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描述了用于通过吸收测量而测定液体中分析物浓度的系统，包括具有检测区域(2)的测试元件(1)，所述检测区域包含至少一个具有用于检测分析物的试剂的反应区域(3)，该试剂在与该分析物反应时造成吸收行为的改变，且所述检测区域(2)包含至少一个参照区域(4)，其中的吸收行为基本不由分析物改变。此外，该系统包括用于至少接收来自检测区域的光强度的空间分辨检测的检测单元(7)和用于评价检测单元(7)信号的评价单元(8)。该系统的特征在于该反应区域(3)和参照区域(4)是二维交替设置的。

1.  用于通过吸收测量而测定液体中分析物浓度的系统，包括：
-具有检测区域的测试元件，该检测区域包含至少一个具有用于检测分析物的试剂的反应区域，该试剂在与该分析物反应时造成反应区域内光密度的改变，和
-该检测区域包含至少一个参照区域，其中吸收行为基本不由于分析物而发生改变，
-用于至少接收来自一部分检测区域的光强度的空间分辨检测的检测单元，该检测单元包含至少一个反应区域和参照区域，和
-用于评价检测单元信号的评价单元，
其特征在于该参照区域具有在润湿时其吸收行为基本不改变的性质。

2.  权利要求1的系统，其特征在于所述检测区域包含多个反应区域和多个参照区域。

3.  权利要求2的系统，其特征在于所述反应区域和所述参照区域是二维交替设置的。

4.  权利要求1、2或3的系统，其特征在于所述至少一个参照区域具有涂层或浸渍层。

5.  权利要求4的系统，其特征在于所述涂层或浸渍层是膜或塑料或人造树脂。

6.  前述权利要求之一的系统，其特征在于当存在分析物时，在反应区域内生成不溶于水的染料。

7.  前述权利要求之一的系统，其特征在于所述试剂包括至少一种与分析物反应的酶。

8.  前述权利要求之一的系统，其特征在于所述参照区域不包含活性酶。

9.  前述权利要求之一的系统，其特征在于所述试剂区域和参照区域的设置和/或形状是无规则的。

10.  前述权利要求之一的系统，其特征在于所述反应区域和参照区域具有相同的尺寸和相同的体积。

11.  前述权利要求之一的系统，其特征在于所述反应区域或参照区域的面积小于1mm²。

12.  前述权利要求之一的系统，其特征在于检测透射光和/或反射光。

13.  用于通过测定光密度来测定体液中分析物浓度的测试元件，包括
-检测区域，其包含多个具有试剂的反应区域和多个参照区域，在该参照区域内，基本不由于分析物而造成光密度的改变，
其特征在于该参照区域具有当润湿时吸收行为基本不改变的性质。

14.  权利要求13的测试元件，其特征在于所述多个反应区域和多个参照区域是二维交替设置的。

15.  用于制备用于测定体液中分析物的测试元件的方法，包括以下步骤：
-提供载体材料
-在该载体材料上施加检测区域，其中所述检测区域具有至少一个反应区域和至少一个参照区域
其特征在于该参照区域具有当润湿时吸收行为基本不改变的性质。

16.  权利要求15的方法，其特征在于所述反应区域和所述参照区域是二维交替设置的。

17.  权利要求16的方法，其特征在于所述试剂区域和所述参照区域的设置和/或形状是无规则的。

18.  权利要求15、16或17的方法，其特征在于使用印刷方法和/或刀涂方法将试剂施加在所述检测区域上。

19.  权利要求15～18之一的方法，其特征在于所述参照区域是通过激光辐照一部分反应区域和/或通过改变一部分反应区域的化学组成而产生的。

20.  权利要求15～19之一的方法，其特征在于，优选通过激光辐照和/或化学处理，使所述参照区域内的至少部分试剂失活。

21.  权利要求15～20之一的方法，其特征在于所述参照区域包含的至少一种物质少于反应区域。

22.  权利要求15～21之一的方法，其特征在于所述参照区域包含至少一种额外的阻止与分析物发生反应的物质。

23.  用于借助权利要求13的测试元件检测分析物的方法，包括以下步骤：
-将样品施加于所述检测区域
-对来自检测区域的反射光强度进行空间分辨测定
-借助于由至少一个反应区域和至少一个参照区域测定的光强度，测定该分析物浓度。

24.  权利要求23的方法，其特征在于施加小于500nl的样品体积。

具有参照的测试元件
技术领域
本发明涉及对液体中分析物浓度的测定。
背景技术
对生理样品中多种分析物浓度的测定在我们的社会中越来越重要。在多种应用领域都对这种样品进行分析，例如在临床实验室或在“家庭监控”中。在这一点上，结果对治疗各种疾病是非常重要的。这也尤其包括在糖尿病管理中对葡萄糖的测定以及在心脏病和血管病的情况下对胆固醇的测定。医学血液诊断学总是需要从待检查的个体中收集血样。
在刺血过程之后进行的分析通常是在小的便携式测定装置(所谓的手提式装置)中进行的，在其中分析用血液润湿的测试元件。这些手提式装置尤其在糖尿病的诊断中是非常重要的。在这些装置中，主要进行电化学或光学测定。在基于光学的测定情况下，用光照射该样品，检测反射光以测定分析物浓度。为此主要使用例如测试条的测试元件，其在作为该测试元件一部分的检测区域上被样品(例如血液或胞间液)润湿。随后该样品与施加在检测区域之内或之上的试剂反应。这可以导致颜色的变化或在电化学反应的情况下导致电荷变化，然后可以对其检测。
在仅施加少量样品的检测区域的光学评价情况下，最优评估检测区域的润湿区域是非常重要的。除了充分照射和检测之外，这可以通过使用参照区域而实现。该参照可以以多种方式进行。例如，可以使用与检测区域分开的参照区域，由此可以对技术效果(例如光源或检测器的性质以及测试元件的某些性质)进行补偿。为了能够关于样品性质进行参照，该参照区域应当具有与检测区域类似的结构。
在文献2004/0071331中使用了用于检测色斑的光强度的反射计测量系统，其中将环绕该斑的周围区域用于参照。该方法的缺点是用于参照的背景信号不被该信号润湿，因此具有与被样品润湿的区域不同的光学性质。
在欧洲专利申请EP0469377中，描述了用于测定样品中分析物浓度的方法，其中划分成在两个对样品中的分析物具有不同结合活性的部分区域。将结合配对物载体固定在该具有较高结合活性的部分区域内，在施加样品时其与该分析物相结合。在对分析物具有较小结合活性的部分区域内的载体上不固定结合配对物。该具有较小结合活性的区域用于参照。该分析系统的缺点在于使用该分析方法，仅能进行和参照前提是将分析物结合到固定在载体上的结合配对物的反应，使得分析物的扩散不再可能。分析物的测定被限制为结合分子。
美国专利号US6249593B1描述了用于在测试载体上检测分析物的系统。将分析物结合到固定在测试载体上的受体。将不包含固定受体的部分测试载体用作参照。而且在该文献中，分析物的测定的前提是结合到固定组分。
从现有技术的缺点中，产生了如下任务，也即开发出不需要将分析物不可逆地结合到测试载体的用于测定分析物浓度的分析系统。
另一任务是提供能够使用非常小的样品体积更精确测定分析物的分析系统。
这个任务通过用于通过吸收测量而测定液体中分析物浓度的系统来实现，该系统包括具有检测区域的测试元件，该检测区域包含至少一个具有用于检测分析物的试剂的反应区域，该试剂在与该分析物反应时造成吸收行为的改变，以及该检测区域包含至少一个参照区域。此外，该系统包含用于至少接收来自检测区域的光强度的空间分辨检测的检测单元和用于评价检测单元信号的评价单元。该系统的特征在于该至少一个参照区域具有在润湿时吸收行为基本不改变的性质。
在这一点上，该检测区域可以具有各种形状，例如其可以是有角的或圆形的。检测区域的优选形状是正方形或矩形的。因此该检测区域具有长度和宽度。由长度和宽度撑起的区域具有至少一个反应区域以及至少一个参照区域。
该至少一个反应区域和至少一个参照区域的区别在于在参照区域内基本没有由于分析物导致的光吸收行为的改变发生。这优选是由于参照区域没有可与分析物反应的试剂而实现的。保持该至少一个参照区域内吸收行为的改变尽可能小的另一种可能方式是避免样品对该至少一个参照区域的润湿。
优选通过参照区域相对于反应区域的几何设置来防止该样品与参照区域的接触。因此，例如可以在两个区域之间存在隔件。除了通过隔件将该参照区域分隔开之外，该参照区域也可以设置在相对于反应区域错开的高度上，使得当将样品施加于检测区域时，该参照区域不与样品接触。当自动将样品施加于检测区域时(例如可以通过使用毛细管或吸收材料实现)，该参照区域可以距施加位置一定距离，以使得由于该参照区域和施加位置之间选定的距离而使该样品液体不能接触到该参照区域。在优选实施方式中，例如用针状结构容纳的液体样品通过用该针状结构有针对性地接触检测区域而施加。该检测区域与针状结构的有针对性(例如自动的)接触可以实现仅有该检测区域的选择区域与该液体接触的效果。
在另一优选的实施方式中，该样品既与反应区域也与参照区域接触。该反应区域具有在润湿时吸收行为基本不改变的性质。参照区域内吸收行为的极微小改变是由于作为液体(例如血清、血液或尿液)施加于检测区域的样品的性质。这些性质例如包括折射率，当将液体施加于检测区域时，由于该液体置换的空气具有与施加液体不同的折射率而使得折射率在检测区域上改变。然而，固体组分或染料以及液体样品的其它组分也属于所述影响吸收行为的性质，而由此不能推导出分析物的存在。因为参照区域内吸收行为的改变仅是反应区域内由于分析物改变造成吸收改变的一部分，因此人们可以谈论基本未改变的吸收行为。在这一点上，参照区域内吸收行为的改变不超过原始吸收的30％，优选不超过5％，特别优选不超过1％。
在优选实施方式中，多个反应区域和多个参照区域二维交替设置。二维交替表示在该反应区域和参照区域所位于的区域上的检测区域内，至少一个反应区域和至少一个参照区域错开地设置。这与观察该区域的平面无关。在这一点上，该两个维度撑起(aufspannen)该检测区域的基面，以及该两个维度的轴彼此呈直角设置。因此，至少一个反应区域和至少一个参照区域既设置在第一个维度也设置在第二个维度中。在这种情况下，各区域可以具有不同的形状和尺寸。
当将样品液体施加于检测区域时，分析物和试剂反应用于至少在至少一个反应区域内检测分析物。在该分析物与试剂的反应过程中，至少一个润湿有样品液体的反应区域的光吸收行为发生改变。在最重要的实际应用中，该试剂包含至少一种优选固定在检测区域上的酶。该酶反应的反应产物中的一部分可以用作用于进一步酶反应的中间产物，或者酶反应的最终产物本身可以改变反应区域内的吸收行为。在两种情况下(最终产物或中间产物)，在该反应过程中生成染料，其改变了反应区域的吸收行为。由于该分析物和至少一种试剂在反应区域内的反应，发生了光吸收行为的改变。在该过程中，在照射波长处的吸收可以升高或降低。因为在优选反应中生成了吸收照射波长的光的染料，因此该吸收优选升高。可以借助于检测器检测来自检测区域反射或透射的光。下面描述了其中由于生成了染料而使吸收行为改变的系统。
在该一个或多个参照区域内至少不发生来自反应区域的改变吸收行为的反应。这可以由于以下作为实例描述的多种原因：
1.在参照区域内没有任何酶。
2.在参照区域内的该至少一种酶是失活的。
3.该显色反应在该参照区域内不发生。
4.参照区域的其它涂层至少部分防止样品对该参照区域的润湿。
5.该参照区域未用样品润湿。
以这种方式，参照区域的结构和对分析物的行为可以设计为与反应区域非常相似。但是，在参照区域内没有发生由于分析物导致的光吸收的改变。该前三种变型可以确保在参照中考虑了样品的性质，这提高了测定结果的精确度。其可以特别优选用于具有尽可能小的测试元件或检测区域的系统中，因为微型化系统的测定信号也非常小，因此容易产生误差。其中考虑了测试元件和样品的不规则性的对检测区域尽可能相同区域的参照，可使非常少量的样品仍能得到充分精确的评价。
为了防止生成的染料从试剂区域扩散到参照区域内，可以选择在由分析物和试剂反应生成之后不溶于水的染料。结果染料沉淀在水溶液(例如血液)中，不会发生染料扩散到相邻区域(例如参照区域)内。
该试剂和参照区域的设置和/或形状可以无规则选择，或者可以均匀。在优选实施方式中，该反应区域和参照区域具有不同的尺寸，该至少一个参照区域特别优选小于该至少一个反应区域。在另一优选的实施方式中，多个试剂区域和参照区域规则设置。在这种情况下，该反应区域和参照区域可以具有相同的尺寸和/或相同的体积。为了能够评价小样品体积，该反应区域和参照区域的面积应选择为尽可能小。因为检测区域的大小仅为几平方毫米，优选的反应区域和参照区域的面积也是几平方毫米。检测区域的最小可能尺寸一方面取决于该反应区域和参照区域的制备方法的选择，另一方面取决于检测的精确度。如果使用高分辨率的检测系统，则可以光学区分非常小的区域。在优选实施方式中，该反应区域或参照区域的面积＜1mm²。为了在分析物的分析中实现足够高的精确度，应当用样品润湿至少一部分反应区域和一部分参照区域。该区域选择得越小，为获得足够润湿反应区域以及足够润湿参照区域的足够信号用于检测分析物所需的样品液体就越少。如果如优选实施方式中所述，反应区域和参照区域二维交替设置，那么单一反应区域和参照区域的润湿就足以测定分析物的浓度。为此为了能够测定尽可能少的样品，可以选择尽可能小的反应区域和参照区域，以使当施加样品时，至少一个反应区域和参照区域被足够润湿。
尤其优选使用印刷方法和/或刀涂方法制备具有不同的二维交替设置的反应区域和参照区域的测试元件。在这种情况下，可以用试剂连续涂覆该检测区域，随后可以通过激光辐照和/或对其化学组成的改性将其部分转化为参照区域。
参照区域的结构
为达到尽可能好的参照，该参照区域应当设计地尽可能与反应区域类似。在分析物与该试剂发生酶反应的情况下，该反应产物通常会从反应位置扩散开，因为该分析物并不结合于载体。为此，反应区域和参照区域通常并不直接彼此相邻安装在该测试元件上。只有当该分析物固定在载体上时，如US6249593B1中所述的在免疫反应中发生的那样，才可以使该反应区域和参照区域直接相邻，其中分析物和检测试剂一起结合于固定的反应参与物。在其中反应产物并未结合于固定的反应参与物的分析系统中发生的扩散过程可以具有该反应产物(例如染料)从反应区域扩散到参照区域的结果。这妨碍了参照或使其不可能。可以采取各种措施来防止反应区域和参照区域的空间分离以及由此避免施加样品的增加。一方面，可以将酶固定在反应区域内，这样造成对反应产物的空间限制。此外，可以将形成的染料设计为不溶于水的。这样就将吸收行为的改变限制于反应区域。这样，反应区域和参照区域可以直接相邻设置，以及可以设计为非常小，因为防止了待检测试剂的扩散。
由于在参照区域内不发生改变吸收行为的反应，因此当参照区域润湿时，该分析物或中间产物可以扩散到反应区域内，因为在参照区域内至少不再发生形成至少一种染料的反应步骤。为使该扩散可在整个检测区域上可比较，可以选择二维交替的参照区域和反应区域的设置。在这种情况下，该区域的尺寸和形状没有限制。然而，优选参照区域和反应区域均匀分布，以确保可比较地扩散到所有区域中以及区域的可比较性。例如在参照区域和反应区域的棋盘式设置中这是可行的。
作为通过激光使酶失活或不在参照区域内施加酶的替代方式，可以通过在一部分参照区域内引入防止该分析物渗透到该区域内的物质，来防止该分析物和试剂在参照区域内反应。这可以是膜，其尽管可渗透水分子，但阻止更大的分子(例如分析物)渗入。可替代地，也可以广泛地阻止液体的渗入。这可以例如通过疏水物质而实现，例如疏水塑料或人造树脂，其阻止液体渗入以及因而阻止分析物的渗入。这种塑料和人造树脂都是现有技术中相当公知的。
酶/辅酶组合物
试剂的选择取决于其浓度待检测的分析物的形式。所有溶于液体中的物质都可以作为分析物。该分析物优选溶于体液中，例如目标分子，例如胆固醇、葡萄糖、甘油三酯、脲、尿酸或HbA_1c。为此可以使用各种酶(例如脱氢酶(例如Gluc-DH)、氧化还原酶(例如GlucDOR))和辅酶(例如黄素(例如FAD/FADH)、烟碱(例如NAD/NADH)或醌衍生物(例如Q、PQQ))。这些酶/辅酶系统是现有技术中足够已知的，例如在专利申请US20050214891中对其进行了描述。在优选实施方式中，葡萄糖是分析物，可以例如通过以下酶反应检测：
1.利用GOD-FAD、POD-和无色染料在固定POD位置的沉淀。
2.利用葡萄糖染料氧化还原酶(GlucDOR-PQQ)、介质和固定的磷钼酸吡咯并喹啉醌(PQQ)。
3.利用将NAD通过Gluc-DH辅助转化为NADH，并使用固定心肌黄酶随后转化四唑盐，其中在最后步骤中甲沉淀。
优选该反应链中的一种组分是固定的。这尤其优选是处于由其生成改变吸收行为的物质的反应链末端的组分。因此，例如将葡萄糖特异性酶(例如GOD、GlucDOR或GlucDH)固定在与参照区域以棋盘状图案交替位于检测区域薄膜上的反应区域内。
为了在测试元件上同时测定一种样品中不同的分析物，可以将不同的酶引入不同的反应区域内。
制备方法
除了US6592815或US7008799中描述的其它传统制备方法之外，可以例如借助于各种印刷方法将该检测区域结构化成参照区域和反应区域：
-丝网印刷
-胶版印刷
-喷墨印刷
-刮刀涂覆。
借助于这些方法，可以在一个步骤中以使其具有含不同功能的不同区域的方式结构化位于如测试元件的结构常见的那样的载体材料上的检测区域的表面。因此，可以用所有所需的试剂印刷该反应区域，而可以将一部分试剂不施加在参照区域上。备选地，可以与反应区域类似地印刷该检测区域，然后将参照区域失活，以使得该参照区域内的酶不再和分析物反应。该失活可以例如通过用激光辐照或通过有针对性施加失活化物质(例如酸或碱)而进行。备选地，也可以将不可逆结合该酶并阻止该酶用于与分析物的反应的物质添加到参照区域。
检测
可以用一种或多种光源照射该检测区域。在这一点上，该检测区域可以被均匀照射或仅在部分区域上被照射。如果仅使用一个光源，可以通过使用乳白色玻璃或其它散射单元改进对检测区域的均匀照射。
用至少一个光源照射该检测区域的替代方式是使用环境光(日光或人工照明)来照射该检测区域。因为环境光是多光谱的，因此可以在测试元件和检测器之间插入滤光器，以仅检测特定波长范围。
替代地，该系统可以具有不同的照射单元以连续照射该测试元件。然而，这并不是绝对必需的。例如可以使用与可由微观机构调节的反光镜相结合的简单激光二极管作为光源。借助于反光镜可以用该激光束无间隙地扫描该测试元件。备选地，可以使用激光阵列，优选VCSEL阵列(垂直腔表面发射激光)。在这种情况下，阵列中的各激光可以单独定位。VCSEL的优点在于该光照射具有低射束发散。这些激光结构具有约5～8°的射束发散。在这种方式下，不仅可以照射小区域，而且此外在该区域上的光通量也非常高。
该照射单元可以由单色或多光谱的、相干或不相干的辐射源构成。使用来自该照射单元的辐射渗透到检测区域中，以检测试剂和分析物的显色反应。该照射单元优选由一个或多个LED构成，其光确保了在样品位置处特别选择的空间强度分布或均匀的照射。在优选实施方式中，使用具有约660nm波长的光。这可以通过选择光源或嵌入仅允许特定波长范围的光透过的成像单元(例如滤光器)而实现。
成像单元可以安装在照射单元和检测区域之间。该成像单元由光学元件(例如透镜、滤光器、镜子、膜片、棱镜、光导或全息元件)构成。这确保了检测区域的照明。另外的成像单元用于将被照射的样品体投射在检测单元上。该成像单元也由成像光学元件(例如透镜、滤光器、镜子、棱镜、膜片、光导或全息元件)构成。非必要地可以使用微光学透镜阵列，其中各单独的元件在检测单元的各元件上形成测试元件的分割的空间区域。当使用多光谱光源时，有意义的是在检测器之前或检测元件之前安装滤光器。
用于本发明的检测单元可以由平面或线性元件构成，其能够对由检测区域成像的散射辐射进行空间分辨以及时间分辨测定。该元件优选是二维CMOS阵列、CCD阵列或线性二极管阵列，其中通过扫描过程进行对检测区域的空间分辨成像。在很多情况下，无空间分辨的简单光学二极管也可以是足够的。这可以例如与检测区域的空间分辨照射结合使用。
测定步骤
在进行测定时，患者或系统进行以下步骤：
-将样品施加于测试元件的检测区域，
-对来自检测区域的反射光强度进行空间分辨测定
-借助于由至少一个反应区域和至少一个参照区域测定的光强度，测定该分析物浓度。
为此使用包括至少一个反应区域和至少一个参照区域的测试元件，其中在该参照区域润湿时基本不发生由于分析物和/或样品造成的吸收行为的改变。可以使用检测系统用于检测，例如已经描述的那些。
本申请中描述的用于检测液体中分析物浓度的系统和方法具有在该装置中不需要其它参照的优点。因此，不需要在该系统中或在所用测试元件上安装另外的参照场以实现测量的足够精确度。
参照区域和反应区域的设置使得这些区域可以同时得到照射和/或检测和/或评价。不需要对不同区域单独照明或检测。
而且，患者不需要注意其如何将样品施加于该测试元件，因为该至少一个参照区域和至少一个反应区域的尺寸和形状保证至少部分参照区域和部分反应区域可以用于该分析。
附图说明
图1a：反射设置的用于吸收测量的系统的示意图。
图1b：透射光设置的用于测定分析物浓度的系统的示意图。
图2a：具有检测区域的测试元件的构造的示意图，该检测区域具有多个交替的等尺寸的反应区域和参照区域。
图2b：具有检测区域的测试元件的构造的示意图，该检测区域具有多个交替的不同尺寸的反应区域和参照区域。
图1a和1b中所示的系统显示具有检测区域(2)的测试元件(1)，该检测区域包含多个参照区域(4)和反应区域(3)。该系统仅示例性示出具有多个参照区域和反应区域；也可设想仅包含一个参照区域(4)和一个反应区域(3)的系统。
在图1a中，该测试元件(1)设置在该系统中，其设置方式使得检测区域(2)至少部分被照射单元(6)照射且从检测区域(2)反射的光被检测器(7)捕获。在评价单元(8)中可以对检测器(7)接收的信号进一步处理和评价。该光照或检测优选部分是空间分辨的，其能使该检测区域区分成反应区域(3)和参照区域(4)。然后可以将反应区域(3)和参照区域(4)的信号在评价单元(8)中相关联并用算法评价。
图1b中示出了这样的系统，其进而包含测试元件(1)以及照射单元(6)和检测器(7)，其中该检测器设置在测试元件(1)与照射单元一侧相反的另一侧。在该实施方式中，必须确保至少该测试元件的检测区域可使辐照部分通过，以使得可以借助检测器(7)测定由分析物和试剂反应导致的吸收。在该实施方式中该光照和/或检测也是以空间分辨方式进行的，其能使该反应区域(3)和参照区域(4)彼此区分开。在图1A中和图1B中的系统中可以在测试元件和照射单元之间在一侧上以及在测试元件和检测元件之间在另一侧上使用另外的成像单元(5)，用于尽可能有效地照射或检测该测试元件。这些成像单元(5)例如可以是透镜、膜片或滤光器。
图2a和2b中显示了测试元件(1)的检测区域(2)的示意结构。测试元件(1)优选具有载体薄膜(11)，试剂(12)可以固定在该载体薄膜上。该试剂(12)并不是固定在检测区域(2)的整个区域上，而是含有固定的试剂的区域(所谓的反应区域(3))与没有固定试剂的参照区域(4)交替存在。
图2A中显示了反应区域(3)和参照区域(4)的非常规则的排列，而图2b中显示了反应区域(3)和参照区域(4)同样交替的变型，然而其中区域的尺寸可以变化。
附图标记
1    测试元件
2    检测区域
3    反应区域
4    参照区域
5    成像单元
6    照射单元
7    检测器
8    评价单元
11   载体薄膜
12   固定组分