从骆驼刺植物中提取的异黄酮木脂素类化合物及其用途和提取方法 技术领域：
本发明涉及一种异黄酮木脂素类化合物及其用途和提取方法，特别是一种从骆驼刺植物中提取的异黄酮木脂素类化合物及其用途和提取方法。
背景技术：
异黄酮并木脂素(isoflavonolignan)类化合物是指异黄酮母体与C6-C3(即Ph-C3)片段通过二噁烷结构发生骈和而形成的一类化合物。天然产物中有类似骈和方式的化合物有黄酮木脂素类化合物和香豆素木脂素类化合物，且关于这两类化合物的相关报道较早，而对于异黄酮并木脂素类化合物的报道是近年才出现的。
异黄酮木脂素类化合物在植物界分布仅限于豆科，且其结构类型就目前文献报道的也仅有两种，母体化合物骈上木脂素片段的化合物，但目前获得这一类物质的途径较窄。
对豆科植物骆驼刺的生物活性成分进行分离鉴定时，分离出了一种新的结构类型的异黄酮木脂素类化合物。虽然目前对此类化合物的研究并不多，但就目前的研究进展来看，此类化合物在植物化学分类学上具有一定的意义。继续深入研究该化合物的化学和药理作用，发现这种新结构的异黄酮木脂素类化合物具有如抗癌、保肝、抗病毒、酶抑制和血小板活化因子拮抗等重要的生理活性。
因此，一种异黄酮木脂素类化合物及该化合物的用途和提取方法，特别是一种从骆驼刺植物中提取的异黄酮木脂素类化合物及该化合物的用途和提取方法的提出，对于充分利用植物资源，开发高效、低毒的天然药物就具有重要的意义。
发明内容：
本发明的目的是提供一种异黄酮木脂素类化合物及该化合物的用途和提取方法，特别是一种从骆驼刺植物中提取的异黄酮木脂素类化合物及该化合物的用途和提取方法。
本发明的异黄酮木脂素类化合物的结构式为：
其表达式为：
2，3-trans-8-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenylmethanol)-2，3-dihydro-7H-1，4-dioxino[2，3-h]chrome-7-one。
经实验验证，上述化合物对PDE4、PDE5均具有抑制作用，而罂粟碱对PDE5抑制作用较PDE4强，因此，本发明的化合物对于治疗勃起困难、增加免疫和抗菌消炎均有积极作用，可应用研究于治疗勃起困难、增加免疫和抗菌消炎一类药物中。
上述化合物的提取方法如下：
原料准备：取骆驼刺干燥原植物粉碎或切成≤2厘米的颗粒或段作为原料；
醇提：按每2500～3500ml 50～70％乙醇加入10kg原料的比例回流提取1～2h，过38～180μm孔径筛，取过滤液。上述的提取最好重复进行2～5次。
合并滤液，浓缩至乙醇浓度≤2％得浓缩液；
萃取：将浓缩液在浓缩液体积2-3倍的氯仿中萃取1～2h，过38～180μm筛；
上述的萃取最好重复进行2-5次，
将所得萃取液浓缩至氯仿浓度≤2％，
硅胶柱层析：按硅胶柱柱体体积8～12倍量取氯仿萃取液经硅胶柱层析；
所述硅胶柱粒径最好为150μm以下，优选为74～150μm。
洗脱：用丙酮含量为10～50％的石油醚-丙酮混合液洗脱
收集洗脱液，经过ODS高效液相制备柱，将所得流动相脱去石油醚和丙酮即得到本发明的异黄酮木脂素类化合物。
上述ODS高效液相制备柱最好为反相ODS高效液相制备柱.
上述高效液相制备柱上述固定相的粒度要求61μm以下，优选45μm以下。
对本发明的异黄酮木脂素类化合物进行分析，结果如下：
1H(300MHz)，13C(600MHz)，and HMBC NMR data of compound(C5H5N，δppm)
对本发明的异黄酮木脂素类化合物的试验证明：
本发明的异黄酮木质素类化合物是特定的PDE5、PDE4抑制剂，可以将其发展成口服制剂以用于治疗勃起困难、增加免疫和抗菌消炎作用。
药理试验如下：
PDE5是从人体血小板分离，PDE4是从大鼠肝脏组织提取每1ml冷冻血样含均匀Buffer溶液[2mmolHEPES缓冲液包含0.25mol/L蔗糖，1mmol/L EDTA，1mmol/L(苯基-甲砜基-氟化物)PMSF PH＝7.2]加入10mL血小板或肝脏匀浆样品，在4℃的条件匀浆60分钟，且将浮在表面物质通过0.2um的滤膜，可溶部分的组织用法玛西亚(Pharmacia)的FPLC系统、单通道Q-柱通过20mmol/L HEPES的buffer溶液(PH2.2)其中含1mmol/L的EDTA和0.5mmol/L的PMSF溶液预平衡，然后通过可溶性的样品，然后用5mL的buffer液中洗，PDE同功酶用0～500mmol/L不同浓度的Nacl在相同的buffer液中(共55ml)进行梯度洗脱，流速1mL/分钟，柱子使PDE的活性部分高度聚集，存于-80摄氏度备用。
本发明的异黄酮木质素类化合物和罂粟碱对PDE5和PDE4作用的活性通过使用两种的同位素(Thomson、Applemam)实验过程显示在FPLC内的环核苷酸PDE具有活性，这种混合物反应(总体积100ml)包含柱部分洗脱物(10ul-25ul)[3H]-cGMP/[3H]-cAMP(0.5umol/L，2uCi/mL)。
实验开始后加入无线电标记底物或孵化酶放入30摄氏度水浴中20分钟，将样品管放沸水中2分钟后实验结束，代谢产品与未代谢底物通过AG1-x2树脂及0.1mol/NaOH洗脱处理地离子交换柱得到分离，并通过闪烁池检测洗脱物的放射性来确定PDE的催化活性。
研究PDE同工酶抑制作用
在二甲基亚砜液中本发明的异黄酮木质素类化合物及罂粟碱被加入到温浴的混合物中。PDE生化酶的加入代表反应开始，全部的抑制实验都在CGMP/CAMP水解不超过15％中进行，并且酶的倍数与数量以线性增长，通过本发明的异黄酮木质素类化合物、罂粟碱对PDE5/PDE4的抑制作用研究动力学，[3H]-cGMP/[3H]-cAMP底物浓度集中在0.3μmol/L至10μmol/L，最初的水解率是在无样品或有样品的存在下进行的(10-10mol/L～10-4mol/L)。
统计分析
对于数据将酶活性的对数与浓度作拟和曲线，计算PDE5抑制作用的半数抑制率s曲线如图1、图2。
试验结果：
1.对特定PDE5活性影响：
本发明的异黄酮木质素类化合物和罂粟碱对PDE5具有剂量依赖性的抑制作用。
本发明的异黄酮木质素类化合物的抑制作用在PDE5为10-8mol/L(2％)～10-4mol/L(99.70％)。罂粟碱的抑制作用在PDE5为10-8mol/L(4.1％)～10-4mol/L(96.40％)。
本发明的异黄酮木质素类化合物和罂粟碱抑制PDE5活性具有浓度依赖性P＜0.01，而二者间并没有显著差异；
2.对PDE4活性影响：
本发明的异黄酮木质素类化合物和罂粟碱对PDE4具有剂量依赖性的抑制作用。
本发明的异黄酮木质素类化合物对PDE4的抑制作用为10-8mol/L(1％)～10-3mol/L(95％)，罂粟碱对PDE4的抑制作用为10-8mol/L(4％)～10-3mol/L(95％)。本发明的异黄酮木质素类化合物和罂粟碱对PDE抑制作用具有浓度依赖性(P＜0.01)，本发明的异黄酮木质素类化合物的抑制作用显著高于罂粟碱。
3.PDE5/PDE4抑制作用：
它们的结果可以从S曲线看出
本发明的异黄酮木质素类化合物在PDE5的半数抑制率为0.43μmol/L，罂粟碱为0.68μmol/L。对PDE4半数抑制率浓度为0.50μmol/L和3.07μmol/L，本发明的异黄酮木质素类化合物和罂粟碱对PDE5的选择力(PDE4/PDE5，IC5o)是1.04倍和4.72倍，本发明的异黄酮木质素类化合物和罂粟碱对PDE4的选择力是0.96倍和0.21倍，本发明的异黄酮木质素类化合物对PDE5的选择性抑制率是罂粟碱(PDE4/PDE5，IC50)的0.22倍，本发明的异黄酮木质素类化合物对PDE4的选择性抑制率是罂粟碱(PDE5/PDE4，IC50)的4.57倍。
该结果说明：
本发明的异黄酮木质素类化合物对PDE4、PDE5均有抑制作用，而罂粟碱对PDE5抑制作用较PDE4强。
本发明首次从骆驼刺植物获得了本发明的化合物，为获得异黄酮木脂素类化合物找到了一种新的途径，对于充分利用植物资源和开发高效、低毒的治疗勃起困难、增加免疫和抗菌消炎作用的天然药物具有重要意义。
附图说明：
图1为本发明的异黄酮木质素对PDE5抑制作用的半数抑制率s曲线图。
图2为本发明的异黄酮木质素对PDE4抑制作用的半数抑制率s曲线图。
具体实施方式：
实施例1：
取骆驼刺干燥原植物粉碎成2厘米的颗粒作为原料，按每3500ml65％的乙醇加入10kg原料回流提取1.5h，过180μm孔径筛，取过滤液，截留物再按10kg原料量/3000ml65％的乙醇的比例重复回流提取2次，合并滤液，减压浓缩并脱醇至乙醇浓度≤2％得浓缩液，将浓缩液在浓缩液体积2倍的氯仿中萃取2h，过100μm筛，截留物重复进行2次萃取，将所得萃取液浓缩至氯仿浓度≤2％，按硅胶柱柱体体积8倍量取氯仿萃取液经150μm粒度的硅胶柱层析，用丙酮含量为15％的石油醚-丙酮混合液洗脱，收集洗脱液，经过反相ODS高效液相制备柱，固定相为硅胶，颗粒度48μm，将所得流动相脱去石油醚和丙酮即得到本发明的异黄酮木脂素类化合物。
实施例2：
取骆驼刺干燥原植物粉碎成1厘米的颗粒作为原料，按每3000ml 70％的乙醇加入10kg原料回流提取2h，过150μm孔径筛，取过滤液，截留物再按10kg原料量/3000ml65％的乙醇的比例重复回流提取3次，合并滤液，减压浓缩并脱醇至乙醇浓度≤2％得浓缩液，将浓缩液在浓缩液体积2倍的氯仿中萃取1.5h，过74μm筛，截留物重复进行2次萃取，将所得萃取液浓缩至氯仿浓度≤2％，按硅胶柱柱体体积10倍量取氯仿萃取液经124μm粒度的硅胶柱层析，用丙酮含量为30％的石油醚-丙酮混合液洗脱，收集洗脱液，经过ODS高效液相制备柱，固定相颗粒度25μm，将所得流动相脱去石油醚和丙酮即得到本发明的异黄酮木脂素类化合物。
实施例3：
取骆驼刺干燥原植物粉碎成0.5厘米的颗粒作为原料，按每3000ml 65％的乙醇加入10kg原料回流提取2h，过150μm孔径筛，取过滤液，截留物再按10kg原料量/2500ml70％的乙醇的比例重复回流提取2次，合并滤液，减压浓缩并脱醇至乙醇浓度≤2％得浓缩液，将浓缩液在浓缩液体积2.5倍的氯仿中萃取1h，过104μm筛，截留物重复进行2次萃取，将所得萃取液浓缩至氯仿浓度≤2％，按硅胶柱柱体体积10倍量取氯仿萃取液经124μm粒度的硅胶柱层析，用丙酮含量为50％的石油醚-丙酮混合液洗脱，收集洗脱液，经过反相ODS高效液相制备柱，固定相颗粒度15μm，将所得流动相脱去石油醚和丙酮即得到本发明的异黄酮木脂素类化合物。
实施例4：
取骆驼刺干燥原植物切成1厘米以内的段作为原料，按每3000ml65％的乙醇加入10kg原料回流提取1.5h，过74μm孔径筛，取过滤液，截留物再按10kg原料量/2800ml65％乙醇的比例重复回流提取3次，合并滤液，减压浓缩并脱醇至乙醇浓度≤2％得浓缩液，将浓缩液在浓缩液体积2.5倍的氯仿中萃取1.5h，过74μm筛，截留物按上述配比重复进行2次萃取，将所得萃取液浓缩至氯仿浓度≤2％，按硅胶柱柱体体积12倍量取氯仿萃取液经74μm粒度的硅胶柱层析，用按硅胶柱柱体体积8倍量，丙酮含量为25％的石油醚-丙酮混合液洗脱，收集洗脱液，经过反相ODS高效液相制备柱，固定相颗粒度23μm，将所得流动相脱去石油醚和丙酮即得到本发明的异黄酮木脂素类化合物。
实施例5：
取骆驼刺干燥原植物切成0.5厘米以内的段作为原料，按每3200ml 50％的乙醇加入10kg原料回流提取1.5h，过38μm孔径筛，取过滤液，截留物再按10kg原料量/2800ml65％乙醇的比例重复回流提取3次，合并滤液，减压浓缩并脱醇至乙醇浓度≤2％得浓缩液，将浓缩液在浓缩液体积2.5倍的氯仿中萃取1.5h，过38μm筛，截留物按上述配比重复进行1次萃取，将所得萃取液浓缩至氯仿浓度≤2％，按硅胶柱柱体体积9倍量取氯仿萃取液经104μm粒度的硅胶柱层析，用按硅胶柱柱体体积12倍量，丙酮含量为45％的石油醚-丙酮混合液洗脱，收集洗脱液，经过反相ODS高效液相制备柱，固定相颗粒度13μm，将所得流动相脱去石油醚和丙酮即得到本发明的异黄酮木脂素类化合物。
实施例6：
取骆驼刺干燥原植物粉碎成0.8厘米以下的颗粒作为原料，按每3400ml 55％的乙醇加入10kg原料回流提取1.5h，过124μm孔径筛，取过滤液，截留物再按10kg原料量/2500ml 50％乙醇的比例重复回流提取3次，合并滤液，减压浓缩并脱醇至乙醇浓度≤2％得浓缩液，将浓缩液在浓缩液体积2倍的氯仿中萃取1h，过44μm筛，截留物按上述配比重复进行2次萃取，将所得萃取液浓缩至氯仿浓度≤2％，按硅胶柱柱体体积11倍量取氯仿萃取液经74μm粒度的硅胶柱层析，用按硅胶柱柱体体积8倍量、丙酮含量为30％的石油醚-丙酮混合液洗脱，收集洗脱液，经过反相ODS高效液相制备柱，固定相颗粒度18μm，将所得流动相脱去石油醚和丙酮即得到本发明的异黄酮木脂素类化合物。
实施例7：
取骆驼刺干燥原植物粉碎成1.2厘米以下的颗粒作为原料，按每2500ml 50％的乙醇加入10kg原料回流提取1.5h，过150μm孔径筛，取过滤液，截留物再按10kg原料量/2500m150％乙醇的比例重复回流提取3次，合并滤液，减压浓缩并脱醇至乙醇浓度≤2％得浓缩液，将浓缩液在浓缩液体积2倍的氯仿中萃取1.5h，过61μm筛，截留物按上述浓缩液体积1.5倍的氯仿中萃取1h并重复进行2次萃取，将所得萃取液浓缩至氯仿浓度≤2％，按硅胶柱柱体体积10倍量取氯仿萃取液经74μm粒度的硅胶柱层析，用按硅胶柱柱体体积10倍量、丙酮含量为25％的石油醚-丙酮混合液洗脱，收集洗脱液，经过反相ODS高效液相制备柱，固定相颗粒度10μm，将所得流动相脱去石油醚和丙酮即得到本发明的异黄酮木脂素类化合物。
实施例8：
取骆驼刺干燥原植物粉碎成1.0厘米以下的颗粒作为原料，按每3300ml 50％的乙醇加入10kg原料回流提取1.5h，过150μm孔径筛，取过滤液，截留物再按10kg原料量/2500ml50％乙醇的比例重复回流提取3次，合并滤液，减压浓缩并脱醇至乙醇浓度≤2％得浓缩液，将浓缩液在浓缩液体积2.2倍的氯仿中萃取1.8h，过62μm筛，截留物按上述浓缩液体积1.5倍的氯仿中萃取1h并重复进行2次萃取，将所得萃取液浓缩至氯仿浓度≤2％，按硅胶柱柱体体积8倍量取氯仿萃取液经74μm粒度的硅胶柱层析，用按硅胶柱柱体体积10倍量、丙酮含量为45％的石油醚-丙酮混合液洗脱，收集洗脱液，经过反相ODS高效液相制备柱，固定相颗粒度6.5μm，将所得流动相脱去石油醚和丙酮即得到本发明的异黄酮木脂素类化合物。
实施例9：
取骆驼刺干燥原植物粉碎成0.8厘米以下的颗粒作为原料，按每3500ml 50％的乙醇加入10kg原料回流提取1.5h，过150μm孔径筛，取过滤液，截留物再按10kg原料量/2800ml50％乙醇的比例重复回流提取2次，合并滤液，减压浓缩并脱醇至乙醇浓度≤2％得浓缩液，将浓缩液在浓缩液体积2.8倍的氯仿中萃取1.5h，过38μm筛，截留物按上述浓缩液体积1.5倍的氯仿中萃取1.5h并重复进行1次萃取，将所得萃取液浓缩至氯仿浓度≤2％，按硅胶柱柱体体积12倍量取氯仿萃取液经58μm粒度的硅胶柱层析，用按硅胶柱柱体体积10倍量、丙酮含量为30％的石油醚-丙酮混合液洗脱，收集洗脱液，经过反相ODS高效液相制备柱，固定相颗粒度2.6μm，将所得流动相脱去石油醚和丙酮即得到本发明的异黄酮木脂素类化合物。
实施例10：
取骆驼刺干燥原植物粉碎成0.5厘米以下的颗粒作为原料，按每3000ml 50％的乙醇加入10kg原料回流提取2h，过150μm孔径筛，取过滤液，截留物再按10kg原料量/3000ml50％乙醇的比例重复回流提取1次，合并滤液，减压浓缩并脱醇至乙醇浓度≤2％得浓缩液，将浓缩液在浓缩液体积2.5倍的氯仿中萃取2h，过149μm筛，截留物按上述浓缩液体积1.5倍的氯仿中萃取2h并重复进行1次萃取，将所得萃取液浓缩至氯仿浓度≤2％，按硅胶柱柱体体积10倍量取氯仿萃取液经106μm粒度的硅胶柱层析，用按硅胶柱柱体体积10倍量、丙酮含量为30％的石油醚-丙酮混合液洗脱，收集洗脱液，经过反相ODS高效液相制备柱，固定相颗粒度58μm，将所得流动相脱去石油醚和丙酮即得到本发明的异黄酮木脂素类化合物。
实施例11：
取骆驼刺干燥原植物粉碎成0.6厘米以下的颗粒作为原料，按每3200ml 50％的乙醇加入10kg原料回流提取1.2h，过124μm孔径筛，取过滤液，截留物再按10kg原料量/2700ml50％乙醇的比例重复回流提取2次，合并滤液，减压浓缩并脱醇至乙醇浓度≤2％得浓缩液，将浓缩液在浓缩液体积2.2倍的氯仿中萃取2h，过89μm筛，截留物按上述浓缩液体积1.5倍的氯仿中萃取2h并重复进行1次萃取，将所得萃取液浓缩至氯仿浓度≤2％，按硅胶柱柱体体积10倍量取氯仿萃取液经74μm粒度的硅胶柱层析，用按硅胶柱柱体体积10倍量、丙酮含量为45％的石油醚-丙酮混合液洗脱，收集洗脱液，经过反相ODS高效液相制备柱，固定相颗粒度74μm，将所得流动相脱去石油醚和丙酮即得到本发明的异黄酮木脂素类化合物。
实施例12：
取骆驼刺干燥原植物粉碎成0.3厘米以下的颗粒作为原料，按每3300ml 50％的乙醇加入10kg原料回流提取1.5h，过124μm孔径筛，取过滤液，截留物再按10kg原料量/2500ml50％乙醇的比例重复回流提取2次，合并滤液，减压浓缩并脱醇至乙醇浓度≤2％得浓缩液，将浓缩液在浓缩液体积2.5倍的氯仿中萃取2h，过44μm筛，截留物按上述浓缩液体积1.8倍的氯仿中萃取1.5h并重复进行1次萃取，将所得萃取液浓缩至氯仿浓度≤2％，按硅胶柱柱体体积10倍量取氯仿萃取液经74μm粒度的硅胶柱层析，用按硅胶柱柱体体积10倍量、丙酮含量为40％的石油醚-丙酮混合液洗脱，收集洗脱液，经过反相ODS高效液相制备柱，固定相颗粒度2.5μm，将所得流动相脱去石油醚和丙酮即得到本发明的异黄酮木脂素类化合物。