类AD与年龄相当的对照组
的能力的评估
将成像有效剂量的合适地放射性标记的柯胺G衍生物注射到怀疑具有由于如AD的病理状况而产生的脑淀粉样蛋白沉积的受试者体内。15分钟到24小时以后，通过SPECT或PET检测脑中传出的放射信号。同时检测检测器检测范围内的所有脑区的放射性。检测范围将被设定到包括小脑，上颞皮层，上/中额皮层，和中间脑区的大部分。在该项研究之前将进行MRI扫描以便按实施例3的方法校正被测脑区脑组织的萎缩。实施例3中讨论的S/VA，S/VCB，和比例A变量将被计算并与先前已从年龄相当的正常对照受试者获得的类似的标准比例比较。实施例6柯胺G与脑血管淀粉样蛋白结合的组织学定位
图11的上图表示由柯胺G染色的两个神经炎斑。染色方法如Stokes和Trickey，临床病理学杂志(J.Clin.Pathol.)26：241-242(1973)的方法，只是用柯胺G代替刚果红。除了有时强度较低外，这些沉积物与用刚果红染色的相同(未显示)。图11的下面两张显微照片显示具有淀粉样蛋白血管病的AD患者的颞叶的相邻的切片。左下切片用刚果红按Puchtler等.，组织化学与细胞化学杂志(J.Histochem.Cytochem.)10：35(1962)Puchtler的方法染色。图11右下切片用柯胺G代替刚果红按Puchtler的方法染色。两个切片容易地表示同一条淀粉样蛋白充满的血管。也可观察到来自红细胞和脂褐质的少量背景自体荧光。两张显微照片均使用异氰酸荧光素(FITC)滤器用激光同焦点显微镜拍摄。亮条表示20微米。实施例7柯胺G和柯胺G衍生物毒性的测定
将剂量为10和100mg/kg的无放射性柯胺G腹膜内给药，72小时内未在小鼠身上发现显著的行为作用和毒性。[14C]柯胺G给药剂量遵守1mg/kg的医嘱。
根据建立LD50的试验，看来柯胺G很少显示急毒性。甚至以无流体体积影响造成的毒害的可注射到小鼠体内的最大体积(约0.025ml/g)的柯胺G饱和溶液对小鼠注射时(100mg/kg)，在至少72小时的最长试验期内都没有明显的行为变化。通过SPECT或PET测定放射性标记的衍生物所需的剂量将执行低于该剂量的剂量制度。
刚果红已经以远大于用于放射性柯胺G衍生物的量，安全注射到人体内，已公开的刚果红的LD50为190mg/kg小鼠(Tubis等，美国药学会志(J.Amer.Pharm.Assoc.)49：422(1960)。它与柯胺G显示的＞100mg/kg的LD50值相似。因此，这两种化学上相似的化合物对小鼠具有相似的低毒性。
同样，通过以范围很宽的浓度注射并按本领域已知的方法研究动物的各种中毒征兆可试验其他柯胺G衍生物对小鼠或其他较高级的哺乳动物的毒性。见，Goodman和Gilman’s；THE PHARMACOLOGICAL BASISFOR THERAPEUTICS(7th Ed.)。实施例8柯胺G防止Aβ(25-35)-诱发的毒性的能力的测定
PC-12细胞中防止Aβ(25-35)-诱发的毒性
使大鼠成嗜铬细胞瘤细胞(PC-12)在含10％胎牛血清的RPMI1640介质中生长。将大约5000指数生长的细胞接种在介质体积为100μl的96-孔平板中，并在37℃培养过夜。将在37℃被预凝聚7天的Aβ(25-35)与柯胺G(CG)或有关化合物在预先加入20μl达到最终浓度(0.01到10μM Aβ(25-35)和0.03到20μMCG)的水溶液中预培养。将预先加入13.3μl灭菌磷酸盐缓冲盐水中的5mg/ml MTT(3，(4，5-二甲基噻唑-2-基)2，5-二苯基四唑鎓溴化物)的细胞培养24小时。在37℃4.5小时后，加入100μl提取缓冲液(在50％DMF/水中的20％w/vSDS；用2.5％的80％乙酸和2.5％1N HCl)将pH值调至4.7并将平板培养过夜。Hansen等，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)119：203(1989)。然后测量560nm处的颜色变化。仅加20μl蒸馏，去离子H2O的对照孔的吸收率被定义为最大存活力。加入0.1％(最终浓度)三硝基甲苯X-100的孔中，细胞被溶解，解释为最大毒性。
用Aβ(25-35)培养PC12细胞导致这些细胞还原MTT的活性对浓度的依赖降低(图12)。图12显示通过MTT还原而测定的在有和无柯胺G存在下增加Aβ(25-35)的浓度对PC12细胞氧化还原活性的影响。MTT还原产物在560nm的吸收被标在纵轴。Aβ(25-35)的单独作用显示于实心条形图中，显示与剂量有关的减少MTT还原的作用。实心条形图中的白色数字显示与对照物(无Aβ，无柯胺G)的明显差异。空心条形图显示20μM柯胺G的保护作用。空心条形图中的黑色数字显示有无柯胺G存在下MTT之间还原的明显差异。
图13说明增加柯胺G浓度对对抗Aβ(25-35)诱导的PC12细胞氧化还原活性降低的保护作用。无Aβ(25-35)时的柯胺G作用显示于实心条形图中。无Aβ(25-35)存在时，任何浓度的柯胺G与对照物(无Aβ，无柯胺G)之间无明显的差异。空心条形图显示1μM Aβ(25-35)和增加浓度的柯胺G的存在下的MTT还原。实心条形图中的白色数字表示各浓度柯胺G存在下，有无Aβ(25-35)之间的MTT还原的明显差异。空心条形图中的黑色数字显示Aβ(25-35)对照物(无柯胺G)与Aβ(25-35)加增加柯胺G浓度之间的MTT还原的明显差异。
在先技术已报导，刚果红的浓度超过2μM时开始对抗Aβ-诱导的毒性，20μM时达到完全的保护。Burgevin等，神经学报导(NeuroReport)5：2429(1994)；Lorenzo和Yankner，Proc.Natl.Acad.Sci.91：12243(1994)；Pollack等，神经学通报(Neuroscience Letters)184：113(1995)；Pollack等，神经学通报(Neuroscience Letters)197：211(1995)。柯胺G的保护作用既取决于Aβ(25-35)的浓度(图12)也取决于柯胺G的浓度(图13)。柯胺G的保护作用在0.2μM时开始明显，这一浓度非常接近柯胺G与合成的Aβ结合的Ki值，0.37μM(图1)。看起来柯胺G的作用比刚果红更强，在0.1到1.0的范围内即显示作用。这与它们与合成的Aβ结合的Ki价是一致的，其中柯胺G为0.37μM而刚果红为2.8μM(图1)。
在另一个实验中(图14)，通过用1μM Aβ(25-35)培养的细胞检查柯胺G与其不与Aβ结合的酚衍生物(见图1)的作用。柯胺G在0.1和1μM显示保护作用，而酚衍生物未显示保护作用，也许还增加了Aβ的毒性。
这些结果说明刚果红亲脂性衍生物，柯胺G在与其结合Aβ非常相似的浓度下防止细胞培养中由Aβ诱导的毒性。这种保护也显示了结构专一性，因为不与合成的Aβ结合的酸衍生物也不能防止Aβ-诱导的毒性。因为柯胺G能在脑中很好地分配，因为这些结果证明柯胺G和与Aβ结合的柯胺G衍生物具有治疗AD的可能性。
柯胺G保护作用的机理尚不清楚。存在两种主要的可能性。首先，柯胺G可阻碍Aβ的凝聚。第二，柯胺G可阻碍Aβ对靶细胞的作用(直接的或非直接的)。刚果红抑制Aβ的凝聚，并保护对抗凝聚的Aβ毒性作用。Lorenzo和Yankner，Proc.Natl，Acad.Sci.91：12243(1994)。上述实验中的对凝聚的阻碍是未必的，因为用柯胺G培养之前Aβ已被预先凝聚。因此，抑制凝聚可表明是柯胺G重要的治疗作用，但不能解释柯胺G对抗凝聚的Aβ的保护作用，在图7所示的柯胺G与Aβ结合的模型中，展示了柯胺G如何“盖”在Aβ表面。这可能改变如何通过细胞-表面受体或其他大分子如补体蛋白认别原纤维沉积的观点，并与可能由这些大分子介导的Aβ的毒性作用的观点冲突。柯胺G和刚果红可能在Aβ凝聚前和后产生多种影响。从治疗学观点看这是有利的，因为患者可能在已存在Aβ凝聚和正在产生淀粉样蛋白沉积时就诊。
权利要求书
按照条约第19条的修改
1.一种式I所示的能与淀粉样蛋白结合的化合物或其水溶性无毒盐：其中：
为N＝N，C≡C，或CR′＝CR′(其中R′表示H或低级烷基)；X为C(R″)2
(其中R″各自独立地为H，F，Cl，Br，I，低级烷基，CF3，CH2-CH2F，O-CH2-CH2F，CH2-CH2-CH2F，O-CH2-CH2-CH2F，CN，(C＝O)-R′，N(R′)2，NO2，(C＝O)N(R′)2O(CO)R′，OR′，COOR′，三烷基锡，如下所示的四唑或噁二唑：
其中R′为H或低级烷基)或X为CH＝CH，N＝N，C＝O，O，NR′(其中R′表示H或低级烷基)，S，或SO2；R1和R2各自独立地为H，F，Cl，Br，I，低级烷基，CF3，CH2-CH2F，O-CH2-CH2F，CH2-CH2-CH2F，O-CH2-CH2-CH2F，CN，(C＝O)-R′，N(R′)2，NO2，(C＝O)N(R′)2O(CO)R′，OR′，COOR′，三烷基锡，如下所示的四唑或噁二
(其中R′为H或低级烷基)，或如下所示的三氮烯：
(其中R8和R9为低级烷基)或如下所示的基团：当式I化合物为二偶氮苯基化合物时，至少一个R2不为H，OCH3，CH3，或卤素；Q各自独立地选自下列结构，各含一个羧酸或酸样官能团：IA，IB，IC，ID，IE，IF和IG，其中
IA具有如下所示的结构：
其中R3，R4，R5，R6，或R7各自独立地为H，F，Cl，Br，I，低级烷基，CF3，CH2-CH2F，O-CH2-CH2F，CH2-CH2-CH2F，O-CH2-CH2-CH2F，CN，(C＝O)-R′，N(R′)2，NO2，(C＝O)N(R′)2O(CO)R′，OR′，COOR′，三烷基锡，如下所示的四唑或噁二唑：
(其中R′为H或低级烷基)，或如下所示的三氮烯：
(其中R8和R9为低级烷基)或如下所示的基团：其中两个Q′中的R3，R4，R5，R6，或R7中至少有一个为羟基，四唑，噁二唑，NO2，或羧基；以及当R5为羟基而R6为羧基或其低级烷基酯时R1，R2，R3，R4，或R7至少有一个不为H；当R5为氨基，R6为羧基或其低级烷基酯，而R7为羟基时，R1，R2，R3，或R4至少一个不为H；当两个R2正好为CH3，或OCH3，R5为羟基，而R6为羧基或其低级烷基酯时，R1，R3，R4，或R7至少一个不为H；当R3，R4，或R7为CH3，R5为羟基而R6为羧基或其低级烷基酯时，R1或R2至少一个不为H或CH3；当R4为F时，R7不为羟基；当R5为羟基而R6为羧基或其低级烷基酯时，R2不为COOH；当R5为羟基而R6为H时，R1，R2，R3，R4，或R7中至少一个不为H；当R6是COOH和R7是羟基时R4不是磺基；当R2为羧基时，R3和R7不为NH2或羟基；当R5为羟基，R6为羧基或其低级烷基酯，而式I中的X为CR′＝CR′时，R1，R2，R3，R4，或R7至少有一个不为H；当式I的X为SO2时R1或R2中至少有一个不是H，或者R3，R5，或R7中至少有一个不为H，羟基，或CH3；
IB具有如下所示的结构：其中：R10，R11，R12，R13，R14，R15，或R16各自独立地为H，F，Cl，Br，I，低级烷基，CF3，CH2-CH2F，O-CH2-CH2F，CH2-CH2-CH2F，O-CH2-CH2-CH2F，CN，(C＝O)-R′，N(R′)2，NO2，(C＝O)N(R′)2，O(CO)R′，OR′，COOR′，三烷基锡，如下所示的四唑或噁二唑：
(其中R′为H或低级烷基)，或如下所示的三氮烯：
(其中R8和R9为低级烷基)或其中两个Q′的R10，R11，R12，R13，R14，R15，或R16中至少有一个为羟基，四唑，噁二唑，NO2或羧基，当R10为羟基而R16为(C＝O)N(R′)2或羧基或其低级烷基酯时，R1或R2中至少有一个为Br或I或R11-R15中至少有一个不为H；当R15为羟基而R16为羧基或其低级烷基酯时，R1或R2中至少有一个为Br或I或R10-R14中至少有一个不为H；当式I中X为SO2时，R1或R2中至少有一个不为H或R11-R14中至少有一个不为H；
IC具有如下所述的结构：其中：R17，R18，R19，R20，或R21中至少一个为H，F，Cl，Br，I，低级烷基，CF3，CH2-CH2F，O-CH2-CH2F，CH2-CH2-CH2F，O-CH2-CH2-CH2F，CN，(C＝O)-R′，N(R′)2，NO2，(C＝O)N(R′)2O(CO)R′，OR′，COOR′，三烷基锡，如下所示的四唑或噁二唑： 有关19条修改的申明
根据1996年9月27日邮寄的国际检索报告，本申请人以此处递交的替换页权利要求1-4a页替换原权利要求1-4页，以对权利要求作出修改。这些替换页对权利要求1有所修改，权利要求2至25与原递交的相同。所述权利要求1之修改在于式I中有关R2的定义，以及修改结构式IA、IB上R基团的结合定义，由此排除检索报告中所引用之文献中已经公开过的那些化合物。
申请人研读过国际检索报告及引用的文献，注意到只指出了权利要求1缺乏新颖性和创造性措施。因此申请人修改了该权利要求，以便该引用文献再不至于破坏替换页所要求保护之化合物的新颖性和创造性措施。
申请人认为替换页第1-4a中所含权利要求，对于检索报告中引用的各文献来说具有新颖性和创造性措施。